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Bioengineering

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/60434
* These authors contributed equally

Summary

脱細胞細胞細胞細胞外マトリックス(dECM)は、工学的構造における標的組織の固有の機能を再現するための適切なマイクロ環境手掛かりを提供することができる。本稿では、膵組織の脱細胞化、膵臓組織由来dECMバイオインクの評価、バイオプリンティング技術を用いた3D膵臓組織構築物の生成に関するプロトコルを解明する。

Abstract

膵島の移植は、低血糖および二次合併症を伴う1型糖尿病に罹患した患者のための有望な治療法である。しかしながら、島の移植はまだ貧しい島の生着や敵対的な環境による移植された島の生存率の低さのようないくつかの制限を持っています。さらに、ヒト多能性幹細胞から分化したインスリン産生細胞は、血糖値を調節できる十分なホルモンを分泌する能力が限られている。そのため、適切なマイクロ環境的手掛かりを持つ細胞を培養して成熟を改善することは強く求められている。本稿では、膵島のグルコース感受性を高めることができる有益な微小環境を提供するために、膵組織由来の細胞外細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製するためのプロトコルを解明し、マイクロ押出ベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵臓組織構築物を生成するプロセス。

Introduction

近年、膵島移植は1型糖尿病患者に対する有望な治療法と考えられている。手順の相対的な安全性および最低の侵襲性は、この処置1の大きな利点である。しかし、島の孤立の成功率が低い、免疫抑制薬の副作用など、いくつかの制限があります。さらに、生着島の数は、敵対的な環境2に起因する移植後に着実に減少する。これらの困難を克服するために、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ(乳酸共グリコール酸)(PLGA)またはポリエチレングリコール(PEG)などの種々の生体適合性物質が膵島移植に適用されています。

3D細胞印刷技術は、その大きな可能性と高性能のために組織工学で出現しています。言うまでもなく、バイオインクは、適切な微小環境を提供し、印刷された組織構造における細胞プロセスの改善を可能にするための重要なコンポーネントとして知られています。フィブリン、アルギン酸塩、コラーゲンなどのせん断薄ヒドロゲルの相当数は、バイオインクスとして広く使用されています。しかしながら、これらの物質は、天然組織3における細胞外マトリックス(ECM)と比較して構造的、化学的、生物学的、および機械的複雑性の欠如を示す。小島とECMの相互作用などの微小環境上の手掛かりは、島の機能を高めるための重要なシグナルです。脱細胞化ECM(dECM)は、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)、および糖タンパク質を含む様々なECM成分の組織特異的組成物を再現することができる。例えば、末梢ECMを保持する一次島(例えば、I型、III型、IV型、Iv、VIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン)は、低アポトーシスおよびより良いインスリン感受性を示し、したがって、組織特異的細胞マトリックス相互作用が元の組織4と同様に機能する能力を高めるために重要であることを示す。

本論文では、膵組織由来の細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製し、膵島の活性と機能を高めるための有益な微小環境的手掛かりを提供するためのプロトコルを解明し、続いてマイクロエクストルションベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵組織構築物を生成するプロセスを解明する(図1)。

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Protocol

豚膵臓組織は地元の食肉処理場から採取された。動物実験は、韓国ソウルのアサン医療センターの制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認された。

1. 組織脱細胞化

  1. 脱細胞化のための溶液を準備します。
    注:すべての溶液調製物に使用される1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、10x PBSに蒸留水を添加して希釈する。
    1. 1% Triton-X 100溶液の場合、1x PBSの900 mLに100mLの100 mLを溶解し、磁気攪拌バーを使用して150 rpmで6時間攪拌しながら、1%Triton-X 100溶液の40mLを10%Triton-X 100溶液で40mLにし、16xの16xmL溶液を100mLで100mLにする。使用直前に準備された PBS。
      メモ:10%Triton-X 100溶液は、必要になるまで室温で保存することができます。
    2. 0.1%の過酢酸溶液の場合、8.5 mLの4.7mLの1酢酸を、使用直前の蒸留水368.7mLで70%エタノールの22.8 mLに希釈します。
  2. 膵臓の末梢組織を取り除き、脱細胞化する前に組織をスライスします。
    1. 切除した豚の膵臓を水道水で洗い、殺菌されたはさみを使って周辺組織を取り除きます。
    2. 鉗子が付いているビニール袋に膵臓を移し、次のステップのために膵臓を効果的に切断するのを助けるために1時間-80°Cで凍結する。
    3. 冷凍膵臓を1mmの厚さにスライスします。
    4. スライスした組織の50gを500mLのプラスチック容器に移す。
      メモ:組織を汚染から保護し、溶液の蒸発を防ぐために、蓋付きのプラスチック容器をここにお勧めします。
  3. 試薬による処理。
    注:脱細胞化プロセス全体は、150rpmのデジタル軌道シェーカーで4°Cで行う必要があります。すべての脱細胞化工程において、膵臓のスライスがくっつくのを防ぐために鉗子を用いた物理的剥離が必要である。蒸留水で容器を洗浄することは、容器内の残留試薬を完全に除去する必要がある。
    1. 試薬処理の前に、シェーカーを使用して300mLの蒸留水でスライスされた膵臓の50gを洗浄します。
    2. 曇った水が消えるまで(約12時間後)、組織を150rpmで連続的に攪拌する。蒸留水を2時間ごとに交換してください。
      注:蒸留水を1時間ごとに交換すると、より迅速に曇った水を取り除くために効率を上げるための方法をお勧めします。
    3. 水を捨て、1x PBS溶液中の400 mLの50gの組織を84時間1xPBS溶液で処理します。
      メモ:この時点で、細胞成分が除去され始めるので、組織の量が減少します。
    4. イソプロパノール(IPA)400mLで2時間処理し、膵臓から残りの脂肪を除去する。
      注:このプロセスで脂肪の除去のために組織がタフになるのは正常です。
    5. 2時間後、IPAを取り出し、400 mLの1x PBSで24時間洗浄し、12時間ごとに1x PBSをリフレッシュします。
    6. 脱細胞組織を殺菌するには、前の溶液を廃棄し、4%エタノール中の400mLの0.1%の酢酸を2時間処理します。
    7. 残留洗剤を除去するには、400 mLの1x PBSで6時間洗浄し、溶液を2時間ごとにリフレッシュします。
    8. 鉗子で50 mL円錐管内の脱細胞組織を収集します。
    9. サンプルを-80°Cで1時間凍結し、蓋の代わりにリントフリーワイプで円錐管を覆い、効率的な凍結乾燥のためにゴムバンドで固定します。
    10. 4dの-50°Cで脱細胞組織を凍結乾燥する。
      注:ステップ1.3では、非細胞化組織の1gも同じ条件で凍結乾燥する必要があります。

2. 脱細胞組織の評価

注:dsDNA、グリコサミノグリカン(GAGs)、および非細胞化組織におけるコラーゲンの残存量をネイティブ組織と比較して評価するには、非細胞化組織(天然組織)および脱細胞組織のそれぞれに少なくとも1gが必要です。評価のバッチ。dsDNA、GAG、およびコラーゲンの量は、組織の乾燥重量に基づいて計算することができる。

  1. 生化学的アッセイのための解決策を準備する。
    1. サンプル消化のためのパパイン溶液を準備します。
      注: 作成するバッファの量は、サンプルの数に応じて調整できます。
      1. 0.1 M リン酸ナトリウム (モノベーシック), 18.6 mg 0.5 mM Na2-EDTA, 8.8 mg の 5 mM システイン HCl をオートクレーブ水 10 mL で溶解します。
      2. 10 M NaOH溶液を加えて、溶液のpHを6.5に調整します。
      3. 上記の溶液と渦に10mg/mLパパインの125 μLを加え、各要素を均等に混合できるようにします。
    2. ジメチルメチレンブルー(DMMB)アッセイの溶液を調製します。
      1. DMMB色素を作るためには、8mgの1,9-ジメチルメチレンブルー塩化亜鉛二重塩、1.52gのグリシン、および1.185gのNaClをオートクレーブ水の500mLに溶解します。ベンチトップpHメーターを使用してpHの変化を測定しながら、0.5 M HCl溶液を加えてpHを3に調整します。次に、500 mL ボトルトップ真空フィルターを通してこれをフィルター処理します。
      2. 10 mg/mL コンドロイチン硫酸 A 溶液の 15 μL を標準用に作成します。
    3. ヒドロキシプロリンアッセイの溶液を準備する。
      1. クロラミン作動液の場合、2.4gの酢酸ナトリウム、クエン酸1g、水酸化ナトリウム0.68gを蒸留水24mLに溶解し、氷酢酸240μL、トルエン10μL、IPA6mLを加えます。
        メモ:ボルテックスミキサーを使用して溶液にすべての粉末を溶解します。クロラミン加工液は、4°Cで最大3ヶ月間保存できます。
      2. クロラミンT溶液の場合、クロラミン加工液の20mLに0.35gのクロラミンTを溶解し、2.5 mLのIPAを加えます。すべてのコンポーネントを混合する渦。
        メモ:使用する直前に準備してください。
      3. P-DAB溶液の場合は、3.75gのP-DABを過塩素酸の6.5 mLとIPAの15 mLに入れます。アルミ箔で包みます。
        メモ:使用する直前に準備してください。
  2. 1.5 mLマイクロ遠心管と渦チューブの凍結乾燥組織の10mgにパパイン溶液の1 mLを追加し、サンプルをより良く消化します。
  3. 1.5 mLマイクロ遠心管をゴムラックに入れ、300 mLの水を含む500 mLビーカーでサンプルを消化し、60°Cで16時間浸潤します。
  4. 9,500 x gで20分間遠心分離し、上清を収集し、新しいチューブに移します。
  5. 脱細胞組織中の残留DNAおよび主要タンパク質を定量する。
    1. 消化したサンプルを分光器に1μL積み込み、メーカーの指示に従ってdsDNAの量を測定します。
      メモ:実験者は、サンプルを汚染しないように、髪を後ろに結び、マスクを着用する必要があります。
  6. DMMBアッセイを実行して、脱細胞組織に残るGAGの量を定量化します。
    1. コンドロイチン硫酸A溶液1μL、1x PBSの499°Lを混ぜて標準を作ります。コンドロイチン硫酸A溶液を0、4、8、12、16、20μg/mLの濃度で蒸留水で希釈します。
    2. 標準および消化されたサンプルの各濃度の50°Lの3重ね合いを96ウェルプレートにロードします。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、DMMB染料の200°Lを各ウェルに加えます。
    4. すぐにマイクロプレートリーダーの525 nmで吸光度を読み取ります。
  7. ヒドロキシプロリンアッセイを行い、コラーゲンの量を定量する。
    1. ヒドロキシプロリンアッセイを行うには、16時間120°Cで同じ量のHClを有する消化サンプルの250μLをインキュベートする。
    2. 室温で残渣を3時間乾燥させてサンプルを冷却し、1x PBSの1 mLでサンプルを再溶解します。
    3. 遠心分離機は2,400 x gで4°Cで10分間。
    4. 100μg/mLヒドロキシプロリン溶液を標準で調製します。
    5. 蒸留水で希釈したヒドロキシプロリン溶液は、標準溶液の濃度0、1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30μg/mLです。
    6. 50°Lのサンプルと標準溶液の30°Lを96ウェルプレートにロードします。
    7. 50μLのクロラミンT溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。
    8. 50°Lのp-DAB溶液を加え、60°Cで30分間インキュベートします。
      注:暗い部屋のアリコート。追加後、プレートをアルミ箔で包みます。
    9. 室温で30分間インキュベートする。
    10. 冷却後、マイクロプレートリーダーで540nmで吸光度を測定します。

3. バイオインク調製

注:pdECM粉末は、少なくとも1年間-80°Cで安定して保存することができます。pH調整の前に、消化されたpdECM溶液は-20°Cで1ヶ月間保存することができます。使用前に、凍結pdECM溶液の試料を4°Cで一晩解凍する。pH調整pdECM溶液は4°Cで最大1週間保存できます。消化されたpdECM溶液は、少なくとも数日間4°Cで保存することができますが、1週間を超えてはなりません。

  1. ペプシンで凍結乾燥pdECMを消化します。
    1. バイオインクの効果的な消化のために、モルタルと害虫を使用して液体窒素で凍結乾燥pdECMを粉砕する。
    2. 50 mL円錐形チューブに200mgのpdECM粉末を集め、0.5M酢酸のペプシン20mgと8.4 mL(最終濃度は2w/v%)を加えます。
    3. 磁気攪拌バーを50mL円錐管に入れ、300rpmで96時間撹拌します。
  2. 消化pdECM溶液のpHを調整します。
    注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
    1. 氷上の正の変位ピペットを使用して40μmのセルストレーナーを使用してpdECM溶液中の未消化粒子を除外し、部品の最適な消化を得ます。
    2. NaOH を使用する前に、10x PBS と渦の 1 mL を追加します。
    3. pH インジケータストリップで pH をチェックして、10 M NaOH で pH を 7 に調整します。
      注:ボルテックスは、バイオインクが他の試薬と完全に混合されるように、NaOHが添加されるたびに。

4. レオロジー分析

  1. 実験的なセットアップ
    1. pdECMバイオインクの1.5%(w/v)を準備し、レオロジー特性を評価します。
    2. 回転計のレート制御モードで、20 mm の円錐板ジオメトリ(2°角度の円錐径 20 mm)を確立します。
    3. インストール済みソフトウェア(TRIOS)で実験シーケンスを作成し、pdECMバイオインクの粘度、ゲル化動力学、動的弾性率を測定します。
      1. 粘度:プレート上にpdECMバイオインクを置きます。pdECMバイオインクの複雑な粘度(Pa·s)を、15°Cの一定温度で1から1,000 s-1に増加させるせん断速度で測定します。
      2. ゲル化動態:プレート上にpdECMバイオインクを置きます。4~37°CのpdECMバイオインクの貯蔵率と損失弾性率を5°C/分(タイムスイープモード)で測定して、複雑弾性率(G*)を計算します。
      3. 動的弾性率:pdECMバイオインクをプレート上に37°Cで30分間置き、測定を行います。pdECMバイオインクの周波数依存記憶弾性率(G')と損失弾性率(G'')を、2%の歪みで0.1~100ラッド/sの範囲で測定します。

5. 膵島を用いた膵臓組織構築物の3D細胞印刷

  1. 孤立した小島の調製
    1. 前の作業5で説明したプロトコルに従って、ラットからプライマリ 島を分離します。
    2. 単離された小石から破片と死んだ細胞を分離するには、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を通過させます。直径が70μm未満の島は、死んでいるか異常と見なされます。
    3. 孤立した小島をRPMI-1640培地でサスペンドし、ペトリ皿の上に置きます。バイオセーフティキャビネットの顕微鏡(4x対物レンズ)の下でP200ボリュームピペットを使用して、直径300μmを超える小島を取り外します。
  2. pdECMバイオインクへのアイレットカプセル化
    1. pH調整済みpdECMバイオインクおよび単離された小腸を調製する。
      注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
    2. pdECMバイオインクと懸濁した媒体を、正の変位ピペットを使用して、均一に混合するまで穏やかに混合します(比率3:1)。
      注:pdECMバイオインクの最終濃度は1.5%、pdECMバイオインクの細胞密度は3,000 IEQ/mLです。
  3. 膵組織構造の3D細胞印刷
    1. 殺菌された注射器および22 Gのノズルを準備しなさい。
      注:このゲージは、直径100~250μmの小冊子を印刷するために選択されました。
    2. シリンジにアイレットを積んだpdECMバイオインクをロードします。
    3. 最適化された印刷条件(供給速度:150mm/min;空気圧:15kPa)でバイオインクをラティスの形で18°Cで印刷します。
    4. バイオインクを架橋するには、プリントされたコンストラクトをインキュベーターに30分間置きます。
    5. 10%ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地である島の培養培地に印刷された構造を浸漬する。

6. パターン構造を有する膵構造の3D細胞印刷

  1. バイオインクの2種類の調製
    1. 複数のバイオインクを使用して印刷の汎用性を検証するには、2組のpdECMバイオインクを準備し、それぞれ1:20の比率で各pdECMバイオインクに0.4%のトリパンブルーとローズベンガル溶液を加えて染色します。
      注:pH調整前にゲル化を避けるために、このプロセスは氷上で行う必要があります。
    2. pdECMバイオインクと懸濁した媒体を、正の変位ピペットを使用して、均一に混合するまで穏やかに混合します(比率3:1)。
      注:pdECMバイオインクの最終濃度は1.5%、pdECMバイオインクの細胞密度は3,000 IEQ/mLです。
  2. 多材料系膵組織構築物の3D細胞印刷
    1. 殺菌された注射器および25 Gのノズルを準備する。
    2. 各バイオインク(青と赤)をそれぞれ2つの異なる注射器にロードします。
    3. 最適化された印刷条件(供給速度:150 mm/min;空気圧:15 kPa)でバイオインクを18°Cで印刷し、青と赤の交互の線で格子の形をします。
    4. バイオインクを架橋するには、プリントされたコンストラクトをインキュベーターに30分間置きます。
    5. 10%ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび100 U/mLストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地である島の培養培地に印刷されたコンストラクトを浸漬します。

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Representative Results

膵組織の脱細胞化
pdECMバイオインクを調製し、3Dバイオプリント組織構築物における膵島の機能を高めるための膵臓組織特異的微小環境を提供するプロセスを開発した(2A)。脱細胞化プロセスの後、dsDNAの97.3%を除去し、コラーゲンおよびGAGなどの代表的なECM成分は、それぞれ天然の膵臓組織と比較して1278.1%および96.9%であった(2B)。

バイオインク調製物
印刷プロセスでpdECMを適用するために、pdECM粉末をペプシンで弱酸で可溶化し、10M NaOH溶液を使用して中和した。消化されたpdECM溶液は、細胞培養培地または1x PBSと混合することによって希釈することができる。本研究では、pdECMバイオインクを最終濃度1.5%で調製し、さらなる研究を行った。pdECMバイオインクは、室温下に置いた際に溶液相を維持し、37°Cで30分間インキュベーションした後、瞬時にゲル相に変換した。pdECMバイオインクが島に及ぼす影響を調べるために、単離された小島をpdECM、アルギン酸塩およびコラーゲンバイオインクに1.5%の濃度で封入した。グルコース刺激インスリン分泌試験の結果、pdECMバイオインク中の小島は実験群の中で最も高い指標(約3.174)を表し、広く適用されたヒドロゲルに対する高い機能性を示す。

レオロジー分析
粘度は、印刷可能な生体材料を考慮する際の重要な特性の1つである。15°Cで1~1,000Hzの周波数でpdECMバイオインクの粘度を測定し、各種dECMバイオインク6、7、8印刷しました。pdECMバイオインクはせん断間引き行動を示し、その値はせん断速度で約10Pa·sであり、pdECMバイオインクがノズルを介した押出に適切なレオロジー特性を有していたことを示す(3A)。4〜37°Cの範囲の温度でのゲル化動態は、生理学的に関連する温度におけるpdECMバイオインクのゲル化挙動を示した。温度が15°Cに達すると複雑な弾性率が上昇し始め、温度を37°Cに維持すると急激に上昇し、pdECMバイオインクのゾルゲル転移を示す(3B)。pdECMバイオインクの動的G'およびG"を生理学的に関連する温度で調べ、印刷プロセス後の安定性を確保し、周波数スイープ条件下で安定した弾性率を有する結果となった(3C)。

3Dセル印刷
3D細胞を含む膵臓組織構築物は、マイクロ押出系印刷プロセスを用いて作製した。直径150μm9の完全球状島の組織体積に対応する少なくとも3,000個の島当量(IEQ)を含むコンストラクトを構築するために、10mm x 10mm x 3mmの寸法で構築を設計した(4A)。膵島を印刷するためのプロセスパラメータと条件は、直径100〜250μmの大きさの大きな細胞クラスターである小島をカプセル化するために選択された(4B)。マルチヘッド印刷システムを用いて、青色と赤色の交互線を有する格子の形状などの様々な種類の3Dコンストラクトを、開発したpdECM(4C)を用いて作製し、3Dバイオプリンティングを目的としたpdECMの汎用性を示し、組織様の配置で2種類以上の生細胞を調和させる。

Figure 1
図1:脱細胞化膵組織の開発の概略図、pdECMバイオインクの評価及び3D膵臓組織構築物の製造この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:pdECMの脱細胞化プロセスおよび生化学的特性評価の代表的な画像。(A) 豚膵組織の脱細胞化の概要(B) 天然組織及びpdECMの生化学的アッセイの結果誤差範囲は標準偏差を示します。著作権 (2019) 化学の王立協会5.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:pdECMバイオインクのレオロジー解析(A)せん断間引き行動を示したpdECMおよびコラーゲンバイオインクの粘度。(B)温度変化時のpdECMおよびコラーゲンバイオインクのゲル化動態。(C) 架橋pdECMとコラーゲンバイオインクの複合弾性率。英国王立化学会の著作権 (2019)5.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:3D膵臓組織構築物に対する細胞を含むpdECMバイオインクの3D細胞印刷(A) 3D膵臓組織構築物の寸法。(B)膵島積層および(C)多材料ベースの3D膵臓組織構築物。英国王立化学会の著作権 (2019)5.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルは、pdECMバイオインクの開発と3D細胞印刷技術を用いた3D膵臓組織構築物の製造について説明した。3D工学組織構築物中の標的組織の微小環境を再現するには、バイオインクの選択が重要である。以前の研究では、組織特異的dECMバイオインクが幹細胞分化および増殖10を促進するのに有益であることを検証した。合成ポリマーと比較して、dECMは、組織特異的な組成およびアーキテクチャ11のために細胞有利な環境として機能することができる。したがって、脱細胞化プロセスは、dECM中の主要成分の高い保持のために真剣に考慮されるべきである。

膵組織の脱細胞化のための異なる洗剤の選択は、残留ECM構成成分12を変化させる。脱細胞化の過程で、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の使用がECMタンパク質13の損失に影響を及ぼす可能性があることに気づいた。したがって、トリオン-X 100、または3-[(3-コリンプロピル)ジメチル-ラモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)のような他の特性に比べて比較的過酷な特性を特徴とする多くの洗浄および脱細胞化プロセスで使用されるイオン性界面活性剤であるSDS溶液の処理のステップを排除することにより、以前のプロトコルを変更しました。このプロトコルでは、SDS溶液の代わりに84時間1%Triton-X 100溶液を使用し、GAGやコラーゲンタンパク質を保存しながら細胞成分を効果的に除去することができました。また、IPAによる残留脂質の除去は、pdECMバイオインクの架橋を誘導するための非常に重要なプロセスであり、以前に公開された記事4と同じ文脈で理解できることに留意した。過酢酸溶液による処理は、脱細胞組織の殺菌にも適用した。さらに、脱細胞組織中の残りの洗剤および化学物質の除去は、炎症性宿主応答を防止するための重要なステップである。ただし、このプロトコルではこの問題については説明しませんでした。脱細胞化の終了時に消毒プロセスを含むプロトコルは、脱細胞化材料の生体適合性を向上させる。さらに、洗剤や化学物質を完全に除去するために、評価基準の基準を考慮する必要があります。

ペプシンによるpdECMバイオインクの消化は、コラーゲンタンパク質中のテロペプチド領域の切断により酸性溶液中のpdECM粉末の均質な混合を達成するために行われた。pH調整プロセスでは、pdECMバイオインクを氷上に保持することは、ゲル化の保存に不可欠です。その後、dECMベースのバイオインクの主な利点の1つである37°Cでインキュベートすることにより、ゲル状態に入ることができる物理的に架橋可能なpdECMプレゲルバイオインクを製造することができます。pdECMバイオインクの適切な濃度の選択も重要である10.理想的なバイオインクは、空気圧や温度変化などの印刷プロセス中に発生する外部損傷から細胞を保護する必要があります。せん断力を加えると、細胞に損傷を与え、印刷物10における細胞の生存率が低下する可能性が知られている。また、バイオインクの濃度を高めることは細胞死を誘導し得る5.対照的に、バイオインクの低濃度は、印刷中の印刷性と形状忠実性が悪いことを意味する低粘度を誘導します。バイオインクの粘度をチェックし、その濃度を最適化する必要があります。.

現在、研究者は、3D組織構築物14、15、16を印刷するための様々なタイプの組織由来バイオインクの開発を積極的に研究しています。これらの研究の結果は、バイオインクが細胞に組織特異的な微小環境を提供できることを示している。これらのユニークな条件は、幹細胞の分化または成熟および細胞の増殖を促進することができる。また、マルチヘッド搭載の3Dセル印刷システムを活用することで、複数のタイプのバイオインクを高精度に同時に印刷することが可能です。この手法を使用して、特定のパターンを持つ構造を生成できるため、設計の汎用性を示すことができます。加えて、異なる種類の細胞を各バイオインクにカプセル化して、天然細胞配置17を模倣することが可能である。これらのパターン化された構造は、細胞間相互作用を改善することによって血管化または共培養効果の誘導に利用することができ、これは、特定の細胞18、19の長期生存における重要な要因となり得る。

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Disclosures

なし。

Acknowledgments

この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する国立研究財団(NRF)の生物・医療技術開発プログラム(2017M3A9C6032067)と「ICTコンシレンス・クリエイティブ・プログラム」(IITP-2019-2011-1-00783)によって支援されました。IITP(情報通信技術企画評価研究所)が監修。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinets CRYSTE PURICUBE 1200
Deep Freezer Thermo Scientific Forma 957
Digital orbital shaker DAIHAN Scientific DH.WSO04010
Dry oven DAIHAN Scientific WON-155
Freeze dryer LABCONCO 7670540
Fridge SANSUNG CRFD-1141
Grater ABM 1415605793
Inverted Microscopes Leica DMi1
Microcentrifuge CRYSTE PURISPIN 17R
Microplate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan GO
Mini centrifuge DAIHAN Scientific CF-5
Multi-Hotplate Stirrers DAIHAN Scientific SMHS-6
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-LITE-PR
pH benchtop meter Thermo Fisher Scientific STARA2110
Rheometer TA Instrument Discovery HR-2
Vortex Mixer DAIHAN Scientific VM-10
Cirurgical Instruments
Operating Scissors Hirose HC.13-122
Forcep Korea Ace Scientific HC.203-30
Materials
1.7 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 ml glass vial Scilab SL.VI1243
40 µm cell strainer Falcon 352340
5 L beaker Dong Sung Science SDS 2400
50 mL cornical tube Falcon 352070
500 mL beaker Korea Ace Scientific KA.23-08
500 mL bottle-top vacuum filter Corning 431118
500 mL plastic container LOCK&LOCK INL301
96well plate Falcon 353072
Aluminum foil DAEKYO
Kimwipe Kimtech
Magnetic bar Korea Ace Scientific BA.37110-0003
Mortar and pestle DAIHAN Scientific SC.MG100
Multi-channel pipettor Eppendorf 4982000314
Petri Dish SPL 10100
pH indicator strips Sigma-Aldrich 1095350001
Sieve filter mesh DAIHAN Scientific
Decellularization
10x pbs Hyclone SH30258.01
4.7% Peracetic acid Omegafarm
70% ethanol SAMCHUN CHEMICALS E0220 SAM
Distilled water
IPA SAMCHUN CHEMICALS samchun I0348
Triton-X 100 Biosesang T1020
Biochemical assay
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt Sigma-Aldrich 341088
10 N NaOH Biosesang S2018
Chloramine T Sigma-Aldrich 857319
Chondroitin sulfate A Sigma-Aldrich C4384
Citric acid Supelco 46933
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Glacial acetic acid Merok 100063
Glycine Sigma-Aldrich 410225
HCl Sigma-Aldrich H1758
Na2-EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaCl SAMCHUN CHEMICALS S2097
Papain Sigma-Aldrich p4762
P-DAB Sigma-Aldrich D2004
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421
Sodium acetate Sigma-Aldrich S5636
Sodium hydroxide Supelco SX0607N
Sodium phosphate(monobasic) Sigma-Aldrich RDD007
Toluene Sigma-Aldrich 244511
Bioink
Charicterized FBS Hyclone SH30084.03
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich P7215
Rose bengal Sigma-Aldrich 198250
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154

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References

  1. Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
  2. Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
  3. Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
  4. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
  5. Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
  6. Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
  7. Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
  8. Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
  9. Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
  10. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
  11. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
  12. Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
  13. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
  14. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
  15. La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
  16. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  17. Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
  18. Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
  19. Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).

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バイオエンジニアリング,問題154,バイオインク,3D細胞印刷,膵臓,細胞外細胞外マトリックス,膵移植,1型糖尿病
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Kim, J., Kim, M., Hwang, D. G.,More

Kim, J., Kim, M., Hwang, D. G., Shim, I. K., Kim, S. C., Jang, J. Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs. J. Vis. Exp. (154), e60434, doi:10.3791/60434 (2019).

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