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Cancer Research

Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Este artigo apresenta um protocolo de centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrífuga de gradiente de densidade para separar as mitocôndrias dos tecidos humanos de câncer de ovário e controlar os tecidos ovarianos para análise quantitativa de proteômica, resultando em uma amostra mitocondrial de alta qualidade e análise proteômica quantitativa de alta produção e alta reprodutibilidade de um proteoma mitocondrial de câncer de ovário humano.

Abstract

O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas mecanismo molecular pouco claro. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Um método eficaz de preparação mitocondrial juntamente com uma tag isobaric para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) proteômica quantitativa são apresentados aqui para analisar o câncer de ovário humano e controlar proteomas mitocondriais, incluindo centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação de troca de cacionária forte (SCX), cromatografia líquida (LC), espectrometria de massa tandem (MS/ EM), análise de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Muitas proteínas foram identificadas com sucesso para maximizar a cobertura do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano e para alcançar o perfil de proteína mitocondrial expressa diferencialmente em cânceres de ovário humano.

Introduction

O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas claro mecanismo molecular1,2. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo3,4,5,6,7. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Metabolismo mitocondrial tem sido proposto e reconhecido como um alvo para a terapia do câncer, e terapia anticondírica pode finalmente ser muito benéfico para prevenir a recorrência e metástase do câncer8. Perfil metabólico individual também já é praticado como uma ferramenta útil para estratificação do câncer e estratégias preditivas9,10.

O objetivo a longo prazo desta pesquisa é desenvolver e usar um método quantitativo de proteômica mitocondrial para estudar o câncer de ovário para esclarecimento de alterações mitocondriais proteoma entre câncer de ovário e controle de tecidos ovarianos, e suas alterações de rede molecular a partir de um ângulo multi-ômicos sistemático 11,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares orientados para mitocôndrias 13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares direcionados às mitocôndrias13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário, previsão, e tratamento personalizado de pacientes com câncer de ovário. Tags isóbaricas para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) rotulagem3,4 são um método eficaz para quantificar as mudanças de proteína mitocondrial. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e controle dos tecidos ovarianos são o pré-requisito para a análise quantitativa iTRAQ de proteomas mitocondriais3. Preparação mitocondrial juntamente com proteômica quantitativa iTRAQ tem sido usada com sucesso em programas de pesquisa de longo prazo sobre o câncer de ovário humano proteoma mitocondrial, incluindo o estabelecimento de mapas de referência proteoma mitocondrial3, a análise de perfis mitocondriais expressos diferencialmente4,14 e modificações pós-translacionais, incluindo a fosforialização, que já resultou na descoberta de importante via de sinalização mudanças de rede em cânceres de ovário humano5, incluindo alterações no metabolismo energético4,metabolismo lipídico, e mitopgia via sistemas3.

Estudos anteriores descobriram que a centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrifugação de gradiente de densidade é um método eficaz para isolar e purificar as mitocôndrias do câncer de ovário humano e controlar os tecidos ovarianos3,4,5,14. A rotulagem iTRAQ juntamente com forte troca de cromação (SCX) cromatografia líquida (LC)-espectrometria de massa em tandem (MS/MS) é a técnica-chave para detectar, identificar e quantificar as proteínas das amostras mitocondriais preparadas.

Aqui, protocolos detalhados para a preparação mitocondrial juntamente com a proteômica quantitativa iTRAQ são descritos. Estes têm sido utilizados com sucesso na análise de proteomas mitocondriais de tecido de câncer de ovário humano. Os protocolos incluem a preparação de amostras, centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação SCX, LC, MS/MS, pesquisa de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Além disso, este protocolo traduz-se facilmente para analisar outros proteomas mitocondriais do tecido humano.

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Protocol

Amostras de tecido ovariano, incluindo tecidos de câncer de ovário (n = 7) e controle normal tecidos ovarianos (n = 11) foram utilizados para este protocolo. O protocolo atual3,4,5 é aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Xiangya da Universidade Central do Sul, na China.

1. Preparação de mitocôndrias de tecidos humanos de câncer de ovário

  1. Prepare 250 mL do amortecedor mitocondrial da isolação misturando o mannitol de 210 mM, 70 mM sacarose, 100 mM cloreto de potássio (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamina ácido tetraacético (EDTA), 0,1 mM etileno glicol bis (2-aminoetileno ether) ácido tetraástico (EGTA), 1 mMM inibidor da protease de fenilmetanosulfonyl (PMSF), 2 mM ortovanadate de sódio (V) e 0,2% albumina de soro bovina (BSA), pH 7.4.
  2. Coloque ~ 1,5 g de tecidos de câncer de ovário em um prato de vidro limpo.
  3. Adicione 2 mL do amortecedor de isolamento mitocondrial pré-refrigerado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.
  4. Use uma tesoura oftalmocal limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mm3 pedaços, e transfira os tecidos picados em um tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg/mL nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (escala de uso 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 °C).
  6. Adicione mais 3 mL de isolamento mitocondrial tampão no tecido homogeneia e misturá-los bem por pipetting.
  7. Centrífuga o tecido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4 °C). Retire a fração nuclear bruta (ou seja, a pelota) e manter o supernatant.
  8. Recentrifuge o supernatant (10.000 x g,10 min, 4 °C). Retire os microssomos (ou seja, o supernatant) e manter a pelota.
  9. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial e resuspender o poço de pelota por pipetting luz.
  10. Centrífuga a suspensão de pelotas (7.000 x g,10 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha as mitocôndrias cruas (ou seja, a pelota).
  11. Adicione 12 mL de 25% de gradiente de densidade médio (ou seja, Nycodenz) para resuspender as mitocôndrias brutas extraídas.
  12. Faça um gradiente de densidade descontínuo, enchendo um tubo de baixo para cima com 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas do passo 1.11), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de gradiente de densidade médio, e centrífuga -lo (52.000 x g, 90 min, 4 °C).
  13. Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na interface entre o meio de gradiente de densidade de 25% e 30% em um tubo limpo.
  14. Adicione o amortecedor mitocondrial da isolação nas mitocôndrias coletadas para diluí-la a um volume de três vezes. Centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C) e descarte o supernatant.
  15. Adicione 2 mL de isolamento mitocondrial tampão para resuspender a pelota, e centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha a pelota.
  16. Recolher a pelota final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazená-lo em -20 °C.
    NOTA: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido do câncer de ovário como a amostra mitocôndria para análise proteômica quantitativa.

2. Preparação de mitocôndrias de tecidos ovarianos de controle humano

  1. Prepare 250 mL do amortecedor mitocondrial da isolação como descrito na etapa 1.1.
  2. Coloque ~ 1,5 g dos tecidos ovarianos controle normal em um prato de vidro limpo.
  3. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial pré-refrigerado para lavar levemente o sangue da superfície do tecido 3x.
  4. Use uma tesoura oftalmocal limpa para picar totalmente o tecido em cerca de 1 mm3 pedaços, e transfira os tecidos picados em um tubo de centrífuga de 50 mL.
  5. Adicione 8 mL de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA em soro soro lógico amortecida com fosfato (PBS) aos tecidos de controle picados e digere (30 min, temperatura ambiente), o que ajuda a lixir os tecidos e células e liberar mitocôndrias. Em seguida, centrífuga (200 x g, 5 min). Descarte o supernatant, e manter os tecidos e células.
  6. Adicione 13,5 mL de tampão de isolamento mitocondrial contendo 0,2 mg/mL nagarse e, em seguida, use um homogeneizador elétrico para homogeneizar (escala de uso 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) os tecidos picados (2 min, 4 °C).
  7. Adicione mais 3 mL de isolamento mitocondrial tampão no tecido homogeneia e misturá-los bem por pipetting.
  8. Centrífuga o tecido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4°C). Retire a fração nuclear bruta (ou seja, a pelota) e manter o supernatant.
  9. Recentrifuge o supernatant (10.000 x g,10 min, 4°C). Retire os microssomos (ou seja, o supernatant) e manter a pelota.
  10. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para resuspender o poço de pelota por pipetting luz.
  11. Centrífuga a suspensão de pelotas (7.000 x g,10 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha as mitocôndrias cruas (ou seja, a pelota).
  12. Adicione 12 mL de 25% de gradiente de densidade médio para resuspender as mitocôndrias brutas extraídas.
  13. Faça um gradiente de densidade descontínuo, preenchendo um tubo de baixo para cima com 8 mL de 38%, 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas do passo 2,12), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de densidade gradiente médio, e centrífuga -lo (52.000 x g, 90min, C4).
  14. Use uma seringa longa e contundente para coletar as mitocôndrias purificadas na faixa, desde a interface entre 25% e 30% até a interface entre 34% e 38% em um tubo limpo.
  15. Adicione o amortecedor mitocondrial da isolação nas mitocôndrias coletadas para diluí-la a um volume de três vezes. Centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C) e descarte o supernatant.
  16. Adicione 2 mL de tampão de isolamento mitocondrial para resuspender a pelota, e centrífuga (15.000 x g,20 min, 4 °C). Descarte o supernatant e mantenha a pelota.
  17. Recolher a pelota final (ou seja, as mitocôndrias purificadas) e armazená-lo em -20 °C.
    NOTA: Combine todas as mitocôndrias purificadas do tecido ovariano controle como as amostras mitocondriais para análise proteômica quantitativa.

3. Verificação da qualidade das amostras mitocondriais de tecido purificado

  1. Pegue um tubo de amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário do passo 1.16 e os tecidos ovarianos controle do passo 2.17) para verificação com microscopia eletrônica (EM).
    NOTA: O protocolo detalhado foi descrito anteriormente15,16.
  2. Prepare o amortecedor de extração de proteína mitocondrial misturando 8 M ureia, 2 M thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT), e 4% (w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimmethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS). Ajuste o pH para 8,52.
  3. Pegue um tubo de amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário no passo 1.16 e os tecidos ovarianos controle no passo 2.17) e adicione o amortecedor de extração de proteína mitocondrial (amostras mitocondriais ao buffer de extração de proteínas, 1:5) suspender a pelota. Congele as amostras em nitrogênio líquido 3x e guarde à temperatura ambiente por 2 h.
  4. Centrífuga a 12.000 x g,30 min, 4 °C, coletar o supernatant (ou seja, a amostra de proteína mitocondrial extraída), e medir o teor de proteína com um ácido bicinchoninic (BCA) kit de ensaio de proteína.
  5. Prepare 50 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) misturando 9,08 g de Tris e 40 mL de ddH2O, ajustando o pH para 8,8 usando HCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Guarde a 4°C.
  6. Prepare 50 mL de 1 M Tris-HCl (pH 6.8) misturando 6,06 g de Tris e 40 mL de ddH2O, ajustando o pH para 6,8 usando HCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 50 mL. Guarde a 4°C.
  7. Prepare 100 mL de 30% de solução acrilamida-bis misturando 29 g de acrilamida, 1 g de bis-acrilamida e 80 mL de ddH2O, e adicionando ddH2O a um volume final de 100 mL. Guarde-o em uma garrafa marrom a 4 °C.
  8. Prepare 1.000 mL de 10x tris-glicina eletroforese tampão misturando 29 g de glicina, 58 g de Tris, 3,7 g de sulfato dodcyl de sódio (SDS), e 800 mL de ddH2O, e, em seguida, adicionando ddH2O a um volume final de 1.000 mL.
  9. Prepare 10 mL de buffer de carregamento misturando 2 mL de glicerina, 0,02 g de bromofenol azul, 0,4 g de SDS, 2 mL de Tris-HCl pH 6.8 e 7 mL de ddH2O, e depois adicionando ddH2O a um volume final de 10 mL.
  10. Prepare 10 mL de 10% de sulfato dodcyl-poliacrilúfo (SDS-PAGE) resolvendo gel, misturando 4 mL de ddh2O, 3,3 mL de 30% de solução acrilamida-Bis, 2,5 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL de 10% SDS, 0,1 mL de 10% de persulfato de amônio e 0,004 mL de tetrametilenodiamina (TEMED). Despeje o SDS-PAGE resolver a solução de gel na placa entre as placas de vidro para o nível da parte inferior do pente. Adicione 2 mL de álcool isópropcia no topo. Deixe 30 min.
  11. Retire o álcool isópropileno e lave o topo com ddH2O 3x. Despeje a solução de gel de concentração de 5%, contendo 4,1 mL de ddH2O, 1,0 mL de 30% de solução acylide-bis, 0,75 mL de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 mL de 10% SDS, 0,06 mL de 10% de perfato de amônio, e 0,006 mL de TEMED. Insira imediatamente o pente na solução do gel de concentração, deixe para 30 min, e retire então o pente.
  12. Prepare o buffer de eletroforese 1x Tris-glicina diluindo 100 mL de tampão de eletroforese trisglicina 10x com 900 mL de ddH2O e despeje no tanque eletroforético.
  13. Misture 30 μg das proteínas mitocondriais do câncer de ovário e controle os tecidos ovarianos da etapa 3.4 com tampão de carregamento para atingir um volume final de 20 μL. Ferva a mistura por 5 min, em seguida, separá-lo com o gel de resolução de 10% SDS-PAGE usando uma tensão constante de 100 V. Quando o azul bromenil atinge o fundo, pare a eletroforese.
  14. Prepare 1,5 L de tampão de transferência eletroforética misturando 150 mL de tampão de eletroforese 10x Tris-glicina, 1.050 mL de ddH2O e 300 mL de metanol.
  15. Mergulhe a membrana PVDF em 100% metanol por 10 min e no amortecedor de transferência eletroforética por pelo menos 5 min. Mergulhe cinco folhas de papel filtro em 1x tampão de transferência elecrophorética por pelo menos 5 min.
  16. Tire o gel SDS-PAGE contendo as proteínas e mergulhe-o no amortecedor de transferência eletroforética por 10 min.
  17. Faça uma fita de transferência colocando uma esponja molhada na placa branca, três folhas de papel de filtro molhado, a membrana PVDF, o gel SDS-PAGE com as proteínas, duas folhas de papel de filtro molhado e a esponja molhada de baixo para cima. Evite bolhas.
  18. Coloque o de transferência no tanque eletroforético, despeje o amortecedor de transferência eletroforética e, em seguida, transfira para 2 h uma corrente constante de 200 mA.
  19. Prepare a solução de ações saline (TBS) 10x Tris-buffered (TBS) misturando 12.114 g de Tris, 29.22 g de NaCl, e adicionando ddH2O a um volume final de 500 mL. Prepare 2 L de 1x TBST misturando 200 mL de 10x TBS, 2 mL de Tween-20 e 1.798 mL de ddH2O. Prepare 100 mL de solução de bloqueio misturando 100 mL de TBST e 5 g de BSA.
  20. Após a transferência, tirar a membrana PVDF, lavar levemente em TBST por 5 min, em seguida, bloqueá-lo em solução de bloqueio para 1 h à temperatura ambiente.
  21. Incubar a membrana PVDF (4 °C durante a noite) com diferentes anticorpos primários específicos para diferentes organelas subcelulares, incluindo laminado B (núcleo celular; anticorpo anti-humano de cabra 1: 1.000 solução de bloqueio), flotilha-1 (citomembrana; coelho anti-humano solução de bloqueio de anticorpos 1:500), COX4I1 (mitocondrana; solução anti-humana de bloqueio de coelhos 1:1.000), GM130 (aparelho Golgi; anticorpo anti-humano de camundongos 1:1.000 solução de bloqueio), catalase (peróxisoma; anticorpo anti-humano coelho 1:1.000 bloqueio solução), e catepsina B (lisóssoma; coelho anticorpo anti-humano 1:1,000 solução de bloqueio). Lave levemente em TBST por 5 min 3x.
  22. Incubar a membrana PVDF por 1 h à temperatura ambiente com os anticorpos secundários correspondentes (coelho anti-cabra, anti-coelho de cabra ou anti-rato de cabra). Lave levemente em TBST por 5 min 3x. Visualize-o com eletrochemiluminescência (ECL).

4. análise iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

NOTA: Os procedimentos detalhados para a seção 4 referem-se às instruções do iTRAQ(Tabela de Materiais).

  1. Adicione o buffer SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 e 100 mM DTT) às amostras mitocondriais purificadas (ou seja, as pelotas dos tecidos de câncer de ovário do passo 1.16 e os tecidos ovarianos de controle do passo 2.17). Vortex a amostra até que não haja precipitação visível.
    NOTA: A amostra mitocondrial para a relação tampão SDT deve ser 1:5.
  2. Ferva a amostra tratada com SDT por 5 min, arrefecer a amostra no gelo e, em seguida, centrífuga (2.000 x g, 2 min).
  3. Coletar o supernatant como as amostras de proteína mitocondrial extraída e medir o teor de proteína com um kit de ensaio de proteína BCA.
  4. Tome proteínas mitocondriais extraídas por SDT (200 μg de cada amostra) para redução, alquilação, digestão com trippsina, dessalinização e liofofilia3,4. Faça três réplicas para cada amostra.
  5. Trate os peptídeos tépticos (100 μg de cada amostra) a partir do passo 4.4 com a solução de brometo de amônio tetraetilo de 100 mM (pH 8.5), e rotule os peptídeos tépticos com um dos reagentes iTRAQ de 6 plex de acordo com suas instruções3,4. Rotular cada amostra 3x.
  6. Misture igualmente 6 amostras de peptídeo téptico rotulado (três de tecidos de câncer de ovário e três de controle de tecidos ovarianos), e seque com um concentrador de vácuo.
  7. Fracionar os peptídeos misturados com rótulo scq com cromatografia SCX em 60 frações (uma fração por 1 min), em seguida, combinar a cada duas frações como uma amostra scx-fracionado (n = 30).
  8. Sujeitar cada amostra fracionada por SCX à análise LC-MS/MS em um espectrômetro de massa3,4 juntamente com um sistema LC nano dentro de um gradiente de separação lc de 60 min para obter dados de Em/MS.
  9. Pesquise os dados de Em/MS para identificar proteínas com o motor de busca(Tabela de Materiais).
  10. Use as intensidades do repórter-íon do iTRAQ para quantificar cada proteína e determinar proteínas diferencial expressas mitocondrial (mtDEPs) com uma mudança de >1.5 ou <-1.5 vezes, e p < 0.05.

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Representative Results

Houve uma diferença na preparação das mitocôndrias dos tecidos de câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos. Este estudo descobriu que era muito mais fácil preparar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário do que de controle tecidos ovarianos3,4. Algumas melhorias tiveram que ser feitas ao protocolo para a preparação das mitocôndrias dos tecidos ovarianos do controle. Primeiro, antes da homogeneização do tecido, era necessário adicionar 8 mL de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA na solução PBS adicionada aos tecidos de controle picados, seguido sdigestão por 30 minutos à temperatura ambiente, e centrifugação em 200 x g para 5 min (ver protocolo passo 2,5). Isso melhorou a preparação das mitocôndrias. Em segundo lugar, o gradiente de densidade descontínua foi diferente para a preparação das mitocôndrias do controle dos tecidos ovarianos e tecidos de câncer de ovário (Figura 1). Para os tecidos de câncer de ovário foi preparado através da adição de 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de gradiente de densidade médio de baixo para cima em um tubo. As mitocôndrias purificadas foram encontradas na interface entre 25% e 30% após a centrífuga(Figura 1A,ver passos protocolares 1,12 e 1,13). Para o controle dos tecidos ovarianos foi preparado adicionando 8 mL de 38%, 5 mL de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (contendo as mitocôndrias brutas), 8 mL de 23%, e 3 mL de 20% de gradiente de densidade médio de baixo para cima em um tubo. Neste caso, as mitocôndrias purificadas estavam na faixa desde a interface entre 25% e 30% até a interface entre 34% e 38% após a centrífugação(Figura 1B,ver passos protocolares 2,13 e 2,14).

O protocolo obatinou amostras mitocondriais de alta qualidade. Amostras mitocondriais de alta qualidade são o pré-requisito para a proteômica mitocondrial quantitativa. Este estudo avaliou a qualidade das mitocôndrias que foram preparadas com centrífugade de velocidade diferencial e centrifugação gradiente de densidade via EM (Figura 2) e mancha ocidental (WB, Figura 3). As imagens do EM demonstraram que em ambos os cancros ovarianos e controlam tecidos ovarianos as organelas principais isoladas eram mitocôndrias, à exceção de uma quantidade pequena de peroxisomes. A morfologia das mitocôndrias mudou mais em cânceres de ovário do que controlar o tecido ovariano (Figura 2). As imagens de WB demonstraram que o componente principal em amostras mitocondriais preparadas dos cancros ovarianos e dos ovário do controle era mitocôndrias, à exceção de uma quantidade pequena de peroxisomes (figura 3). Os resultados wb foram consistentes com os resultados EM. Era razoável que os peroxisomos fossem contidos em mitocôndrias preparadas, pois as mitocôndrias interagem extensivamente com peroxingos3,17,18,que por sua vez refletem a completude funcional das mitocôndrias. Esses resultados demonstraram a alta qualidade das amostras mitocondriais preparadas.

A quantidade de proteína mitocondrial preparada com este protocolo foi adequada para uma análise mais aprofundada. É necessário obter uma quantidade suficiente de amostras mitocondriais de câncer de ovário e controlar os tecidos ovarianos. Este estudo combinou as amostras mitocondriais preparadas a partir de sete tecidos de câncer de ovário, e de 11 controle de tecidos ovarianos3. Um total de 2.409 μg de amostra mitocondrial de proteína foi obtido para câncer de ovário e 4.440 μg de amostra de proteína mitocondrial para controle do tecido ovariano(Tabela 1). Geralmente, para a proteômica quantitativa iTRAQ, cada amostra precisa de pelo menos 600 proteínas μg (200 μg proteínas por cada rotulagem iTRAQ, 3 replica). Portanto, as amostras de proteína mitocondrial preparadas foram suficientes para a análise quantitativa da proteômica iTRAQ.

A realização do número máximo de proteínas quantificadas beneficia a investigação aprofundada das mitocôndrias no câncer de ovário humano. Este estudo detectou, identificou e quantificou 5.115 proteínas em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano, incluindo 2.565 (50,14%) proteínas upregulated (relação dos cancros aos controles >1) e 2.550 (49.86%) proteínas desreguladas (proporção de cânceres para controles <1)3 (Tabela 2). Além disso, este estudo determinou 1.198 mtDEPs entre cânceres de ovário e ovários de controle com >1.5 ou <-1.5 vezes mudanças (p < 0,05), incluindo 523 (43,66%) proteínas upregulated e 675 (56.34%) proteínas downregulated4 (Tabela 2). Estes dados são atualmente o maior perfil de proteoma mitocondrial no câncer de ovário.

Figure 1
Figura 1: As mitocôndrias brutas foram purificadas com centrífuga de gradiente de densidade descontínua para câncer de ovário (A)e controle ovariano (B)tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Imagem de micrografia eletrônica de mitocôndrias isoladas do câncer de ovário(A)e controle ovariano (B)tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Organelle-specific anticorpo-based imagens borrão ocidental de mitocôndrias isoladas do câncer de ovário (A)e controlar o ovário (B)tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Amostra de proteína mitocondrial Volume (μL) Concentração (μg/μL) Proteínas (μg)
Tecido ovariano do cancro 530 4.545 2,409
Controle o tecido ovariano 750 5.92 4,440

Tabela 1: A quantidade de amostras de proteína mitocondrial preparadas.

Categoria O número de proteínas totais* O número de proteínas expressas diferencialmente#
Regulação up 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Regulação de baixo 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
Total 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
*A proporção de cânceres para controles é >1 para up-regulação, <1 para baixo-regulação.
# A proporção de cânceres em relação aos controles é de 1,5 vezes para a regulação em cima, e a dobre a baixo prazo para a regulação.

Tabela 2: O número de proteínas identificadas pelo iTRAQ a partir de amostras mitocondriais preparadas.

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Discussion

Alterações mitocondriais são uma marca registrada do câncer de ovário. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala beneficia a compreensão aprofundada da função mitocondrial na patogênese do câncer de ovário e alterações na rede molecular mitocondrial, e ajuda a esclarecer seu mecanismo molecular para a descoberta subsequente da terapia alvo e biomarcadores eficazes com base em mitocôndrias4,5,8. A centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrífuga de inclinação de densidade efetivamente isolada e purificada mitocôndrias do câncer de ovário humano e controle dos tecidos ovarianos. As amostras mitocondriais preparadas eram de alta qualidade e eram adequadas para análise sumidiosa mais adicional da proteômica.

As amostras mitocondriais preparadas continham uma pequena quantidade de peroxifusos3,17,18 e proteínas citosólicas19,20. Isso não deve ser simplesmente considerado contaminação, porque eles interagem direta ou indiretamente ou aderem com as mitocôndrias para permitir que as mitocôndrias funcionem mais completamente. Estudos descobriram que as mitocôndrias interagem extensivamente com o citoesqueletoactina 19,20 e peroxisomes17,18. É inevitável que algumas proteínas citossólicas e proteínas peroxisinas sejam contidas em amostras mitocondriais isoladas.

A técnica chave para detectar, identificar e quantificar proteínas das amostras mitocondriais preparadas foi a rotulagem iTRAQ-SCX-LC-MS/MS. Este estudo identificou e quantificou 5.115 proteínas mitocondriais3,incluindo 1.198 mtDEPs4,14. O grande número de proteínas mitocondriais encontradas nos tecidos do câncer de ovário inclui aquelas que podem ajudar a entender o papel das mitocôndrias na patogênese do câncer de ovário e também ser um recurso para a descoberta de terapia de destino personalizada com base no metabolismo mitocondrial8, e até mesmo encontrar biomarcadores eficazes com base na genômica mitocondrial, proteômica e metaônômica de um ângulo multi-ômicos sistemático sistemático9,11,12,13. Além disso, com a introdução de conceitos proteofornos e de espécies de proteínas no proteoma, a exploração aprofundada de proteoforas mitocondriais ou espécies proteicas pode levar diretamente à descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos para câncer de ovário10,21,22.

Além disso, os protocolos atuais na análise dos proteomas mitocondriais do tecido ovariano humano descritos aqui são traduzidos facilmente para estudar outros proteomas mitocondriais da doença humana.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Hunan Provincial Hundred Talent Plan (para X.Z.), o Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), a National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 e 81272798 to XZ), as doações da China "863" Plan Projeto (Grant No. 2014AA020610-1 para XZ), e a Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. concebeu o conceito para o presente manuscrito, obteve os dados de proteômica quantitativa iTRAQ de amostras de mitocôndrias, escreveu e revisou o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável pelo apoio financeiro e correspondente Trabalho. H.L. preparou amostras de mitocôndrias. A S.Q. participou de trabalhos parciais. X.H.Z participou de escrever e editar o idioma inglês. N.L. analisou os dados de proteômica iTRAQ. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

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References

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Pesquisa do câncer Edição 153 câncer de ovário mitocôndrias centrífuga de velocidade diferencial centrifugação gradiente de densidade tag isobaric para rotulagem relativa e quantificação absoluta (iTRAQ) forte troca de cation (SCX) cromatografia líquida (LC) espectrometria de massa tandem (MS/MS) proteoma mitocôndrial
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Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

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