Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול של צנטריפוגה מהירות דיפרנציאלי בשילוב עם צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה המיטו, מרקמות סרטן השחלות האנושי ושליטה רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטקומניקס כמותיים, וכתוצאה מכך מדגם מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה, תפוקה גבוהה ו-high-, בדיקת פרוטאומוניקס כמותית של סרטן השחלות האנושי פרוטדום מיטוכונדריאלי.
Abstract
סרטן השחלות הוא סרטן גניקולוגי נפוץ עם תמותה גבוהה אך מנגנון מולקולרי לא ברור. סרטן השחלות ביותר מאובחנים בשלב מתקדם, אשר ברצינות הסלים טיפול. שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות האנושי, ו המיטו, הם המרכזים של חילוף החומרים באנרגיה, איתות התא, ומתח חמצוני. תובנות מעמיקות לשינויים של הפרוטדום מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות לעומת שליטה רקמת השחלות ייהנו הבנה מעמיקה של מנגנונים מולקולריים של סרטן השחלות, ואת התגלית של סמנים יעילים ואמינים ומטרות טיפוליות. שיטת הכנה מיטוכונדריאלי יעיל בשילוב עם תג isobaric עבור קוונפיקציה יחסיים ומוחלטים (iTRAQ) פרוטאומניקס כמותיים מוצגים כאן כדי לנתח את סרטן השחלות האנושי בקרת פרוטמס מיטוכונדריזה, כולל צנטריפוגה מהירות דיפרנציאליות, צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה, הערכת איכות של דגימות מיטוכונדריאלי, העיכול חלבונים עם טריפסין, תיוג iTRAQ, שבירה חזקה של החלפת קטיון (SCX), כרומטוגרפיה נוזלית (LC), בטנדם ספקטרומטר מסה (MS/ MS), ניתוח מסדי נתונים, ניתוח כמותי של חלבונים מיטוכונדריאלי. חלבונים רבים זוהו בהצלחה כדי למקסם את הסיקור של סרטן השחלות האנושי פרוטדום מיטוכונדריאל ולהשיג את פרופיל חלבון מיטוכונדריאלי הביע האדם בסרטן השחלות האנושי.
Introduction
סרטן השחלות הוא סרטן גניקולוגי נפוץ עם תמותה גבוהה אך מנגנון מולקולרי לא ברור1,2. רוב סוגי סרטן השחלות מאובחנים בשלב מתקדם, אשר ברצינות הסלים טיפול. שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות האנושית, ו המיטומטר הם מרכזי חילוף החומרים של אנרגיה, תא איתות, ומתח חמצוני3,4,5,6,7. תובנות מעמיקות לשינויים של הפרוטדום מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות לעומת שליטה רקמת השחלות ייהנו הבנה מעמיקה של מנגנונים מולקולריים של סרטן השחלות, ואת התגלית של סמנים יעילים ואמינים ומטרות טיפוליות. חילוף חומרים מיטוכונדריאלי הוצע והוכר כיעד לטיפול בסרטן, antimitochondrial therapy עשוי בסופו של דבר להיות מועיל מאוד למניעת הישנות גרורות של סרטן8. פרופיל מטבולית בודדים כבר מתרגלת גם ככלי שימושי עבור סרטן ריבוד ואסטרטגיות ניבוי9,10.
לטווח ארוך המטרה של מחקר זה היא לפתח ולהשתמש מיטוכונדריאלי כמותי פרוטאומוניקס שיטה ללמוד סרטן השחלות לבירור של שינויים מיטוכונדריאלי השחלה בין סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות, ואת שינוי הרשת המולקולרית שלהם מזווית מרובת מעגלים שיטתית11,12, אשר תגרום לגילוי של המיטואים ממוקד בסמנים מולקולריים13 להבהרה של המנגנונים המולקולריים של סרטן השחלות, חיזוי, וטיפול אישי של חולי סרטן השחלות. תגי איקובארית לקוונפיקציה יחסיים ומוחלטים (itraq) תיוג3,4 הם שיטה יעילה לכמת את שינויי חלבון מיטוכונדריאלי. הכנת דוגמאות מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה מסרטן השחלות האנושי ורקמות השחלות בקרת הם תנאי הקדם של iTRAQ ניתוח כמותי של פרוטמס מיטוכונדריזה3. הכנה מיטוכונדריאלי משולב עם itraq כמותי פרוטאומניקס כבר בשימוש בהצלחה תוכניות לטווח ארוך על סרטן השחלות האנושי מיטוכונדריאלי, כולל הקמת מפות התייחסות מיטוכונדריאלי פרוטדום3, ניתוח של פרופילים מיטוכונדריאלי הביע באופן משמעותי4,14 ו-translational שינויים, כולל ז הרשת שינויים בסרטן השחלות האנושית5, כולל שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה4, מטבוליזם השומנים, ואת מסלול מיטואופגיה מערכות3.
מחקרים קודמים מצאו כי צנטריפוגה מהירות משולבת בשילוב עם צפיפות הדרגתי צנטריפוגה היא שיטה יעילה כדי לבודד ולטהר את המיטומטר מסרטן השחלות האנושי בקרת רקמות השחלות3,4,5,14. התיוג iTRAQ בשילוב עם החלפת קטיון חזקה (SCX)-כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-טנדם המסה (MS/MS) היא טכניקת המפתח כדי לזהות, לזהות, ולכמת את החלבונים מתוך דגימות מיטוכונדריאלי מוכן.
כאן, פרוטוקולים מפורטים עבור הכנה מיטוכונדריאלי יחד עם iTRAQ כמותי פרוטאומניקס מתוארים. אלה השתמשו בהצלחה בניתוח של סרטן השחלות האנושי מיטוכונדריזה רקמות. הפרוטוקולים כוללים הכנת דגימות, מהירות דיפרנציאלית צנטריפוגה, צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, הערכת איכות של דגימות מיטוכונדריאלי, העיכול חלבונים עם טריפסין, iTRAQ תיוג, משבר SCX, LC, MS/MS, חיפוש מסד נתונים, וניתוח כמותי של חלבונים מיטוכונדריאלי. יתר על כן, פרוטוקול זה מיתרגם בקלות לנתח מיטוכונדריזה רקמות האדם אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות השחלות דגימות כולל רקמות סרטן השחלות (n = 7) ורקמות השחלות בקרה רגיל (n = 11) שימשו עבור פרוטוקול זה. הפרוטוקול הנוכחי3,4,5 מאושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים xiangya של מרכז דרום האוניברסיטה, סין.
1. הכנת המיטו, מרקמות סרטן השחלות האנושית
- להכין 250 mL של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי על ידי ערבוב 210 mM mannitol, 70 mM סוכות, 100 מ"מ אשלגן כלוריד (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 מ"מ diamine חומצה (EDTA), 0.1 mM אתילן גליקול bis (2-עמינח האתר) הטטראצטט חומצה (EGTA), 1 מ"מ מעכבי פרוטאז (PMSF) מעכב, 2 מ"מ נתרן (V), ו 0.2% בסרום שור (BSA), pH 7.4.
- מקום ~ 1.5 g של רקמות סרטן השחלות בצלחת זכוכית נקייה.
- הוסף 2 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי מקורר לשטוף בקלילות את הדם ממשטח הרקמה 3 x.
- השימוש במספריים אופטלמולוגי נקי כדי למלא את הרקמה לתוך כ 1 מ"מ3 חתיכות, ולהעביר את רקמות טחון לתוך צינור צנטריפוגה 50 mL.
- הוסף 13.5 mL של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי המכיל 0.2 mg/mL הישבן, ולאחר מכן להשתמש הומוגניצר חשמלי כדי המגון (שימוש בקנה מידה 2, 10 s 6x, מרווח 10 s) רקמות טחון (2 דקות, 4 ° c).
- הוסף עוד 3 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי לתוך רקמת המגון ומערבבים היטב על ידי ליטוף.
- צנטריפוגה את הרקמה המוכנה הומומטר (1,300 x g, 10 דקות, 4 ° c). הסר את השבר הגרעיני הגולמי (כלומר, הגלולה) ולשמור על הסופרנטאנט.
- Recentrifuge הסופרנטנט (10,000 x g, 10 דקות, 4 ° c). הסר את המיקרוזומים (כלומר, סופרנטאנט) ושמור את הגלולה.
- הוסף 2 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי והשהה מחדש את הגלולה היטב על ידי ליטוף באור.
- צנטריפוגה את הבולם הגלולה (7,000 x g, 10 דקות, 4 ° c). להיפטר supernatant ולשמור על המיטו, כלומר, הגלולה.
- הוסף 12 מ ל של 25% בינונית צפיפות מעבר הצבע (כלומר, Nycodenz) כדי להשעות מחדש את המיטו, שחולצו גולמי.
- בצע הדרגתי צפיפות מתמשכת על ידי מילוי צינורית מלמטה למעלה עם 5 מ ל של 34%, 8 מ ל 30%, 12 מ ל 25% (המכיל את המיטומטר הגולמי משלב 1.11), 8 מ ל 23%, ו 3 מ ל של 20% צפיפות מעבר בינונית, ו צנטריפוגה אותו (52,000 x g, 90 min, 4 °
- השתמש מזרק ארוך וקהה לאסוף את המיטומטר מטוהרים בממשק בין 25% ו 30% צפיפות מעבר הצבע לתוך צינור נקי.
- הוסף מאגר בידוד מיטוכונדריאלי לתוך המיטומטר שנאסף כדי לדלל אותו לנפח שלוש-קיפול. צנטריפוגה (15,000 x g, 20 דקות, 4 ° c) ולמחוק את supernatant.
- הוסף 2 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי כדי להשהות את הגלולה, וצנטריפוגה (15,000 x g, 20 דקות, 4 ° c). . השמט את הסופרנטאנט ושמור את הגלולה
- לאסוף את הגלולה האחרונה (כלומר, המיטומטר מטוהרים) ולאחסן אותו ב-20 ° c.
הערה: לשלב את כל המיטומטריה מרקמת סרטן השחלות כמו מדגם המיטו, ניתוח פרוטקומניקס כמותיים.
2. הכנת המיטו, מרקמות השחלות בקרת האדם
- הכינו 250 mL של מאגר הבידוד היטוכונדריאלי כמתואר בשלב 1.1.
- מקום ~ 1.5 g של רקמות נורמלי השחלות בקרת בצלחת זכוכית נקייה.
- הוסף 2 מ ל של מאגר מיטוכונדריאלי מקורר מראש כדי לשטוף בקלילות את הדם ממשטח הרקמה 3x.
- השימוש במספריים אופטלמולוגי נקי כדי למלא את הרקמה לתוך כ 1 מ"מ3 חתיכות, ולהעביר את רקמות טחון לתוך צינור צנטריפוגה 50 mL.
- הוסף 8 מ מ של 0.05% טריפסין/20 מ"מ EDTA במלח פוספט באגירה (PBS) לרקמות בקרה טחון, ולעכל (30 דקות, טמפרטורת החדר), אשר מסייע lyse רקמות ותאים ושחרור המיטומטר. לאחר מכן צנטריפוגה (200 x g, 5 דקות). השמט את הסופרנטאנט ושמור את הרקמות והתאים.
- הוסף 13.5 mL של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי המכיל 0.2 mg/mL הישבן, ולאחר מכן להשתמש הומוגניצר חשמלי כדי המגון (שימוש בקנה מידה 2, 10 s 6x, מרווח 10 s) רקמות טחון (2 דקות, 4 ° c).
- הוסף עוד 3 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי לתוך רקמת המגון ומערבבים היטב על ידי ליטוף.
- צנטריפוגה את הרקמה המוכנה הומומטר לאכול (1,300 x g, 10 דקות, 4 ° c). הסר את השבר הגרעיני הגולמי (כלומר, הגלולה) ולשמור על הסופרנטאנט.
- Recentrifuge הסופרנטנט (10,000 x g, 10 דקות, 4 ° c). הסר את המיקרוזומים (כלומר, סופרנטאנט) ושמור את הגלולה.
- הוסף 2 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי כדי להשהות את הגלולה היטב על ידי ליטוף אור.
- צנטריפוגה את הבולם הגלולה (7,000 x g, 10 דקות, 4 ° c). להיפטר supernatant ולשמור על המיטו, כלומר, הגלולה.
- הוסף 12 מ ל של 25% בינונית צפיפות מעבר הצבע כדי להשעות את המיטו, שחולצו גסה.
- הפוך את הדרגתי לדחיסות רציפה על-ידי מילוי צינורית מלמטה למעלה עם 8 מ ל של 38%, 5 מ ל של 34%, 8 מ ל של 30%, 12 מ ל 25% (המכיל את המיטוגרם הגולמי משלב 2.12), 8 מ ל של 23%, ו 3 מ ל של 20% צפיפות מעבר בינונית, ו צנטריפוגה אותו (52,000 x g, 90 דקות, 4 ° c).
- השתמש מזרק ארוך וקהה לאסוף את המיטומטר מטוהרים בטווח מן הממשק בין 25% ו 30% לממשק בין 34% ו 38% לתוך צינור נקי.
- הוסף מאגר בידוד מיטוכונדריאלי לתוך המיטומטר שנאסף כדי לדלל אותו לנפח שלוש-קיפול. צנטריפוגה (15,000 x g, 20 דקות, 4 ° c) ולמחוק את supernatant.
- הוסף 2 מ ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי כדי להשהות את הגלולה, וצנטריפוגה אותו (15,000 x g, 20 דקות, 4 ° c). . השמט את הסופרנטאנט ושמור את הגלולה
- לאסוף את הגלולה האחרונה (כלומר, המיטומטר מטוהרים) ולאחסן אותו ב-20 ° c.
הערה: לשלב את כל המיטומטריה מרקמת השחלה בקרת כמו דגימות מיטוכונדריאלי עבור ניתוח פרוטאומניקס כמותיים.
3. אימות האיכות של דוגמאות מיטוכונדריאלי לרקמה מטוהרים
- קח שפופרת של דגימות מיטוכונדריאלי מטוהרים (כלומר, כדורי מרקמות סרטן השחלות משלב 1.16 ורקמות השחלות שליטה משלב 2.17) לאימות עם אלקטרון מיקרוסקופ (EM).
הערה: הפרוטוקול המפורט תואר בעבר15,16. - להכין את מאגר הפקת חלבון מיטוכונדריאלי על ידי ערבוב 8 M שתנן, 2 M thiourea, 40 mM טריס, 1 מ"מ EDTA, 130 מ"מ dithiothreitol (DTT), ו-4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethymonio (בחורים). כוונן את ה-pH ל-8.52.
- קח שפופרת של דגימות מיטוכונדריאלי מטוהרים (כלומר, כדורי מרקמות סרטן השחלות בשלב 1.16 ורקמות השחלות בקרה בשלב 2.17) ולהוסיף מאגר מיטוכונדריאלי מיצוי חלבון (דגימות מיטוכונדריאלי מאגר חילוץ חלבונים, 1:5) כדי ל . להשעות מחדש את הגלולה הקפאת דגימות בחנקן נוזלי 3x ולאחסן בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g, 30 דקות, 4 ° צ', לאסוף את סופרנאטאנט (כלומר, המדגם חלבון מיטוכונדריאלי מופק), ולמדוד את תכולת החלבון עם חומצה בינוצ'ונטית (bca) שיטת החלבון ערכת.
- להכין 50 mL של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8) על ידי ערבוב 9.08 g של Tris ו-40 mL של ddH2o, כוונון ה-pH ל8.8 באמצעות HCl, והוספת ddh2o לנפח הסופי של 50 mL. חנות ב -4 ° c.
- להכין 50 mL של 1 M Tris-HCl (pH 6.8) על ידי ערבוב 6.06 g של טריס 40 ו-mL של ddH2o, כוונון ה-pH ל6.8 באמצעות HCl, והוספת ddh2o כדי נפח הסופי של 50 mL. חנות ב -4 ° c.
- הכינו 100 mL של 30% אקרילאמיד-bis על ידי ערבוב של 29 גר' אקרילי, 1 גר' של bis-אקריל, ו 80 mL של ddH2o, והוסיף ddh2o לנפח הסופי של 100 mL. אחסן אותו בבקבוק חום ב -4 ° c.
- להכין 1,000 mL של מאגר האלקטרופורזה 10x טריס-גליצין על ידי ערבוב 29 גרם של גליצין, 58 g של טריס, 3.7 g של נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו800 mL של ddH2o, ולאחר מכן הוספת ddh2o לנפח הסופי של 1,000 mL.
- הכינו 10 מ ל של מאגר טעינה על ידי ערבוב 2 מ ל גליצרין, 0.02 g של ברומאופנול כחול, 0.4 g של SDS, 2 מ ל של טריס-HCl pH 6.8, ו-7 mL של ddH2O, ולאחר מכן הוספת ddh2o לנפח הסופי של 10 ml.
- הכינו 10 מ ל של 10% נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-עמוד) בפתרון ג'ל על ידי ערבוב 4 מ ל של ddH2O, 3.3 mL של 30% אקרילאמיד-Bis פתרון, 2.5 mL של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8), 0.1 ml של 10% sds, 0.1 ml של 10% אמוניום פרסולפט, ו-0.004 מ ל של טטרמתיליפילואמיאמין (temed). יוצקים את ה-SDS-עמוד בפתרון הפתרון ג'ל לתוך הצלחת בין צלחות זכוכית לרמה של החלק התחתון של המסרק. הוסיפו 2 מ ל של אלכוהול איזופרופיל למעלה. . לעזוב ל -30 דקות
- להסיר את האלכוהול איזופרופילי ולשטוף את החלק העליון עם ddH2O 3x. יוצקים את 5% ג'ל ריכוז הפתרון המכיל 4.1 mL של ddH2O, 1.0 mL של 30% acylamide-bis פתרון, 0.75 ml של 1 M טריס-HCl (pH 6.8), 0.06 ml של 10% sds, 0.06 ml של 10% אמוניום פרסולפט, ו 0.006 ML של temed. מיד להכניס את המסרק לתוך הפתרון ג'ל הריכוז, לעזוב 30 דקות, ואז להוציא את המסרק.
- להכין את מאגר האלקטרופורזה 1x טריס-גליצין על ידי דילול 100 mL של 10x טריס-מאגר אלקטרופורזה-גליצין עם 900 mL של ddH2O ו לשפוך לתוך הטנק electrophoretic.
- מערבבים 30 μg של חלבונים מיטוכונדריאלי מסרטן השחלות ושליטה רקמות השחלות משלב 3.4 עם מאגר טעינת להגיע לנפח הסופי של 20 μL. מרתיחים את התערובת עבור 5 דקות, ולאחר מכן להפריד אותו עם 10% SDS-עמוד בפתרון באמצעות מתח קבוע של 100 V. כאשר הכחול הברופנול מגיע לתחתית, הפסיקו את האלקטרופורזה.
- להכין 1.5 L של מאגר העברה electrophoretic ידי ערבוב 150 mL של 10x Tris-גליצין מאגר אלקטרופורזה, 1,050 mL של ddH2O, ו 300 mL של מתנול.
- משרים את קרום PVDF ב 100% מתנול עבור 10 דקות ובמאגר העברה אלקטרופסטי לפחות 5 דקות. לספוג חמישה גיליונות של נייר סינון ב-1x בחירה במאגר העברת מאגר לפחות 5 דקות.
- להוציא את ה-SDS-דף ג'ל המכיל את החלבונים, ולהשרות אותו במאגר העברה אלקטרולפיטית עבור 10 דקות.
- הפוך קלטת העברה על-ידי הצבת ספוג רטוב על הלוח הלבן, שלושה גיליונות של נייר סינון רטוב, קרום PVDF, הג SDS-PAGE עם החלבונים, שני גיליונות של נייר סינון רטוב, ואת הספוג רטוב מלמטה למעלה. להימנע כל בועות.
- מניחים את הקלטת העברה לתוך המיכל אלקטרולפיסטי, יוצקים במאגר העברת אלקטרופסטי, ולאחר מכן להעביר עבור 2 h תחת קבוע 200 mA הנוכחי.
- להכין פתרון מניות באגירה 10x טריס (TBS) על ידי ערבוב 12.114 g של טריס, 29.22 g של הנאל, והוסיף ddH2O לנפח הסופי של 500 mL. להכין 2 L של 1 x TBST על ידי ערבוב 200 mL של 10 x TBS, 2 מ ל של רצף-20, ו 1,798 mL של ddH2O. להכין 100 ml של פתרון חסימת ידי ערבוב 100 ML של tbst ו 5 גרם של bsa.
- לאחר ההעברה, להוציא את קרום PVDF, לשטוף בקלות ב TBST עבור 5 דקות, ואז לחסום את זה בחסימת פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- ממברנה הקרום PVDF (4 ° c ללילה) עם נוגדנים ראשוניים שונים ספציפיים לאורגלים שונים, כולל lamin B (גרעין התא; נוגדן אנטי אדם 1:1,000 פתרון חסימה), flotillin-1 (cytomembrane; ארנב אנטי אנושי) נוגדנים 1:500 חסימה פתרון), COX4I1 (המיטותרפיה; ארנב אנטי-אדם 1:1000 חסימה פתרון), GM130 (מערכת Golgi; נוגדן נגד האדם 1:1000 פתרון חסימה), קטלאז (פרקסיכמה; הארנב אנטי אדם נוגדן 1:1000 חוסם פתרון), והקתדרה B (lysosome; הארנב אנטי אדם נוגדן 1:1000 חסימה פתרון). לשטוף קלות בתוך TBST עבור 5 דקות 3x.
- מעכדת את קרום PVDF עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים המשניים המתאימים (ארנב נגד עז, עז אנטי ארנבת, או עז נגד עכבר). לשטוף קלות בתוך TBST עבור 5 דקות 3x. דמיינו את זה עם אלקטרוכימויומיננסנציה (ECL).
4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS ניתוח
הערה: ההליכים המפורטים עבור סעיף 4 מתייחסים להוראות iTRAQ (טבלת חומרים).
- הוספת מאגר SDT (4% SDS, 100 mM טריס-HCl pH 7.6, ו 100 מ"מ DTT) על דגימות מיטוכונדריאני מטוהרים (כלומר, כדורי מרקמות סרטן השחלות משלב 1.16 ואת רקמות השחלות שליטה משלב 2.17). מערבולת הדגימה עד שאין מזרז גלוי.
הערה: דגם מיטוכונדריאלי ליחס מאגר SDT צריך להיות 1:5. - מרתיחים את המדגם SDT מטופלים עבור 5 דקות, לצנן את המדגם על קרח, ולאחר מכן צנטריפוגה (2,000 x g, 2 דקות).
- לאסוף את סופרנטנט כמו הדגימות חלבון מיטוכונדריאלי מחולץ ולמדוד את תכולת החלבון עם ערכת שיטת חלבון BCA.
- קח sdt-חלבונים מיטוכונדריאלי מחולץ (200 μg של כל דוגמה) לצמצום, אלקיללציה, העיכול עם טריפסין, התפלה וליטוליזציה3,4. לעשות שלוש משכפל עבור כל דוגמית.
- לטפל הפפטידים טריטיק (100 μg של כל מדגם) משלב 4.4 עם 100 mM הטטרתיל אמוניום ברומיד (pH 8.5), ולסמן את הפפטידים טריטיק עם אחד הריאגנטים 6-plex itraq על פי הוראותיו3,4. סמן כל דגם 3x.
- מערבבים באופן שווה 6 התווית בדגימות טריטיק פפטיד (שלושה מרקמות סרטן השחלות ושלושה מרקמות השחלות שליטה), ויבש עם מרכז ואקום.
- אנגיופלסטיקה מעורב iTRAQ-הפפטידים עם תוויות SCX לתוך 60 שברים (שבר אחד לכל 1 דקות), ולאחר מכן לשלב כל שני שברים כמדגם SCX-שבירה (n = 30).
- נושא כל מדגם scx-מפוצל לניתוח LC-ms/MS על ספקטרומטר המסה3,4 ביחד עם מערכת הננו lc בתוך 60-min מעבר הפרדה lc לקבל נתונים ms/ms.
- חפש בנתוני MS/MS כדי לזהות חלבונים באמצעות מנוע החיפוש (טבלת חומרים).
- השתמש הכתב iTRAQ-כוונות יון לכמת כל חלבון ולקבוע מיטוכונדריאלי הביע חלבונים (mtDEPs) עם שינוי של > 1.5 או <-1.5 קיפול, ו p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היה הבדל בהכנת המיטו, מרקמות סרטן השחלות ושליטה רקמות השחלות. מחקר זה מצא כי היה הרבה יותר קל להכין המיטומטר מרקמות סרטן השחלות מאשר בקרת רקמות השחלות3,4. כמה שיפורים היה צריך להתבצע בפרוטוקול להכנת המיטוגרם מרקמות השחלות שליטה. ראשית, לפני המגון רקמות, היה צורך להוסיף 8 מ ל של 0.05% טריפסין/20 מ"מ EDTA לתוך הפתרון PBS הוסיף רקמות בקרה טחון, ואחריו עיכול 30 דקות בטמפרטורת החדר, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות (ראה פרוטוקול שלב 2.5). זה שיפור ההכנה של המיטו,. שנית, הדרגתי בצפיפות מתמשכת היה שונה להכנת המיטו, מרקמות השחלות שליטה רקמות סרטן השחלות (איור 1). עבור רקמות סרטן השחלות זה היה מוכן על ידי הוספת 5 מ ל של 34%, 8 mL של 30%, 12 mL של 25% (המכיל את המיטומטר גולמי), 8 מ ל 23%, ו 3 מ ל של 20% צפיפות מעבר הצבע מלמטה למעלה בצינור. המיטו, מטוהרים נמצאו בממשק בין 25% ו 30% לאחר צנטריפוגה (איור 1A, ראה שלביהפרוטוקול1.12 ו 1.13). עבור רקמות השחלות שליטה זה היה מוכן על ידי הוספת 8 מ ל של 38%, 5 מ ל של 34%, 8 mL של 30%, 12 מ ל 25% (המכיל את המיטומטר גולמי), 8 מ ל 23%, ו 3 מ ל של 20% צפיפות מעבר הצבע מלמטה למעלה בצינור. במקרה זה, המיטו, מטוהרים היו בטווח מן הממשק בין 25% ו 30% לממשק בין 34% ו 38% לאחר צנטריפוגה (איור 1B, ראה שלבי הפרוטוקול 2.13 and 2.14).
הפרוטוקול מהווה דוגמאות מיטוכונדריאלי איכותיות באיכות גבוהה. דגימות מיטוכונדריאלי איכותיים באיכות גבוהה הם תנאי הקדם עבור פרוטקומקס מיטוכונדריאלי כמותי. מחקר זה העריך את האיכות של המיטומטר שהיו מוכנים עם צנטריפוגה וצפיפות מהירות הדרגתי צנטריפוגה באמצעות EM (איור 2) ו כתם מערבי (WB, איור 3). תמונות EM הראו כי הן סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות הראשי הארגונית מבודדים היו המיטו, למעט כמות קטנה של פרמוקסיזומים. המבנה של המיטו, השתנה יותר סרטן השחלות מאשר בקרת רקמת השחלות (איור 2). תמונות WB הראו כי המרכיב העיקרי בדגימות מיטוכונדריאלי מוכן מסרטן השחלות והשחלות שליטה היה המיטומטר, למעט כמות קטנה של פרקסיזומים (איור 3). תוצאות ה-WB היו עקביות בתוצאות ה-EM. זה היה סביר עבור הפרמוקסיזומים להיות כלול במיטומטר מוכן, כי המיטו, אינטראקציה בהרחבה עם פרמוקסיזומים3,17,18, אשר בתורו משקפים את השלמות תפקודית של המיטו,. תוצאות אלה הפגינו את האיכות הגבוהה של דגימות מיטוכונדריאלי מוכן.
כמות החלבון המיטוכונדריאלי המוכן בפרוטוקול זה הייתה נאותה לניתוח נוסף. יש צורך להשיג כמות מספקת של דגימות מיטוכונדריאלי מסרטן השחלות בקרת רקמות השחלות. מחקר זה בשילוב דגימות מיטוכונדריאלי מוכן מתוך שבעה רקמות סרטן השחלות, מ 11 רקמות השחלות שליטה3. סך של 2,409 μg של דגימת חלבון מיטוכונדריאלי הושגה עבור סרטן השחלות, ו 4,440 μg של מדגם חלבון מיטוכונדריאלי עבור רקמת השחלות שליטה (שולחן 1). בדרך כלל, עבור iTRAQ כמותי פרוטאומיקס, כל הצרכים לדוגמה לפחות 600 μg חלבונים (200 μg חלבונים לכל התיוג iTRAQ, 3 משכפל). לכן, דגימות החלבון המודריאלי המוכן היו מספיקות ל-iTRAQ בניתוח פרוטאומניקס כמותי.
ההישג של המספר המרבי של חלבונים כמותית לתועלת החקירה מעמיק של המיטו, בסרטן השחלות האנושית. מחקר זה זיהה, זיהה, ו ככמת 5,115 חלבונים בסרטן השחלות לעומת שליטה רקמת השחלות, כולל 2,565 (50.14%) חלבונים upregulated (היחס של סרטן לפקדים > 1) ו 2,550 (49.86%) להוריד חלבונים (יחס של סרטן לפקדים < 1)3 (טבלה 2). עוד, מחקר זה קבע 1,198 mtDEPs בין סרטן השחלות ושחלות שליטה עם > 1.5 או <-1.5 מקפלים שינויים (p < 0.05), כולל 523 (43.66%) חלבונים ו675 (56.34%) חלבונים מוסדרים4 (טבלה 2). נתונים אלה הם כיום הפרופיל מיטוכונדריאלי הגדול ביותר בסרטן השחלות.
איור 1: המיטוצנטריפוגה הגולמי היו מטוהרים עם צפיפות מתמשכת מעבר הדרגתי עבור סרטן השחלות (א) ובקרה השחלות (ב) רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונת מיקרוגרף אלקטרון של המיטו, מבודדים מסרטן השחלות (א) ו השחלה בקרה (ב) רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבוסס נוגדן מבוססי-נוגדנים המבוסס על תמונות כתמי המיטומטר מבודד מסרטן השחלות (א) ובקרה השחלות (ב) רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דגימת חלבון מיטוכונדריאלי | אמצעי אחסון (μL) | ריכוז (μg/μL) | חלבונים (μg) |
| רקמת סרטן השחלות | 530 | 4.545 | 2,409 |
| בקרת רקמת השחלות | 750 | 5.92 | 4,440 |
טבלה 1: כמות דגימות החלבון המודריאלי המוכנים.
| קטגוריה | מספר החלבונים הכולל * | מספרהחלבונים שהוביעו באופן מהותי |
| תקנה מעלה | 2,565% (50.14%) | 523% (43.66%) |
| למטה-רגולציה | 2,550% (49.86%) | 675% (56.34%) |
| כולל | 5,115% (100.0%) | 1,198% (100.0%) |
| * היחס של סרטן לפקדים הוא > 1 עבור התקנה מעלה, < 1 עבור למטה-רגולציה. | ||
| # היחס של סרטן לפקדים הוא > 1.5 לקפל עבור התקנה מעלה, ו <-1.5 קיפול למטה-רגולציה. | ||
שולחן 2: מספר החלבונים שזוהו על-ידי ה-iTRAQ מדגימות מיטוכונדריאלי מוכנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות. הכנתדוגמאות מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה מסרטן השחלות האנושית ורקמות בקרה בקנה מידה גדול פרוטאוניקס כמותיים תועלת ההבנה העמוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות בפתוגנזה ומיטוכונדריאלי שינויים ברשת מולקולרית, ולעזור להבהיר את המנגנון המולקולרי שלה לגילוי היעד של טיפול המטרה ב מהירות דיפרנציאלית צנטריפוגה בשילוב עם צפיפות מעבר צנטריפוגה באופן יעיל מבודדים ומטוהרים המיטוטרים מסרטן השחלות האנושי בקרת רקמות השחלות. דגימות מיטוכונדריאלי הוכנו היו באיכות גבוהה מאוד והיו מתאימים לניתוח הפרוטאומטיקה כמותי נוסף.
דגימות מיטוכונדריאלי הוכנו הכילו כמות קטנה של פרמוקסיזומים3,17,18 ו ציטוסולמלק החלבונים19,20. זה לא צריך להיות פשוט נחשב זיהום, כי הם ישירות או בעקיפין אינטראקציה או לדבוק עם המיטומינציה לתת פונקציה מיטוכונמיטוציה לחלוטין. מחקרים מצאו כי המיטואיטין אינטראקציה בהרחבה עם שלד ציטוטין19,20 ו פרמוקסיזומים17,18. זה בלתי נמנע עבור חלבונים מסוימים ציטוסולורק ומספר חלבונים כדי להיות כלולים בדגימות מיטוכונדריאלי מבודדים.
הטכניקה המפתח כדי לזהות, לזהות, ולכמת חלבונים מתוך דגימות מיטוכונדריאלי הוכנו היה iTRAQ תיוג-SCX-LC-MS/MS. מחקר זה זיהה וככמת 5,115 חלבונים מיטוכונדריאלי3, כולל 1,198 mtdeps4,14. לגוגנמבר של חלבונים מיטוכונדריאלי שנמצאו ברקמות סרטן השחלות כולל אלה שיכולים לעזור להבין את התפקיד של המיטותרפיה בסרטן השחלות בפתוגנזה וגם להיות משאב לגילוי של טיפול אישי היעד מבוסס על מטבוליזם מיטוכונדריאלי8, ואפילו מציאת ביומרים יעילים המבוססים על גנומיקה מיטוכונדריאלי, פרוטאומניקס, ו טבולומיקס מזוית מרובת מעגלים שיטתית9,11,12,13. יתר על כן, עם המבוא של פרוטאופורם ומושגים מיני חלבון ב פרוטדום, חקר מעמיק של פרוטאופורטים מיטוכונדריאלי או מינים חלבון יכול להוביל ישירות לגילוי של ביוארקרס יעיל ואמין ומטרות טיפוליות לסרטן השחלות10,21,22.
יתר על כן, הפרוטוקולים הנוכחיים בניתוח של סרטן השחלות האנושי מיטוכונדריאלי הרקמות המתוארות כאן מתורגמים בקלות כדי ללמוד פרוטמים מיטוכונדריזה של מחלות אנושיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מחוז הונאן 100 כישרון תוכנית (כדי X.Z.), קרנות החולים Xiangya למבוא כשרונות (כדי XZ), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט No. 81572278 ו 81272798 ל XZ), מענקים מסין "863" תוכנית פרוייקט (גרנט No. 2014AA020610-1 ל-XZ), ואת הקרן המחוזית למדעי הטבע של סין (גראנט No. 14JJ7008 כדי XZ). X.Z. הגה את הקונספט של כתב היד הנוכחי, השיג את iTRAQ כמותי הנתונים של דגימות המיטוגרם, כתב ושונה את כתב היד, מתואם את העבודה הרלוונטית, והיה אחראי על התמיכה הפיננסית והמקביל עבודה. H.L. מוכנים דגימות המיטו,. S.Q. השתתפו בעבודה חלקית. X. H. Z השתתפה בכתיבה ועריכה של השפה האנגלית. N.L. ניתח את נתוני ה-iTRAQ. כל המחברים אישרו את כתב היד הסופי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
