Summary
A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.
Abstract
O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.
Introduction
Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ao transplante de ilhotas pancreáticas para superar essas dificuldades.
A tecnologia de impressão de células 3D está surgindo em engenharia de tecidos devido ao seu grande potencial e alto desempenho. Escusado será dizer que os bioinks são conhecidos como componentes importantes para fornecer um microambiente adequado e permitir a melhoria dos processos celulares em construções de tecidos impressos. Um número substancial de hidrogéis de afinamento de tesoura, como fibrina, alginato e colágeno são amplamente utilizados como bioinks. No entanto, esses materiais mostram falta de complexidade estrutural, química, biológica e mecânica em comparação com a matriz extracelular (ECM) no tecido nativo3. Pistas microambientais, como as interações entre ilhotas e ECM são sinais importantes para melhorar a função das ilhotas. ECM descelularizado (dECM) pode recriar a composição específica do tecido de vários componentes de ECM, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Por exemplo, ilhotas primárias que retêm seus ECMs periféricos (por exemplo, tipo I, III, IV, V e VI colágeno, laminina e fibronectina) exibem baixa apoptose e melhor sensibilidade à insulina, indicando assim que as interações de matriz celular específicas do tecido são importantes para melhorar sua capacidade de funcionar de forma semelhante ao tecido original4.
Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de biotilidade sacarcelulares descelularizadas (pdECM) derivadas de tecidos pancreáticos (pdECM) para fornecer sugestões microambientais benéficas para impulsionar a atividade e as funções das ilhotas pancreáticas, seguidas pelos processos de geração de construções de tecidos pancreáticos 3D usando uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusion (Figura 1).
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Protocol
Tecidos pancreáticos suínos foram coletados de um matadouro local. Experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Asan Medical Center, Seul, Coréia.
1. Descelularização de tecidos
- Prepare as soluções para a descelularização.
NOTA: 1x fosfato-buffered soro lógico (PBS) usado em todos os preparativos de solução é diluído pela adição de água destilada para 10x PBS.- Para a solução Triton-X 100 de 1%, dissolva 100 mL de 100% de solução Triton-X 100 em 900 mL de 1x PBS usando uma barra de agitação magnética com a agitação a 150 rpm para 6 h. Faça 400 mL de 1% Triton-X 100 solução com 40 mL de 10% Triton-X 100 solução e 360 mL de 1x PBS preparado pouco antes do uso.
NOTA: A solução Triton-X 100 de 10% pode ser armazenada à temperatura ambiente até que seja necessário. - Para a solução de ácido peracético de 0,1%, diluir 8,5 mL de 4,7% de ácido peracético em 22,8 mL de 70% de etanol com 368,7 mL de água destilada pouco antes do uso.
- Para a solução Triton-X 100 de 1%, dissolva 100 mL de 100% de solução Triton-X 100 em 900 mL de 1x PBS usando uma barra de agitação magnética com a agitação a 150 rpm para 6 h. Faça 400 mL de 1% Triton-X 100 solução com 40 mL de 10% Triton-X 100 solução e 360 mL de 1x PBS preparado pouco antes do uso.
- Retire os tecidos periféricos do pâncreas e corte o tecido antes da descelularização.
- Lave o pâncreas porcino ressecado com água da torneira corrente e retire os tecidos periféricos usando tesoura esterilizada.
- Transfira o pâncreas em um saco plástico com fórceps e congele -80 °C por 1 h para ajudar a cortar o pâncreas de forma eficaz para o próximo passo.
- Corte o pâncreas congelado em pedaços de 1 mm de espessura usando um ralador.
- Transfira 50 g do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mL.
NOTA: Um recipiente plástico com uma tampa é recomendado aqui para proteger os tecidos da contaminação e evitar a evaporação da solução.
- Tratamento com reagentes.
NOTA: Todo o processo de descelularização deve ser realizado a 4 °C em um agitador orbital digital às 150 rpm. Em todas as etapas de descelularização, o desprendimento físico usando fórceps é necessário para evitar que as fatias de pâncreas grudem. Lavar o recipiente com água destilada é necessário para remover os reagentes residuais completamente no recipiente.- Antes de qualquer tratamento de reagente, lave 50 g de pâncreas fatiado com 300 mL de água destilada usando uma coqueteleira.
- Mexa o tecido continuamente a 150 rpm até que a água turva desapareça (após aproximadamente 12 h). Substitua a água destilada a cada 2 h.
NOTA: Alterar a água destilada a cada hora é recomendado para a eficiência para remover a água turva mais rapidamente. - Descarte a água e trate os 50 g de tecidos com 400 mL de 1% Triton-X 100 na solução PBS 1x por 84 h. Refresque a solução a cada 12 h.
NOTA: Neste ponto, a quantidade de tecido diminuirá porque os componentes celulares começam a ser removidos. - Trate com 400 mL de isopropanol (IPA) por 2 h para remover a gordura restante do pâncreas.
NOTA: É normal que o tecido se torne difícil devido à remoção de gordura neste processo. - Após 2 h, retire o IPA e lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 24 h. Refresque o PBS 1x cada 12 h.
- Esterilizar o tecido descelularizado, descarte a solução anterior e trate com 400 mL de 0,1% de ácido peracético em 4% de etanol para 2 h.
- Para remover detergente residual, lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 6 h. Refresque a solução a cada 2 h.
- Colete os tecidos descelularizados em um tubo cônico de 50 mL com fórceps.
- Congele a amostra a -80 °C para 1 h. Cubra o tubo cônico com uma limpeza sem fiapos em vez da tampa e conserte com um elástico para lioffiização eficiente.
- Lyofilize o tecido descelularizado em -50 °C para 4 d.
NOTA: Para a etapa 1.3, 1 g de tecido não decelularizado também deve ser liofilizado as mesmas condições.
2. Avaliação de tecidos descelularedos
NOTA: Para avaliar a quantidade residual de dsDNA, glicosaminoglicanos (GAGs) e colágeno no tecido descelularizado em comparação com o tecido nativo, pelo menos 1 g de cada um dos tecidos não descelularizados (tecido nativo) e tecido descelularizado são necessários para um lote de avaliação. A quantidade de dsDNA, GAGs e colágeno pode ser calculada com base no peso seco do tecido.
- Prepare soluções para ensaios bioquímicos.
- Prepare a solução de papain para a digestão da amostra.
NOTA: A quantidade de buffer a ser feita pode ser ajustada de acordo com o número de amostras.- Dissolva 119 mg de 0,1 M de fosfato de sódio (monobasic), 18,6 mg de 0,5 mM Na2-EDTA, e 8,8 mg de 5 mM cisteína-HCl em 10 mL de água autocllavada.
- Ajuste o pH da solução para 6,5 adicionando a solução De 10 M NaOH.
- Adicione 125 μL de 10 mg/mL solução de ações de papaina para a solução acima e vórtice, permitindo que cada elemento se misture uniformemente.
- Prepare soluções para o ensaio azul de dimetileno (DMMB).
- Para fazer dinência de DMMB, dissolva 8 mg de 1,9-dimetileno de zinco azul cloreto de dois sal, 1,52 g de glicina e 1,185 g de NaCl em 500 mL de água autocllavada. Ajuste o pH para 3 adicionando a solução HCl de 0,5 M ao medir a mudança de pH usando um medidor de pH de bancada. Em seguida, filtre isso através de um filtro de vácuo de 500 mL.
- Faça 15 μL de 10 mg/mL chondroitin sulfato Uma solução para o padrão.
- Prepare soluções para o ensaio hidroxiproline.
- Para a solução de trabalho de cloramina, dissolva 2,4 g de acetato de sódio, 1 g de ácido cítrico e 0,68 g de hidróxido de sódio em 24 mL de água destilada e adicione 240 μL de ácido acético glacial, 10 μL de tolueno e 6 mL de IPA.
NOTA: Dissolva todos os pós em solução usando um misturador de vórtice. A solução de trabalho de cloramina pode ser armazenada a 4 °C por até três meses. - Para a solução de cloromina T, dissolva 0,35 g de cloramina T em 20 mL de solução de trabalho de cloramina e adicione 2,5 mL de IPA. Vortex para misturar todos os componentes.
NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso. - Para a solução P-DAB, coloque 3,75 g de P-DAB em 6,5 mL de ácido perdérico e 15 mL de IPA; envolvê-lo em folha de alumínio.
NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso.
- Para a solução de trabalho de cloramina, dissolva 2,4 g de acetato de sódio, 1 g de ácido cítrico e 0,68 g de hidróxido de sódio em 24 mL de água destilada e adicione 240 μL de ácido acético glacial, 10 μL de tolueno e 6 mL de IPA.
- Prepare a solução de papain para a digestão da amostra.
- Adicione 1 mL de solução de papaina a 10 mg de tecido lyofificado em um tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL e vórtice do tubo para digerir melhor a amostra.
- Coloque o tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL em um rack de borracha e digere as amostras em um copo de 500 mL que contém 300 mL de água a 60 °C por 16 h.
- Centrífuga a 9.500 x g por 20 min, recolher o supernatant, e transferi-lo para um novo tubo.
- Quantificar o DNA residual e as principais proteínas do tecido descelularizado.
- Carga 1 μL de amostra digerida no espectrômetro e medir a quantidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: O experimentador deve amarrar o cabelo para trás e usar uma máscara para evitar contaminar a amostra.
- Carga 1 μL de amostra digerida no espectrômetro e medir a quantidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.
- Realize um ensaio de DMMB para quantificar a quantidade de GAGs que permanece no tecido decellularized.
- Misture 1 μL de sulfato de condroitina Uma solução e 499 μL de 1x PBS para fazer padrões. Diluir o sulfato de condroitina Uma solução com água destilada em concentrações de 0, 4, 8, 12, 16 e 20 μg/mL.
- Carregar triplicados de 50 μL de cada concentração do padrão e amostras digeridas em uma placa de 96 poços.
- Adicione 200 μL do tintendência DMMB a cada poço usando uma pipeta multicanal.
- Leia imediatamente a absorção em 525 nm em um leitor do microplate.
- Realize um ensaio hidroxiproline para quantificar a quantidade de colágeno.
- Para realizar um ensaio hidroxiproline, incubar 250 μL de amostra digerida com volumes iguais de HCl em 120 °C para 16 h.
- Seque os resíduos à temperatura ambiente por 3 h para resfriar as amostras e, em seguida, redissolver as amostras em 1 mL de 1x PBS.
- Centrífuga a 2.400 x g por 10 min a 4 °C.
- Prepare a solução hidroxiproline de 100 μg/mL como padrão.
- Diluir a solução hidroxiproline com água destilada a uma concentração de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL para uma solução padrão.
- Carregar triplicados de 50 μL de amostras e solução padrão em uma placa de 96 poços.
- Adicione 50 μL de solução De Cloramina T, em seguida, incubar por 20 min à temperatura ambiente.
- Adicione 50 μL de solução p-DAB e incubar por 30 min a 60 °C.
NOTA: Aliquot em um quarto escuro. Após a adição, envolva a placa com papel alumínio. - Incubar à temperatura ambiente por 30 min.
- Após o resfriamento, medir a absorção em 540 nm em um leitor de microplaca.
3. Preparação bioink
NOTA: pó pdECM pode ser armazenado de forma evigorada a -80 °C por pelo menos um ano. Antes do ajuste do pH, a solução de pdECM digerido pode ser armazenada a -20 °C por um mês. Antes do uso, descongele a amostra da solução congelada do pdECM em 4 °C durante a noite. A solução pdECM ajustada ao pH pode ser armazenada a 4 °C por até uma semana. A solução de pdECM digerido pode ser armazenada a 4 °C por pelo menos alguns dias, mas não deve exceder 1 semana.
- Dime o pdECM liofilizado com pepsina.
- Para uma digestão eficaz do bioink, pulverize o pdECM lyophilized com nitrogênio líquido usando um almofariz e um pilão.
- Colete 200 mg do pó pdECM no tubo cônico de 50 mL e adicione 20 mg de peptina e 8,4 mL do ácido acético de 0,5 M (concentração final é de 2 w/v%).
- Coloque a barra de agitação magnética no tubo cônico de 50 mL e mexa em 300 rpm para 96 h.
- Ajuste o pH da solução de pdECM digerido.
NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, esse processo deve ser realizado no gelo.- Filtrar as partículas não digeridas na solução pdECM usando um filtro de célula de 40 μm usando uma pipeta de deslocamento positivo no gelo para obter a digestão ideal das partes.
- Adicione 1 mL do PBS 10x e vórtice antes de usar NaOH.
- Ajuste o pH para 7 com 10 M NaOH verificando o pH com tiras indicadoras de pH.
NOTA: Vortex cada vez Que NaOH é adicionado de modo que o bioink seja misturado completamente com os outros reagents.
4. Análise reológica
- Configuração experimental
- Prepare os 1,5% (w/v) de bioink pdECM para avaliar as propriedades reológicas.
- Estabeleça uma geometria da placa do cone de 20 milímetros (diâmetro do cone de 20 milímetros com um ângulo de 2°) na modalidade taxa-controlada de um rheometer.
- Criar sequências experimentais no software instalado (TRIOS) para medir a viscosidade, a cinética de gelação e o modulus dinâmico do bioink pdECM.
- Viscosidade: Coloque o bioink pdECM na placa. Medir viscosidade complexa (Pa·s) de bioink pdECM uma taxa crescente de cisalhamento de 1 para 1.000s-1 a uma temperatura constante de 15 °C.
- Cinética gelatação: Coloque o bioink pdECM na placa. Calcule o complexo modulus (G*) medindo o modulus do armazenamento e da perda do bioink do pdECM em 4-37 °C com uma taxa incremental do aumento de 5 °C/min (modalidade da tempo-varredura).
- Modulo dinâmico: Coloque o bioink pdECM na placa a 37 °C por 60 minutos antes da medição. Medir o modulus de armazenamento dependente da frequência (G') e o modulus de perda (G'') do bioink pdECM na faixa de 0,1-100 rad/s em 2% de tensão.
5. impressão de células 3D de construções de tecidopanpático usando ilhota
- Preparação de ilhotas isoladas
- Isolar ilhotas primárias de um rato de acordo com os protocolos descritos em um trabalho anterior5.
- Para separar detritos e células mortas da ilhota isolada, passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm. Ilhotas com um diâmetro inferior a 70 μm são consideradas mortas ou anormais.
- Suspenda as ilhotas isoladas no meio RPMI-1640 e coloque-as na placa de Petri. Remova ilhotas maiores que 300 μm de diâmetro usando uma pipeta de volume P200 o microscópio (lente objetiva 4x) no armário de biossegurança.
- Encapsulamento de ilhota em bioink pdECM
- Prepare bioink pdECM ajustado pH e ilhota isolada.
NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser realizado no gelo. - Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada.
NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.
- Prepare bioink pdECM ajustado pH e ilhota isolada.
- Impressão de células 3D de construções de tecidopanpático
- Prepare uma seringa esterilizada e um bico de 22 G.
NOTA: Este medidor foi selecionado para ilhotas de impressão com um diâmetro de 100-250 μm. - Carregar ilhota-laden pdECM bioink na seringa.
- Imprima o bioink com a condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça.
- Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.
- Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura ilhota, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% fetal bovino soro (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.
- Prepare uma seringa esterilizada e um bico de 22 G.
6. impressão de células 3D de construção pancreática com estrutura padronizada
- Preparação de dois tipos do bioink
- Para validar a versatilidade de impressão usando bioinks múltiplos, prepare dois conjuntos de bioinks pdECM e manche-os adicionando 0,4% da solução Trypan Blue e Rose Bengal em cada bioink pdECM em uma proporção de 1:20, respectivamente.
NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser conduzido no gelo. - Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada.
NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.
- Para validar a versatilidade de impressão usando bioinks múltiplos, prepare dois conjuntos de bioinks pdECM e manche-os adicionando 0,4% da solução Trypan Blue e Rose Bengal em cada bioink pdECM em uma proporção de 1:20, respectivamente.
- Impressão de células 3D de construções de tecidopanptica baseadas em vários materiais
- Prepare seringas esterilizadas e um bico de 25 G.
- Carregue cada bioink (azul e vermelho) em duas seringas diferentes, respectivamente.
- Imprima o bioink com condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça com linhas alternadas de azul e vermelho.
- Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.
- Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura de ilhotas, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.
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Representative Results
Descelularização dos tecidos pancreáticos
Desenvolvemos o processo de preparação de biotilidade pdECM para fornecer microambientes específicos de tecido pancreático para melhorar a funcionalidade das ilhotas em uma construção de tecido bioimpresso 3D (Figura 2A). Após o processo de descelularização, 97,3% do dsDNA foi removido e os componentes representativos da ECM, como colágeno e GAGs, permaneceram em 1278,1% e 96,9% em relação ao tecido pancreático nativo, respectivamente (Figura 2B).
Preparação bioink
Para aplicar o pdECM no processo de impressão, o pó pdECM foi solubilizado em ácido fraco com pepsina e neutralizado usando a solução de 10 M NaOH. A solução de pdECM digerido poderia então ser diluída através da mistura com um meio de cultura celular ou 1x PBS. Neste estudo, preparamos bioink pdECM em uma concentração final de 1,5% para um estudo mais aprofundado. O bioink pdECM manteve uma fase de solução quando foi colocado temperatura ambiente e instantaneamente convertido em uma fase de gel após a incubação em 37 °C por 30 min. Para investigar o efeito do bioink pdECM em ilhotas, ilhotas isoladas foram encapsuladas no pdECM, alginato e bioinks de colágeno a uma concentração de 1,5%. O resultado do teste de secreção de insulina estimulada por glicose mostrou que ilhotas no bioink pdECM representaram o maior índice (aproximadamente 3.174) entre os grupos experimentais, indicando maior funcionalidade sobre os hidrogéis amplamente aplicados para encapsulamento de ilhotas5.
Análise reológica
A viscosidade é uma das características críticas ao considerar um biomaterial imprimível. Medimos a viscosidade do bioink pdECM em uma frequência que varia de 1 a 1.000 Hz a 15 °C para impressão de bioinks dECM6,7,8. O bioink pdECM apresentou comportamento de desbaste de cisalhamento e o valor foi de aproximadamente 10 Pa·s à taxa de cisalhamento de 1/s, indicando que o bioink pdECM tinha características reológicas apropriadas para extrusão através de um bico (Figura 3A). A cinética da gelação a uma temperatura que varia de 4 a 37 °C indicava o comportamento de gelação do bioink pdECM em temperaturas fisiologicamente relevantes. O complexo modulus começou a aumentar quando a temperatura chegou a 15 °C, e aumentou rapidamente quando a temperatura foi mantida em 37 °C, indicando a transição sol-gel do bioink pdECM (Figura 3B). O dinâmico G' e G do bioink pdECM foram investigados em temperaturas fisiologicamente relevantes para garantir sua estabilidade após o processo de impressão, o que resultou em ter um modulus estável a condição de varredura de freqüência (Figura 3C).
Impressão de células 3D
As construções de tecidopanptica carregadas de células 3D foram fabricadas usando um processo de impressão baseado em microextrusão. Para construir uma construção contendo pelo menos 3.000 equivalentes de ilhotas (IEQ), que corresponde ao volume de tecido de uma ilhota perfeitamente esférica com um diâmetro de 150 μm9, projetamos a construção com uma dimensão de 10 mm x 10 mm x 3 mm (Figura 4A). Os parâmetros e condições do processo para a impressão de ilhotas pancreáticas foram selecionados para encapsular ilhotas, que são grandes aglomerados celulares em tamanhos que variam de 100-250 μm de diâmetro (Figura 4B). Usando um sistema de impressão multi-cabeça, vários tipos de construções 3D, como a forma da rede com linhas alternativas de azul e vermelho foram fabricados usando o pdECM desenvolvido (Figura 4C), indicando a versatilidade do pdECM com a finalidade de bioimpressão 3D para harmonizar dois ou mais tipos de células vivas em um arranjo semelhante ao tecido.
Figura 1: Esquemático do desenvolvimento de tecido pancreático descelularizado, avaliação de bioink pdECM e fabricação de construções de tecidos pancreáticos 3D. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Imagens representativas do processo de descelularização e caracterização bioquímica do pdECM. (A)Visão geral da descelularização do tecido pancreático suíno. (B)Resultados de ensaios bioquímicos de tecido nativo e pdECM. Barras de erro mostram desvio padrão. Direitos autorais (2019) A Royal Society of Chemistry5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Análise reológica do bioink pdECM. (A)Viscosidade de pdECM e bioinks de colágeno que exibiam comportamento de desbaste de corte. (B) Cinética de gelação de pdECM e bioinks de colágeno durante a mudança de temperatura. (C) O complexo modulus de pdECM crosslinked e bioinks de colágeno. Direitos autorais (2019) da Royal Society of Chemistry5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Impressão de células 3D de bioink pdECM carregado de células para construções de tecidopanpático 3D. (A)As dimensões do tecido pancreático 3D são construídas. (B) Construções de tecidopancresptica3D com base em ilhotas pancreáticas. Direitos autorais (2019) da Royal Society of Chemistry5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação10. Em comparação com polímeros sintéticos, o dECM pode servir como um ambiente favorável às células por causa da composição específica do tecido e arquitetura11. Portanto, o processo de descelularização deve ser seriamente considerado para a alta retenção de componentes principais no dECM.
A seleção de diferentes detergentes para descelularização do tecido pancreático varia o constituinte residual de ECM12. No processo de descelularização, notamos que o uso de sulfato dodócia de sódio (SDS) pode afetar a perda das proteínas ECM13. Assim, modificamos nosso protocolo anterior, eliminando o passo para o tratamento da solução SDS, que é um surfactante iônico usado em muitos processos de limpeza e descelularização com características relativamente duras em comparação com os outros, como Trion-X 100, ou 3-[(3-cholamidopropyl) dimetil-lammonio]-1 propanesulfona (CHAPS). Neste protocolo, usamos a solução Triton-X 100 de 1% para 84 h em vez da solução SDS, que foi capaz de remover os componentes celulares de forma eficaz, preservando GAGs e proteínas colagenous. Além disso, observamos que a remoção de lipídios residuais através do tratamento com IPA também é um processo muito crucial para induzir a interligação de bioink pdECM e pode ser entendido no mesmo contexto que um artigo publicado anteriormente4. O tratamento com solução de ácido peracético também foi aplicado para a esterilização do tecido descelularizado. Além disso, a remoção dos detergentes e produtos químicos restantes no tecido descelularizado é um passo crucial para evitar a resposta inflamatória do hospedeiro. No entanto, não discutimos essa questão neste protocolo. Protocolos que incluem um processo de higienização no final da descelularização melhorarão a biocompatibilidade do material descelularizado. Além disso, as normas para critérios de avaliação devem ser consideradas para garantir que os detergentes e produtos químicos sejam completamente removidos.
A digestão do bioink pdECM com pepsina foi realizada para alcançar a mistura homogênea de pó pdECM na solução ácida pela clivagem da região telopeptide na proteína colagenous. No processo de ajuste do pH, manter o bioink pdECM no gelo é fundamental para a preservação da gelação. Depois, podemos produzir bioinks pré-gel pdECM fisicamente transfáveis que podem entrar em um estado de gel incubando a 37 °C, que é uma das principais vantagens dos bioinks à base de dECM. A seleção da concentração adequada do bioink pdECM também é importante10. Um bioink ideal deve proteger as células de danos externos que ocorrem durante o processo de impressão, como pressão pneumática e mudança de temperatura. Sabe-se que a força de cisalhamento aplicada pode causar danos às células e reduzir a viabilidade celular nas construções impressas10. Além disso, melhorar as concentrações de bioink poderia induzir a morte celular5. Em contraste, baixas concentrações de bioink induz baixa viscosidade, o que significa baixa impressão e fidelidade durante a impressão. É necessário verificar a viscosidade do bioink e otimizar sua concentração.
Atualmente, os pesquisadores estão estudando ativamente o desenvolvimento de vários tipos de bioinks derivados de tecidos para a impressão de construções de tecido 3D14,15,16. Os resultados destes estudos indicam que o bioink poderia fornecer microambientes específicos do tecido para pilhas. Estas condições únicas podem promover a diferenciação ou maturação das células-tronco e a proliferação de células. Além disso, a utilização do sistema de impressão de células 3D equipada com várias cabeças torna possível imprimir vários tipos de bioinks com alta precisão simultaneamente. Usando esta técnica, uma estrutura com um padrão específico pode ser produzida, mostrando assim a versatilidade do projeto. Além disso, é viável encapsular diferentes tipos de células em cada bioink para imitar o arranjo de células nativas17. Essas estruturas padronizadas podem ser utilizadas na indução da vascularização ou efeito cocultura, melhorando as interações célula-célula, que podem ser fatores-chave na sobrevivência a longo prazo de células específicas18,19.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica da National Research Foundation (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionado pelo IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
