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Cancer Research

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Dieser Artikel stellt ein Protokoll der Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation vor, um Mitochondrien von menschlichen Eierstockkrebsgeweben zu trennen und Eierstockgewebe für die quantitative Proteomik-Analyse zu kontrollieren, eine hochwertige mitochondriale Probe und eine quantitative Proteomikanalyse mit hohem Durchsatz und hoher Reproduzierbarkeit eines humanen Ovarialkarzinoms mitochondrialem Proteom.

Abstract

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen menschlicher Eierstockkrebserkrankungen, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, der Zellsignalisierung und des oxidativen Stresses. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Eine effektive mitochondriale Präparationsmethode in Verbindung mit einem isobarischen Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) quantitative Proteomik werden hier vorgestellt, um menschlichen Eierstockkrebs zu analysieren und mitochondriale Proteome zu kontrollieren, einschließlich Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, starke Kationenaustauschfraktionierung (SCX), Flüssigkeitschromatographie (LC), Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS), Datenbankanalyse und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Viele Proteine wurden erfolgreich identifiziert, um die Abdeckung des humanen Ovarialkarzinoms zu maximieren und das differenziell exprimierte mitochondriale Proteinprofil bei menschlichen Eierstockkrebs zu erreichen.

Introduction

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus1,2. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von menschlichen Eierstockkrebs, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress3,4,5,6,7. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Mitochondrialer Stoffwechsel wurde vorgeschlagen und als Ziel für die Krebstherapie anerkannt, und antimitochondriale Therapie könnte letztlich sehr vorteilhaft für die Verhinderung des Wiederauftretens und Metastasierung von Krebs8sein. Individuelle metabolische Profilerstellung wird auch bereits als nützliches Werkzeug für Krebsschichtung und Vorhersagestrategien9,10praktiziert.

Das langfristige Ziel dieser Forschung ist die Entwicklung und Verwendung einer quantitativen mitochondrialen Proteomik-Methode zur Untersuchung von Eierstockkrebs zur Klärung von mitochondrialen Proteomveränderungen zwischen Eierstockkrebs und Kontrolle von Eierstockgeweben und deren molekularen Netzwerkveränderungen aus einem systematischen Multiomics-Winkel11,12, was zur Entdeckung von mitochondrienzielorientierten molekularen Biomarkern13 zur Klärung der molekularen Mechanismen von und personalisierte Behandlung von Eierstockkrebspatienten. Isobarische Tags für die relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Kennzeichnung3,4 sind eine effektive Methode, um die mitochondrialen Proteinveränderungen zu quantifizieren. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus humanem Eierstockkrebs und die Kontrolle von Eierstockgeweben sind die Voraussetzung für die quantitative iTRAQ-Analyse von mitochondrialen Proteomen3. Mitochondriale Präparat in Verbindung mit iTRAQ quantitative proteomics wurde erfolgreich in langfristigen Forschungsprogrammen über den menschlichen Eierstockkrebs mitochondrialen Proteom verwendet, einschließlich der Einrichtung von mitochondrialen Proteom Referenzkarten3, die Analyse von differenziell exprimierten mitochondrialen Profilen4,14 und post-translational Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung, die bereits zur Entdeckung eines wichtigen Signalwegs geführt hat Netzwerkveränderungen bei menschlichen Eierstockkrebs5, einschließlich Veränderungen im Energiestoffwechsel4, Fettstoffwechsel, und Mitophagie-Signalweg-Systeme3.

Frühere Studien haben herausgefunden, dass Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation eine effektive Methode ist, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs zu isolieren und zu reinigen und Eierstockgewebe3,4,5,14zu kontrollieren. Die iTRAQ-Etikettierung in Verbindung mit starker Kationenaustausch (SCX)-Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist die Schlüsseltechnik, um die Proteine aus den vorbereiteten mitochondrialen Proben zu erkennen, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Hier werden detaillierte Protokolle für die mitochondriale Präparation in Verbindung mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik beschrieben. Diese wurden erfolgreich bei der Analyse von humanen Eierstockkrebsgewebe mitochondrialen Proteomen eingesetzt. Die Protokolle umfassen die Vorbereitung von Proben, Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, SCX-Fraktionierung, LC, MS/MS, Datenbanksuche und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokoll leicht, um andere menschliche Gewebe mitochondriale Proteome zu analysieren.

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Protocol

Für dieses Protokoll wurden Eierstockgewebe einschließlich Eierstockkrebsgewebe (n = 7) und normales Kontroll-Ovarialgewebe (n = 11) verwendet. Das vorliegende Protokoll3,4,5 ist von der Xiangya Hospital Medical Ethics Committee of Central South University, China, genehmigt.

1. Präparation von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe

  1. Vorbereiten 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers durch Mischen von 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM Diaminetetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Ethylenglykol bis(2-Aminoethylether)Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Proteaseinhibitor, 2 mM Natriumorthovanadate (V) und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,4.
  2. Legen Sie 1,5 g Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.
  3. Fügen Sie 2 ml des vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffers hinzu, um das Blut von der Gewebeoberfläche 3x leicht zu waschen.
  4. Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm3 Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.
  5. Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).
  6. Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
  7. Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.
  8. Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.
  9. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet durch leichte Pipettierung gut aus.
  10. Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.
  11. Fügen Sie 12 ml mit 25% Dichtegradientenmedium (d.h. Nycodenz) hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.
  12. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 5 ml 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien ab Schritt 1,11), 8 ml von 23% und 3 ml 20% Dichtegradientenmedium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 °C) füllen.
  13. Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Schnittstelle zwischen dem 25% und 30% Dichtegradientenmedium in ein sauberes Rohr zu sammeln.
  14. Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.
  15. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder auszusetzen, und Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.
  16. Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Eierstockkrebsgewebe als Mitochondrienprobe für die quantitative Proteomik-Analyse.

2. Herstellung von Mitochondrien aus dem eierrischen Gewebe der menschlichen Kontrolle

  1. Bereiten Sie 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Legen Sie 1,5 g des normalen Kontroll-Ovarialgewebes in eine saubere Glasschale.
  3. Fügen Sie 2 ml vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche 3x zu waschen.
  4. Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm3 Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.
  5. Fügen Sie 8 ml 0,05% Trypsin/20 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) in das gehackte Kontrollgewebe und verdauen (30 min, Raumtemperatur), was hilft, das Gewebe und die Zellen zu lysieren und Mitochondrien freizusetzen. Dann Zentrifuge (200 x g, 5 min). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Gewebe und Zellen auf.
  6. Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).
  7. Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
  8. Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.
  9. Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.
  10. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet durch leichte Pipettierung gut auszusetzen.
  11. Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.
  12. Fügen Sie 12 ml mit 25% DichteGradientenmedium hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.
  13. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 8 ml von 38%, 5 ml von 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien von Schritt 2,12), 8 ml von 23% und 3 ml mit 20% Dichtegradienten medium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 ° C) füllen.
  14. Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien im Bereich von der Schnittstelle zwischen 25% und 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% in ein sauberes Rohr zu sammeln.
  15. Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.
  16. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, und zentrifugieren Sie es (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.
  17. Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Kontroll-Ovarialgewebe als mitochondriale Proben für die quantitative Proteomik-Analyse.

3. Überprüfung der Qualität von gereinigten gewebemitochondrialen Proben

  1. Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17) zur Überprüfung mit Elektronenmikroskopie (EM).
    HINWEIS: Das detaillierte Protokoll wurde zuvor beschrieben15,16.
  2. Bereiten Sie den mitochondrialen Proteinextraktionspuffer durch Mischen von 8 M Harnstoff, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonat (CHAPS) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,52 ein.
  3. Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe in Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes in Schritt 2.17) und fügen Sie mitochondrialen Proteinextraktionspuffer (mitochondriale Proben zum Proteinextraktionspuffer, 1:5) das Pellet wieder aussetzen. Die Proben in flüssigem Stickstoff 3x einfrieren und bei Raumtemperatur 2 h lagern.
  4. Zentrifuge bei 12.000 x g,30 min, 4 °C, sammeln Sie den Überstand (d.h. die extrahierte mitochondriale Proteinprobe) und messen Sie den Proteingehalt mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit.
  5. 50 ml von 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) durch Mischen von 9,08 g Tris und 40 ml ddH2O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 8,8 einstellen und ddH2O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
  6. 50 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8) durch Mischen von 6,06 g Tris und 40 ml ddH2O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 6,8 einstellen und ddH2O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
  7. 100 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung durch Mischen von 29 g Acrylamid, 1 g Bisacrylamid und 80 ml ddH2 O und Zugabe von ddH2O auf ein Endvolumen von 100 ml vorbereiten. Bewahren Sie sie in einer braunen Flasche bei 4 °C auf.
  8. 1.000 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer durch Mischen von 29 g Glycin, 58 g Tris, 3,7 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 800 ml ddH2O vorbereiten und dann ddH2O zu einem Endvolumen von 1.000 ml hinzufügen.
  9. 10 ml Ladepuffer durch Mischen von 2 ml Glycerin, 0,02 g Bromphenolblau, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCl pH 6,8 und 7 ml ddH2O vorbereiten und dann ddH2O zu einem Endvolumen von 10 ml hinzufügen.
  10. 10 ml 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auflösendes Gel durch Mischen von4 ml ddH2 O vorbereiten, 3,3 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,004 ml Tetramethylethylendiniin (TEMED). Gießen Sie die SDS-PAGE-Auflösungsgellösung in die Platte zwischen den Glasplatten auf die Ebene des Bodens des Kamms. Fügen Sie 2 ml Isopropylalkohol auf die Oberseite. Lassen Sie für 30 min.
  11. Entfernen Sie den Isopropylalkohol und waschen Sie die Oberseite mit ddH2O 3x. Gießen Sie die 5%ige Gellösung mit 4,1 ml ddH2O, 1,0 ml 30% Acylamid-bis-Lösung, 0,75 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,006 ml TEMED. Den Kamm sofort in die Konzentrationsgellösung einlegen, 30 min lassen und dann den Kamm herausnehmen.
  12. Bereiten Sie den 1x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer vor, indem Sie 100 ml 100-Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer mit 900 ml ddH2O verdünnen und in den elektrophoretischen Tank gießen.
  13. Mischen Sie 30 g der mitochondrialen Proteine aus dem Eierstockkrebs und kontrollieren Sie Eierstockgewebe von Schritt 3.4 mit Ladepuffer bis zu einem Endvolumen von 20 l. Kochen Sie das Gemisch für 5 min, und trennen Sie es dann mit dem 10% SDS-PAGE Auflösungsgel mit einer konstanten Spannung von 100 V. Wenn das Bromphenolblau den Boden erreicht, stoppen Sie die Elektrophorese.
  14. 1,5 l elektrophoretischen Transferpuffer vorbereiten, indem 150 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer, 1.050 ml ddH2O und 300 ml Methanol gemischt werden.
  15. Die PVDF-Membran in 100% Methanol für 10 min und im elektrophoretischen Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen. Fünf Blatt Filterpapier in 1x elecrophoretischem Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen.
  16. Nehmen Sie das SDS-PAGE-Gel heraus, das die Proteine enthält, und tränken Sie es 10 min im elektrophoretischen Transferpuffer.
  17. Machen Sie eine Transferkassette, indem Sie einen nassen Schwamm auf die weiße Platte, drei Blatt nasses Filterpapier, die PVDF-Membran, das SDS-PAGE-Gel mit den Proteinen, zwei Blatt nasses Filterpapier und den nassen Schwamm von unten nach oben legen. Vermeiden Sie Blasen.
  18. Legen Sie die Transferkassette in den elektrophoretischen Tank, gießen Sie den elektrophoretischen Transferpuffer ein und übertragen Sie dann 2 h unter einem konstanten 200 mA Strom.
  19. Bereiten Sie 10x Tris-gepufferte Salin (TBS) Stofflösung vor, indem Sie 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl mischen und ddH2O zu einem Endvolumen von 500 ml hinzufügen. Bereiten Sie 2 L 1x 1x TBST vor, indem Sie 200 ml 10x TBS, 2 ml Tween-20 und 1.798 ml ddH2O mischen. Bereiten Sie 100 ml Blockierlösung durch Mischen von 100 ml TBST und 5 g BSA vor.
  20. Nach dem Transfer die PVDF-Membran herausnehmen, in TBST 5 min leicht waschen und dann in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.
  21. Inkubieren Sie die PVDF-Membran (4 °C über Nacht) mit verschiedenen primären Antikörpern, die für verschiedene subzelluläre Organellen spezifisch sind, einschließlich Lamin B (Zellkern; Ziegenantihumanantikörper 1: 1.000 Blockierlösung), Flottillin-1 (Zytomembran; Kaninchen-Antihuman Antikörper 1:500 Blockierlösung), COX4I1 (Mitochondrion; Kaninchen antihuman 1:1,000 Blockierlösung), GM130 (Golgi-Apparat; Maus-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierlösung), Kataalase (Peroxisome; Kaninchen-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierung und Kathepsin B (Lysosom; Kaninchen antihumanantikörper 1:1,000 Blocking Solution). In TBST für 5 min 3x leicht waschen.
  22. Inkubieren Sie die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Kaninchen-Anti-Ziege, Ziege Anti-Kaninchen oder Ziege Anti-Maus). In TBST für 5 min 3x leicht waschen. Visualisieren Sie es mit Elektrochemilumineszenz (ECL).

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS Analyse

HINWEIS: Die detaillierten Verfahren für Abschnitt 4 beziehen sich auf die iTRAQ-Anweisungen (Tabelle der Materialien).

  1. SDT-Puffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 und 100 mM DTT) zu den gereinigten mitochondrialen Proben hinzufügen (d.h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17). Wirbeln Sie die Probe, bis es keinen sichtbaren Niederschlag gibt.
    HINWEIS: Das mitochondriale Verhältnis zu SDT-Puffer sollte 1:5 betragen.
  2. Die SDT-behandelte Probe 5 min aufkochen, die Probe auf Eis abkühlen und dann Zentrifuge (2.000 x g, 2 min) abkühlen.
  3. Sammeln Sie den Überstand als extrahierte mitochondriale Proteinproben und messen Sie den Proteingehalt mit einem BCA-Protein-Assay-Kit.
  4. Nehmen Sie SDT-extrahierte mitochondriale Proteine (200 g jeder Probe) zur Reduktion, Alkylierung, Verdauung mit Trypsin, Entsalzung und Lyophilisierung3,4. Machen Sie drei Replikationen für jedes Beispiel.
  5. Behandeln Sie die tryptischen Peptide (100 g jeder Probe) ab Schritt 4.4 mit 100 mM Tetraethylammoniumbromidlösung (pH 8.5) und beschriften Sie die tryptischen Peptide mit einem der 6-Plexi-iTRAQ-Reagenzien gemäß den Anweisungen3,4. Beschriften Sie jedes Sample 3x.
  6. Mischen Sie gleich 6 markierte tryptische Peptidproben (drei aus Eierstockkrebsgewebe und drei aus der Kontrolle von Eierstockgeweben) und trocknen Sie mit einem Vakuumkonzentrator.
  7. Fraktionieren Sie die gemischten iTRAQ-markierten Peptide mit SCX-Chromatographie in 60 Fraktionen (eine Fraktion pro 1 min), und kombinieren Sie dann alle zwei Fraktionen als SCX-fraktionierte Probe (n = 30).
  8. Unterziehen Sie jede SCX-fraktionierte Probe einer LC-MS/MS-Analyse auf einem Massenspektrometer3,4 gekoppelt mit einem Nano-LC-System innerhalb eines LC-Trenngradienten von 60 min, um MS/MS-Daten zu erhalten.
  9. Durchsuchen Sie die MS/MS-Daten, um Proteine mit der Suchmaschine (Tabelle der Materialien) zu identifizieren.
  10. Verwenden Sie die iTRAQ Reporter-Ionen-Intensitäten, um jedes Protein zu quantifizieren und mitochondriale Differentialexprimien (mtDEPs) mit einer Veränderung von >1,5 oder <-1,5-fach und p < 0,05 zu bestimmen.

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Representative Results

Es gab einen Unterschied in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und der Kontrolle von Eierstockgeweben. Diese Studie ergab, dass es viel einfacher war, Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben vorzubereiten als aus der Kontrolle von Eierstockgeweben3,4. Das Protokoll zur Herstellung von Mitochondrien aus kontrollischen Eierstockgeweben musste verbessert werden. Zunächst war es vor der Gewebehomogenisierung notwendig, 8 ml 0,05% Trypsin/20 mM EDTA in die PBS-Lösung zu geben, die den gehackten Kontrollgeweben zugesetzt wurde, gefolgt von der Verdauung für 30 min bei Raumtemperatur und der Zentrifugation bei 200 x g für 5 min (siehe Protokollschritt 2.5). Dies verbesserte die Zubereitung von Mitochondrien. Zweitens war der diskontinuierliche Dichtegradient für die Herstellung von Mitochondrien aus kontrollierendem Eierstockgewebe und Eierstockkrebsgewebe(Abbildung 1) unterschiedlich. Für Eierstockkrebsgewebe wurde es durch Zugabe von 5 ml 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien), 8 ml von 23% und 3 ml 20% Dichtegradienten medium von unten nach oben in einem Rohr hergestellt. Die gereinigten Mitochondrien wurden an der Schnittstelle zwischen 25% und 30% nach Zentrifugation gefunden(Abbildung 1A, siehe Protokollschritte 1.12 und 1.13). Zur Kontrolle des Eierstockgewebes wurde es durch Zugabe von 8 ml 38%, 5 ml von 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien), 8 ml von 23% und 3 ml 20% Dichtegradientenmittlerem von unten nach oben in einem Rohr hergestellt. In diesem Fall lagen die gereinigten Mitochondrien im Bereich von 25% bis 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% nach Zentrifugation(Abbildung 1B, siehe Protokollschritte 2.13 und 2.14).

Das Protokoll übergab hochwertige mitochondriale Proben. Hochwertige mitochondriale Proben sind die Voraussetzung für quantitative mitochondriale Proteomik. Diese Studie bewertete die Qualität der Mitochondrien, die mit Differentialgeschwindigkeitszentrifugation und Dichtegradientenzentrifugation über EM (Abbildung 2) und Western Blot (WB, Abbildung 3) hergestellt wurden. EM-Bilder zeigten, dass sowohl bei Eierstockkrebs als auch bei der Kontrolle von Eierstockgeweben die wichtigsten isolierten Organellen Mitochondrien waren, mit Ausnahme einer geringen Menge peroxisomen. Die Morphologie der Mitochondrien veränderte sich bei Eierstockkrebs stärker als bei der Kontrolle des Eierstockgewebes (Abbildung 2). WB-Bilder zeigten, dass die Hauptkomponente in vorbereiteten mitochondrialen Proben von Eierstockkrebs und Eierstöcken Mitochondrien war, mit Ausnahme einer geringen Menge an Peroxisomen (Abbildung 3). Die WB-Ergebnisse entsprachen den EM-Ergebnissen. Es war vernünftig, dass Peroxisomen in vorbereiteten Mitochondrien enthalten waren, da Mitochondrien ausgiebig mit Peroxisomen3,17,18interagieren, die wiederum die funktionelle Vollständigkeit der Mitochondrien widerspiegeln. Diese Ergebnisse zeigten die hohe Qualität der vorbereiteten mitochondrialen Proben.

Die mit diesem Protokoll hergestellte Menge an mitochondrialem Protein war für weitere Analysen ausreichend. Es ist notwendig, eine ausreichende Menge an mitochondrialen Proben von Eierstockkrebs zu erhalten und Eierstockgewebe zu kontrollieren. Diese Studie kombinierte die mitochondrialen Proben, die aus sieben Eierstockkrebsgeweben und aus 11 Kontroll-Ovarialgeweben 3 hergestellt wurden. Für Eierstockkrebs wurden insgesamt 2.409 g mitochondriale Proteinproben und zur Kontrolle des Eierstockgewebes 4.440 g mitochondriale Proteinproben entnommen (Tabelle 1). Im Allgemeinen benötigt jede Probe für die quantitative iTRAQ-Proteomik mindestens 600 g Proteine (200 g Proteine pro iTRAQ-Kennzeichnung, 3 Replikationen). Daher reichten die vorbereiteten mitochondrialen Proteinproben für die quantitative iTRAQ-Proteomik-Analyse aus.

Die Erreichung der maximalen Anzahl quantifizierter Proteine kommt der eingehenden Untersuchung von Mitochondrien bei menschlichem Eierstockkrebs zugute. Diese Studie identifizierte, identifizierte und quantifizierte 5.115 Proteine bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle von Eierstockgewebe, darunter 2.565 (50,14%) hochregulierte Proteine (Verhältnis von Krebs zu Kontrollen >1) und 2.550 (49,86%) downregulierte Proteine (Verhältnis von Krebs zu Kontrollen <1)3 (Tabelle 2). Darüber hinaus ermittelte diese Studie 1.198 mtDEPs zwischen Eierstockkrebs und Eierstöcken mit >1,5- oder <-1,5-fachen Veränderungen (p < 0,05), darunter 523 (43,66 %) hochregulierte Proteine und 675 (56,34%) unterregulierte Proteine4 (Tabelle 2). Diese Daten sind derzeit das größte mitochondriale Proteomprofil bei Eierstockkrebs.

Figure 1
Abbildung 1: Die rohen Mitochondrien wurden mit diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation für Eierstockkrebs (A) gereinigt und kontrollierten Eierstockgewebe (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Elektronenmikroskopie von Mitochondrien, die von Eierstockkrebs isoliert sind (A) und Kontroll-Ovarialgewebe (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Organelle-spezifische Antikörper-basierte Western-Blot-Bilder von Mitochondrien, die von Eierstockkrebs isoliert sind (A) und Kontroll-Ovarialgewebe (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mitochondriale Proteinprobe Volumen (L) Konzentration (g/l) Proteine (g)
Eierstockkrebsgewebe 530 4.545 2,409
Kontrolle des Eierstockgewebes 750 5.92 4,440

Tabelle 1: Die Menge der vorbereiteten mitochondrialen Proteinproben.

Kategorie Die Anzahl der Gesamtproteine* Die Anzahl der differenziell exprimiertenProteine
Up-Regulierung 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Down-Regulierung 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
gesamt 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
*Verhältnis von Krebs zu Kontrollen ist >1 für Up-Regulierung, <1 für Down-Regulierung.
# Das Verhältnis von Krebs zu Kontrollen ist >1,5-fach für up-regulation, und <-1.5 falten für Down-Regulierung.

Tabelle 2: Die Anzahl der iTRAQ-identifizierten Proteine aus vorbereiteten mitochondrialen Proben.

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Discussion

Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von Eierstockkrebs. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe nützen dem tiefen Verständnis der mitochondrialen Funktion bei Eierstockkrebspathogenese und mitochondrialen molekularen Netzwerkveränderungen und helfen dabei, den molekularen Mechanismus für die spätere Entdeckung der Zieltherapie und wirksamer Biomarker auf Basis von Mitochondrien4,5,8zu klären. Die Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit der Dichtegradientenzentrifugation isolierte und gereinigte Mitochondrien effektiv von menschlichem Eierstockkrebs und kontrollierte Eierstockgewebe. Die vorbereiteten mitochondrialen Proben waren von sehr hoher Qualität und eigneten sich für weitere quantitative Proteomik-Analysen.

Die vorbereiteten mitochondrialen Proben enthielten eine kleine Menge peroxisomen3,17,18 und zytosolische Proteine19,20. Dies sollte nicht einfach als Kontamination betrachtet werden, weil sie direkt oder indirekt mit Mitochondrien interagieren oder haften, um Mitochondrien vollständiger funktionieren zu lassen. Studien haben herausgefunden, dass Mitochondrien ausgiebig mit dem Aktin-Zytoskelett19,20 und Peroxisomen17,18interagieren. Es ist unvermeidbar, dass einige zytosolische Proteine und Peroxisomenproteine in isolierten mitochondrialen Proben enthalten sind.

Die Schlüsseltechnik zum Erkennen, Identifizieren und Quantifizieren von Proteinen aus den vorbereiteten mitochondrialen Proben war die iTRAQ-Kennzeichnung-SCX-LC-MS/MS. Diese Studie identifizierte und quantifizierte 5.115 mitochondriale Proteine3, einschließlich 1.198 mtDEPs4,14. Die große Anzahl von mitochondrialen Proteinen, die in den Eierstockkrebsgeweben gefunden werden, umfasst auch die, die helfen können, die Rolle von Mitochondrien bei der Pathogenese für Eierstockkrebs zu verstehen und auch eine Ressource für die Entdeckung einer personalisierten Zieltherapie auf der Grundlage des mitochondrialen Stoffwechsels8zu sein und sogar wirksame Biomarker auf der Grundlage von mitochondrialen Genomiken zu finden, Proteomik und Metabolomik aus einem systematischen Multi-Omics-Winkel9,11,12,13. Darüber hinaus könnte mit der Einführung von Proteoform- und Proteinartenkonzepten im Proteom eine eingehende Erforschung von mitochondrialen Proteoformen oder Proteinarten direkt zur Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele für Eierstockkrebs führen10,21,22.

Darüber hinaus lassen sich die vorliegenden Protokolle zur Analyse der hier beschriebenen humanen Ovarialkarkchenmitochondrialen Proteome leicht übersetzen, um andere mitochondriale Proteome der menschlichen Krankheit zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Hunan Provincial Hundred Talent Plan (zu X.Z.), die Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 und 81272798 to XZ), die Stipendien aus China "863" Plan Projekt (Grant-Nr. 2014AA020610-1 bis XZ) und die Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. konzipierte das Konzept für das vorliegende Manuskript, erhielt die iTRAQ quantitativen Proteomik-Daten von Mitochondrienproben, schrieb und überarbeitete das Manuskript, koordinierte die entsprechende Arbeit und war für die finanzielle Unterstützung und die entsprechende Arbeit. H.L. bereitete Mitochondrienproben her. S.Q. nahm an Teilarbeiten teil. X.H.Z nahm am Schreiben und Bearbeiten der englischen Sprache teil. N.L. analysierte die iTRAQ Proteomics-Daten. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

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References

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Tags

Krebsforschung Ausgabe 153 Eierstockkrebs Mitochondrien Differentialgeschwindigkeitszentrifugation Dichtegradientenzentrifugation Isobaric Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Etikettierung starker Kationenaustausch (SCX) Flüssigchromatographie (LC) Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) mitochondriales Proteom
Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse
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Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

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