Summary
La matrice extracellulare decellularizzata (dECM) può fornire adeguati segnali microambientali per ricapitolare le funzioni intrinseche dei tessuti bersaglio in un costrutto ingegnerizzato. Questo articolo chiarisce i protocolli per la decellularizzazione del tessuto pancreatico, la valutazione del bioink dECM derivato dal tessuto pancreatico e la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa.
Abstract
Il trapianto di isole pancreatiche è un trattamento promettente per i pazienti che soffrono di diabete di tipo 1 accompagnato da ipoglicemia e complicazioni secondarie. Tuttavia, il trapianto di isole presenta ancora diverse limitazioni, come la scarsa vitalità delle isole trapiantate a causa di un cattivo innesto di isole e di ambienti ostili. Inoltre, le cellule che producono insulina differenziata dalle cellule staminali pluripotenti umane hanno capacità limitate di secernere ormoni sufficienti che possono regolare il livello di glucosio nel sangue; pertanto, è fortemente necessario migliorare la maturazione colticce le cellule con adeguati segnali microambientali. In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di un bioink a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) derivato dal tessuto pancreatico per fornire un microambiente benefico che può aumentare la sensibilità al glucosio delle isole pancreatiche, seguito da descrivere i processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampa basata sulla microestrusione.
Introduction
Recentemente, il trapianto di islet pancreatico è stato considerato un trattamento promettente per i pazienti con diabete di tipo 1. La relativa sicurezza e la minima invasività della procedura sono grandi vantaggi di questo trattamento1. Tuttavia, ha diverse limitazioni come il basso tasso di successo delle isole isolare e gli effetti collaterali dei farmaci immunosoppressori. Inoltre, il numero di isolotti innevati diminuisce costantemente dopo il trapianto a causa dell'ambiente ostile2. Vari materiali biocompatibili come algerino, collagene, poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) o glicole di polietilene (PEG) sono stati applicati al trapianto di islet pancreatico per superare queste difficoltà.
La tecnologia di stampa cellulare 3D sta emergendo nell'ingegneria tissutale a causa del suo grande potenziale e delle sue alte prestazioni. Inutile dire che i bioinchi sono noti come componenti importanti per fornire un microambiente adatto e consentire il miglioramento dei processi cellulari nei costrutti di tessuto stampato. Un numero considerevole di idrogel che dilaniano la cesoia come fibrina, alginato e collagene sono ampiamente utilizzati come bioinks. Tuttavia, questi materiali mostrano una mancanza di complessità strutturale, chimica, biologica e meccanica rispetto alla matrice extracellulare (ECM) nel tessuto nativo3. I segnali microambientali come le interazioni tra isolotti ed ECM sono segnali importanti per migliorare la funzione delle isolotti. Decellularizzato ECM (dECM) può ricreare la composizione specifica del tessuto di vari componenti ECM tra cui collagene, glicosaminoglicani (GAG) e glicoproteine. Ad esempio, le isole primarie che mantengono le loro ECU periferiche (ad esempio, le interazioni di tipo I, III, IV, V e VI collagene, laminina e fibronectina) presentano una bassa apoptosi e una migliore sensibilità all'insulina, indicando così che le interazioni cellula-matrice specifiche del tessuto sono importanti per migliorare la loro capacità di funzionare in modo simile al tessuto originale4.
In questo articolo, chiariamo i protocolli per la preparazione di bioinchiostro a matrice extracellulare decellularizzata decellularizzata (pdECM) di tessuto pancreatico per fornire segnali microambientali benefici per aumentare l'attività e le funzioni delle isole pancreatiche, seguiti dai processi per la generazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando una tecnica di biostampabasatasu microestrusingne ( Figura 1 ).
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Protocol
Tessuti pancreatici porcini sono stati raccolti da un macello locale. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Asan Medical Center di Seoul, Corea.
1. Decellularizzazione dei tessuti
- Preparare le soluzioni per la decellularizzazione.
NOTA: 1x salina con buffer fosfato (PBS) utilizzata in tutti i preparati della soluzione viene diluita aggiungendo acqua distillata a 10 volte PBS.- Per la soluzione 1% Triton-X 100, sciogliere 100 mL di 100% soluzione Triton-X 100 in 900 mL di 1x PBS utilizzando una barra di stiring magnetico con l'agitazione a 150 rpm per 6 h. Make 400 mL di 1% Soluzione Triton-X 100 con 40 mL di 10% Soluzione Triton-X 100 e 360 mL di 1x1x PBS preparato poco prima dell'uso.
NOTA: la soluzione 10% Triton-X 100 può essere conservata a temperatura ambiente fino a quando necessario. - Per la soluzione dell'acido peracetico dello 0,1%, diluire 8,5 mL di 4,7% di acido peraceto in 22,8 mL di 70% di etanolo con 368,7 mL di acqua distillata poco prima dell'uso.
- Per la soluzione 1% Triton-X 100, sciogliere 100 mL di 100% soluzione Triton-X 100 in 900 mL di 1x PBS utilizzando una barra di stiring magnetico con l'agitazione a 150 rpm per 6 h. Make 400 mL di 1% Soluzione Triton-X 100 con 40 mL di 10% Soluzione Triton-X 100 e 360 mL di 1x1x PBS preparato poco prima dell'uso.
- Rimuovere i tessuti periferici del pancreas e affettare il tessuto prima della decellularizzazione.
- Lavare il pancreas di porcina resezionato con acqua corrente del rubinetto e rimuovere i tessuti periferici utilizzando forbici sterilizzate.
- Trasferire il pancreas in un sacchetto di plastica con la forza e congelare a -80 gradi centigradi per 1 h per aiutare a tagliare il pancreas in modo efficace per il passo successivo.
- Affettare il pancreas congelato in pezzi spessi 1 mm con una grattugia.
- Trasferire 50 g di tessuto a fette in un contenitore di plastica da 500 ml.
NOTA: Un contenitore di plastica con coperchio è consigliato qui per proteggere i tessuti dalla contaminazione e prevenire l'evaporazione della soluzione.
- Trattamento con reagenti.
NOTA: L'intero processo di decellularizzazione deve essere effettuato a 4 gradi centigradi su uno shaker orbitale digitale a 150 giri/min. In tutte le fasi di decellularizzazione, il distacco fisico con la pinze è necessario per evitare che le fette di pancreas si attacchino insieme. Per rimuovere completamente i reagenti residui nel contenitore è necessario lavare il contenitore con acqua distillata.- Prima di qualsiasi trattamento reagente, lavare 50 g di pancreas a fette con 300 mL di acqua distillata utilizzando uno shaker.
- Mescolare il tessuto continuamente a 150 giri/min fino a quando l'acqua torbida scompare (dopo circa 12 h). Sostituire l'acqua distillata ogni 2 h.
NOTA: Si consiglia di cambiare l'acqua distillata ogni ora per l'efficienza per rimuovere più rapidamente l'acqua torbida. - Scartare l'acqua e trattare i 50 g di tessuti con 400 mL di 1% Triton-X 100 in 1x soluzione PBS per 84 h. Aggiornare la soluzione ogni 12 h.
NOTA: A questo punto, la quantità di tessuto diminuirà perché i componenti cellulari iniziano a essere rimossi. - Trattare con 400 mL di isopropanolo (IPA) per 2 h per rimuovere il grasso rimanente dal pancreas.
NOTA: È normale che il tessuto diventi duro a causa della rimozione del grasso in questo processo. - Dopo 2 h, rimuovere l'IPA e lavare il tessuto con 400 mL di 1x PBS per 24 h. Aggiornare il 1x PBS ogni 12 h.
- Per sterilizzare il tessuto decellularizzato, scartare la soluzione precedente e trattare con 400 mL di 0,1% acido peracetico nel 4% di etanolo per 2 h.
- Per rimuovere il detergente residuo, lavare il tessuto con 400 mL di 1x PBS per 6 h. Aggiornare la soluzione ogni 2 h.
- Raccogliere i tessuti decellularizzati in un tubo conico da 50 mL con pinze.
- Congelare il campione a -80 gradi centigradi per 1 h. Coprire il tubo conico con una salvietta senza lanucca al posto del coperchio e fissare con un elastico per un'efficiente liofilizzazione.
- Liofilarizzare il tessuto decellularizzato a -50 gradi centigradi per 4 d.
NOTA: Per il passaggio 1.3, 1 g di tessuto non decellularizzato deve anche essere liofilizzato alle stesse condizioni.
2. Valutazione dei tessuti decellularizzati
NOTA: Per valutare la quantità residua di dsDNA, glicosaminoglicani (GAG) e collagene nel tessuto decellularizzato rispetto al tessuto nativo, sono necessari almeno 1 g di ciascuno dei tessuti non decellularizzati (tessuto nativo) e del tessuto decellularizzato gruppo di valutazione. La quantità di dsDNA, GAG e collagene può essere calcolata in base al peso secco del tessuto.
- Preparare soluzioni per saggi biochimici.
- Preparare la soluzione papaina per la digestione del campione.
NOTA: la quantità di buffer da effettuare può essere regolata in base al numero di campioni.- Sciogliere 119 mg di fosfato di sodio 0,1 M (monobasico), 18,6 mg di 0,5 mM Na2-EDTA e 8,8 mg di 5 mM di cisteina-HCl in 10 mL di acqua autoclaved.
- Regolare il pH della soluzione a 6,5 aggiungendo una soluzione NaOH da 10 M.
- Aggiungere 125 luna di 10 mg/mL soluzione di brodo papaina alla soluzione di cui sopra e vortice, permettendo ad ogni elemento di mescolare in modo uniforme.
- Preparare le soluzioni per il saggio di methyl-metilene blu (DMMB).
- Per fare la tintura DMMB, sciogliere 8 mg di 1,9-dimetil-metilene-cloruro di zinco blu, 1,52 g di glicina, e 1.185 g di NaCl in 500 mL di acqua autoclata. Regolare il pH a 3 aggiungendo una soluzione HCl da 0,5 M mentre si misura il cambio di pH utilizzando un misuratore di pH bench-top. Quindi, filtrare questo attraverso un filtro a vuoto da 500 mL.
- Rendere 15 ll di 10 mg/mL di solfato di condroitina Una soluzione per lo standard.
- Preparare le soluzioni per il saggio di idrossiprolina.
- Per la soluzione di lavoro della cloramina, sciogliere 2,4 g di acetato di sodio, 1 g di acido citrico e 0,68 g di idrossido di sodio in 24 mL di acqua distillata e aggiungere 240L di acido glaciale acetico, 10 ll di toluene e 6 mL di IPA.
NOTA: Sciogliere tutte le polveri in soluzione utilizzando un miscelatore vortice. La soluzione di lavoro Chloramine può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi per un massimo di tre mesi. - Per la soluzione chloramina T, sciogliere 0,35 g di cloramina T in 20 mL di soluzione di lavoro cloramina e aggiungere 2,5 mL di IPA. Vortice per mescolare tutti i componenti.
NOTA: Preparare immediatamente prima dell'uso. - Per la soluzione P-DAB, inserire 3,75 g di P-DAB in 6,5 mL di acido perclorico e 15 mL di IPA; avvolgerlo in un foglio di alluminio.
NOTA: Preparare immediatamente prima dell'uso.
- Per la soluzione di lavoro della cloramina, sciogliere 2,4 g di acetato di sodio, 1 g di acido citrico e 0,68 g di idrossido di sodio in 24 mL di acqua distillata e aggiungere 240L di acido glaciale acetico, 10 ll di toluene e 6 mL di IPA.
- Preparare la soluzione papaina per la digestione del campione.
- Aggiungere 1 mL di soluzione papaina a 10 mg di tessuto liofilizzato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 mL e vortice il tubo per digerire meglio il campione.
- Mettere il tubo di microcentrifuga da 1,5 ml in un rack di gomma e digerire i campioni in un becher da 500 mL che contiene 300 mL di acqua a 60 gradi centigradi per 16 h.
- Centrifuga a 9.500 x g per 20 min, raccogliere il supernatante, e trasferirlo in un nuovo tubo.
- Quantificare il DNA residuo e le principali proteine nel tessuto decellularizzato.
- Caricare 1 l di campione digerito nello spettrometro e misurare la quantità di dsDNA secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Lo sperimentatore deve legare i capelli indietro e indossare una maschera per evitare di contaminare il campione.
- Caricare 1 l di campione digerito nello spettrometro e misurare la quantità di dsDNA secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire un saggio DMMB per quantificare la quantità di GAG che rimane nel tessuto decellularizzato.
- Mescolare 1 ll di solfato di condroitina Una soluzione e 499 -L di 1x PBS per fare gli standard. Diluire il solfato di condroitina Una soluzione con acqua distillata a concentrazioni di 0, 4, 8, 12, 16 e 20 g/mL.
- Caricare i triplicati di 50 gradi di ogni concentrazione dei campioni standard e digeriti in una piastra di 96 pozze.
- Aggiungere 200 l del coloranti DMMB ad ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
- Leggere immediatamente l'assorbimento a 525 nm su un lettore di microplacino.
- Eseguire un saggio di idrossiprolina per quantificare la quantità di collagene.
- Per condurre un'acido idrossiprolina, incubare 250 l di campione digerito con volumi uguali di HCl a 120 gradi centigradi per 16 h.
- Asciugare i residui a temperatura ambiente per 3 h per raffreddare i campioni e quindi ri-dissolviare i campioni in 1 mL di 1x PBS.
- Centrifuga a 2.400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione di idrossido di 100 g/mL di serie.
- Diluire la soluzione idrossiprolina con acqua distillata ad una concentrazione di 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/mL per una soluzione standard.
- Caricare in una piastra di 96 pozzetto triplicati di 50 litri di campioni e soluzione standard.
- Aggiungere 50 -L di chloramina T soluzione quindi incubare per 20 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 50 -L di soluzione p-DAB e incubare per 30 min a 60 gradi centigradi.
NOTA: Aliquota in una stanza buia. Dopo l'aggiunta, avvolgere la piastra con un foglio di alluminio. - Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Dopo il raffreddamento, misurare l'assorbimento a 540 nm su un lettore di microplacio.
3. Preparazione Bioink
NOTA: la polvere pdECM può essere conservata stabilmente a -80 gradi centigradi per almeno un anno. Prima della regolazione del pH, la soluzione pdECM digerita può essere conservata a -20 gradi centigradi per un mese. Prima dell'uso, scongelare il campione di soluzione pdECM congelata a 4 gradi centigradi durante la notte. La soluzione pdECM regolata in pH può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana. La soluzione pdECM digerita può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno un paio di giorni, ma non deve superare 1 settimana.
- Digerire il pdECM liofilizzato con pepsina.
- Per una digestione efficace del bioink, polverizza il pdECM lofilofilfato con azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello.
- Raccogliere 200 mg della polvere pdECM nel tubo conico 50 mL e aggiungere 20 mg di pepsina e 8,4 mL dell'acido acetico 0,5 M (la concentrazione finale è 2 w/v%).
- Posizionare la barra magnetica di agitazione nel tubo conico 50 mL e mescolare a 300 giri/m per 96 h.
- Regolare il pH della soluzione pdECM digerita.
NOTA: Al fine di evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere condotto sul ghiaccio.- Filtrare le particelle non digerite nella soluzione pdECM utilizzando un colino cellulare di 40 m utilizzando una pipetta di spostamento positivo sul ghiaccio per ottenere la digestione ottimale delle parti.
- Aggiungere 1 mL di 10x PBS e vortice prima di utilizzare NaOH.
- Regolare il pH a 7 con 10 M NaOH controllando il pH con strisce indicatore pH.
NOTA: Vortice ogni volta che NaOH viene aggiunto in modo che il bioinchiostro sia accuratamente mescolato con gli altri reagenti.
4. Analisi reologica
- Configurazione sperimentale
- Preparare il bioinchiostro 1.5% (w/v) del pdECM per valutare le proprietà reologiche.
- Stabilire una geometria della piastra del cono da 20 mm (diametro del cono di 20 mm con un angolo di 2 gradi) in modalità di controllo della velocità di un reometro.
- Creare sequenze sperimentali nel software installato (TRIOS) per misurare la viscosità, la cinetica della gelazione e il modulo dinamico del bioink pdECM.
- Viscosità: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra. Misurare la viscosità complessa (Paàs) del bioink pdECM con un tasso di taglio crescente da 1 a 1.000 s-1 ad una temperatura costante di 15 gradi centigradi.
- Cinetica di gelazione: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra. Calcolare il complesso modulo (G) misurando il modulo di archiviazione e perdita di pdECM bioink a 4-37 s c con un tasso di aumento incrementale di 5 C/min (modalità di spazzamento temporale).
- Modulo dinamico: Posizionare il bioinchiostro pdECM sulla piastra a 37 gradi centigradi per 60 minuti prima della misurazione. Misurare il modulo di archiviazione dipendente dalla frequenza (G') e il modulo di perdita (G'') del bioink pdECM nell'intervallo di 0,1-100 rad/s con una deformazione del 2%.
5. Stampa di cellule 3D di costrutti di tessuto pancreatico con isolotto
- Preparazione di isolotti isolati
- Isolare le isole primarie da un ratto secondo i protocolli descritti in un lavoro precedente5.
- Per separare i detriti e le cellule morte dall'isolotto isolato isolato, passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 70 m. Le isole con un diametro inferiore a 70 m sono considerate morte o anormali.
- Sospendere le isole isolate nel mezzo RPMI-1640 e posizionarle sulla piastra di Petri. Rimuovere le isole di diametro superiore a 300 m utilizzando una pipetta di volume P200 al microscopio (4x obiettivo obiettivo) nell'armadio di biosicurezza.
- Incapsulamento delle islet nel bioink pdECM
- Preparare il bioinchiostro pdECM regolato in pH e l'isolotto isolato.
NOTA: Per evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere eseguito sul ghiaccio. - Mescolare delicatamente il bioinchiostro pdECM e il supporto sospesi con isolotti (rapporto 3:1) utilizzando una pipetta di spostamento positivo fino a quando non viene mescolato uniformemente.
NOTA: la concentrazione finale del bioinchiostro pdECM è dell'1,5% e la densità cellulare nel bioinchiostro pdECM è 3.000 IEQ/mL.
- Preparare il bioinchiostro pdECM regolato in pH e l'isolotto isolato.
- Stampa cellulare 3D di costrutti di tessuto pancreatico
- Preparare una siringa sterilizzata e un ugello da 22 G.
NOTA: Questo misuratore è stato selezionato per la stampa di isolotti con un diametro di 100-250 m. - Caricare il bioinchiostro pdECM carico di iletto nella siringa.
- Stampare il bioinchiostro con la condizione di stampa ottimizzata (velocità di alimentazione: 150 mm/min; pressione pneumatica: 15 kPa) a 18 gradi centigradi a forma di reticolo.
- Per collegare in modo incrociato il bioinchiostro, posizionare il costrutto stampato nell'incubatrice per 30 min.
- Immergere il costrutto stampato nel supporto di coltura dell'isolotto che è RPMI-1640 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomicina.
- Preparare una siringa sterilizzata e un ugello da 22 G.
6. Stampa di celle 3D del costrutto pancreatico con struttura modellata
- Preparazione di due tipi di bioink
- Per convalidare la versatilità di stampa utilizzando più bioinks, preparare due serie di bioink pdECM e macchiarli aggiungendo 0,4% Trypan Blue e Rose Bengal soluzione in ogni bioink pdECM con un rapporto di 1:20, rispettivamente.
NOTA: Per evitare la gelazione prima della regolazione del pH, questo processo deve essere condotto sul ghiaccio. - Mescolare delicatamente il bioinchiostro pdECM e il supporto sospesi con isolotti (rapporto 3:1) utilizzando una pipetta di spostamento positivo fino a quando non viene mescolato uniformemente.
NOTA: la concentrazione finale del bioinchiostro pdECM è dell'1,5% e la densità cellulare nel bioinchiostro pdECM è 3.000 IEQ/mL.
- Per convalidare la versatilità di stampa utilizzando più bioinks, preparare due serie di bioink pdECM e macchiarli aggiungendo 0,4% Trypan Blue e Rose Bengal soluzione in ogni bioink pdECM con un rapporto di 1:20, rispettivamente.
- Stampa di cellule 3D di costrutti di tessuto pancreatico multimateriale
- Preparare siringhe sterilizzate e un ugello da 25 G.
- Caricare ogni bioinchiostro (blu e rosso) in due siringhe diverse, rispettivamente.
- Stampare il bioinchiostro con una condizione di stampa ottimizzata (velocità di avanzamento: 150 mm/min; pressione pneumatica: 15 kPa) a 18 gradi centigradi a forma di reticolo con linee alternate di blu e rosso.
- Per collegare in modo incrociato il bioinchiostro, posizionare il costrutto stampato nell'incubatrice per 30 min.
- Immergere il costrutto stampato in supporti di coltura dell'isolotto che è RPMI-1640 medio integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomicina.
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Representative Results
Decellularizzazione dei tessuti pancreatici
Abbiamo sviluppato il processo di preparazione del bioink pdECM per fornire microambienti specifici del tessuto pancreatico per migliorare la funzionalità delle isolotti in un costrutto di tessuto biostampato 3D (Figura 2A). Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del dsDNA è stato rimosso e componenti ECM rappresentativi come collagene e GAG sono rimasti rispettivamente al 1278,1% e al 96,9% rispetto a quello del tessuto pancreatico nativo (Figura 2B).
Preparazione bioink
Per applicare il pdECM nel processo di stampa, la polvere pdECM è stata solubile in acido debole con pepsina e neutralizzata utilizzando la soluzione 10 M NaOH. La soluzione pdECM digerita potrebbe quindi essere diluita mescolando con un mezzo di coltura cellulare o 1x PBS. In questo studio, abbiamo preparato il bioink pdECM ad una concentrazione finale dell'1,5% per ulteriori studi. Il bioink pdECM ha mantenuto una fase di soluzione quando è stato posto sotto temperatura ambiente e immediatamente convertito in una fase gel dopo l'incubazione a 37 gradi centigradi per 30 min. Per studiare l'effetto del bioink pdECM sulle isole, le isole isolate sono state incapsulate nei bioink pdECM, alginati e collagene ad una concentrazione dell'1,5%. Il risultato del test di secrezione di insulina stimolato dal glucosio ha mostrato isole nel bioink pdECM rappresentato l'indice più alto (circa 3.174) tra i gruppi sperimentali, indicando una maggiore funzionalità rispetto agli idrogel ampiamente applicati per l'incapsulamento delle isole5.
Analisi reologica
La viscosità è una delle caratteristiche critiche quando si considera un biomateriale stampabile. Abbiamo misurato la viscosità del bioink pdECM ad una frequenza che va da 1 a 1.000 Hz a 15 gradi centigradi per la stampa di vari bioinks dECM6,7,8. Il bioink pdECM ha mostrato un comportamento di diradamento della cesoia e il valore era di circa 10 Paàs alla velocità di taglio di 1/s, indicando che il bioink pdECM aveva caratteristiche reologiche appropriate per l'estrusione attraverso un ugello (Figura 3A). La cinetica di gelazione ad una temperatura variabile da 4 a 37 gradi centigradi ha indicato il comportamento di gelazione del bioink pdECM a temperature fisiologicamente rilevanti. Il complesso modulo ha iniziato ad aumentare quando la temperatura ha raggiunto i 15 gradi centigradi, ed è aumentata rapidamente quando la temperatura è stata mantenuta a 37 gradi centigradi, indicando la transizione sol-gel del bioink pdECM (Figura 3B). Il bioink dinamico G' e G" del bioinchiostro pdECM sono stati studiati a temperature fisiologicamente rilevanti per garantire la sua stabilità dopo il processo di stampa, il che ha portato ad avere un modulo stabile sotto la condizione di sweep di frequenza (Figura 3C).
Stampa di celle 3D
I costrutti di tessuto pancreatico 3D carichi di cellule sono stati fabbricati utilizzando un processo di stampa basato sulla microestrusione. Per costruire un costrutto contenente almeno 3.000 equivalenti Islet (IEQ), che corrisponde al volume del tessuto di un isolotto perfettamente sferico con un diametro di 150 m9, abbiamo progettato il costrutto con una dimensione di 10 mm x 10 mm x 3 mm (Figura 4A). I parametri di processo e le condizioni per la stampa di isole pancreatiche sono stati selezionati per incapsulare le isole, che sono grandi cluster cellulari in dimensioni di 100-250 m di diametro (Figura 4B). Utilizzando un sistema di stampa multitesta, vari tipi di costrutti 3D, come la forma del reticolo con linee alternative di blu e rosso, sono stati fabbricati utilizzando il pdECM sviluppato (Figura 4C), indicando la versatilità di pdECM allo scopo di biostampare 3D per armonizzare due o più tipi di cellule viventi in una disposizione di tessuto.
Figura 1: Schematico dello sviluppo del tessuto pancreatico decellularizzato, valutazione del bioinchiostro pdECM e fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative del processo di decellularizzazione e della caratterizzazione biochimica del pdECM. (A) Panoramica della decellularizzazione del tessuto pancreatico dei suini. (B) Risultati dei saggi biochimici di tessuti autoctoni e pdECM. Le barre di errore mostrano la deviazione standard. Diritto d'autore (2019) La Royal Society of Chemistry5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi reologica del bioinchiostro pdECM. (A) Viscosità dei bioink pdECM e collagene che mostravano un comportamento di assottigliamento della cesoia. (B) Cinetica di gelazione di pdECM e bioinks collagene durante il cambiamento di temperatura. (C) Il complesso modulo di pdECM e bioinks di collagene collegati. Diritto d'autore (2019) della Royal Society of Chemistry5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Stampa di cellule 3D di bioinchiostro pdECM carico di cellule per costrutti di tessuto pancreatico 3D. (A) Le dimensioni dei costrutti di tessuto pancreatico 3D. (B) I costrutti di tessuto pancreatico 3D basati sull'isolotto e (C) basato su islet. Diritto d'autore (2019) della Royal Society of Chemistry5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha descritto lo sviluppo di bioinks pdECM e la fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico 3D utilizzando tecniche di stampa cellulare 3D. Per ricapitolare il microambiente del tessuto bersaglio nel costrutto di tessuto ingegnerizzato 3D, la scelta del bioink è fondamentale. In uno studio precedente, abbiamo convalidato che i bioink dECM specifici dei tessuti sono utili per promuovere la differenziazione delle cellule staminali e la proliferazione10. Rispetto ai polimeri sintetici, il dECM può fungere da ambiente favorevole alle cellule a causa della composizione e dell'architettura specifiche dei tessuti11. Pertanto, il processo di decellularizzazione dovrebbe essere seriamente considerato per l'elevata ritenzione dei principali componenti nel dECM.
La selezione di diversi detergenti per la decellularizzazione del tessuto pancreatico varia il residuo ECM costituente12. Nel processo di decellularizzazione, abbiamo notato che l'uso di solfato di sodio dodecyl (SDS) può influenzare la perdita delle proteine ECM13. Così, abbiamo modificato il nostro protocollo precedente eliminando il passo per il trattamento della soluzione SDS, che è un surfactant ionico utilizzato in molti processi di pulizia e decellularizzazione con caratteristiche relativamente dure rispetto agli altri come Trion-X 100, o 3-(3-cholamidopropyl) dimetilil-lammonio]-1-propanesulfonato (CHAPS). In questo protocollo, abbiamo utilizzato 1% soluzione Triton-X 100 per 84 h invece della soluzione SDS, che è stata in grado di rimuovere i componenti cellulari in modo efficace preservando i GAG e le proteine collagenose. Inoltre, abbiamo notato che la rimozione dei lipidi residui trattando con IPA è anche un processo molto cruciale per indurre il collegamento incrociato del bioink pdECM e può essere compreso nello stesso contesto di un articolo4pubblicato in precedenza . Il trattamento con soluzione di acido peracetico è stato applicato anche per la sterilizzazione del tessuto decellularizzato. Inoltre, la rimozione dei detergenti e delle sostanze chimiche rimanenti nel tessuto decellularizzato è un passo cruciale per prevenire la risposta infiammatoria dell'ospite. Tuttavia, non abbiamo discusso la questione in questo protocollo. I protocolli che includono un processo di sanificazione alla fine della decellularizzazione miglioreranno la biocompatibilità del materiale decellularizzato. Inoltre, è necessario considerare norme per i criteri di valutazione per garantire che detergenti e sostanze chimiche vengano completamente rimossi.
La digestione del bioink pdECM con pepsina è stata eseguita per ottenere la miscelazione omogenea di polvere pdECM nella soluzione acida per scissione della regione telopeptide nella proteina collagenosa. Nel processo di regolazione del pH, mantenere il bioinchiostro pdECM sul ghiaccio è fondamentale per la conservazione della gelazione. In seguito, possiamo produrre bioink pre-gel pdECM collegabili fisicamente che possono entrare in uno stato gel incubando a 37 gradi centigradi, che è uno dei principali vantaggi dei bioink a base di dECM. Anche la selezione della corretta concentrazione del bioinchiostro pdECM è importante10. Un bioink ideale deve proteggere le cellule da danni esterni che si verificano durante il processo di stampa, come la pressione pneumatica e il cambiamento di temperatura. È noto che la forza di taglio applicata può causare danni alle cellule e ridurre la vitalità cellulare nei costrutti stampati10. Inoltre, migliorare le concentrazioni di bioink potrebbe indurre la morte cellulare5. Al contrario, basse concentrazioni di bioink inducono una bassa viscosità che significa scarsa stampabilità e forma-fedeltà durante la stampa. È necessario controllare la viscosità del bioink e ottimizzare la sua concentrazione.
Attualmente, i ricercatori stanno studiando attivamente lo sviluppo di vari tipi di bioinks di origine tissutale per la stampa di costrutti di tessuto 3D14,15,16. I risultati di questi studi indicano che il bioink potrebbe fornire microambienti specifici dei tessuti per le cellule. Queste condizioni uniche possono promuovere la differenziazione o la maturazione delle cellule staminali e la proliferazione delle cellule. Inoltre, l'utilizzo del sistema di stampa a celle 3D dotato di più teste consente di stampare più tipi di bioinks con alta precisione contemporaneamente. Utilizzando questa tecnica, può essere prodotta una struttura con un modello specifico, mostrando così la versatilità del design. Inoltre, è possibile incapsulare diversi tipi di cellule in ogni bioink per imitare la disposizione delle cellule native17. Queste strutture modellate possono essere utilizzate nell'induzione della vascolarizzazione o dell'effetto di co-coltura migliorando le interazioni cellula-cellula, che possono essere fattori chiave nella sopravvivenza a lungo termine di specifiche cellule18,19.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio & Medical Technology Development Program della National Research Foundation (NRF) finanziato dal governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e da "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionato dall'IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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