Summary
本稿では、ヒト卵巣癌組織からミトコンドリアを分離し、定量プロテオミクス解析のために卵巣組織を制御する密度勾配遠心分離と組み合わせた微分速度遠心分離のプロトコルを提示し、ヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオメの高品質なミトコンドリアサンプルと高スループットで再現性の高い定量プロテオミクス解析を行う。
Abstract
卵巣癌は、死亡率は高いが分子機構が不明確な一般的な婦人科癌である。ほとんどの卵巣癌は進行期に診断され、治療を深刻に妨げる。ミトコンドリアの変化はヒトの卵巣癌の特徴であり、ミトコンドリアはエネルギー代謝、細胞シグナル伝達、酸化ストレスの中心である。対照卵巣組織と比較した卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオームの変化に関する深い洞察は、卵巣癌の分子機構の深い理解と、効果的で信頼性の高いバイオマーカーおよび治療標的の発見に役立つ。ヒト卵巣癌を解析し、ミトコンドリアプロテオメを制御するために、相対および絶対定量(iTRAQ)定量のための等圧タグと組み合わせた有効なミトコンドリア調製方法がここに提示され、 差動速度遠心分離、密度勾配遠心分離、ミトコンドリアサンプルの品質評価、トリプシンによるタンパク質消化、iTRAQ標識、強カチ交換分画(SCX)、液体クロマトグラフィー(LC)、タンデム質量分析(MS/MS)、データベース分析、ミトコンドリアタンパク質の定量分析。多くのタンパク質は、ヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオームのカバレッジを最大化し、ヒト卵巣癌における微分発現ミトコンドリアタンパク質プロファイルを達成するために正常に同定された。
Introduction
卵巣癌は、死亡率は高いが分子機構が不明確な一般的な婦人科癌である1、2.卵巣癌のほとんどは進行期に診断され、治療を深刻に妨げる。ミトコンドリアの変化はヒト卵巣癌の特徴であり、ミトコンドリアはエネルギー代謝、細胞シグナル伝達、および酸化ストレス3、4、5、6、7の中心である。対照卵巣組織と比較した卵巣癌におけるミトコンドリアプロテオームの変化に関する深い洞察は、卵巣癌の分子機構の深い理解と、効果的で信頼性の高いバイオマーカーおよび治療標的の発見に役立つ。ミトコンドリア代謝が提案され、癌治療の標的として認識されており、抗ミトコンドリア療法は最終的には癌8の再発および転移を予防するために非常に有益であり得る。個々の代謝プロファイリングは、癌階層化および予測戦略9、10のための有用なツールとしても既に実施されている。
本研究の長期的な目標は、卵巣癌と対照卵巣組織との間のミトコンドリアプロテオム改変を解明するための卵巣癌を研究するための定量的ミトコンドリアプロテオミクス法を開発し、使用することであり、その分子ネットワーク変化は、系統的多項角11、12からの分子ネットワーク変化、これはミトコンドリア標的分子バイオマーカーの発見をもたらす予測、および卵巣癌患者のパーソナライズされた治療。相対および絶対定量のための等位タグ(iTRAQ)標識3、4は、ミトコンドリアタンパク質変化を定量する有効な方法である。ヒト卵巣癌および対照卵巣組織からの高品質のミトコンドリアサンプルの調製は、ミトコンドリアプロテオメ3のiTRAQ定量分析の前提条件である。iTRAQ定量プロテオミクスと組み合わせたミトコンドリア製剤は、ミトコンドリアプロテオーム基準マップ3の確立を含むヒト卵巣癌ミトコンドリアプロテオームに関する長期研究プログラムで成功しており、微分発現ミトコンドリアプロファイル4、14およびリン酸化を含む翻訳後修飾の分析は、すでに重要なシグナル経路の発見に至っているヒト卵巣癌におけるネットワーク変化5、エネルギー代謝4の変化を含む、脂質代謝、およびミトファジー経路系3。
これまでの研究では、密度勾配遠心分離と組み合わせた差動速度遠心分離は、ヒト卵巣癌からミトコンドリアを単離および精製し、卵巣組織3、4、5、14を制御する有効な方法である。iTRAQ標識と強いカチオン交換(SCX)-液体クロマトグラフィー(LC)-タンデム質量分析(MS/MS)は、調製されたミトコンドリアサンプルからタンパク質を検出、同定、定量するための重要な技術です。
ここでは、iTRAQ定量プロテオミクスと組み合わせたミトコンドリア調製のための詳細なプロトコルについて説明する。これらは、ヒト卵巣癌組織ミトコンドリアプロテオムの解析に正常に使用されている。プロトコルには、サンプルの調製、微分速度遠心分離、密度勾配遠心分離、ミトコンドリアサンプルの品質評価、トリプシンによるタンパク質消化、iTRAQ標識、SCX分画、LC、MS/MS、データベース検索、ミトコンドリアタンパク質の定量分析が含まれます。さらに、このプロトコルは、他のヒト組織ミトコンドリアプロテオメを分析するために容易に変換する。
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Protocol
卵巣癌組織(n=7)および正常対照卵巣組織(n=11)を含む卵巣組織サンプルがこのプロトコルに使用された。本議定書3、4、5は、中国中南大学の仙陽病院医療倫理委員会によって承認されている。
1. ヒト卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製
- 210 mMマンニトール、70 mMスクロース、100 mM 塩化カリウム(KCl)、50 mM Tris-HCl、1 mMジアミンテトラ酢酸(EDTA)、0.1 mMエチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)テトラ酢酸(EGTA)を混合してミトコンドリア単離バッファーの250mLを調製フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)プロテアーゼ阻害剤、2mMオルソバナジン酸ナトリウム(V)、および0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.4。
- 卵がん組織の~1.5gを清潔なガラス皿に入れます。
- 前冷ミトコンドリア単離バッファーを2mL加え、組織表面3xから血液を軽く洗浄する。
- きれいな眼科用はさみを使用して組織を約1mm3個に完全にミンチし、50mL遠心管に細心組織を移します。
- 0.2 mg/mLのナガエルを含むミトコンドリア単離バッファーを13.5mL加え、電気ホモジナイザーを使用して、ミンチ組織(2分、4°C)を均質化します(スケール2、10 s 6x、間隔10sを使用)。
- 組織ホモジネにミトコンドリア単離バッファーの別の3 mLを追加し、ピペットによってそれらをよく混合します。
- 調製した組織ホモジネートを遠心分離する(1,300 x g,10分,4°)。粗核分画(すなわち、ペレット)を取り除き、上清を保ちます。
- 最近上清を行う(10,000×g、10分、4°)。 ミクロソーム(すなわち、上清)を取り除き、ペレットを保ちます。
- ミトコンドリア分離バッファーを2mL加え、軽ピペットでペレットをうまく再サスペンドします。
- ペレット懸濁液を遠心分離する(7,000 x g,10分, 4 °C)。上清を捨て、粗ミトコンドリア(すなわち、ペレット)を保ちます。
- 抽出した粗ミトコンドリアを再中断するために、25%密度勾配培地(すなわち、ナイコデンツ)の12 mLを追加します。
- 下から上にチューブを充填して不連続密度勾配を作成し、34%の5mL、30%の8 mL、25%の12 mL(ステップ1.11の粗ミトコンドリアを含む)、23%の8 mL、および20%密度培地の3 mL、および遠心分離(52,000 g、90°C)を行います。
- 25%と30%の密度勾配媒体の間の界面で精製されたミトコンドリアをきれいなチューブに集めるために、長くて鈍い注射器を使用してください。
- 採取したミトコンドリアにミトコンドリア単離バッファーを加え、3倍のボリュームに希釈します。遠心分離機(15,000×g、20分、4°)を廃棄し、上清を廃棄する。
- ミトコンドリア単離バッファーを2mL加えてペレットを再サスペンドし、遠心分離機(15,000 x g,20分、4°C)を加えます。上清を捨て、ペレットを保管します。
- 最終的なペレット(すなわち、精製されたミトコンドリア)を収集し、-20°Cで保存します。
注:定量プロテオミクス分析のためのミトコンドリアサンプルとして卵巣癌組織から精製されたすべてのミトコンドリアを組み合わせます。
2. ヒト対照卵巣組織からのミトコンドリアの調製
- ステップ1.1の説明に従ってミトコンドリア単離バッファーの250mLを調製する。
- 通常対照卵巣組織の~1.5gを清潔なガラス皿に入れます。
- 2 mL のプレチルドミトコンドリア単離バッファーを加え、組織表面から血液を軽く洗浄します。
- きれいな眼科用はさみを使用して組織を約1mm3個に完全にミンチし、50mL遠心管に細心組織を移します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.05%トリプシン/20 mM EDTAの8mLを加え、組織や細胞をリゼングしてミトコンドリアを放出する消化(30分、室温)を消化します。次いで遠心分離機(200xg、5分)。 上清を捨て、組織や細胞を保管します。
- 0.2 mg/mLのナガエルを含むミトコンドリア単離バッファーを13.5mL加え、電気ホモジナイザーを使用して、ミンチ組織(2分、4°C)を均質化します(スケール2、10 s 6x、間隔10sを使用)。
- 組織ホモジネにミトコンドリア単離バッファーの別の3 mLを追加し、ピペットによってそれらをよく混合します。
- 調製した組織ホモジネートを遠心分離する(1,300 x g,10分,4°C)。粗核分画(すなわち、ペレット)を取り除き、上清を保ちます。
- 最近上清を行う(10,000×g、10分、4°C)。 ミクロソーム(すなわち、上清)を取り除き、ペレットを保ちます。
- ミトコンドリア分離バッファーを 2 mL 加えて、軽いピペットによってペレットを適切に再スレドします。
- ペレット懸濁液を遠心分離する(7,000 x g,10分, 4 °C)。上清を捨て、粗ミトコンドリア(すなわち、ペレット)を保ちます。
- 抽出した粗ミトコンドリアを再サスペンドするために、25%密度勾配培地の12 mLを追加します。
- 38%の8 mLで下から上にチューブを充填することにより、不連続な密度勾配を作ります。 34%の5mL、30%の8mL、25%の12mL(ステップ2.12からの粗ミトコンドリアを含む)、23%の8mL、および20%密度勾配培地の3mL、及び遠心分離(52,000xg、90分、4°C)。
- 長くて鈍い注射器を使用して、25%から30%の間の界面から34%と38%の間の界面までの範囲で精製されたミトコンドリアをきれいなチューブに集めます。
- 採取したミトコンドリアにミトコンドリア単離バッファーを加え、3倍のボリュームに希釈します。遠心分離機(15,000×g、20分、4°)を廃棄し、上清を廃棄する。
- ミトコンドリア単離バッファーを2mL加えてペレットを再サスペンドし、遠心分離します(15,000 x g,20分、4 °C)。上清を捨て、ペレットを保管します。
- 最終的なペレット(すなわち、精製されたミトコンドリア)を収集し、-20°Cで保存します。
注:定量プロテオミクス分析のためのミトコンドリアサンプルとして対照卵巣組織からすべての精製ミトコンドリアを組み合わせます。
3. 精製組織ミトコンドリア試料の品質検証
- 精製されたミトコンドリアサンプルのチューブ(すなわち、ステップ1.16の卵巣癌組織からのペレットとステップ2.17からのコントロール卵巣組織)を電子顕微鏡(EM)で検証します。
注 : 詳細なプロトコルは、前の15,16で説明しました。 - 8 M尿素、2 M チオレア、40 mM トリス、1 mM EDTA、130 mM ジチオトレイトール (DTT)、および 4% (w:v) 3-(3-コールラミドプロピル) ジメチルアンモニオ)-1-プロパンスルホン酸を混合してミトコンドリアタンパク質抽出バッファーを準備します。pHを8.52に調整します。
- 精製されたミトコンドリアサンプルのチューブ(すなわち、ステップ1.16の卵巣癌組織からのペレットとステップ2.17のコントロール卵巣組織)を取り、ミトコンドリアタンパク質抽出バッファー(ミトコンドリアサンプルをタンパク質抽出バッファーに、1:5)を加えて、ペレットを再サスペンドします。液体窒素3xで試料を凍結し、室温で2時間保存します。
- 12,000 x gで遠心分離し、30分、4°C、上清(すなわち、抽出されたミトコンドリアタンパク質サンプル)を収集し、ビチンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットでタンパク質含有量を測定する。
- 9.08gのトリスと40mLのddH2 Oを混合し、HClを使用してpHを8.8に調整し、ddH2Oを50mLの最終容積に加えて、1.5M Tris-HCl(pH-H.8)の50mLを準備します。4°Cで保管してください。
- 6.06gのトリスと40mLのddH2Oを混合し、HClを使用してpHを6.8に調整し、ddH2Oを50mLの最終容積に加えて、1M Tris-HCl(pH-HCl)の50mLを調製します。4°Cで保管してください。
- アクリルアミド29g、ビスアクリルアミド1g、ddH2O80mLを混合し、ddH2Oを100mLの最終体積に添加して、30%アクリルアミドビス溶液を100mL調製します。茶色のボトルに4°Cで保管してください。
- 10xトリスグリシン電気泳動バッファーの 1,000 mL を調製し、29 gのグリシン、58 gのトリス、3.7 gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および 800 mL の ddH 2 O を ddH2O に加えて、ddH2O を 1,000 mL の最終体積に加えて調製します。
- グリセリン2mL、ブロモフェノールブルー0.02g、SDS0.4g、Tris-HCl pH 6.82mL、ddH2Oの7mLを混合し、ddH2Oを最終体積10mLに加えて、ローディングバッファーを10mLに調製します。
- ddH2Oの4mLを混合してゲルを解き解く10%ドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)の10mLを調製し、 3.3 mLの30%アクリルアミドビス溶液、1.5MトリスHClの2.5 mL(pH 8.8)、10%SDSの0.1 mL、10%過硫酸アンモニウムの0.1mL、およびテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)の0.004 mL。SDS-PAGE解決ゲル溶液をガラス板の間のプレートに、くし底部のレベルまで注ぎます。上にイソプロピルアルコールを2mL加えます。30分間放置します。
- イソプロピルアルコールを取り除き、ddH2O 3xで上部を洗います。ddH2Oの4.1 mL、30%アシラミドビス溶液の1.0 mL、1 MトリスHCl(pH 6.8)の0.75 mL、10%SDSの0.06 mL、10%のアンモニウム過硫酸0.06 mL、および0.06mLを含む5%濃度ゲル溶液を注ぎます。すぐにコンメのゲル溶液に櫛を挿入し、30分間放置し、その後、櫛を取り出します。
- 10x Tris-glycine電気泳動バッファーを ddH2O の 900 mL で 100 mL 希釈して準備し、電気泳動タンクに注ぎます。
- 卵巣癌のミトコンドリアタンパク質の30μgを混合し、ステップ3.4から卵巣組織をローディングバッファで制御し、最終体積20°Lに達し、混合物を5分間沸騰させ、100Vの電圧定数を使用して10%SDS-PAGE分解ゲルで分離します。 ブロンフェノールブルーが底に達したら、電気泳動を停止します。
- 10x Tris-glycine電気泳動バッファーの 150 mL、ddH2O の 1,050 mL、および 300 mL のメタノールを混合して、1.5 L の電気泳動伝達バッファーを準備します。
- PVDF膜を100%メタノールに10分間、電気泳動転写緩衝液に少なくとも5分間浸漬し、5枚の濾紙を1xエクロフォレティック転写緩衝液に少なくとも5分間浸漬する。
- タンパク質を含むSDS-PAGEゲルを取り出し、電気泳動転写緩衝液に10分間浸します。
- 白いプレートに濡れたスポンジ、3枚の湿式濾過紙、PVDF膜、タンパク質を含むSDS-PAGEゲル、湿式濾過紙の2枚、下から上に濡れたスポンジを置いて転写カセットを作ります。気泡は避けてください。
- トランスファーカセットを電気泳動タンクに入れ、電気泳動伝達緩衝液を注ぎ、一定の200mA電流で2時間移動します。
- 10xトリス緩衝生理線(TBS)のストック液を調製し、12.114gのトリス、29.22gのNaClを混合し、ddH2Oを500mLの最終容積に加えて調製します。10x TBSの200 mL、Tween-20の2 mL、ddH2O.100 mLのTBSTと5gのBSAを混合してブロッキング溶液の100 mLを調製して、1x TBSTの2Lを調製します。
- 転写後、PVDF膜を取り出し、TBSTで軽く5分間洗浄し、室温で1時間遮断溶液でブロックします。
- PVDF膜(4°C)を、ラミンB(細胞核;ヤギ抗ヒト抗体1:1,000ブロッキング溶液)、フロチリン-1(細胞膜、ウサギ抗ヒト)を含む異なる細胞内小器官に特異的な異なる一次抗体でインキュベートする。抗体1:500ブロッキング溶液)、COX4I1(ミトコンドリオン;ウサギ抗ヒト1:1,000ブロッキング溶液)、GM130(ゴルジ装置;マウス抗ヒト抗体1:1,000ブロッキング溶液)、カタラゼ(ペルオキシソーム;ウサギ抗ヒト抗体1:1,000ブロッキング)溶液)、およびカテプシンB(リソソーム、ウサギ抗ヒト抗体1:1,000ブロッキング溶液)とする。TBSTで5分間軽く洗います。
- 対応する二次抗体(ウサギ抗ヤギ、ヤギ抗ウサギ、またはヤギ抗マウス)を用して室温でPVDF膜を1時間インキュベートする。TBSTで5分間軽く洗います。エレクトロケミクルミネッセンス(ECL)で可視化します。
4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS分析
メモ:セクション4の詳細な手順は、iTRAQの手順(材料表)を参照してください。
- 精製されたミトコンドリアサンプル(すなわち、ステップ1.16の卵巣癌組織からのペレットとステップ2.17からのコントロール卵巣組織)にSDTバッファー(4%SDS、100 mM Tris pH 7.6、および100 mM DTT)を追加します。目に見える沈殿がなくなるまで試料をボルテックスする。
注:SDTバッファー比に対するミトコンドリアサンプルは1:5でなければなりません。 - SDT処理サンプルを5分間沸騰させ、氷上で試料を冷やし、次いで遠心分離機(2,000 x g、2分)。
- 抽出されたミトコンドリアタンパク質サンプルとして上清を収集し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質含有量を測定します。
- SDT抽出したミトコンドリアタンパク質(各サンプルの200μg)を服用して、トリプシンによる還元、アルキル化、トリプシンによる消化、脱塩、凍結乾燥3、4を行う。サンプルごとに 3 つの反復を実行します。
- ステップ4.4からトリプティックペプチド(各サンプルの100μg)を100mMテトラエチル臭化ド(pH 8.5)で処理し、その指示3、4に従って6プレックスiTRAQ試薬の1つでトリプティックペプチドに標識する。各サンプルに 3x のラベルを付けます。
- 同様に6つの標識されたトリプティックペプチドサンプル(卵巣癌組織から3つ、コントロール卵巣組織から3つ)を混合し、真空濃縮器で乾燥させる。
- SCXクロマトグラフィーを用いた混合iTRAQ標識ペプチドを60画分(1分につき1画分)に分画し、2つの画分をSCX分画サンプル(n=30)として組み合わせます。
- 各SCX分画サンプルを質量分析計3、4の質量分析計でLC-MS/MS分析に対象とし、60分LC分離勾配内のナノLCシステムと組み合わせてMS/MSデータを取得します。
- MS/MS データを検索し、検索エンジン (材料表)でタンパク質を識別します。
- iTRAQレポーターイオン強度を使用して、各タンパク質を定量し、>1.5または<-1.5倍、およびp< 0.05の変化を伴うミトコンドリア微分発現タンパク質(mtDEP)を決定します。
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Representative Results
卵巣癌組織および対照卵巣組織からのミトコンドリアの調製に違いがあった。この研究は、対照卵巣組織3、4からよりも卵巣癌組織からミトコンドリアを調製する方がはるかに簡単であることを発見した。コントロール卵巣組織からのミトコンドリアの調製のためのプロトコルにいくつかの改善を行う必要がありました.まず、組織均質化の前に、ミンチ対照組織に添加したPBS溶液に0.05%トリプシン/20 mM EDTAの8mLを加え、続いて室温で30分間消化し、5分間200gで遠心分離する必要があった(プロトコルステップ2.5参照)。これは、ミトコンドリアの調製を改善しました.第2に、不連続密度勾配は、対照卵巣組織および卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製に対して異なっていた(図1)。卵巣癌組織の場合は、34%の5mL、30%の8mL、25%の12mL(粗ミトコンドリアを含む)、8mL23%、および20%密度勾配培地の3mLをチューブに下から上に加えて調製した。精製されたミトコンドリアは、遠心分離後の25%~30%の界面で発見された(図1A、プロトコルステップ1.12および1.13を参照)。対照卵巣組織の場合は、38%の8mL、34%の5mL、30%の8mL、25%の12mL(粗ミトコンドリアを含む)、8mL23%、および20%密度勾配培地の3mLをチューブに下から上に加えて調製した。この場合、精製されたミトコンドリアは、遠心分離後の34%から38%の間の界面までの範囲であった(図1B、プロトコルステップ2.13および2.14を参照)。
プロトコルは、高品質のミトコンドリアサンプルを隠した。高品質のミトコンドリアサンプルは、定量的ミトコンドリアプロテオミクスの前提条件です。本研究では、EM(図2)とウェスタンブロットを介して微分速度遠心分離と密度勾配遠心分離で調製したミトコンドリアの品質を評価した(WB、図3)。EM画像は、卵巣癌と対照卵巣組織の両方において、少数のペルオキシソームを除いて、単離された主オルガネラがミトコンドリアであることを実証した。ミトコンドリアの形態は、コントロール卵巣組織よりも卵巣癌の方が変化する(図2)。WB画像は、卵巣癌および対照卵巣からの調製されたミトコンドリアサンプルの主要成分が、少量のペルオキシソームを除いてミトコンドリアであることを実証した(図3)。WB結果はEM結果と一致した。ミトコンドリアはペルオキシソーム3、17、18と広範囲に相互作用するため、調製されたミトコンドリアに含まれるのは合理的であり、これはミトコンドリアの機能的完全性を反映している。これらの結果は、調製されたミトコンドリア試料の高品質を実証した。
このプロトコルで調製されたミトコンドリアタンパク質の量は、さらなる分析に十分であった。卵巣癌から十分な量のミトコンドリアサンプルを得て、卵巣組織をコントロールする必要があります。本研究は、7つの卵巣癌組織から調製したミトコンドリア試料と、11対照卵巣組織3から組み合わせた。卵巣癌に対しては合計2,409μgのミトコンドリアタンパク質サンプルが得られ、卵巣組織を制御するためのミトコンドリアタンパク質サンプルは4,440μgであった(表1)。一般に、iTRAQ定量プロテオミクスの場合、各サンプルには少なくとも600μgのタンパク質(各iTRAQ標識あたり200μgタンパク質、3個が複製)が必要です。したがって、調製したミトコンドリアタンパク質サンプルは、iTRAQ定量プロテオミクス解析に十分であった。
定量タンパク質の最大数の達成は、ヒト卵巣癌におけるミトコンドリアの詳細な調査に利益をもたらす。この研究は、2,565個(50.14%)を含む対卵組織と比較して、卵巣癌における5,115個のタンパク質を検出、同定、定量した。アップレギュレーションタンパク質(対照に対する癌の比率 >1)および2,550(49.86%)ダウンレギュレーションタンパク質 (対照に対する癌の比率 <1)3 (表 2)さらに、この研究では、卵巣癌と対照卵巣との間に1,198 mtDEPを決定し、>1.5または<-1.5折りたたみ変化(p < 0.05)、523(43.66%)を含むアップレギュレーションタンパク質および675 (56.34%)ダウンレギュレーションタンパク質4 (表 2)これらのデータは現在、卵巣癌における最大のミトコンドリアプロテオームプロファイルである。
図1:粗ミトコンドリアを卵巣癌(A)および制御卵巣(B)組織に対する不連続密度勾配遠心分離で精製した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:卵巣癌(A)および制御卵巣(B)組織から単離されたミトコンドリアの電子顕微鏡画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:卵巣癌(A)および制御卵巣(B)組織から単離されたミトコンドリアのオルガネラ特異的抗体ベースのウェスタンブロット画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ミトコンドリアタンパク質サンプル | 体積(°L) | 濃度 (φg/μL) | タンパク質 (μg) |
| 卵巣癌組織 | 530 | 4.545 | 2,409 |
| コントロール卵巣組織 | 750 | 5.92 | 4,440 |
表1:調製したミトコンドリアタンパク質サンプルの量。
| カテゴリ | 総タンパク質数* | 微分発現タンパク質の数# |
| アップレギュレーション | 2,565 (50.14%) | 523 (43.66%) |
| ダウンレギュレーション | 2,550 (49.86%) | 675 (56.34%) |
| 合計 | 5,115 (100.0%) | 1,198 (100.0%) |
| *コントロールに対する癌の比率は、アップレギュレーションの場合は>1、ダウンレギュレーションの場合は<1です。 | ||
| #コントロールに対する癌の比率は、アップレギュレーションの場合は >1.5 倍、ダウンレギュレーションの場合は <-1.5 倍です。 | ||
表2:調製したミトコンドリアサンプルからのiTRAQ同定タンパク質の数。
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Discussion
ミトコンドリアの変化は卵巣癌の特徴である。ヒト卵巣癌からの高品質なミトコンドリアサンプルの調製と大規模な定量プロテオミクスの対照組織は、卵巣癌病因におけるミトコンドリア機能の詳細な理解とミトコンドリア分子ネットワークの変化に利益をもたらし、ミトコンドリア4、5、8に基づく標的治療および有効なバイオマーカーのその後の発見のための分子メカニズムを明らかにするのに役立つ。密度勾配遠心分離と組み合わせた微分速度遠心分離は、ヒト卵巣癌および対照卵巣組織から効果的に単離および精製されたミトコンドリアを単離および精製した。調製されたミトコンドリアサンプルは非常に高品質であり、さらなる定量プロテオミクス分析に適していた。
調製したミトコンドリア試料には、少量のペルオキシソーム3、17、18およびサイトソリックタンパク質19、20が含まれていた。ミトコンドリアがより完全に機能するように、直接的または間接的に相互作用したり、ミトコンドリアと付着したりするので、これは単に汚染と考えるべきではありません。研究は、ミトコンドリアがアクチン細胞骨格19、20およびペルオキシソーム17、18と広範囲に相互作用することを発見した。一部の細胞質タンパク質およびペルオキシソームタンパク質が単離されたミトコンドリアサンプルに含まれるのは避けられない。
調製したミトコンドリアサンプルからタンパク質を検出、同定、定量する重要な技術は、iTRAQ標識-SCX-LC-MS/MSであった。本研究では、1,198 mtDEPs4,14を含む5,115個のミトコンドリアタンパク質3を同定および定量した。卵巣癌組織に見られるミトコンドリアタンパク質の数が多いのは、卵巣癌病因におけるミトコンドリアの役割を理解するのに役立つものであり、またミトコンドリア代謝8に基づくパーソナライズされた標的療法の発見のためのリソースであり、さらにはミトコンドリアゲノムに基づく効果的なバイオマーカーを見つけ、 プロテオミクス、および系統的マルチオミックス角度9、11、12、13からのメタボロミクス。さらに、プロテオームにおけるプロテオフォームおよびタンパク質種の概念の導入により、ミトコンドリアプロテオフォームまたはタンパク質種の詳細な探索は、卵巣癌10、21、22に対する有効かつ信頼性の高いバイオマーカーおよび治療標的の発見に直接つながる可能性がある。
さらに、ここで説明するヒト卵巣癌組織ミトコンドリアプロテオムの解析における本プロトコルは、他のヒト疾患ミトコンドリアプロテオムを研究するために容易に翻訳される。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、湖南省百人タレントプラン(X.Z.)、仙陽病院人材紹介基金(XZ)、中国国立自然科学財団(Grant. 81572278およびXZ)、中国からの助成金「863」計画によって支えられました。プロジェクト(助成金番号2014AA020610-1からXZ)、中国湖南省自然科学財団(グラントNo.14JJ7008からXZ)。X.Z.は、本原稿の概念を考案し、ミトコンドリアサンプルのiTRAQ定量プロテオミクスデータを取得し、原稿を書いて改訂し、関連する作業を調整し、財務支援とそれに対応する責任を負った仕事。H.L.はミトコンドリアサンプルを調製した。SQ.は部分的な作業に参加しました。X.H.Zは英語の執筆と編集に参加しました。N.L.はiTRAQプロテオミクスデータを分析した。すべての著者は最終原稿を承認した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
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