Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Fremstilling af mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol med differentialhastighed centrifugering i kombination med tæthed gradient centrifugering at adskille mitokondrier fra humane æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse, resulterer i en høj kvalitet mitokondrie prøve og høj gennemløb og høj reproducerbarhed kvantitativ proteomics analyse af en menneskelig ovariecancer mitokondrie proteome.

Abstract

Kræft i æggestokkene er en almindelig gynækolog cancer med høj dødelighed, men uklar molekyl mekanisme. De fleste kræft i æggestokkene er diagnosticeret i den avancerede fase, som alvorligt hæmmer terapi. Mitokondrie ændringer er et kendetegn for humane ovariecancer, og mitokondrier er centrene for energimetabolisme, celle signalering og oxidativ stress. Dybtgående indsigt i de ændringer af mitokondrie proteom i æggestokkene kræft sammenlignet med kontrol æggestokkene væv vil gavne dybtgående forståelse af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, og opdagelsen af effektive og pålidelige biomarkører og terapeutiske mål. En effektiv mitokondrie præparationsmetode kombineret med et isobarisk tag til relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) kvantitative proteomics er præsenteret her for at analysere humane ovariecancer og kontrol mitokondrie proteomer, herunder centrifugeringshastighed, tæthed gradient centrifugering, kvalitetsvurdering af mitokondrie prøver, protein fordøjelse med trypsin, iTRAQ mærkning, stærk kation udveksling fraktionering (SCX), væskekromatografi (LC), tandem massespektrometri (MS/ MS), database analyse, og kvantitativ analyse af mitokondrie proteiner. Mange proteiner er blevet identificeret med succes for at maksimere dækningen af den humane ovariecancer mitokondrie proteom og for at opnå den differentielt udtrykte mitokondrie protein profil i humane ovariekræft.

Introduction

Kræft i æggestokkene er en almindelig gynækolog cancer med høj dødelighed, men uklar molekyl mekanisme1,2. De fleste af æggestokkene kræft er diagnosticeret i den avancerede fase, som alvorligt hæmmer terapi. Mitokondrie ændringer er et kendetegn for humane ovariecancer, og mitokondrier er centrene for energimetabolisme, celle signalering og oxidativ stress3,4,5,6,7. Dybtgående indsigt i de ændringer af mitokondrie proteom i æggestokkene kræft sammenlignet med kontrol æggestokkene væv vil gavne dybtgående forståelse af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, og opdagelsen af effektive og pålidelige biomarkører og terapeutiske mål. Mitokondrie metabolisme er blevet foreslået og anerkendt som et mål for kræftbehandling, og antimitokondriel terapi kan i sidste ende være meget gavnligt for at forhindre gentagelse og metastase af kræft8. Individuelle metaboliske profilering er også allerede praktiseres som et nyttigt redskab til kræft stratificering og forudsigende strategier9,10.

Det langsigtede mål med denne forskning er at udvikle og anvende en kvantitativ mitokondriel proteomics metode til at studere kræft i æggestokkene for afklaring af mitokondrie proteom ændringer mellem ovariecancer og kontrol æggestokkene væv, og deres molekylære netværk ændringer fra en systematisk multi-omics vinkel11,12, hvilket vil resultere i opdagelsen af mitokondrier-målrettede molekylære biomarkører13 for afklaring af de molekylære mekanismer af kræft i æggestokkene, forudsigelse og personlig behandling af kræftpatienter i æggestokkene. Isobariske Tags til relativ og absolut kvantificering (itraq) mærkning3,4 er en effektiv metode til at kvantificere mitokondrie protein ændringer. Forberedelse af høj kvalitet mitokondrie prøver fra Human ovariecancer og kontrol æggestokkene væv er forudsætningen for iTRAQ kvantitativ analyse af mitokondrie proteomer3. Mitokondrie forberedelse kombineret med itraq kvantitative proteomics er med held blevet anvendt i langsigtede forskningsprogrammer om den humane ovariecancer mitokondrie proteom, herunder etablering af mitokondrie proteom referencekort3, analyse af differentielt udtrykte mitokondrie profiler4,14 og post-translationelle modifikationer, herunder fosforylering, som allerede har resulteret i opdagelsen af vigtige signalering pathway netværk ændringer i humane æggestokkene kræft5, herunder ændringer i energimetabolisme4, lipid metabolisme, og mitophagy pathway-systemer3.

Tidligere undersøgelser har fundet, at differentialhastighed centrifugering i kombination med tæthed gradient centrifugering er en effektiv metode til at isolere og rense mitokondrier fra humane ovariecancer og kontrol æggestokkene væv3,4,5,14. ITRAQ-mærkningen kombineret med stærk kation udveksling (SCX)-Liquid kromatografi (LC)-tandem massespektrometri (MS/MS) er den vigtigste teknik til at detektere, identificere og kvantificere proteinerne fra de forberedte mitokondrie prøver.

Her beskrives detaljerede protokoller for mitokondrie præparat kombineret med iTRAQ kvantitative proteomics. Disse er blevet anvendt med succes i analysen af humane æggestokkene Cancer væv mitokondrie proteomer. Protokollerne omfatter forberedelse af prøver, differentialhastighed centrifugering, tæthed gradient centrifugering, kvalitetsvurdering af mitokondrie prøver, protein fordøjelse med trypsin, iTRAQ mærkning, SCX fraktionering, LC, MS/MS, database søgning, og kvantitativ analyse af mitokondrie proteiner. Desuden er denne protokol let oversætter til at analysere andre humane væv mitokondrie proteomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ovarievæv, herunder ovariecancer væv (n = 7) og normalt kontrol ovarie væv (n = 11), blev anvendt til denne protokol. Den nuværende protokol3,4,5 er godkendt af xiangya Hospital Medical Ethics Committee of central South University, Kina.

1. forberedelse af mitokondrier fra humane æggestokkene Cancer væv

  1. 250 mL af mitokondriel isolations buffer fremstilles ved blanding 210 mM mannitol, 70 mM saccharose, 100 mM kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamin tetraeddikesyre (EDTA), 0,1 mM ethylenglycol bis (2-aminoethylether) tetraeddikesyre (EGTA), 1 mM phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) proteasehæmmer, 2 mM natriumorthovanadat (V) og 0,2% bovint serumalbumin (BSA), pH 7,4.
  2. Sted ~ 1,5 g æggestokkene Cancer væv i en ren glas skål.
  3. Tilsæt 2 mL af den præ-afkølede mitokondrie isolations buffer for let at vaske blodet fra vævsoverfladen 3x.
  4. Brug ren oftalmisk saks til at hakkevævet helt i ca. 1 mm3 stykker, og overfør det hakkede væv til et 50 ml centrifugeglas.
  5. Tilsæt 13,5 mL mitokondriel isolations buffer indeholdende 0,2 mg/mL nagarse, og brug derefter en elektrisk homogenisator til at homogenisere (brug skala 2, 10 s 6x, interval 10 s) det hakkede væv (2 min, 4 °C).
  6. Tilsæt yderligere 3 ml mitokondriel isolations buffer ind i vævet-homogenater og bland dem godt ved pipettering.
  7. Den tilberedte vævs homogeni centrifugeres (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Fjern den rå nukleare fraktion (dvs. pellet) og holde supernatanten.
  8. Recentrifuge supernatanten (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Fjern mikrosomer (dvs. supernatanten) og holde pellet.
  9. Tilsæt 2 mL mitokondriel isolations buffer og resuspender pellet brønden ved let pipettering.
  10. Centrifuger pellet suspensionen (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Kassér supernatanten og opbevar den rå mitokondrier (dvs. pellet).
  11. Tilsæt 12 mL 25% tæthed gradient medium (dvs., Nycodenz) at resuspendere den ekstraherede rå mitokondrier.
  12. Lav en diskontinuerlig massefylde gradient ved at fylde et rør fra bund til top med 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (indeholdende rå mitokondrier fra trin 1,11), 8 mL 23% og 3 mL 20% tæthed gradient medium, og centrifuge det (52.000 x g, 90 min, 4 °c).
  13. Brug en lang og sløv sprøjte til at samle den rensede mitokondrier på grænsefladen mellem 25% og 30% tæthed gradient medium i et rent rør.
  14. Tilsæt mitokondriel isolations buffer i den indsamlede mitokondrier til at fortynde den til en tre-fold volumen. Centrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °c) og kassér supernatanten.
  15. Tilsæt 2 mL mitokondriel isolations buffer til at resuspendere pellet, og centrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Kassér supernatanten og opbevar pellet.
  16. Saml den endelige pellet (dvs. den rensede mitokondrier) og opbevar den ved-20 °C.
    Bemærk: Kombiner alle rensede mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv som mitokondrier prøven for kvantitativ proteomics analyse.

2. fremstilling af mitokondrier fra menneskelige kontrol æggestokkene væv

  1. Forbered 250 mL af mitokondriel isolations buffer som beskrevet i trin 1,1.
  2. Placer ~ 1,5 g af de normale kontrol ovarie væv i en ren glas skål.
  3. Tilsæt 2 mL forkølet mitokondriel isolations buffer for let at vaske blodet fra vævsoverfladen 3x.
  4. Brug ren oftalmisk saks til at hakkevævet helt i ca. 1 mm3 stykker, og overfør det hakkede væv til et 50 ml centrifugeglas.
  5. Der tilsættes 8 mL 0,05% trypsin/20 mM EDTA i fosfat-bufferet saltvand (PBS) til det hakkede kontrolvæv og fordøje (30 min, stuetemperatur), hvilket hjælper med at lyse væv og celler og frigiver mitokondrier. Derefter centrifugeres (200 x g, 5 min). Kassér supernatanten, og hold væv og celler.
  6. Tilsæt 13,5 mL mitokondriel isolations buffer indeholdende 0,2 mg/mL nagarse, og brug derefter en elektrisk homogenisator til at homogenisere (brug skala 2, 10 s 6x, interval 10 s) det hakkede væv (2 min, 4 °C).
  7. Tilsæt yderligere 3 ml mitokondriel isolations buffer ind i vævet-homogenater og bland dem godt ved pipettering.
  8. Den tilberedte vævs homogeni centrifugeres (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Fjern den rå nukleare fraktion (dvs. pellet) og holde supernatanten.
  9. Recentrifuge supernatanten (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Fjern mikrosomer (dvs. supernatanten) og holde pellet.
  10. Tilsæt 2 mL mitokondriel isolations buffer for at resuspendere pellet brønden ved let pipettering.
  11. Centrifuger pellet suspensionen (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Kassér supernatanten og opbevar den rå mitokondrier (dvs. pellet).
  12. Tilsæt 12 mL 25% tæthed gradient medium til at resuspendere den ekstraherede rå mitokondrier.
  13. Lav en diskontinuerlig massefylde gradient ved at fylde et rør fra bund til top med 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (indeholdende rå mitokondrier fra trin 2,12), 8 mL 23% og 3 mL 20% densitet gradient medium, og centrifuge det (52.000 x g, 90 min, 4 °c).
  14. Brug en lang og sløv sprøjte til at indsamle den rensede mitokondrier i intervallet fra grænsefladen mellem 25% og 30% til grænsefladen mellem 34% og 38% i et rent rør.
  15. Tilsæt mitokondriel isolations buffer i den indsamlede mitokondrier til at fortynde den til en tre-fold volumen. Centrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °c) og kassér supernatanten.
  16. Der tilsættes 2 mL mitokondriel isolations buffer for at resuspendere pellet og centrifugeres (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Kassér supernatanten og opbevar pellet.
  17. Saml den endelige pellet (dvs. den rensede mitokondrier) og opbevar den ved-20 °C.
    Bemærk: Kombiner alle renset mitokondrier fra kontrol ovarie vævet som mitokondrie prøver til kvantitativ proteomics analyse.

3. verifikation af kvaliteten af de rensede vævs mitokondrie prøver

  1. Tag et rør af rensede mitokondrie prøver (dvs. pellets fra æggestokkene Cancer væv fra trin 1,16 og kontrol æggestokkene væv fra trin 2,17) til verifikation med elektronmikroskopi (EM).
    Bemærk: den detaljerede protokol blev beskrevet tidligere15,16.
  2. Klargøre mitokondrie-protein ekstraktions bufferen ved at blande 8 M urinstof, 2 M thiourea, 40 mm Tris, 1 mm EDTA, 130 mm ditiotreitol (DTT) og 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonat (chaps). Juster pH-værdien til 8,52.
  3. Tag et rør af rensede mitokondrie prøver (dvs. pellets fra æggestokkene Cancer væv i trin 1,16 og kontrol æggestokkene væv i trin 2,17) og tilsæt mitokondrie protein udvinding buffer (mitokondrie prøver til protein udvinding buffer, 1:5) til resuspendere pellet. Fryse prøverne i flydende nitrogen 3x og opbevares ved stuetemperatur i 2 timer.
  4. Centrifugeres ved 12.000 x g, 30 min, 4 °c, opsamles supernatanten (dvs. den ekstraherede mitokondriale protein prøve), og der måles proteinindholdet med et bicinchoninsyre (BCA) protein assay kit.
  5. Der fremstilles 50 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) ved blanding af 9,08 g Tris og 40 mL ddH2o, justering af pH til 8,8 ved brug af HCl og tilføjelse af DDH2o til en endelig volumen på 50 ml. Opbevares ved 4 °C.
  6. Forbered 50 mL af 1 M Tris-HCl (pH 6,8) ved at blande 6,06 g Tris og 40 mL ddH2o, justere pH til 6,8 ved hjælp af HCl og tilføje DDH2o til en endelig volumen på 50 ml. Opbevares ved 4 °C.
  7. 100 mL 30% acrylamid-BIS-opløsning opblandes ved blanding af 29 g acrylamid, 1 g bis-acrylamid og 80 mL ddH2o, og DDH2o føjes til et endeligt rumfang på 100 ml. Opbevar den i en brun flaske ved 4 °C.
  8. Forbered 1.000 mL 10x Tris-glycin elektroforese buffer ved at blande 29 g glycin, 58 g Tris, 3,7 g natriumdodecyl sulfat (SDS) og 800 mL ddH2o, og derefter tilføje DDH2o til en endelig volumen på 1.000 ml.
  9. Der opblandes 10 ml indlæsnings buffer ved at blande 2 ml glycerin, 0,02 g bromphenolblåt blåt, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCL pH 6,8 og 7 ml DDH2o og derefter tilsætte DDH2o til et endeligt volumen på 10 ml.
  10. Forbered 10 mL 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) ved at blande 4 mL ddH2O 3,3 ml af 30% acrylamid-BIS opløsning, 2,5 ml af 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% ammonium persulfat og 0,004 ml tetramethylethylendiamin (TEMED). Hæld SDS-side løsning gel opløsning i pladen mellem glaspladerne til niveauet af bunden af kammen. Tilsæt 2 mL isopropylalkohol på toppen. Forlad i 30 min.
  11. Fjern isopropylalkohol og vask toppen med ddH2O 3x. Hæld 5% koncentration gel opløsning indeholdende 4,1 mL af ddH2O, 1,0 ml af 30% acylamide-BIS opløsning, 0,75 ml af 1 M Tris-HCL (pH 6,8), 0,06 ml af 10% SDS, 0,06 ml af 10% ammonium persulfat, og 0,006 ml af TEMED. Straks indsætte kam i koncentrationen gel opløsning, orlov i 30 min, og derefter tage ud kam.
  12. Forbered 1x Tris-Glycine elektroforese buffer ved fortynding 100 mL 10x Tris-Glycine elektroforese buffer med 900 mL ddH2O og hæld i den elektroforetiske tank.
  13. Bland 30 μg mitokondrie proteiner fra æggestokkene kræft og kontrollere æggestokkene væv fra trin 3,4 med loading buffer til at nå et endeligt volumen på 20 μL. Kog blandingen i 5 min, derefter adskille den med 10% SDS-side løse gel ved hjælp af en konstant spænding på 100 V. Når bromphenol blå når bunden, stoppe elektroforese.
  14. Forbered 1,5 L elektroforetisk overførsels buffer ved at blande 150 mL 10x Tris-glycin elektroforese buffer, 1.050 mL ddH2O og 300 ml methanol.
  15. PVDF-membranen i blød i 100% methanol i 10 minutter og i elektroforetisk overførings buffer i mindst 5 min. sug fem ark filtrerpapir i 1x elekrophoretisk overførsels buffer i mindst 5 minutter.
  16. Tag den SDS-side gel, der indeholder proteinerne, og sug den i elektroforetisk overførsels buffer i 10 minutter.
  17. Lav en overførings kassette ved at anbringe en våd svamp på den hvide plade, tre ark vådt filtrerpapir, PVDF-membranen, SDS-SIDERS gel med proteinerne, to ark vådt filtrerpapir og den våde svamp fra bunden til toppen. Undgå bobler.
  18. Placer overførings kassetten i den elektroforetiske tank, hæld i den elektroforetiske overførsels buffer, og overfør derefter i 2 timer under en konstant 200 mA strøm.
  19. Forbered 10x Tris-Buffered Saline (TBS) stamopløsning ved at blande 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl, og tilføje ddH2O til en endelig volumen på 500 ml. Klargør 2 L 1x TBST ved at blande 200 mL 10x TB'ER, 2 mL Tween-20 og 1.798 mL ddH2O. Forbered 100 ml blokerende opløsning ved at blande 100 ml tbst og 5 g BSA.
  20. Efter overførsel skal PVDF-membranen vaskes let i TBST i 5 minutter, hvorefter den blokeres i blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
  21. PVDF-membranen (4 °C natten over) med forskellige primære antistoffer, som er specifikke for forskellige subcellulære organeller, herunder Lamin B (cellekerne; ged anti-Human antistof 1:1.000 blokerende opløsning), flotillin-1 (cytomembrane; kanin anti-Human antistof 1:500 blokerende opløsning), COX4I1 (mitokondrion; kanin anti-Human 1:1000 blokerende opløsning), GM130 (Golgi apparater; mus anti-humant antistof 1:1000 blokerende opløsning), katalase (peroxysom; kanin anti-humant antistof 1:1000 blokering opløsning), og cathepsina B (lysosome, kanin anti-Human antistof 1:1000 blokerende opløsning). Vask let i TBST i 5 min 3 x.
  22. PVDF-membranen i 1 time ved stuetemperatur med de tilsvarende sekundære antistoffer (kanin anti-ged, ged anti-kanin, eller ged anti-mus). Vask let i TBST i 5 min 3 x. Visualisere det med elektrochemiluminescens (ECL).

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS analyse

Bemærk: de detaljerede procedurer for afsnit 4 henviser til iTRAQ-instruktionerne (tabel over materialer).

  1. Tilsæt SDT buffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7,6, og 100 mM DTT) til de rensede mitokondrie prøver (dvs. pellets fra æggestokkene Cancer væv fra trin 1,16 og kontrol ovarie væv fra trin 2,17). Hvirvel prøven, indtil der ikke er noget synligt bundfald.
    Bemærk: mitokondrie prøven til SDT-buffer ratio bør være 1:5.
  2. Kog den SDT-behandlede prøve i 5 minutter, Afkøl prøven på is, og centrifuger derefter (2.000 x g, 2 min).
  3. Saml supernatanten som de ekstraherede mitokondrielle protein prøver og mål proteinindholdet med et BCA protein assay kit.
  4. Tag SDT-ekstraherede mitokondrielle proteiner (200 μg af hver prøve) til reduktion, alkylering, fordøjelse med trypsin, afsaltning og lyophilisering3,4. Gør tre replikater for hver prøve.
  5. De trypticase peptider (100 μg af hver prøve) behandles fra trin 4,4 med 100 mm tetraethylammoniumbromid opløsning (pH 8,5), og de trypticase peptider med et af de 6-plex itraq reagenser i henhold til dens anvisninger3,4. Mærk hver prøve 3x.
  6. Bland lige 6 mærkede trypticase peptid prøver (tre fra æggestokkene Cancer væv og tre fra Control ovarie væv), og tør med en vakuum koncentrator.
  7. Fraktionere de blandede iTRAQ-mærkede peptider med SCX-kromatografi til 60 fraktioner (en fraktion pr. 1 min), og Kombiner derefter hver to fraktioner som en SCX-fraktioneret prøve (n = 30).
  8. Underkastes hver SCX-fraktioneret prøve til LC-MS/MS-analyse på et massespektrometer på3,4 kombineret med et Nano LC-system inden for en 60-min LC-separations gradient for at opnå MS/MS-data.
  9. Søg i MS/MS data for at identificere proteiner med søgemaskinen (tabel over materialer).
  10. Brug iTRAQ reporter-ion intensiteter til at kvantificere hvert protein og bestemme mitokondrie differentielt udtrykte proteiner (mtDEPs) med en ændring på > 1.5 eller <-1,5 fold, og p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der var en forskel i forberedelsen af mitokondrierne fra æggestokkene Cancer væv og kontrol æggestokkene væv. Denne undersøgelse viste, at det var meget lettere at forberede mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv end fra kontrol ovarie væv3,4. Nogle forbedringer skulle foretages til protokollen for fremstilling af mitokondrier fra kontrol æggestokkene væv. Før vævshomogenisering var det først nødvendigt at tilføje 8 mL 0,05% trypsin/20 mM EDTA i PBS-opløsningen føjet til det hakkede kontrolvæv efterfulgt af fordøjelse i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugering ved 200 x g i 5 minutter (Se protokol trin 2,5). Dette forbedrede forberedelsen af mitochondrier. For det andet var den diskontinuerligt tæthed gradient anderledes for fremstilling af mitokondrier fra kontrol ovarie væv og æggestokkene Cancer væv (figur 1). For kræft i æggestokkene blev det fremstillet ved tilsætning af 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (indeholdende rå mitokondrier), 8 mL 23% og 3 mL 20% densitet gradient medium fra bund til top i et rør. Den rensede mitokondrier blev fundet ved grænsefladen mellem 25% og 30% efter centrifugering (figur 1A, se protokol trin 1,12 og 1,13). For kontrol ovarie væv blev det fremstillet ved tilsætning af 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (indeholdende rå mitokondrier), 8 mL 23% og 3 mL 20% densitet gradient medium fra bund til top i et rør. I dette tilfælde var den rensede mitokondrier i intervallet fra grænsefladen mellem 25% og 30% til grænsefladen mellem 34% og 38% efter centrifugering (figur 1B, se protokol trin 2,13 og 2,14).

Protokollen var af høj kvalitet mitokondrie prøver. Høj kvalitet mitokondrie prøver er forudsætningen for kvantitative mitokondrie proteomics. I denne undersøgelse evaluerede man kvaliteten af mitokondrierne, som blev fremstillet med Centrifugerings-og massefylde gradient centrifugering via EM (figur 2) og Western blot (WB, figur 3). EM billeder viste, at i både kræft i æggestokkene og kontrol æggestokkene væv de vigtigste organeller isoleret var mitokondrier, bortset fra en lille mængde af peroxisomes. Den morfologi af mitokondrier ændret mere i æggestokkene kræft end kontrol æggestokkene væv (figur 2). WB-billeder viste, at den vigtigste bestanddel i forberedte mitokondrie prøver fra ovariecancer og kontrol æggestokke var mitokondrier, bortset fra en lille mængde af peroxisomer (figur 3). WB resultaterne var i overensstemmelse med de EM resultater. Det var rimeligt, at peroxyomer blev indeholdt i forberedt mitokondrier, fordi mitokondrier interagerer udførligt med peroxisomerne3,17,18, hvilket igen afspejler den funktionelle fuldstændighed af mitokondrierne. Disse resultater viste den høje kvalitet af de forberedte mitokondrie prøver.

Mængden af mitokondriel protein, som er fremstillet med denne protokol, var tilstrækkelig til yderligere analyse. Det er nødvendigt at opnå en tilstrækkelig mængde mitokondrie prøver fra kræft i æggestokkene og kontrollere æggestokkene væv. Denne undersøgelse kombinerede mitokondrie prøver fremstillet af syv æggestokkene Cancer væv, og fra 11 kontrol æggestokkene væv3. I alt 2.409 μg mitokondriel protein prøve blev opnået for kræft i æggestokkene, og 4.440 μg mitokondrial protein prøve for kontrol ovarie væv (tabel 1). Generelt for iTRAQ kvantitative proteomics, hver prøve har brug for mindst 600 μg proteiner (200 μg proteiner pr hver iTRAQ mærkning, 3 replikater). Derfor var de forberedte mitokondrie protein prøver tilstrækkelige til iTRAQ kvantitativ proteomics analyse.

Opnåelsen af det maksimale antal kvantificerede proteiner gavner den dybtgående undersøgelse af mitokondrier i human kræft i æggestokkene. Denne undersøgelse afslørede, identificerede, og kvantificerede 5.115 proteiner i æggestokkene kræft sammenlignet med kontrol ovarie væv, herunder 2.565 (50,14%) upregulerede proteiner (forholdet mellem kræft og kontrol > 1) og 2.550 (49,86%) nedregulerede proteiner (forholdet mellem kræft og kontrol < 1)3 (tabel 2). Desuden fastsatte denne undersøgelse 1.198 mtDEPs mellem ovariecancer og kontrol æggestokke med > 1,5 eller <-1,5 fold ændringer (p < 0,05), herunder 523 (43,66%) upregulerede proteiner og 675 (56,34%) nedregulerede proteiner4 (tabel 2). Disse data er i øjeblikket den største mitokondrie proteom profil i kræft i æggestokkene.

Figure 1
Figur 1: råmitokondrierne blev renset med diskontinuert massefylde gradient centrifugering for ovariecancer (A) og kontrol af æggestokkene (B) væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: elektron Mikrograf billede af mitokondrier isoleret fra kræft i æggestokkene (A) og kontrollere æggestokkene (B) væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: organelle-specifikke antistof-baserede Western blot billeder af mitokondrier isoleret fra kræft i æggestokkene (A) og kontrol æggestokkene (B) væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mitokondriel protein prøve Volumen (μL) Koncentration (μg/μL) Proteiner (μg)
Æggestokkene Cancer væv 530 4,545 2.409
Kontrol æggestokkene væv 750 5,92 4.440

Tabel 1: mængden af tilberedte mitokondrielle protein prøver.

Kategori Antallet af totale proteiner * Antallet af differentielt udtrykte proteiner#
Up-regulation 2.565 (50,14%) 523 (43,66%)
Nedregulering 2.550 (49,86%) 675 (56,34%)
Samlede 5.115 (100,0%) 1.198 (100,0%)
* Forholdet mellem kræft og kontrol er > 1 for up-regulation, < 1 for down-regulering.
# Ratio af kræft til kontrol er > 1.5 fold for up-regulation, og <-1,5 fold for ned-regulering.

Tabel 2: antallet af iTRAQ-identificerede proteiner fra tilberedte mitokondrie prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondrie ændringer er et kendetegn for kræft i æggestokkene. Forberedelse af høj kvalitet mitokondrie prøver fra humane ovariecancer og kontrol væv for store kvantitative proteomics gavne den dybtgående forståelse af mitokondrie funktion i æggestokkene Cancer patogenese og mitokondrie molekylære netværk ændringer, og hjælpe med at præcisere sin molekylære mekanisme til efterfølgende opdagelse af Target Therapy og effektive biomarkører baseret på mitokondrier4,5,8. Differentialhastighed centrifugering i kombination med tæthed gradient centrifugering effektivt isoleret og renset mitokondrier fra humane ovariecancer og kontrol æggestokkene væv. De forberedte mitokondrie prøver var af meget høj kvalitet og var egnede til yderligere kvantitativ proteomics analyse.

De forberedte mitokondrie prøver indeholdt en lille mængde af peroxisomer3,17,18 og cytosolisk proteiner19,20. Dette bør ikke blot betragtes som kontaminering, fordi de direkte eller indirekte interagere eller overholde mitokondrier at lade mitokondrier funktion mere fuldstændigt. Undersøgelser har fundet, at mitokondrier interagerer udførligt med actin cytoskelet19,20 og peroxisomerne17,18. Det er uundgåeligt for nogle cytosolisk proteiner og peroxysom proteiner, der skal være indeholdt i isolerede mitokondrie prøver.

Den vigtigste teknik til at detektere, identificere og kvantificere proteiner fra de forberedte mitokondrie prøver var iTRAQ mærkning-SCX-LC-MS/MS. Denne undersøgelse identificerede og kvantificerede 5.115 mitokondrie proteiner3, herunder 1.198 mtdeps4,14. Nyebestemmelser af mitokondrie proteiner findes i æggestokkene Cancer væv omfatter dem, der kan bidrage til at forstå rollen af mitokondrier i æggestokkene kræft patogenese og også være en ressource for opdagelsen af personlige mål terapi baseret på mitokondrie metabolisme8, og endda finde effektive biomarkører baseret på mitokondrie Genomics, proteomics, og metabolomics fra en systematisk multi-omics vinkel9,11,12,13. Desuden, med indførelsen af proteoform og protein arter begreber i proteome, dybdegående udforskning af mitokondrie proteoformer eller protein arter kan direkte føre til opdagelsen af effektive og pålidelige biomarkører og terapeutiske mål for kræft i æggestokkene10,21,22.

Endvidere, de nuværende protokoller i analyse af humane æggestokkene Cancer væv mitokondrie proteomer beskrevet her er let oversat til at studere andre menneskelige sygdom mitokondrie proteomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Hunan Provincial hundred talent plan (til X.Z.), Xiangya Hospital midler til talent Introduktion (til XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskuddene fra Kina "863" plan Projekt (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ) og Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 til XZ). X.Z. udtænkt konceptet for det nuværende manuskript, opnåede itraq kvantitative proteomics data af mitokondrier prøver, skrev og revideret manuskriptet, koordinerede det relevante arbejde, og var ansvarlig for den finansielle støtte og tilsvarende Arbejde. H.L. tilberedte mitokondrier prøver. S.Q. deltog i delvis arbejde. X. H. Z deltog i skriftligt og redigeret engelsk sprog. N.L. analyseret iTRAQ proteomics data. Alle forfattere godkendte det endelige manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

Tags

Kræftforskning kræft i æggestokkene mitokondrier differentialhastighed centrifugering tæthed gradient centrifugering isobarisk tag for relative og absolutte kvantificering (itraq) mærkning stærk kation udveksling (SCX) væskekromatografi (LC) tandem massespektrometri (MS/MS) mitokondrie proteom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter