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Cancer Research

Préparation des mitochondries à partir des tissus du cancer de l'ovaire et des tissus ovariens de contrôle pour l'analyse quantitative de la protéomique

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Cet article présente un protocole de centrifugation différentielle-vitesse en combination avec la centrifugation de gradient de densité pour séparer des mitochondries des tissus humains de cancer de l'ovaire et commander des tissus ovariens pour l'analyse quantitative de protéomique, résultant en un échantillon mitochondrial de haute qualité et l'analyse quantitative de protéomique à haut débit et à haute reproductibilité d'un protéome mitochondrial humain de cancer de l'ovaire.

Abstract

Le cancer de l'ovaire est un cancer gynécologique commun avec la mortalité élevée mais le mécanisme moléculaire peu clair. La plupart des cancers de l'ovaire sont diagnostiqués à un stade avancé, ce qui entrave sérieusement la thérapie. Les changements mitochondriaux sont une caractéristique des cancers de l'ovaire humain, et les mitochondries sont les centres du métabolisme énergétique, de la signalisation cellulaire et du stress oxydatif. Des informations approfondies sur les changements du protéome mitochondrial dans les cancers de l'ovaire par rapport au tissu ovarien témoin bénéficieront d'une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires du cancer de l'ovaire, et de la découverte de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques efficaces et fiables. Une méthode efficace de préparation mitochondriale couplée à une étiquette isobarique pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) des protéomiques quantitatifs sont présentées ici pour analyser le cancer de l'ovaire humain et contrôler les protéomes mitochondriaux, y compris la centrifugation à vitesse différentielle, la centrifugation du gradient de densité, l'évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, la digestion des protéines avec la trypsine, l'étiquetage iTRAQ, la fractionnement fort de l'échange de cation (SCX), la chromatographie liquide (LC), la spectrométrie de masse en tandem (MS/ MS), l'analyse de base de données, et l'analyse quantitative des protéines mitochondriales. De nombreuses protéines ont été identifiées avec succès afin de maximiser la couverture du protéome mitochondrial du cancer de l'ovaire humain et d'atteindre le profil de protéines mitochondriales exprimé s'exprimant différemment dans les cancers de l'ovaire humain.

Introduction

Le cancer de l'ovaire est un cancer gynécologique commun avec une mortalité élevée mais mécanisme moléculaire peu clair1,2. La plupart des cancers de l'ovaire sont diagnostiqués à un stade avancé, ce qui entrave sérieusement la thérapie. Les changements mitochondriaux sont une caractéristique des cancers de l'ovaire humain, et les mitochondries sont les centres du métabolisme énergétique, de la signalisation cellulaire et du stress oxydatif3,4,5,6,7. Des informations approfondies sur les changements du protéome mitochondrial dans les cancers de l'ovaire par rapport au tissu ovarien témoin bénéficieront d'une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires du cancer de l'ovaire, et de la découverte de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques efficaces et fiables. Le métabolisme mitochondrial a été proposé et identifié comme cible pour la thérapie de cancer, et la thérapie antimitochondriale pourrait finalement être très salutaire pour empêcher la répétition et la métastes du cancer8. Le profilage métabolique individuel est également déjà pratiqué comme un outil utile pour la stratification du cancer et les stratégies prédictives9,10.

L'objectif à long terme de cette recherche est de développer et d'utiliser une méthode quantitative de protéomique mitochondriale pour étudier le cancer de l'ovaire pour clarifier les altérations du protéome mitochondrial entre le cancer de l'ovaire et les tissus ovariens témoins, et leurs altérations du réseau moléculaire à partir d'un angle multi-omique systématique11,12, qui se traduira par la découverte de mitochondries ciblées biomarqueurs moléculaires13 pour la clarification des mécanismes moléculaires du cancer de l'ovaire, et le traitement personnalisé des patients atteints du cancer de l'ovaire. Les étiquettes isobariques pour l'étiquetage relatif et absolu (iTRAQ)3,4 sont une méthode efficace pour quantifier les changements de protéine mitochondriale. La préparation d'échantillons mitochondriaux de haute qualité provenant du cancer de l'ovaire humain et des tissus ovariens témoins est la condition préalable à l'analyse quantitative iTRAQ des protéomes mitochondriaux3. La préparation mitochondriale couplée à la protéomique quantitative iTRAQ a été utilisée avec succès dans des programmes de recherche à long terme sur le protéome mitochondrial du cancer de l'ovaire humain, y compris l'établissement de cartes de référence du protéome mitochondrial3, l'analyse des profils mitochondriaux exprimés différemment4,14 et des modifications post-traductionnelles, y compris la phosphorylation, qui a déjà abouti à la découverte d'importantes voies de signalisation. changements de réseau dans les cancers humains de l'ovaire5, y compris les altérations du métabolisme énergétique4, le métabolisme des lipides, et mitophagie voies-systèmes3.

Des études antérieures ont révélé que la centrifugation à vitesse différentielle en combinaison avec la centrifugation de gradient de densité est une méthode efficace pour isoler et purifier les mitochondries du cancer de l'ovaire humain et contrôler les tissus ovariens3,4,5,14. L'étiquetage iTRAQ couplé à un échange de cation forte (SCX)-chromatographie liquide (LC)-tandem spectrométrie de masse (MS/MS) est la technique clé pour détecter, identifier et quantifier les protéines des échantillons mitochondriaux préparés.

Ici, des protocoles détaillés pour la préparation mitochondriale coupléavec à la protéomique quantitative d'iTRAQ sont décrits. Ceux-ci ont été utilisés avec succès dans l'analyse des protéomes mitochondriaux de tissu de cancer de l'ovaire humain. Les protocoles comprennent la préparation d'échantillons, la centrifugation à vitesse différentielle, la centrifugation du gradient de densité, l'évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, la digestion des protéines avec la trypsine, l'étiquetage iTRAQ, la fractionnement SC, La SP, la SP/MS, la recherche de base de données et l'analyse quantitative des protéines mitochondriales. En outre, ce protocole se traduit facilement pour analyser d'autres protéomes mitochondriaux de tissu humain.

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Protocol

Des échantillons de tissus ovariens, y compris des tissus du cancer de l'ovaire (n - 7) et des tissus ovariens témoins normaux (n - 11) ont été utilisés pour ce protocole. Le protocole actuel3,4,5 est approuvé par le Comité d'éthique médicale de l'hôpital Xiangya de l'Université Centrale du Sud, Chine.

1. Préparation des mitochondries à partir de tissus humains du cancer de l'ovaire

  1. Préparer 250 ml de tampon d'isolement mitochondrial en mélangeant 210 mM de mannitol, 70 mM de saccharose, 100 mM de chlorure de potassium (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM d'acide tétraacétique diamineux (EDTA), 0,1 mM d'éthylène glycol bis (2-éthyle)acide tétraacétique (EGTA), 1 mM inhibiteur de la protéase du phénylmethanesulfonyl (PMSF), 2 mM d'orthovanadate de sodium (V) et 0,2 % d'albumine de sérum bovin (BSA), pH 7,4.
  2. Placer 1,5 g de tissus du cancer de l'ovaire dans un plat en verre propre.
  3. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial pré-réfrigéré pour laver légèrement le sang de la surface du tissu 3x.
  4. Utilisez des ciseaux ophtalmiques propres pour hacher complètement le tissu en morceaux d'environ 1 mm3, et transférer les tissus hachés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml.
  5. Ajouter 13,5 mL de tampon d'isolement mitochondrial contenant 0,2 mg/mL de nagarse, puis utiliser un homogénéisateur électrique pour homogénéiser (utiliser l'échelle 2, 10 s 6x, intervalle 10 s) les tissus hachés (2 min, 4 oC).
  6. Ajouter un autre 3 ml de tampon d'isolement mitochondrial dans les homogénéités tissulaires et bien les mélanger par pipetting.
  7. Centrifuger le tissu préparé homogénéisé (1 300 x g, 10 min, 4 oC). Retirez la fraction nucléaire brute (c.-à-d. la pastille) et gardez le supernatant.
  8. Recentrifuge le supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 oC). Retirez les microsomes (c.-à-d. le supernatant) et gardez le granule.
  9. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial et resuspendre le puits de granule par tuyauterie légère.
  10. Centrifugeuse suspension à granulés (7 000 x g, 10 min, 4 oC). Jetez le supernatant et gardez les mitochondries brutes (c.-à-d. la pastille).
  11. Ajouter 12 ml de milieu de gradient de densité de 25 % (c.-à-d. Nycodenz) pour suspendre à nouveau les mitochondries brutes extraites.
  12. Faire un gradient de densité discontinue en remplissant un tube de bas en haut avec 5 ml de 34 %, 8 ml de 30 %, 12 ml de 25 % (contenant les mitochondries brutes de l'étape 1,11), 8 ml de 23 % et 3 ml de gradient de densité moyenne de 20 %, et la centrifugeuse (52 000 x g, 90 min, 4 oC).
  13. Utilisez une seringue longue et émoussée pour recueillir les mitochondries purifiées à l'interface entre le milieu de gradient de densité de 25 % et 30 % dans un tube propre.
  14. Ajouter un tampon d'isolement mitochondrial dans les mitochondries recueillies pour le diluer à un volume triple. Centrifugeuse (15 000 x g, 20 min, 4 oC) et jeter le supernatant.
  15. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial pour resuspendre la pastille et la centrifugeuse (15 000 x g,20 min, 4 oC). Jeter le supernatant et garder la boulette.
  16. Recueillir la pastille finale (c.-à-d. les mitochondries purifiées) et la stocker à -20 oC.
    REMARQUE : Combinez toutes les mitochondries purifiées du tissu de cancer de l'ovaire comme échantillon de mitochondries pour l'analyse quantitative de protéomique.

2. Préparation des mitochondries à partir de tissus ovariens témoins humains

  1. Préparer 250 ml du tampon d'isolement mitochondrial tel que décrit à l'étape 1.1.
  2. Placer 1,5 g des tissus ovariens témoins normaux dans un plat en verre propre.
  3. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial préréfrigéré pour laver légèrement le sang de la surface du tissu 3x.
  4. Utilisez des ciseaux ophtalmiques propres pour hacher complètement le tissu en morceaux d'environ 1 mm3, et transférer les tissus hachés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml.
  5. Ajouter 8 ml de trypsine/20 mM EDTA à la saline tamponnée de phosphate (PBS) dans les tissus témoins hachés, et digérer (30 min, température ambiante), ce qui aide à lyser les tissus et les cellules et à libérer les mitochondries. Puis centrifugeuse (200 x g, 5 min). Jeter le supernatant, et garder les tissus et les cellules.
  6. Ajouter 13,5 mL de tampon d'isolement mitochondrial contenant 0,2 mg/mL de nagarse, puis utiliser un homogénéisateur électrique pour homogénéiser (utiliser l'échelle 2, 10 s 6x, intervalle 10 s) les tissus hachés (2 min, 4 oC).
  7. Ajouter un autre 3 ml de tampon d'isolement mitochondrial dans les homogénéités tissulaires et bien les mélanger par pipetting.
  8. Centrifuger le tissu préparé homogénéisé (1 300 x g, 10 min, 4 oC). Retirez la fraction nucléaire brute (c.-à-d. la pastille) et gardez le supernatant.
  9. Recentrifuge le supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 oC). Retirez les microsomes (c.-à-d. le supernatant) et gardez le granule.
  10. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial pour resuspendre le puits de granule par tuyauterie légère.
  11. Centrifugeuse suspension à granulés (7 000 x g, 10 min, 4 oC). Jetez le supernatant et gardez les mitochondries brutes (c.-à-d. la pastille).
  12. Ajouter 12 ml de gradient de densité de 25 % moyen pour resuspendre les mitochondries brutes extraites.
  13. Faire un gradient de densité discontinue en remplissant un tube de bas en haut avec 8 ml de 38 %, 5 ml de 34 %, 8 ml de 30 %, 12 ml de 25 % (contenant les mitochondries brutes de l'étape 2,12), 8 ml de 23 % et 3 ml de gradient de densité moyenne de 20 %, et la centrifugeuse (52 000 x g, 90 min, 4 oC).
  14. Utilisez une seringue longue et émoussée pour recueillir les mitochondries purifiées dans la gamme de l'interface entre 25% et 30% à l'interface entre 34% et 38% dans un tube propre.
  15. Ajouter un tampon d'isolement mitochondrial dans les mitochondries recueillies pour le diluer à un volume triple. Centrifugeuse (15 000 x g, 20 min, 4 oC) et jeter le supernatant.
  16. Ajouter 2 ml de tampon d'isolement mitochondrial pour resuspendre la pastille et la centrifuger (15 000 x g, 20 min, 4 oC). Jeter le supernatant et garder la boulette.
  17. Recueillir la pastille finale (c.-à-d. les mitochondries purifiées) et la stocker à -20 oC.
    REMARQUE : Combinez toutes les mitochondries purifiées du tissu ovarien témoin comme échantillons mitochondriaux pour l'analyse quantitative de protéomique.

3. Vérification de la qualité des échantillons mitochondriaux purifiés de tissu

  1. Prenez un tube d'échantillons mitochondriaux purifiés (c.-à-d. les granulés des tissus du cancer de l'ovaire à partir de l'étape 1.16 et les tissus ovariens témoins de l'étape 2.17) pour la vérification par microscopie électronique (EM).
    REMARQUE: Le protocole détaillé a été décrit précédemment15,16.
  2. Préparer le tampon d'extraction de protéines mitochondriales en mélangeant 8 M d'urée, 2 M de thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (TNt), et 4 % (w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS). Ajuster le pH à 8,52.
  3. Prenez un tube d'échantillons mitochondriaux purifiés (c.-à-d. les granulés des tissus du cancer de l'ovaire à l'étape 1.16 et les tissus ovariens témoins à l'étape 2.17) et ajoutez un tampon d'extraction de protéines mitochondriales (échantillons mitochondriaux au tampon d'extraction de protéines, 1:5) à resuspendre la pastille. Congeler les échantillons dans de l'azote liquide 3x et les conserver à température ambiante pendant 2 h.
  4. Centrifugeuse à 12 000 x g, 30 min, 4 oC, collecte le supernatant (c.-à-d. l'échantillon de protéines mitochondriales extraits) et mesure la teneur en protéines à l'égard d'un kit d'analyse des protéines d'acide caninchoninique (BCA).
  5. Préparer 50 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) en mélangeant 9,08 g de Tris et 40 ml de ddH2O, en ajustant le pH à 8,8 à l'aide de HCl, et en ajoutant ddH2O à un volume final de 50 ml. Conserver à 4 oC.
  6. Préparer 50 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6,8) en mélangeant 6,06 g de Tris et 40 ml de ddH2O, en ajustant le pH à 6,8 à l'aide de HCl, et en ajoutant ddH2O à un volume final de 50 ml. Conserver à 4 oC.
  7. Préparer 100 ml de solution d'acrylamide-bis à 30% en mélangeant 29 g d'acrylamide, 1 g de bis-acrylamide, et 80 mL de ddH2O, et en ajoutant ddH2O à un volume final de 100 ml. Conservez-le dans une bouteille brune à 4 oC.
  8. Préparer 1 000 ml de tampon d'électrophorèse de 10x tris-glycine en mélangeant 29 g de glycine, 58 g de Tris, 3,7 g de sulfate de dodecyl de sodium (SDS), et 800 mL de ddH2O, puis en ajoutant ddH2O à un volume final de 1 000 ml.
  9. Préparer 10 ml de tampon de chargement en mélangeant 2 ml de glycérine, 0,02 g de bleu bromophénol, 0,4 g de SDS, 2 mL de Tris-HCl pH 6,8, et 7 mL de ddH2O, puis en ajoutant ddH2O à un volume final de 10 ml.
  10. Préparer 10 mL de 10% de sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gel de résolution en mélangeant 4 mL de ddH2O, 3,3 mL de solution d'acrylamide-Bis à 30 %, 2,5 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml de 10 % de SDS, 0,1 mL de persulfate à 10 % d'ammonium et 0,004 mL de tétramethylènediamine (TEMED). Verser la solution de gel de résolution SDS-PAGE dans la plaque entre les plaques de verre au niveau du fond du peigne. Ajouter 2 ml d'alcool isopropyl sur le dessus. Laisser reposer 30 min.
  11. Retirer l'alcool isopropyl et laver le dessus avec ddH2O 3x. Verser la solution de gel de concentration de 5 % contenant 4,1 ml de ddH2O, 1,0 mL de solution d'acylamide-bis de 30 %, 0,75 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 mL de 10 % de SDS, 0,06 mL de persulfate d'amsulium de 10 % et 0,006 mL de TEMED. Insérez immédiatement le peigne dans la solution de gel de concentration, laissez-le pendant 30 min, puis sortez le peigne.
  12. Préparer le tampon 1x Tris-glycine électrophoresis en diluant 100 ml de 10x Tris-glycine electrophoresis tampon avec 900 mL de ddH2O et verser dans le réservoir électrophoretic.
  13. Mélanger 30 g de protéines mitochondriales du cancer de l'ovaire et contrôler les tissus ovariens de l'étape 3.4 avec un tampon de chargement pour atteindre un volume final de 20 l. Faire bouillir le mélange pendant 5 min, puis séparer avec le gel de résolution SDS-PAGE de 10 % à l'aide d'une tension constante de 100 V. Lorsque le bleu bromphénol atteint le fond, arrêtez l'électrophoresis.
  14. Préparer 1,5 L de tampon de transfert électrophorétic en mélangeant 150 mL de tampon d'électrophorèse Tris-glycine 10x, 1 050 mL de ddH2O et 300 mL de méthanol.
  15. Faire tremper la membrane PVDF dans 100% de méthanol pendant 10 min et dans un tampon de transfert électrophoretique pendant au moins 5 minutes. Tremper cinq feuilles de papier filtre dans un tampon de transfert elecrophorétique 1x pendant au moins 5 minutes.
  16. Sortez le gel SDS-PAGE contenant les protéines et trempez-le dans un tampon de transfert électrophoretique pendant 10 min.
  17. Faire une cassette de transfert en plaçant une éponge humide sur la plaque blanche, trois feuilles de papier filtre humide, la membrane PVDF, le gel SDS-PAGE avec les protéines, deux feuilles de papier filtre humide, et l'éponge humide de bas en haut. Évitez les bulles.
  18. Placez la cassette de transfert dans le réservoir électrophorétic, versez dans le tampon de transfert électrophoretique, puis transférez pendant 2 h sous un courant constant de 200 mA.
  19. Préparer 10x Solution de stock saline tamponnée Tris (TBS) en mélangeant 12,114 g de Tris, 29,22 g de NaCl, et en ajoutant ddH2O à un volume final de 500 ml. Préparer 2 L de 1x TBST en mélangeant 200 mL de 10x TBS, 2 mL de Tween-20 et 1 798 ml de ddH2O. Préparer 100 ml de solution de blocage en mélangeant 100 mL de TBST et 5 g de BSA.
  20. Après le transfert, retirer la membrane PVDF, laver légèrement dans le TBST pendant 5 min, puis le bloquer dans la solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.
  21. Incuber la membrane PVDF (4 oC pendant la nuit) avec différents anticorps primaires spécifiques à différents organites subcellulaires, y compris la lamin B (noyau cellulaire; anticorps anti-humains caprins 1 : solution de blocage de 1 000), flottille-1 (cytomembrane; lapin anti-humain anticorps 1:500 solution de blocage), COX4I1 (mitochondrie; lapin anti-humain 1:1,000 solution de blocage), GM130 (appareil Golgi; souris anticorps anti-humains 1:1,000 solution de blocage), catalase (peroxysome; lapin anticorps anti-humain 1:1,000 blocage solution), et cathepsin B (lysosome; lapin anticorps anti-humain 1:1,000 solution de blocage). Laver légèrement dans le TBST pendant 5 min 3x.
  22. Incuber la membrane PVDF pendant 1 h à température ambiante avec les anticorps secondaires correspondants (anti-chèvre de lapin, chèvre anti-lapin, ou chèvre anti-souris). Laver légèrement dans le TBST pendant 5 min 3x. Visualisez-le avec l'électrochimie (ECL).

4. analyse iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

REMARQUE : Les procédures détaillées de l'article 4 font référence aux instructions de l'iTRAQ(Tableau des matériaux).

  1. Ajouter le tampon SDT (4 % de SDS, 100 mM tris-HCl pH 7,6 et 100 mM DTT) aux échantillons mitochondriaux purifiés (c.-à-d. les granulés des tissus du cancer de l'ovaire à partir de l'étape 1,16 et les tissus ovariens témoins de l'étape 2,17). Vortex l'échantillon jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de précipitation visible.
    REMARQUE : Le ratio tampon de l'échantillon mitochondrial au SDT doit être de 1:5.
  2. Faire bouillir l'échantillon traité au TDS pendant 5 min, refroidir l'échantillon sur la glace, puis centrifuger (2 000 x g, 2 min).
  3. Recueillir le supernatant comme échantillons de protéines mitochondriales extraits et mesurer la teneur en protéines avec un kit d'analyse des protéines BCA.
  4. Prenez les protéines mitochondriales extraites de SDT (200 g de chaque échantillon) pour la réduction, l'alkylation, la digestion avec la trypsine, le dessalement et la lyophilisation3,4. Faites trois répliques pour chaque échantillon.
  5. Traiter les peptides tryptiques (100 g de chaque échantillon) à partir de l'étape 4.4 avec 100 mM solution de bromure d'ammonium tétraéthyle (pH 8,5), et étiqueter les peptides tryptiques avec l'un des réactifs iTRAQ 6 plex selon ses instructions3,4. Étiqueter chaque échantillon 3x.
  6. Mélanger également 6 échantillons de peptide tryptique étiquetés (trois à partir de tissus du cancer de l'ovaire et trois de tissus ovariens témoins), et sécher avec un concentrateur sous vide.
  7. Fractionner les peptides mélangés étiquetés iTRAQ avec la chromatographie SCX en 60 fractions (une fraction par 1 min), puis combiner toutes les deux fractions comme un échantillon fractionné SCX (n - 30).
  8. Soumettez chaque échantillon fractionné de SCX à l'analyse LC-MS/MS sur un spectromètre de masse3,4 couplé à un nano système LC dans un gradient de séparation LC de 60 min pour obtenir des données sur la SP/SP.
  9. Rechercher les données MS/MS pour identifier les protéines avec le moteur de recherche (Tableau des matériaux).
  10. Utilisez les intensités de reporter-ion iTRAQ pour quantifier chaque protéine et déterminer les protéines exprimées différemment par les mitochondries (mtDEP) avec un changement de 1,5 ou de 1,5 fois, et de p 'lt; 0,05.

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Representative Results

Il y avait une différence dans la préparation des mitochondries des tissus de cancer de l'ovaire et des tissus ovariens de contrôle. Cette étude a révélé qu'il était beaucoup plus facile de préparer des mitochondries à partir de tissus du cancer de l'ovaire que des tissus ovariens témoins3,4. Certaines améliorations ont dû être apportées au protocole pour la préparation des mitochondries à partir de tissus ovariens témoins. Tout d'abord, avant l'homogénéisation des tissus, il était nécessaire d'ajouter 8 ml de trypsine/20 mM EDTA de 0,05 % dans la solution PBS ajoutée aux tissus témoins hachés, suivie d'une digestion de 30 min à température ambiante, et d'une centrifugation à 200 x g pendant 5 min (voir l'étape du protocole 2,5). Ceci a amélioré la préparation des mitochondries. Deuxièmement, le gradient de densité discontinue était différent pour la préparation des mitochondries à partir de tissus ovariens témoins et de tissus du cancer de l'ovaire (figure 1). Pour les tissus du cancer de l'ovaire, il a été préparé en ajoutant 5 ml de 34%, 8 ml de 30%, 12 ml de 25% (contenant les mitochondries brutes), 8 ml de 23%, et 3 ml de gradient de densité de 20% milieu de fond en haut dans un tube. Les mitochondries purifiées ont été trouvées à l'interface entre 25% et 30% après centrifugation (Figure 1A, voir les étapes du protocole 1.12 et 1.13). Pour le contrôle des tissus ovariens, il a été préparé en ajoutant 8 ml de 38 %, 5 ml de 34 %, 8 ml de 30 %, 12 ml de 25 % (contenant les mitochondries brutes), 8 ml de 23 % et 3 ml de gradient de densité de 20 % moyen de fond en haut dans un tube. Dans ce cas, les mitochondries purifiées étaient dans la gamme de l'interface entre 25% et 30% à l'interface entre 34% et 38% après centrifugation (Figure 1B, voir les étapes du protocole 2.13 et 2.14).

Le protocole a obatined des échantillons mitochondriaux de haute qualité. Des échantillons mitochondriaux de haute qualité sont la condition préalable à la protéomique mitochondriale quantitative. Cette étude a évalué la qualité des mitochondries qui ont été préparées à l'aide d'une centrifugation à vitesse différentielle et d'une centrifugation du gradient de densité par l'intermédiaire de l'EM (figure 2) et de la tache occidentale (WB, figure 3). Les images d'EM ont démontré que dans les cancers ovariens et les tissus ovariens témoins les organites principaux isolés étaient des mitochondries, excepté une petite quantité de peroxysomes. La morphologie des mitochondries a plus changé dans les cancers de l'ovaire que dans le contrôle des tissus ovariens (figure 2). Les images de la BM ont démontré que la principale composante des échantillons mitochondriaux préparés des cancers de l'ovaire et des ovaires témoins était les mitochondries, à l'exception d'une petite quantité de peroxysomes (figure 3). Les résultats de la Banque mondiale étaient conformes aux résultats de la SE. Il était raisonnable pour les peroxysomes d'être contenus dans les mitochondries préparées, parce que les mitochondries interagissent intensivement avec les peroxysomes3,17,18, qui reflètent à leur tour l'exhaustivité fonctionnelle des mitochondries. Ces résultats ont démontré la haute qualité des échantillons mitochondriaux préparés.

La quantité de protéine mitochondriale préparée avec ce protocole était suffisante pour une analyse plus approfondie. Il est nécessaire d'obtenir une quantité suffisante d'échantillons mitochondriaux du cancer de l'ovaire et de contrôler les tissus ovariens. Cette étude a combiné les échantillons mitochondriaux préparés à partir de sept tissus du cancer de l'ovaire, et de 11 tissus ovariens témoins3. Un total de 2 409 g d'échantillon de protéines mitochondriales a été obtenu pour les cancers de l'ovaire, et 4 440 g d'échantillon de protéines mitochondriales pour le tissu ovarien témoin (tableau 1). En général, pour la protéomique quantitative iTRAQ, chaque échantillon a besoin d'au moins 600 protéines g (200 protéines g par étiquette iTRAQ, 3 répliques). Par conséquent, les échantillons préparés de protéine mitochondriale étaient suffisants pour l'analyse quantitative de protéomique d'iTRAQ.

La réalisation du nombre maximum de protéines quantifiées bénéficie de l'étude approfondie des mitochondries dans le cancer de l'ovaire humain. Cette étude a détecté, identifié et quantifié 5 115 protéines dans les cancers de l'ovaire par rapport aux tissus ovariens témoins, dont 2 565 (50,14 %) protéines à taux de régulé (rapport des cancers aux témoins n.1) et 2 550 (49,86 %) protéines régulées (ratio des cancers aux témoins 'lt;1)3 (tableau 2). De plus, cette étude a permis de déterminer 1 198 mtDEP entre les cancers de l'ovaire et les ovaires témoins avec des changements de plis (p et 0,05 %), dont 523 (43,66 %) protéines régulées et 675 (56,34 %) protéines régulées à la baisse4 (tableau 2). Ces données sont actuellement le plus grand profil de protéome mitochondrial dans le cancer de l'ovaire.

Figure 1
Figure 1 : Les mitochondries brutes ont été purifiées avec la centrifugation discontinude de gradient de densité pour le cancer de l'ovaire (A) et contrôlent les tissus ovariens (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Image micrographique électronique des mitochondries isolées du cancer de l'ovaire (A) et contrôlent les tissus ovariens (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Images de taches occidentales à base d'anticorps spécifiques à organelle des mitochondries isolées du cancer de l'ovaire (A) et des tissus de contrôle de l'ovaire (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Échantillon de protéines mitochondriales Volume (L) Concentration (g/L) Protéines (g)
Tissu du cancer de l'ovaire 530 4.545 2,409
Contrôler le tissu ovarien 750 5.92 4,440

Tableau 1 : Quantité d'échantillons de protéines mitochondriales préparés.

Catégorie Le nombre total de protéines Le nombre de protéinesexprimées différemment
Réglementation à la hausse 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Réglementation à la baisse 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
Total 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
Le ratio des cancers aux contrôles est le premier pour la mise en place de la réglementation, le lt;1 pour la réglementation vers le bas.
# Le ratio des cancers aux témoins est de 1,5 fois pour la réglementation up, et de 1,5 fois pour la régulation des redowns.

Tableau 2 : Nombre de protéines identifiées par iTRAQ à partir d'échantillons mitochondriaux préparés.

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Discussion

Les altérations mitochondriales sont une caractéristique du cancer de l'ovaire. La préparation d'échantillons mitochondriaux de haute qualité provenant du cancer de l'ovaire humain et des tissus témoins pour la protéomique quantitative à grande échelle bénéficie de la compréhension approfondie de la fonction mitochondriale dans la pathogénie du cancer de l'ovaire et les changements du réseau moléculaire mitochondrial, et aide à clarifier son mécanisme moléculaire pour la découverte ultérieure de la thérapie cible et des biomarqueurs efficaces basés sur les mitochondries4,5,8. La centrifugation à vitesse différentielle en combinaison avec la centrifugation de gradient de densité a effectivement isolé et purifié des mitochondries du cancer de l'ovaire humain et contrôle des tissus ovariens. Les échantillons mitochondriaux préparés étaient de très haute qualité et convenaient à une analyse protéomique quantitative plus poussée.

Les échantillons mitochondriaux préparés contenaient une petite quantité de peroxysomes3,17,18 et protéines cytosoliques19,20. Cela ne doit pas être simplement considéré comme une contamination, car ils interagissent directement ou indirectement ou adhèrent avec les mitochondries pour laisser les mitochondries fonctionner plus complètement. Des études ont révélé que les mitochondries interagissent largement avec le cytosquelette d'actine19,20 et les peroxysomes17,18. Il est inévitable que certaines protéines cytosoliques et les protéines peroxysomes soient contenues dans des échantillons mitochondriaux isolés.

La technique clé pour détecter, identifier et quantifier les protéines des échantillons mitochondriaux préparés était l'étiquetage iTRAQ-SCX-LC-MS/MS. Cette étude a identifié et quantifié 5 115 protéines mitochondriales3, dont 1 198 mtDEP4,14. Le grand nombre de protéines mitochondriales trouvées dans les tissus du cancer de l'ovaire comprend ceux qui peuvent aider à comprendre le rôle des mitochondries dans la pathogénie du cancer de l'ovaire et aussi être une ressource pour la découverte de la thérapie cible personnalisée basée sur le métabolisme mitochondrial8, et même trouver des biomarqueurs efficaces basés sur la génomique mitochondriale, la protéomique, et la métabolomique à partir d'un angle systématique multi-omiques9,11,12,13. En outre, avec l'introduction de concepts d'espèces protéoformes et protéiques dans le protéome, l'exploration en profondeur des protéoformes mitochondriaux ou des espèces protéiques pourrait directement conduire à la découverte de biomarqueurs efficaces et fiables et de cibles thérapeutiques pour le cancer de l'ovaire10,21,22.

En outre, les protocoles actuels dans l'analyse des protéomes mitochondriaux de tissu de cancer de l'ovaire humain décrits ici sont facilement traduits pour étudier d'autres protéomes mitochondriales de maladie humaine.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Hunan Provincial Hundred Talent Plan (à X.Z.), le Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (à XZ), la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 et 81272798 à XZ), les subventions de la Chine "863" Plan Projet (Grant No. 2014AA020610-1 à XZ), et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Hunan de Chine (Grant No. 14JJ7008 à XZ). X.Z. a conçu le concept du présent manuscrit, a obtenu les données quantitatives de protéomique iTRAQ des échantillons de mitochondries, a écrit et révisé le manuscrit, a coordonné le travail pertinent, et a été responsable du soutien financier et correspondant Travail. H.L. a préparé des échantillons de mitochondries. S.Q. a participé à des travaux partiels. X.H.Z a participé à l'écriture et à l'édition de l'anglais. N.L. a analysé les données protéomiques d'iTRAQ. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

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References

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Recherche sur le cancer numéro 153 cancer de l'ovaire mitochondries centrifugation à vitesse différentielle centrifugation du gradient de densité étiquette isobarique pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) échange de cation forte (SCX) chromatographie liquide (LC) spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) protéome mitochondrial
Préparation des mitochondries à partir des tissus du cancer de l'ovaire et des tissus ovariens de contrôle pour l'analyse quantitative de la protéomique
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Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

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