Summary
Bu makalede, insan yumurtalık kanseri dokularından mitokondriyi ayırmak ve kantitatif proteomik analiziçin yumurtalık dokularını kontrol etmek için yoğunluk gradyan santrifüj santrifüjü ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü protokolü sunmaktadır. bir insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom yüksek kaliteli mitokondriyal örnek ve yüksek üretim ve yüksek tekrarlanabilirlik kantitatif proteomik analizi ile sonuçlanan.
Abstract
Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojik kanserdir. Çoğu yumurtalık kanseri ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliğidir, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyalizasyonu, ve oksidatif stres. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. İnsan yumurtalık kanserini analiz etmek ve mitokondriyal proteomları kontrol etmek için göreceli ve mutlak nicel (iTRAQ) kantitatif proteomikler için bir isobarik etiketle birleşen etkili bir mitokondriyal preparat yöntemi sunulmuştur. diferansiyel hızlı santrifüj, yoğunluk gradyan santrifüj, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, güçlü katyon değişimi fraksiyonasyonu (SCX), sıvı kromatografi (LC), tandem kütle spektrometresi (MS/ MS), veritabanı analizi ve mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizi. Birçok protein başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom kapsama maksimize etmek ve insan yumurtalık kanserlerinde farklı ifade mitokondriyal protein profili elde etmek için tespit edilmiştir.
Introduction
Yumurtalık kanseri yüksek mortalite ama belirsiz moleküler mekanizma ile ortak bir jinekolojikkanserdir 1,2. Yumurtalık kanserlerinin çoğu ileri evrede teşhis edilir, hangi ciddi tedavi engellenir. Mitokondriyal değişiklikler insan yumurtalık kanserlerinin bir özelliği, ve mitokondri enerji metabolizması merkezleri, hücre sinyal, ve oksidatif stres3,4,5,6,7. Yumurtalık kanserlerinde mitokondriyal proteom değişiklikleri içine derinlemesine anlayışlar yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarıderinlez anlaşılması yarar sağlayacaktır, ve etkili ve güvenilir biyobelirteçleri ve terapötik hedeflerin keşfi. Mitokondriyal metabolizma önerilmiştir ve kanser tedavisi için bir hedef olarak kabul, ve antimitokondriyal tedavi sonuçta kanser nüks ve metastaz önlemek için çok yararlı olabilir8. Bireysel metabolik profilleme de zaten kanser tabakalaşma ve tahmin stratejileriiçinyararlı bir araç olarak uygulanmış 9,10.
Bu araştırmanın uzun vadeli amacı, yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokuları arasındaki mitokondriyal proteom değişikliklerinin açıklanması için yumurtalık kanserini incelemek için kantitatif mitokondriyal proteomik bir yöntem geliştirmek ve kullanmaktır. ve sistematik multi-omics açı11moleküler ağ değişiklikleri11 ,12, yumurtalık kanseri moleküler mekanizmalarının açıklanması için mitokondri hedefli moleküler biyobelirteçlerin keşfi neden olacak13, tahmin ve yumurtalık kanseri hastalarının kişiselleştirilmiş tedavi. Bağıl ve mutlak nicelik (iTRAQ) etiketleme için İzobarik etiketler3,4 mitokondriyal protein değişikliklerini ölçmek için etkili bir yöntemdir. İnsan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması mitokondriyal proteomların iTRAQ kantitatif analizi için ön koşuldur3. Mitokondriyal hazırlık iTRAQ kantitatif proteomik ile birleştiğinde başarıyla insan yumurtalık kanseri mitokondriyal proteom hakkında uzun vadeli araştırma programlarında kullanılmıştır, mitokondriyal proteom referans haritaları kurulması da dahil olmak üzere3, diferansiyel ifade mitokondriyal profilleranalizi 4,14 ve post-çevirial değişiklikler, zaten önemli bir keşif sinyali ile sonuçlandı insan yumurtalık kanserlerinde ağ değişiklikleri5, enerji metabolizmasında değişiklikler de dahil olmak üzere4, lipid metabolizması, ve mitophagy yol sistemleri3.
Önceki çalışmalarda yoğunluk gradyan santrifüj santrifüj ile birlikte diferansiyel hız santrifüj insan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından mitokondri izole etmek ve arındırmak için etkili bir yöntem olduğunu bulduk3,4,5,14. Güçlü katyon değişimi (SCX)-sıvı kromatografisi (LC)-tandem kütle spektrometresi (MS/MS) ile birleşen iTRAQ etiketleme, hazırlanan mitokondriyal örneklerdeki proteinleri tespit etmek, tanımlamak ve ölçmek için anahtar tekniktir.
Burada iTRAQ kantitatif proteomikleri ile birleşen mitokondriyal hazırlık için ayrıntılı protokoller açıklanmıştır. Bu başarıyla insan yumurtalık kanseri doku mitokondriyal proteomların analizinde kullanılmıştır. Protokoller, numunelerin hazırlanması, diferansiyel hız santrifüjü, yoğunluk gradyan santrifüjü, mitokondriyal örneklerin kalite değerlendirmesi, tripsin ile protein sindirimi, iTRAQ etiketleme, SCX fraksiyonasyonu, LC, MS/MS, veritabanı aramave mitokondriyal proteinlerin kantitatif analizini içerir. Ayrıca, bu protokol kolayca diğer insan doku mitokondriyal proteomanaliz çevirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol de dahil olmak üzere yumurtalık kanseri dokuları (n = 7) ve normal kontrol yumurtalık dokuları (n = 11) içeren yumurtalık dokusu örnekleri kullanıldı. Mevcut protokol3,4,5 Xiangya Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi Merkezi Güney Üniversitesi, Çin tarafından onaylanmıştır.
1. İnsan yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlanması
- 210 mM mannitol, 70 mM sakaroz, 100 mM potasyum klorür (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamin tetraasetik asit (EDTA), 0,1 mM etilen glikol bis(2-etil eter)tetratik asit (EA), masase, 70 mM sakaroz karıştırılarak mitokondriyal izolasyon tamponunun 250 mL'sini hazırlayın fenilmesulfonil florür (PMSF) proteaz inhibitörü, 2 mM sodyum ortamazat (V) ve %0.2 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA), pH 7.4.
- Temiz bir cam çanak yumurtalık kanseri dokularının ~ 1.5 g yerleştirin.
- Doku yüzeyinden 3x kan hafifçe yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
- Yaklaşık 1 mm3 adet dokuyu tamamen kıymak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıymalı dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 0,2 mg/mL nagarse içeren 13,5 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve sonra kıyma dokuları (2 dk, 4 °C) homojenleştirmek için elektrikli bir homojener kullanın (kullanım ölçeği 2, 10 s 6x, aralık 10 s)
- Doku homojenates içine mitokondriyal izolasyon tampon başka 3 mL ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın.
- Hazırlanan doku homojen (1.300 x g,10 dk, 4 °C) santrifüj. Ham nükleer fraksiyonu çıkarın (yani, pelet) ve supernatant tutun.
- Recentrifuge supernatant (10.000 x g, 10 dk, 4 °C). Mikrozomları çıkarın (yani, supernatant) ve pelet tutun.
- 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile peleti iyice askıya alın.
- Pelet süspansiyonuna santrifüj (7.000 x g,10 dk, 4 °C). Supernatant atın ve ham mitokondri (yani, pelet) tutmak.
- Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunluk gradyan ortamının (yani Nycodenz) 12 mL'sini ekleyin.
- Bir tüpü %34 5 mL, %30'luk 8 mL, %25'lik 12 mL (1.11 adımdan itibaren ham mitokondriyi içeren), %23'lük 8 mL ve %20 yoğunlukgradient orta 3 mL ile alttan yukarıdoğru bir tüp doldurarak kesintisiz bir yoğunluk degradesi yapın ve (52.000 x g, 90 min, 4 C) yapın.
- Temiz bir tüp içine% 25 ve% 30 yoğunluk gradyan orta arasında arayüz saflaştırılmış mitokondri toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın.
- Toplanan mitokondri içine mitokondriyal izolasyon tampon ekleyin üç kat hacimde seyreltmek için. Santrifüj (15.000 x g, 20 dk, 4 °C) ve supernatant atın.
- Peleti yeniden askıya almak için 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve santrifüj (15.000 x g,20 dk, 4 °C) ekleyin. Supernatant atın ve pelet tutun.
- Son peleti (yani saflaştırılmış mitokondri) toplayın ve -20 °C'de saklayın.
NOT: Kantitatif proteomik analiz için mitokondri örneği olarak yumurtalık kanseri dokusundan tüm saflaştırılmış mitokondriyi birleştirin.
2. İnsan kontrol yumurtalık dokularından mitokondri hazırlanması
- Adım 1.1'de açıklandığı gibi mitokondriyal izolasyon tamponunun 250 mL'sini hazırlayın.
- Temiz bir cam çanak normal kontrol yumurtalık dokularının ~ 1,5 g yerleştirin.
- Doku yüzeyinden 3x kan hafifçe yıkamak için önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
- Yaklaşık 1 mm3 adet dokuyu tamamen kıymak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıymalı dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 8 mL 0.05% trypsin/20 mM EDTA fosfat tamponlu salin (PBS) kıyma kontrol dokularına ekleyin ve sindirmek (30 dk, oda sıcaklığında), hangi doku ve hücreleri lyse ve mitokondri serbest yardımcı olur. Sonra santrifüj (200 x g, 5 dk). Supernatant atın ve dokular ve hücreleri tutmak.
- 0,2 mg/mL nagarse içeren 13,5 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve sonra kıyma dokuları (2 dk, 4 °C) homojenleştirmek için elektrikli bir homojener kullanın (kullanım ölçeği 2, 10 s 6x, aralık 10 s)
- Doku homojenates içine mitokondriyal izolasyon tampon başka 3 mL ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın.
- Hazırlanan doku homojen (1.300 x g,10 dk, 4 °C) santrifüj. Ham nükleer fraksiyonu çıkarın (yani, pelet) ve supernatant tutun.
- Recentrifuge supernatant (10.000 x g, 10 dk, 4 ° C). Mikrozomları çıkarın (yani, supernatant) ve pelet tutun.
- Hafif borulama ile pelet iyi askıya almak için mitokondriyal izolasyon tampon 2 mL ekleyin.
- Pelet süspansiyonuna santrifüj (7.000 x g,10 dk, 4 °C). Supernatant atın ve ham mitokondri (yani, pelet) tutmak.
- Çıkarılan ham mitokondriyi yeniden askıya almak için %25 yoğunluk gradyan ortamının 12 mL'sini ekleyin.
- Bir tüpü aşağıdan yukarıya %38 8 mL ile doldurarak kesintili bir yoğunluk degradesi yapın, %34'ün 5 mL'si, %30'unun 8 mL'si, %25'inin 12 mL'si (2.12'den itibaren ham mitokondriyi içeren), %23'ün 8 mL'si ve %20 yoğunlukgradient ortamının 3 mL'si ve santrifüj (52.000 x g, 90 dk, 4 °C).
- Temiz bir tüp içine% 34 ve% 38 arasında arayüz% 25 ve% 30 arasında aralığında saflaştırılmış mitokondri toplamak için uzun ve künt bir şırınga kullanın.
- Toplanan mitokondri içine mitokondriyal izolasyon tampon ekleyin üç kat hacimde seyreltmek için. Santrifüj (15.000 x g, 20 dk, 4 °C) ve supernatant atın.
- Peleti yeniden askıya almak için 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve santrifüj edin (15.000 x g,20 dk, 4 °C). Supernatant atın ve pelet tutun.
- Son peleti (yani saflaştırılmış mitokondri) toplayın ve -20 °C'de saklayın.
NOT: Tüm saflaştırılmış mitokondriyi kontrol yumurtalık dokusundan kantitatif proteomik analiz için mitokondriyal örnekler olarak birleştirin.
3. Saflaştırılmış doku mitokondriyal örneklerinin kalitesinin doğrulanması
- Elektron mikroskobu (EM) ile doğrulama için saflaştırılmış mitokondriyal örnekler (yani, adım 1.16 ve adım 2.17 gelen kontrol yumurtalık dokularından yumurtalık kanseri dokularından pelet) bir tüp alın.
NOT: Ayrıntılı protokol daha önce15,16açıklanmıştır. - 8 M üre, 2 M tiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT) ve %4(w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS) karıştırılarak mitokondriyal protein ekstraksiyon tamponu hazırlayın. pH'ı 8,52'ye ayarlayın.
- Saflaştırılmış mitokondriyal örneklerden (yani, adım 1.16'daki yumurtalık kanseri dokularından gelen peletleri ve 2.17 adımdaki kontrol yumurtalık dokularından) bir tüp alın ve mitokondriyal protein ekstraksiyon tamponu (protein çıkarma tamponuna mitokondriyal örnekler, 1:5) ekleyin peleti yeniden askıya alın. Numuneleri sıvı nitrojen 3x'te dondurun ve oda sıcaklığında 2 saat saklayın.
- 12.000 x g, 30 dk, 4 °C'de santrifüj, supernatant (yani, çıkarılan mitokondriyal protein örneği) toplayın ve protein içeriğini bikonkosinik asit (BCA) protein test kiti ile ölçün.
- 9,08 g Tris ve 40 mL ddH2O'yu karıştırarak, pH'ı HCl kullanarak 8,8'e ayarlayarak ve ddH2O'yu 50 mL'lik son bir hacme ekleyerek 1,5 M Tris-HCl'nin (pH 8,8) 50 mL'sini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 6,06 g Tris ve 40 mL ddH2O'yu karıştırarak, pH'ı HCl kullanarak 6,8'e ayarlayarak ve ddH2O'yu 50 mL'lik son bir hacme ekleyerek 1 M Tris-HCl'nin 50 mL'sini (pH 6,8) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 29 g akrilamid, 1 g bis-akrilamid ve 80 mL ddH2O'nun karıştırılması ve 100 mL'lik son hacmine ddH2O ekleyerek 100 mL%30 akrilamid-bis çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de kahverengi bir şişede saklayın.
- 29 g glisin, 58 g Tris, 3,7 g sodyum dodecil sülfat (SDS) ve 800 mL ddH2O'yu karıştırarak 10x tris-glisin elektroforez tamponunun 1.000 mL'sini hazırlayın ve 1.000 mL'lik son hacme ddH2O ekleyerek hazırlayın.
- 2 mL gliserin, 0,02 g bromofenol mavisi, 0,4 g SDS, 2 mL Tris-HCl pH 6.8 ve 7 mL ddH 2 O'nun ddH2O'unu karıştırarak ve ddH2O'nun son hacmine 10 mL'lik son hacmi ekleyerek 10 mL yükleme tamponunu hazırlayın.
- 10 mL %10 sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) 4 mL ddH2O karıştırılarak jel ilerler, 3.3 mL %30 akrilamid-Bis çözeltisi, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 mL %10 SDS, 0.1 mL % 10 amonyum persülfat ve 0.004 mL tetrametilenediamin (TEMED). SDS-PAGE çözümlü jel çözeltisini cam plakalar arasındaki plakaya tarakın alt seviyesine dökün. Üstüne 2 mL izopropil alkol ekleyin. 30 dakika bekletin.
- Izopropil alkolü çıkarın ve üstte ddH2O 3x ile yıkayın. 4.1 mL ddH2O, 1.0 mL %30 akilamid-bis çözeltisi içeren %5 konsantrasyon jel çözeltisini dökün, 1 M Tris-HCl 0.75 mL (pH 6.8), 0.06 mL %10 SDS, 0.06 mL %10 amonyum perülfat ve 0.006 mL TEMED. Hemen konsantrasyon jeli çözeltisi içine tarak takın, 30 dakika bekletin ve sonra tarak çıkarmak.
- 10x Tris-glisin elektroforez tamponunun 100 mL'sini 900 mL ddH2O ile seyrelterek 1x Tris-glisin elektroforez tamponu hazırlayın ve elektroforetik tanka dökün.
- Yumurtalık kanserinden gelen 30 μg mitokondriyal proteinleri karıştırın ve 3.4 adımdan kontrol yumurtalık dokularını yükleme tamponu ile 20 μL'lik son bir hacme ulaşın. Karışımı 5 dk kaynatın, sonra 100 V sabit voltaj kullanarak %10 SDS-PAGE çözme jeli ile ayırın. Bromfenol mavisi dibe ulaştığında elektroforezi durdurun.
- 150 mL 10x Tris-glisin elektroforez tamponu, 1.050 mL ddH2O ve 300 mL metanol karıştırarak elektroforetik transfer tamponunun 1,5 L'sini hazırlayın.
- PVDF membranı 10 dakika boyunca %100 metanol ve elektroforetik transfer tamponunda en az 5 dakika bekletin.
- Proteinleri içeren SDS-PAGE jelini alın ve 10 dakika boyunca elektroforetik transfer tamponuna batırın.
- Beyaz plaka, ıslak filtre kağıdı üç yaprak, PVDF membran, proteinler, ıslak filtre kağıdı iki yaprak ve ıslak sünger aşağıdan üste ıslak sünger ile ıslak bir sünger yerleştirerek bir transfer kaset olun. Herhangi bir kabarcıklar kaçının.
- Transfer kasetini elektroforetik tanka yerleştirin, elektroforetik transfer tamponunu dökün ve 2 saat boyunca sabit 200 mA akım altında aktarın.
- 12.114 g Tris, 29.22 g NaCl'i karıştırarak ve 500 mL'lik son hacme ddH2O ekleyerek 10x Tris tamponlu salin (TBS) stok çözeltisini hazırlayın. 10x TBS'nin 200 mL'si, 2 mL'si Tween-20 ve 1.798 mL ddH2O'nun karıştırılarak 100 mL'lik blokaj çözeltisini 100 mL ve 5 g BSA'yı karıştırarak 1x TBST'nin 2 L'sini hazırlayın.
- Aktarımdan sonra, PVDF membranını alın, 5 dk TBST'de hafifçe yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklama çözeltisinde engelleyin.
- PVDF membranını (4 °C) lamin B (hücre çekirdeği; keçi anti-insan antikor1: 1.000 bloklama çözeltisi), flotillin-1 (tavşan anti-insan) dahil olmak üzere farklı hücre altı organellerine özgü farklı primer antikorlarla kuluçkaya yatırın antikor 1:500 blokaj çözeltisi), COX4I1 (mitokondrion; tavşan anti-insan 1:1,000 engelleme solüsyonu), GM130 (Golgi aparatı; fare anti-insan antikor 1:1,000 bloklama çözeltisi), katalaz (peroksizom; tavşan anti-insan antikor 1:1,000 engelleme çözeltisi) ve cathepsin B (lizom; tavşan anti-insan antikor 1:1.000 engelleme çözeltisi). TBST'de 5 dk 3x hafifçe yıkayın.
- PVDF membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca ilgili ikincil antikorlarla (tavşan anti-keçisi, keçi anti-tavşanı veya keçi anti-faresi) kuluçkaya yatırın. TBST'de 5 dk 3x hafifçe yıkayın. Elektromilüminesans (ECL) ile görselleştirin.
4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS analizi
NOT: Bölüm 4 için ayrıntılı prosedürler iTRAQ talimatlarına(Malzeme Tablosu)bakınız.
- Saflaştırılmış mitokondriyal numunelere (yani, 1.16.adımdan yumurtalık kanseri dokularından gelen peletlere ve 2.17.adımdan kontrol yumurtalık dokularına) SDT tamponu (%4 SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 ve 100 mM DTT) ekleyin. Görünür çökelti olmayana kadar örneği girdap.
NOT: SDT tampon oranına mitokondriyal örnek 1:5 olmalıdır. - 5 dakika için SDT ile tedavi örnek kaynatın, buz üzerinde örnek soğumave sonra santrifüj (2.000 x g, 2 dk).
- Eksiten mitokondriyal protein örnekleri olarak supernatant toplayın ve bca protein test kiti ile protein içeriğini ölçün.
- Azaltma, alkillenme, tripsin ile sindirim, tuzdan arındırma ve liyofilizasyon için SDT-ekstrakte mitokondriyal proteinler (her örnek200 μg) alın3,4. Her örnek için üç çoğaltma yapın.
- 100 mM tetraetil amonyum bromür çözeltisi (pH 8.5) ile adım 4.4 den triptik peptidler (her örnek 100 μg) tedavi ve talimatlarına göre 6-pleks iTRAQ reaktifler biri ile triptik peptidler etiket3,4. Her örneği 3x etiketle.
- Mix eşit etiketli 6 triptik peptid örnekleri (yumurtalık kanseri dokularından üç ve kontrol yumurtalık dokularından üç), ve bir vakum konsantratörü ile kuru.
- Karışık iTRAQ etiketli peptidleri SCX kromatografisi ile 60 kesir (1 dk başına bir kesir) olarak kesirlendirin, sonra her iki fraksiyonu SCX fraksiyonlu örnek olarak birleştirin (n = 30).
- Ms/MS verilerini elde etmek için 60 dk'lık LC ayırma gradyanı içinde nano LC sistemi ile birleştiğinde kütle spektrometresi3,4 üzerinde LC-MS/MS analizine her SCX-fraksiyonlu örnek konu.
- Arama motoru(Malzeme Tablosu)ile proteinleri tanımlamak için MS/MS verilerini arayın.
- Her proteini ölçmek ve mitokondriyal farklılaştırıcı proteinleri (mtDEP) >1.5 veya <-1.5 kat ve p < 0.05'i değiştirmek için iTRAQ muhabiri-iyon yoğunluklarını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yumurtalık kanseri dokuları ve kontrol yumurtalık dokuları mitokondri hazırlanmasında bir fark vardı. Bu çalışmada, yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlamak için çok daha kolay olduğunu bulundu kontrol yumurtalık dokularından daha3,4. Kontrol yumurtalık dokularından mitokondri hazırlanması için protokolde bazı iyileştirmeler yapılması gerekiyordu. İlk olarak doku homojenizasyonundan önce kıymalı kontrol dokularına eklenen PBS çözeltisine %0.05 tripsin/20 mM EDTA'nın 8 mL eklenmesi, ardından oda sıcaklığında 30 dk sindirimive 5 dk için 200 x g santrifüj (protokol adım 2.5'e bakınız) eklenme niz gerekiyordu. Bu mitokondri hazırlanması geliştirilmiş. İkinci olarak, kesintili yoğunluk gradyanı kontrol yumurtalık dokuları ve yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlanması için farklıydı(Şekil 1). Yumurtalık kanseri dokuları için %34'ün 5 mL, %30'un 8 mL, %25'inin 12 mL'si (ham mitokondri içeren), 8 mL'si %23 ve 3 mL'lik 20 yoğunluk gradyan ortamı bir tüpte alttan üste ilave edilerek hazırlanmıştır. Arındırılmış mitokondri, santrifüj den sonra %25 ile %30 arasında arabirimde bulunmuştur(Şekil 1A, bkz. protokol adımları 1.12 ve 1.13). Yumurtalık dokularının kontrolü için %38'lik 8 mL, %34'te 5 mL, %30'da 8 mL, %25'inde 12 mL (ham mitokondri içeren), 8 mL %23 ve 3 mL 20 yoğunluk gradyan ortamı bir tüpte alttan üste kadar artırılarak hazırlanmıştır. Bu durumda, saflaştırılmış mitokondri% 25 ve% 30 arasında arabirim arasında aralığında% 34 ve% 38 arasında arabirim santrifüj sonra(Şekil 1B, protokol adımları 2.13 ve 2.14 bakınız).
Protokol, yüksek kaliteli mitokondriyal numuneleri obatined. Yüksek kaliteli mitokondriyal numuneler kantitatif mitokondriyal proteomiklerin ön koşuludur. Bu çalışmada diferansiyel hızlı santrifüj ve yoğunluk gradyan santrifüj üem(Şekil 2) ve Batı lekeleri (WB, Şekil 3)ile hazırlanan mitokondrinin kalitesi değerlendirildi. EM görüntüleri hem yumurtalık kanserleri ve kontrol yumurtalık dokularında izole ana organeller mitokondri olduğunu gösterdi, peroksizomların küçük bir miktar dışında. Mitokondrinin morfolojisi yumurtalık kanserlerinde kontrol yumurtalık dokusundan daha fazla değişmiştir(Şekil 2). WB görüntüleri, yumurtalık kanserleri ve kontrol yumurtalıklarından alınan mitokondriyal örneklerdeki ana bileşenin az miktarda peroksizom dışında mitokondri olduğunu göstermiştir(Şekil 3). WB sonuçları EM sonuçları ile uyumluidi. Bu peroksizomlar için hazırlanan mitokondri içerdiği için makul oldu, mitokondri peroksizomlar ile yoğun etkileşim çünkü3,17,18, hangi sırayla mitokondri fonksiyonel bütünlüğü yansıtır. Bu sonuçlar hazırlanan mitokondriyal numunelerin yüksek kalitesini göstermiştir.
Bu protokol ile hazırlanan mitokondriyal protein miktarı daha ileri analiz için yeterliydi. Yumurtalık kanseri nden yeterli miktarda mitokondriyal örnek alınması ve yumurtalık dokularının kontrol altına alınması gerekmektedir. Bu çalışmada yedi yumurtalık kanseri dokularından hazırlanan mitokondriyal örnekleri kombine, ve 11 kontrol yumurtalık dokuları3. Yumurtalık kanserleri için toplam 2.409 μg mitokondriyal protein örneği, kontrol yumurtalık dokusu için 4.440 μg mitokondriyal protein örneği elde edilmiştir(Tablo 1). Genellikle, iTRAQ kantitatif proteomikler için her numunenin en az 600 μg proteine (her iTRAQ etiketlemesi başına 200 μg protein, 3 kopya) ihtiyacı vardır. Bu nedenle hazırlanan mitokondriyal protein örnekleri iTRAQ kantitatif proteomik analizi için yeterliydi.
Sayısal proteinlerin maksimum sayıda başarı insan yumurtalık kanserinde mitokondri derinlemesine araştırma yararları. Bu çalışma, yumurtalık kanserlerinde 2.565 (%50.14) olmak üzere yumurtalık dokusunu kontrol etmek üzere 5.115 protein saptanmış, saptanmış ve ölçüldü. güncellenen proteinler (kanserlerin kontrollere oranı >1) ve 2.550 (%49.86) indirgenmiş proteinler (kanserlerin kontrollere oranı <1)3 (Tablo 2). Ayrıca bu çalışmada yumurtalık kanserleri ile kontrol yumurtalıkları arasında 1.198 mtDEP saptamıştır ve 523 (%43,66) dahil olmak üzere >1.5 veya <-1.5 kat değişiklikler (p < 0.05) ve 675 (%56,34) indirgenmiş proteinler4 (Tablo 2). Bu veriler şu anda yumurtalık kanserinde en büyük mitokondriyal proteom profili vardır.
Şekil 1: Ham mitokondri yumurtalık kanseri (A) ve kontrol yumurtalık (B) dokuları için kesintili yoğunluk gradyan santrifüj santrifüj ile arındırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yumurtalık kanserinden izole edilmiş mitokondrinin elektron mikrograf görüntüsü (A) ve kontrol yumurtalık (B) dokuları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yumurtalık kanserinden izole edilmiş mitokondrinin organelle özgü antikor bazlı Batı leke görüntüleri(A) ve yumurtalık (B) dokuları kontrol eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mitokondriyal protein örneği | Hacim (3L) | Konsantrasyon (3g/μL) | Proteinler (μg) |
| Yumurtalık kanseri dokusu | 530 | 4.545 | 2,409 |
| Yumurtalık dokusunu kontrol etmek | 750 | 5.92 | 4,440 |
Tablo 1: Hazırlanan mitokondriyal protein örneklerinin miktarı.
| Kategori | Toplam protein sayısı* | Farklı ifade edilen proteinlerin sayısı# |
| Yukarı düzenleme | 2,565 (50.14%) | 523 (43.66%) |
| Aşağı düzenleme | 2,550 (49.86%) | 675 (56.34%) |
| Toplam | 5,115 (100.0%) | 1,198 (100.0%) |
| *Kanserlerin kontrollere oranı yukarı regülasyon için >1, aşağı regülasyon için <1'dir. | ||
| # Kanserlerin kontrollere oranı yukarı regülasyon için >1.5 kat, aşağı regülasyon için <-1.5 kattır. | ||
Tablo 2: Hazırlanan mitokondriyal örneklerden iTRAQ ile tanımlanan proteinlerin sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondriyal değişiklikler yumurtalık kanserinin bir özelliğidir. Büyük ölçekli kantitatif proteomikler için insan yumurtalık kanseri ve kontrol dokularından yüksek kaliteli mitokondriyal örneklerin hazırlanması yumurtalık kanseri patogenezi ve mitokondriyal moleküler ağ değişiklikleri mitokondriyal fonksiyonun derinlemesine anlaşılması yarar ve mitokondri 4 dayalı hedef tedavi ve etkili biyobelirteçleri sonraki keşif için moleküler mekanizmasını açıklığa kavuşturmak yardımcı olur ,5,8. Yoğunluk gradyan santrifüj santrifüjü ile birlikte diferansiyel hız santrifüjü etkili izole ve insan yumurtalık kanseri ve kontrol yumurtalık dokularından izole ve saflaştırılmış mitokondri. Hazırlanan mitokondriyal numuneler çok kaliteliydi ve daha fazla kantitatif proteomik analiz için uygundu.
Hazırlanan mitokondriyal örnekler peroksizomlarküçükbir miktar3,17,18 ve sitozolik proteinler19,20içeriyordu. Bu sadece kontaminasyon olarak kabul edilmemelidir, çünkü doğrudan veya dolaylı olarak etkileşim veya mitokondri ile daha tamamen çalışması için yapışır. Çalışmalar, mitokondri aktin sitoskeleton19,20 ve peroksizomlar 17,18ile yoğun etkileşim bulduk. Bazı sitozolik proteinlerin ve peroksizom proteinlerin izole mitokondriyal örneklerde yer almasını kaçınılmazdır.
Hazırlanan mitokondriyal örneklerdeki proteinleri tespit etmek, tanımlamak ve ölçmek için anahtar teknik iTRAQ etiketleme-SCX-LC-MS/MS idi. Bu çalışmada 5.115 mitokondriyal protein3,1.198 mtDEPs4,14dahil olarak tanımlanmış ve sayısallaştırılmış. Yumurtalık kanseri dokularında bulunan mitokondriyal proteinlerin çok sayıda yumurtalık kanseri patogenezinde mitokondri rolünü anlamak için yardımcı olabilir ve aynı zamanda mitokondriyal metabolizma8dayalı kişiselleştirilmiş hedef tedavi keşfi için bir kaynak olabilir , ve hatta mitokondriyal genomik dayalı etkili biyobelirteçler bulma, içerir proteomik ve sistematik multi-omics açı dan metabolomik9,11,12,13. Ayrıca, proteome proteoform ve protein türleri kavramlarının tanıtımı ile, mitokondriyal proteoformlar veya protein türlerinin derinlemesine keşif doğrudan etkili ve güvenilir biyobelirteçler ve yumurtalık kanseri için terapötik hedeflerin keşfine yol açabilir10,21,22.
Ayrıca, burada açıklanan insan yumurtalık kanseri doku mitokondriyal proteomların analizinde mevcut protokoller kolayca diğer insan hastalığı mitokondriyal proteomlar çalışma tercüme edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Hunan Provincial Hundred Talent Plan (X.Z.), Xiangya Hastanesi Yetenek Giriş Fonları (XZ), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 81572278 ve 81272798 XZ), Çin hibe "863" Planı tarafından desteklendi Proje (Hibe No. 2014AA020610-1 XZ için) ve Çin Hunan İl Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 14JJ7008 XZ için). X.Z. bu makalenin konseptini tasarladı, mitokondri örneklerinin iTRAQ kantitatif proteomik verilerini elde etti, el yazması yazdı ve revize etti, ilgili çalışmayı koordine etti ve finansal destekten ve buna karşılık gelen Çalışma. H.L. mitokondri örnekleri hazırladı. S.Q. kısmi çalışmaya katıldı. X.H.Z İngilizce'nin yazımına ve editörlüğünü aldı. N.L. iTRAQ proteomics verilerini analiz etti. Tüm yazarlar son taslağı onayladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
