Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Подготовка митохондрий из тканей рака яичников и контроль тканей яичников для количественного анализа протеомики

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

В этой статье представлен протокол центрифугирования дифференциальной скорости в сочетании с центрифугированием градиента плотности, чтобы отделить митохондрии от тканей рака яичников человека и контролировать ткани яичников для количественного анализа протеомики, в результате высококачественный митохондриальный образец и высокой пропускной и высокой воспроизводимости количественного анализа протеомики рака яичников митохондриального протеома.

Abstract

Рак яичников является распространенным гинекологическим раком с высокой смертностью, но неясным молекулярным механизмом. Большинство раковых заболеваний яичников диагностируются в продвинутой стадии, что серьезно затрудняет терапию. Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников человека, и митохондрии являются центрами энергетического метаболизма, сигнализации клеток и окислительного стресса. Глубокое понимание изменений митохондриального протеома при раке яичников по сравнению с контролем тканей яичников поможет углубленное понимание молекулярных механизмов рака яичников, а также открытие эффективных и надежных биомаркеров и терапевтических целей. Эффективный метод митохондриальной подготовки в сочетании с изоббарической меткой для относительной и абсолютной количественной протеомики (iTRA) представлены здесь для анализа рака яичников человека и контроля митохондриальных протео, включая дифференциальную скорость центрифугирования, центрифугирование градиента плотности, оценку качества образцов митохондриального, пищеварение белка с трипсином, маркировку iTRA, сильную фракционность обмена катиона (SCX), жидкую хроматографию (LC), тандемную масс-спектрометрию (MS/ MS), анализ баз данных и количественный анализ митохондриальных белков. Многие белки были успешно определены, чтобы максимизировать охват рака яичников человека митохондриального протеома и для достижения дифференциально выраженный профиль митохондриального белка в раке яичников человека.

Introduction

Рак яичников является распространенным гинекологическим раком с высокой смертностью, но неясным молекулярным механизмом1,2. Большинство случаев рака яичников диагностируется на продвинутой стадии, что серьезно затрудняет терапию. Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников человека, и митохондрии являются центрами энергетического метаболизма, сигнализации клеток, и окислительного стресса3,4,5,6,7. Глубокое понимание изменений митохондриального протеома при раке яичников по сравнению с контролем тканей яичников поможет углубленное понимание молекулярных механизмов рака яичников, а также открытие эффективных и надежных биомаркеров и терапевтических целей. Митохондриальный метаболизм был предложен и признан в качестве мишени для терапии рака, и антимитохондриальная терапия может в конечном итоге быть очень полезным для предотвращения рецидива и метастазирования рака8. Индивидуальное метаболическое профилирование также уже практикуется как полезный инструмент для стратификации рака и прогностических стратегий9,10.

Долгосрочная цель этого исследования заключается в разработке и использовании количественного метода митохондриальной протеомики для изучения рака яичников для уточнения изменений митохондриального протеома между раком яичников и контроля тканей яичников, и их молекулярные изменения сети от систематического угла мультиомики11,12, что приведет к открытию митохондрий целевых молекулярных биомаркеров13 для уточнения молекулярных механизмов рака яичников, прогнозирование и персонализированное лечение больных раком яичников. Изобарические метки для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA) маркировки3,4 являются эффективным методом количественной оценки изменений митохондриального белка. Приготовление высококачественных образцов митохондрий из рака яичников человека и контроль тканей яичников являются необходимым условием для количественного анализа митохондриальных протеом3. Митохондриальная подготовка в сочетании с iTRA' количественной протеомики была успешно использована в долгосрочных исследовательских программ о человеческом раке яичников митохондриальной протеоме, в том числе создание митохондриальной протеомей3, анализ дифференциально выраженных митохондриальных профилей4,14 и пост-трансляционных модификаций, в том числе фосфогенных изменения сети в рака яичников человека5, в том числе изменения в энергетическом метаболизме4, липидный метаболизм, и митофагии пути-системы3.

Предыдущие исследования показали, что дифференциальная скорость центрифугирования в сочетании с плотностью градиента центрифугирования является эффективным методом для изоляции и очистки митохондрий от рака яичников человека и контроля тканей яичников3,4,5,14. Маркировка iTRA' в сочетании с сильным обменом катионов (SCX)-жидкой хроматографии (LC)-тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) является ключевым методом для обнаружения, идентификации и количественной оценки белков из подготовленных образцов митохондрий.

Здесь описаны подробные протоколы для митохондриальной подготовки в сочетании с количественной протеомикой iTRA. Они успешно используются в анализе человеческих раковых опухолей ткани митохондриальных протеомов. Протоколы включают в себя подготовку образцов, дифференциальную скорость центрифугирования, центрифугирование градиента плотности, оценку качества митохондриальных образцов, пищеварение белка с трипсином, маркировку iTRA, фракционацию SCX, LC, MS/MS, поиск базы данных и количественный анализ митохондриальных белков. Кроме того, этот протокол легко переводится для анализа других человеческих тканей митохондриальных протеомов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для этого протокола были использованы образцы тканей яичников, включая ткани рака яичников (n No 7) и нормальные ткани яичников (n No 11). Настоящий протокол3,4,5 одобрен Комитетом по медицинской этике больницы Сянькья Центрального южного университета, Китай.

1. Подготовка митохондрий из тканей рака яичников человека

  1. Подготовка 250 мл буфера изоляции митохондриальной путем смешивания 210 мМ маннитол, 70 мм сахарозы, 100 мм хлорид калия (KCl), 50 мм Tris-HCl, 1 мМ диамин тетраацетическая кислота (EDTA), 0,1 мм этилен гликоль бис (2-аминоэтил эфир)тетраацетической кислоты (EGTA), 1 мм фенилметанесульфонил фторид (PMSF) ингибитор протеазы, 2 мМ ортованадат натрия (V), и 0,2% бычьей сыворотки альбумина (BSA), рН 7.4.
  2. Поместите 1,5 г тканей рака яичников в чистую стеклянную тарелку.
  3. Добавьте 2 мл предварительно охлажденных митохондриальных изоляционных буферов, чтобы слегка вымыть кровь с поверхности ткани 3x.
  4. Используйте чистые офтальмологические ножницы, чтобы полностью измельчить ткань примерно на 1 мм3 части, и перенести фарш ткани в 50 мл центрифуги трубки.
  5. Добавьте 13,5 мл буфера изоляции митохондриальной изоляции, содержащего 0,2 мг/мл нагарсе, а затем используйте электрический гомогенизатор для гомогениза (использовать шкалу 2, 10 с 6x, интервал 10 с) рубленые ткани (2 мин, 4 кв с).
  6. Добавить еще 3 мл митохондриального буфера изоляции в ткани гомогенатов и хорошо перемешать их путем пипетки.
  7. Центрифуге подготовленной ткани гомената (1300 х г,10 мин, 4 КК). Удалите сырую ядерную фракцию (т.е. гранулы) и сохраните супернатант.
  8. Recentrifuge supernatant (10,000 x g,10 min, 4 c). Удалите микросомы (т.е. супернатант) и сохраните гранулы.
  9. Добавьте 2 мл буфера изоляции митохондриальной изоляции и отдохните гранулы хорошо легким пипеттингом.
  10. Centrifuge гранулы суспензии (7000 х г,10 мин, 4 КК). Откажитесь от супернатанта и сохраните грубые митохондрии (т.е. гранулы).
  11. Добавьте 12 мл 25% среды градиента плотности (т.е. Nycodenz), чтобы повторно приостановить извлеченные сырые митохондрии.
  12. Сделать прерывистой градиент плотности, заполнив трубку снизу вверх с 5 мл 34%, 8 мл 30%, 12 мл 25% (содержащие сырой митохондрии от шага 1.11), 8 мл 23%, и 3 мл 20% плотность градиента среды, и центрифуга его (52,000 х г, 90 мин, С 4).
  13. Используйте длинный и тупой шприц для сбора очищенных митохондрий на стыке между 25% и 30% плотность градиента среды в чистую трубку.
  14. Добавьте буфер митохондриальной изоляции в собранные митохондрии, чтобы разбавить его до трехкратного объема. Центрифуга (15000 х г,20 мин, 4 кв с) и отбросить супернатант.
  15. Добавьте 2 мл буфера изоляции митохондрий, чтобы приостановить работу гранул, и центрифугу (15 000 х г,20 мин, 4 кв. C). Откажитесь от супернатанта и держите гранулы.
  16. Соберите окончательные гранулы (т.е. очищенные митохондрии) и храните его при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте все очищенные митохондрии из ткани рака яичников в качестве образца митохондрий для количественного анализа протеомики.

2. Подготовка митохондрий из тканей яичников управления человеком

  1. Подготовьте 250 мл буфера изоляции митохондрий, как описано в шаге 1.1.
  2. Поместите 1,5 г нормальной контрольной ткани яичников в чистую стеклянную тарелку.
  3. Добавьте 2 мл предварительно охлажденных митохондриальных изоляционных буферов, чтобы слегка вымыть кровь с поверхности ткани 3x.
  4. Используйте чистые офтальмологические ножницы, чтобы полностью измельчить ткань примерно на 1 мм3 части, и перенести фарш ткани в 50 мл центрифуги трубки.
  5. Добавьте 8 мл 0,05% трипсина/20 мМ EDTA в фосфатно-буферный солен (PBS) в фарш контрольные ткани, и дайджест (30 мин, комнатная температура), которая помогает лизать ткани и клетки и высвобождение митохондрий. Затем центрифуга (200 х г,5 мин). Откажитесь от супернатанта, и сохранить ткани и клетки.
  6. Добавьте 13,5 мл буфера изоляции митохондриальной изоляции, содержащего 0,2 мг/мл нагарсе, а затем используйте электрический гомогенизатор для гомогениза (использовать шкалу 2, 10 с 6x, интервал 10 с) рубленые ткани (2 мин, 4 кв с).
  7. Добавить еще 3 мл митохондриального буфера изоляции в ткани гомогенатов и хорошо перемешать их путем пипетки.
  8. Центрифуге подготовленной ткани гомената (1300 х г,10 мин, 4 градусов по Цельсию). Удалите сырую ядерную фракцию (т.е. гранулы) и сохраните супернатант.
  9. Recentrifuge супернатант (10,000 x g,10 мин, 4'C). Удалите микросомы (т.е. супернатант) и сохраните гранулы.
  10. Добавьте 2 мл буфера изоляции митохондриальной изоляции, чтобы хорошо приостановить гранулы легким пипеттингом.
  11. Centrifuge гранулы суспензии (7000 х г,10 мин, 4 КК). Откажитесь от супернатанта и сохраните грубые митохондрии (т.е. гранулы).
  12. Добавьте 12 мл 25% градиентной среды плотности, чтобы приостановить добычу сырой митохондрии.
  13. Сделать прерывистой градиент плотности, заполнив трубку снизу вверх с 8 мл 38%, 5 мл 34%, 8 мл 30%, 12 мл 25% (содержащие сырой митохондрии от шага 2.12), 8 мл 23%, и 3 мл 20% плотность градиента среднего, и центрифуга это (52,00 c0 c0).
  14. Используйте длинный и тупой шприц для сбора очищенных митохондрий в диапазоне от интерфейса от 25% до 30% до интерфейса между 34% и 38% в чистую трубку.
  15. Добавьте буфер митохондриальной изоляции в собранные митохондрии, чтобы разбавить его до трехкратного объема. Центрифуга (15000 х г,20 мин, 4 кв с) и отбросить супернатант.
  16. Добавьте 2 мл буфера изоляции митохондрий, чтобы приостановить гранулы, и центрифугиего (15000 х г,20 мин, 4 кв С). Откажитесь от супернатанта и держите гранулы.
  17. Соберите окончательные гранулы (т.е. очищенные митохондрии) и храните его при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте все очищенные митохондрии из контрольной ткани яичников в виде митохондриальных образцов для количественного анализа протеомики.

3. Проверка качества очищенных образцов митохондриальных тканей

  1. Возьмите трубку очищенных образцов митохондриального (т.е. гранулы из тканей рака яичников со ступени 1.16 и контрольные ткани яичников со ступени 2.17) для проверки с помощью электронной микроскопии (ЭМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол был описан ранее15,16.
  2. Подготовьте буфер экстракции митохондриального белка, смешав 8 M мочевины, 2 М тиуреа, 40 мм Трис, 1 мМ ЭДТА, 130 мМ дитиотрейтол (ДТТ) и 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) диметилламмонио (CHAPS). Отрегулируйте рН до 8.52.
  3. Возьмите трубку очищенных образцов митохондриального (т.е. гранулы из тканей рака яичников в шаге 1.16 и контроль тканей яичников в шаге 2.17) и добавить митохондриальный буфер экстракции белка (митохондриальные образцы для белка эксцвизии буфера, 1:5) приостановить гранулы. Заморозить образцы в жидком азоте 3x и хранить при комнатной температуре в течение 2 ч.
  4. Центрифуга на 12000 х г, 30 мин, 4 КК, собирать супернатант (т.е. извлеченный образец митохондриального белка), и измерить содержание белка с bicinchoninic кислоты (BCA) белка анализ комплект.
  5. Приготовьте 50 мл 1,5 М Tris-HCl (pH 8.8), смешивая 9,08 г Tris и 40 мл ddH2O, регулируя рН до 8,8 с помощью HCl и добавляя ddH2O до окончательного объема 50 мл. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  6. Приготовьте 50 мл 1 M Tris-HCl (pH 6.8), смешивая 6,06 г Tris и 40 мл ddH2O, регулируя рН до 6,8 с помощью HCl и добавляя ddH2O до окончательного объема 50 мл. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  7. Приготовьте 100 мл 30% раствора акриламида-биса, смешивая 29 г акриламида, 1 г бис-акриламида и 80 мл ddH2O и добавляя ddH2O до окончательного объема 100 мл. Храните его в коричневой бутылке при 4 градусах Цельсия.
  8. Приготовьте 1000 мл 10-кратного трехглицина электрофореса буфера путем смешивания 29 г глицина, 58 г Трис, 3,7 г сульфата натрия (SDS), и 800 мл ddH2O, а затем добавить ddH2O до окончательного объема 1,000 мл.
  9. Приготовьте 10 мл погрузочного буфера путем смешивания 2 мл глицерина, 0,02 г бромофенола синего, 0,4 г SDS, 2 мл Tris-HCl pH 6,8 и 7 мл ddH2O, а затем добавляя ddH2O до окончательного объема 10 мл.
  10. Подготовка 10 мл 10% натрия dodecyl сульфат-полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE) разрешителяя гель путем смешивания 4 мл ddH2O, 3,3 мл 30% раствора акриламида-Биса, 2,5 мл 1,5 М Трис-Хкл (pH 8.8), 0,1 мл 10% SDS, 0,1 мл 10% аммиакпера и 0,004 мл тетраметилметилениамин (TEMED). Налейте растворяющийся гель растворный раствор SDS-PAGE в тарелку между стеклянными пластинами до уровня нижней части гребня. Добавьте 2 мл изопропилового спирта сверху. Оставьте на 30 мин.
  11. Удалите изопропиловый спирт и вымойте верхнюю часть ddH2O 3x. Налейте 5% раствор концентрации геля, содержащий 4,1 мл ddH2O, 1,0 мл 30% ациламид-бис раствор, 0,75 мл 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 0,06 мл 10% SDS, 0,06 мл 10% аммония persulfate, и 0,00L6 mMED. Сразу вставьте гребень в раствор концентрационного геля, оставьте на 30 мин, а затем выняйте гребень.
  12. Подготовьте 1x буфер электрофореза 1x Tris-glycine путем разбавления 100 мл 10x Tris-glycine электрофорекс буфер амфорус с 900 мл ddH2O и налить в электрофоретический бак.
  13. Смешайте 30 мкг митохондриальных белков от рака яичников и контролировать ткани яичников от шага 3.4 с погрузочным буфером, чтобы достичь конечного объема 20 qL. Отварить смесь в течение 5 минут, затем отделить его с 10% SDS-PAGE растворяя гель с помощью постоянного напряжения 100 В. Когда bromphenol синий достигает дна, остановить электрофорус.
  14. Приготовьте 1,5 л электрофоретической переносного буфера, смешивая 150 мл 10-x трехглицина электрофорексбуфера, 1050 мл ddH2O и 300 мл метанола.
  15. Замочите мембрану PVDF в 100% метаноле в течение 10 мин и в электрофоретический буфер передачи, по крайней мере 5 мин. Замочите пять листов фильтровальной бумаги в 1x элекрогоретический буфер передачи, по крайней мере 5 мин.
  16. Вынизвините гель SDS-PAGE, содержащий белки, и замочите его в электрофоретический буфер передачи в течение 10 минут.
  17. Сделайте кассету передачи, поместив влажную губку на белую тарелку, три листа влажной фильтровальной бумаги, мембрану PVDF, гель SDS-PAGE с белками, два листа влажной фильтровальной бумаги и влажную губку снизу вверх. Избегайте пузырьков.
  18. Поместите переносную кассету в электрофоретический бак, влейте электрофоретический переносной буфер, а затем перенесите на 2 ч под постоянным током 200 мА.
  19. Приготовьте 10x Tris-буферизированный солен (TBS) штоковый раствор, смешивая 12,114 г Tris, 29,22 г NaCl и добавляя ddH2O до окончательного объема 500 мл. Подготовка 2 L 1x TBST путем смешивания 200 мл 10x TBS, 2 мл Tween-20, и 1798 мл ddH2O. Подготовка 100 мл блокирующего раствора путем смешивания 100 мл TBST и 5 г BSA.
  20. После передачи выняйте мембрану PVDF, слегка промойте в TBST в течение 5 минут, затем заблокируйте ее в блокирующем растворе на 1 ч при комнатной температуре.
  21. Инкубировать мембрану PVDF (4 кВ ночь) с различными первичными антителами, специфическими для различных субклеточных органелл, включая ламин B (клеточное ядро; коза античеловеческое антитело 1: 1000 блокирующий раствор), флотилий-1 (цитомембран; кролик анти-человеческий антитела 1:500 блокирующий раствор), COX4I1 (митохондрион; кролик анти-человеческий 1:1,000 блокирующий раствор), GM130 (аппарат Golgi; мышь античеловеческое антитело 1:1,000 блокирующий раствор), каталаза (пероксисома; кролик анти-человеческое антитело 1:1,000 блокирующее раствор), и катепсин B (лисососома; кролик анти-человеческое антитело 1:1,000 блокирующий раствор). Слегка промыть в TBST в течение 5 мин 3x.
  22. Инкубировать мембрану PVDF на 1 ч при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами (кролик антикозла, козла анти-кролика, или коза анти-мышь). Слегка промыть в TBST в течение 5 мин 3x. Визуализируйте его с электрохимилюминесценцией (ECL).

4. анализ iTRA-SCX-LC-MS/MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры для раздела 4 относятся к инструкциям iTRA (Таблица материалов).

  1. Добавьте sDT буфер (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 и 100 mM DTT) к очищенным митохондриальным образцам (т.е. гранулы из тканей рака яичников от ступени 1.16 и контрольные ткани яичников от шага 2.17). Вихрь образца до тех пор, пока не будет видимых осадков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение митохондриального образца к буферу SDT должно составить 1:5.
  2. Отварить обработанный ПДТ образец в течение 5 мин, охладить образец на льду, а затем центрифугу (2000 х г,2 мин).
  3. Соберите супернатант в виде извлеченных образцов митохондриального белка и измерьте содержание белка с помощью набора протеинов BCA.
  4. Возьмите SDT-извлеченные митохондриальные белки (200 мкг каждого образца) для сокращения, алкилирования, пищеварения с трипсином, опреснением и лиофилизацией3,4. Сделайте три реплики для каждого образца.
  5. Лечить триптических пептидов (100 мкг каждого образца) со ступени 4.4 с 100 мМ тетраэтил аммония бромистый раствор (pH 8.5), и этикетки триптических пептидов с одним из 6-плюрекс iTRA' реагентов в соответствии с его инструкциями3,4. Этикетка каждого образца 3x.
  6. Смешайте одинаково 6 помеченных проб триптических пептидов (три из тканей рака яичников и три из контрольных тканей яичников), и сухой с вакуумным концентратором.
  7. Фракция смешанных пептидов с маркировкой iTRA' с хроматографией SCX на 60 фракций (одна фракция на 1 мин), затем объединить каждые две фракции в качестве фракционированного образца SCX (n no 30).
  8. Подвергайте каждый образец SCX фракционному анализу LC-MS/MS на масс-спектрометре3,4 в сочетании с системой nano LC в 60-минутном градиенте lc для получения данных MS/MS.
  9. Поиск MS / MS данные для идентификации белков с поисковой системой (Таблица материалов).
  10. Используйте интенсивность репортера-ионного iTRA, чтобы количественно определить каждый белок и определить митохондриальные дифференциально выраженные белки (мтДЕП) со сменой на 1,5 или lt;-1,5 раза, и p qlt; 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Существовала разница в подготовке митохондрий из тканей рака яичников и контроля тканей яичников. Это исследование показало, что было гораздо легче подготовить митохондрии из тканей рака яичников, чем из контроля тканей яичников3,4. Некоторые улучшения должны были быть сделаны в протокол для подготовки митохондрий из контрольных тканей яичников. Во-первых, до гомогенизации тканей, необходимо было добавить 8 мл 0,05% трипсина/20 мМ EDTA в раствор PBS, добавленный в фарш контрольные ткани, а затем пищеварение в течение 30 мин при комнатной температуре, и центрифугирование при температуре 200 х г в течение 5 мин (см. протокол шаг 2.5). Это улучшило подготовку митохондрий. Во-вторых, прерывистое градиент плотности отличался для подготовки митохондрий от контроля тканей яичников и тканей рака яичников(рисунок 1). Для тканей рака яичников он был подготовлен путем добавления 5 мл 34%, 8 мл 30%, 12 мл 25% (содержащие сырые митохондрии), 8 мл 23%, и 3 мл 20% плотность градиента среды снизу вверх в трубке. Очищенные митохондрии были обнаружены на стыке между 25% и 30% после центрифугации(рисунок 1А,см. протокольные шаги 1.12 и 1.13). Для контроля тканей яичников он был подготовлен путем добавления 8 мл 38%, 5 мл 34%, 8 мл 30%, 12 мл 25% (содержащие сырой митохондрии), 8 мл 23%, и 3 мл 20% плотность градиентной среды от дна до вершины в трубке. В этом случае очищенные митохондрии находились в диапазоне от интерфейса от 25% до 30% до интерфейса между 34% и 38% после центрифугации(рисунок 1B, см. протокол ьсм. действия протокола 2.13 и 2.14).

Протокол обязывает высококачественные образцы митохондрий. Высококачественные митохондриальные образцы являются необходимым условием для количественной митохондриальной протеомики. Это исследование оценивало качество митохондрий, которые были подготовлены с дифференциальной скоростью центрифугирования и плотности градиентцентрии центрифугирования через EM (Рисунок 2) и Западной пятно (WB, Рисунок 3). Em изображения показали, что как в раке яичников и контроля тканей яичников основные органеллы изолированы были митохондрии, за исключением небольшого количества пероксисом. Морфология митохондрий изменилась больше при раке яичников, чем контроль над тканями яичников(рисунок 2). Изображения ВБ показали, что основным компонентом в подготовленных образцах митохондрий от рака яичников и контрольных яичников были митохондрии, за исключением небольшого количества пероксисом(рисунок 3). Результаты ВБ соответствовали результатам EM. Было разумно, чтобы пероксисомы содержались в подготовленных митохондриях, потому что митохондрии активно взаимодействуют с пероксисомами3,17,18, которые, в свою очередь, отражают функциональную полноту митохондрий. Эти результаты продемонстрировали высокое качество подготовленных образцов митохондрий.

Количество митохондриального белка, подготовленного с помощью этого протокола, было достаточным для дальнейшего анализа. Необходимо получить достаточное количество образцов митохондрий от рака яичников и контролировать ткани яичников. Это исследование объединило митохондриальные образцы, подготовленные из семи тканей рака яичников, и из 11 контрольныхтканейяичников 3 . В общей сложности было получено 2409 мкг образца митохондриального белка при раке яичников и 4440 мкг образца митохондриального белка для контроля тканей яичников(таблица 1). Как правило, для количественной протеомики iTRA, каждый образец нуждается по крайней мере 600 мкг белков (200 мкг белков на каждую маркировку iTRA, 3 репликации). Таким образом, подготовленные образцы митохондриального белка были достаточными для количественного анализа протеомики iTRA.

Достижение максимального количества количественных белков приносит пользу углубленного исследования митохондрий при раке яичников человека. Это исследование выявило, идентифицировало и количественно определило 5115 белков при раке яичников по сравнению с контролем тканей яичников, в том числе 2565 (50,14%) upregulated протеины (отношение раков к управлению nogt;1) и 2.550 (49.86%) вниз регулируемых белков (отношение раковых заболеваний к контролю злт;1)3 (Таблица 2). Кроме того, это исследование определило 1198 mtDEPs между раком яичников и контроля яичников с йgt;1.5 или lt;-1,5 раз изменения (р/ 0,05), в том числе 523 (43,66%) вверх регулируемых белков и 675 (56.34%) вниз регулируемых белков4 (Таблица 2). Эти данные в настоящее время являются крупнейшим митохондриальным протеомом профиля в рак яичников.

Figure 1
Рисунок 1: Сырые митохондрии были очищены с прерывистой плотности градиентцентрии для рака яичников (A) и контроль яичников (B) тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Электронный микрограф изображение митохондрий, изолированных от рака яичников (A) и контроль яичников (B) тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Органелл-специфические антитела на основе западных помот изображений митохондрий изолированы от рака яичников (A) и контролировать ткани яичников (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Образец митохондриального белка Объем (КЛ) Концентрация (мкг/л) Белки (мкг)
Раковая ткань яичников 530 4.545 2,409
Контроль тканей яичников 750 5.92 4,440

Таблица 1: Количество подготовленных образцов митохондриального белка.

Категории Количество всего белков Количество дифференциальновыраженных белков
Вверх-регулирование 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Даун-регуляция 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
Общая 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
«Соотношение раковых заболеваний к контролю является nogt;1 для до-регулирования, lt;1 для вниз-регулирования.
# Соотношение раковых заболеваний к элементам управления составляет 1,5 раза для до регулирования, и lt;-1,5 раза для вниз регулирования.

Таблица 2: Количество идентифицированных iTRA- белков из подготовленных образцов митохондрий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников. Приготовление высококачественных образцов митохондриального из рака яичников человека и контрольных тканей для крупномасштабной количественной протеомики способствует глубокому пониманию митохондриальной функции при патогенезах рака яичников и изменениях митохондриальной сети, а также помогает прояснить его молекулярный механизм для последующего открытия целевой терапии и эффективных биомаркеров на основе митохондрий4,5. Центрифугация дифференциальной скорости в сочетании с центрифугированием градиента плотности эффективно изолировало и очищенные митохондрии от рака яичников человека и контроль тканей яичников. Подготовленные митохондриальные образцы были очень высокого качества и подходят для дальнейшего количественного анализа протеомики.

Подготовленные митохондриальные образцы содержали небольшое количество пероксисом3,17,18 и цитозолических белков19,20. Это не должно быть просто считается загрязнением, потому что они прямо или косвенно взаимодействуют или придерживаются митохондрий, чтобы митохондрии функционировать более полно. Исследования показали, что митохондрии активно взаимодействуют с актином цитоскелет19,20 и пероксисомами17,18. Это неизбежно для некоторых цитозолических белков и пероксисомных белков, содержащихся в изолированных митохондриальных образцов.

Ключевым методом обнаружения, идентификации и количественной оценки белков из подготовленных образцов митохондриальных образцов была маркировка iTRA-SCX-LC-MS/MS. Это исследование выявило и количественно 5115 митохондриальных белков3,в том числе 1198 mtDEPs4,14. Большое количество митохондриальных белков, найденных в тканях рака яичников включает в себя те, которые могут помочь понять роль митохондрий в патогенезе рака яичников, а также быть ресурсом для открытия персонализированной целевой терапии на основе митохондриального метаболизма8, и даже найти эффективные биомаркеры на основе митохондриальной геномики, протеомика, и метаболомика из систематического многономика угол9,11,12,13. Кроме того, с введением протеоформы и белковых видов концепций в протеоме, углубленное исследование митохондриальных протеоформ или белковых видов может непосредственно привести к открытию эффективных и надежных биомаркеров и терапевтических целей для рака яичников10,21,22.

Кроме того, нынешние протоколы в анализе человеческих раковых опухолей ткани митохондриальных протеомов, описанных здесь, легко переводятся для изучения других заболеваний человека митохондриальных протеомов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Хунань провинциальной сто талантов плана (к X.З.), Xiangya больницы фонды для ввода талантов (к X ), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81572278 и 8127298 до X " Проект (Грант No 2014AA020610-1 до ХЗ) и Фонд естественных наук провинции Хунань Китая (Грант No 14JJ7008 до X). Х.З. задумал концепцию настоящей рукописи, получил количественные данные iTRA' количественной протеомики образцов митохондрий, написал и пересмотрел рукопись, координировал соответствующую работу и отвечал за финансовую поддержку и соответствующую Работы. H.L. подготовил образцы митохондрий. С.З. участвовал в частичной работе. Х.Х.З. участвовал в написании и редактировании английского языка. Н.Л. проанализировал данные протеомики iTRA. Все авторы одобрили окончательную рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

Tags

Исследования рака Выпуск 153 рак яичников митохондрии дифференциальная скорость центрифугирования градиента плотности центрифугации изоббарическая метка для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA) маркировки сильный катификационный обмен (SCX) жидкая хроматография (LC) тандемная масс-спектромия (MS/MS) митохориарная протеэме
Подготовка митохондрий из тканей рака яичников и контроль тканей яичников для количественного анализа протеомики
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter