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Cancer Research

मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए ओवेरियन कैंसर ऊतकों और नियंत्रण ओवेरियन ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

यह लेख मानव अंडाशय के कैंसर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने और मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए घनत्व ढाल केंद्रीकरण के संयोजन में अंतर-गति केंद्रीकरण का प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसके परिणामस्वरूप एक उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूना और उच्च-थ्रूपुट और उच्च प्रजनन क्षमता मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण मानव ओवेरियन कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम का।

Abstract

ओवेरियन कैंसर उच्च मृत्यु दर लेकिन अस्पष्ट आणविक तंत्र के साथ एक आम स्त्री रोग है। अधिकांश अंडाशय के कैंसर का निदान उन्नत चरण में किया जाता है, जो चिकित्सा को गंभीर रूप से बाधित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मानव अंडाशय के कैंसर की एक पहचान हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय, सेल सिग्नलिंग और ऑक्सीडेटिव तनाव के केंद्र हैं। ओवेरियन ऊतक को नियंत्रित करने की तुलना में अंडाशय के कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के परिवर्तनों में गहराई से अंतर्दृष्टि से ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्र की गहराई से समझ और प्रभावी और विश्वसनीय बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज को लाभ होगा। मानव अंडाशय के कैंसर का विश्लेषण करने और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम को नियंत्रित करने के लिए सापेक्ष और पूर्ण क्वांटिफिकेशन (iTRAQ) मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए एक आइसोबेरिक टैग के साथ मिलकर एक प्रभावी माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी विधि प्रस्तुत की जाती है, जिसमें अंतर-गति केंद्रीकरण, घनत्व ग्रेडेंट सेंट्रलियूगेशन, माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों का गुणवत्ता मूल्यांकन, ट्राइप्सिन के साथ प्रोटीन पाचन, आईटीआरक्यू लेबलिंग, मजबूत cation एक्सचेंज अंशीकरण (SCX), लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी), टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/ एमएस), डेटाबेस विश्लेषण, और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक विश्लेषण। मानव अंडाशय के कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के कवरेज को अधिकतम करने और मानव अंडाशय के कैंसर में विभेदित रूप से व्यक्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए कई प्रोटीन ों की सफलतापूर्वक पहचान की गई है।

Introduction

ओवेरियन कैंसर एक सामान्य स्त्री रोग है जिसमें मृत्यु दर अधिक होती है लेकिन अस्पष्ट आणविक तंत्र1,2। अधिकांश ओवेरियन कैंसर का निदान उन्नत चरण में किया जाता है, जो चिकित्सा को गंभीर रूप से बाधित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन मानव अंडाशय के कैंसर की एक पहचान हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय, सेल सिग्नलिंग और ऑक्सीडेटिव तनाव3,4,5,6,7के केंद्र हैं। ओवेरियन ऊतक को नियंत्रित करने की तुलना में अंडाशय के कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के परिवर्तनों में गहराई से अंतर्दृष्टि से ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्र की गहराई से समझ और प्रभावी और विश्वसनीय बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज को लाभ होगा। माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म का प्रस्ताव किया गया है और कैंसर थेरेपी के लिए एक लक्ष्य के रूप में मान्यता दी गई है, और एंटीमाइटोकॉन्ड्रियल थेरेपी अंततः कैंसर8की पुनरावृत्ति और मेटास्तासिस को रोकने के लिए बहुत फायदेमंद हो सकती है। व्यक्तिगत मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग को कैंसर स्तरीकरण और भविष्य कहनेवाली रणनीतियों9,10के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में भी पहले से ही प्रचलित किया जाता है ।

इस शोध का दीर्घकालिक लक्ष्य ओवेरियन कैंसर और नियंत्रण अंडाशय के ऊतकों के बीच माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओम परिवर्तन के स्पष्टीकरण के लिए ओवेरियन कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओमिक्स विधि का विकास और उपयोग करना है, और उनके आणविक नेटवर्क में एक व्यवस्थित बहु-ओमिक्स कोण11,12से परिवर्तन होता है, जिसके परिणामस्वरूप ओवेरियन कैंसर के आणविक तंत्रों के स्पष्टीकरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित आणविक बायोमार्कर13 की खोज होगी, भविष्यवाणी, और अंडाशय के कैंसर रोगियों के व्यक्तिगत उपचार। 3,4 लेबलिंगसापेक्ष और पूर्ण क्वांटिफिकेशन (ITRAQ) के लिए आइसोबेरिक टैग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। मानव अंडाशय के कैंसर और नियंत्रण अंडाशय ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की तैयारी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम्स3के ITRAQ मात्रात्मक विश्लेषण के लिए शर्त है। माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी iTRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के साथ मिलकर मानव अंडाशय के कैंसर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के बारे में दीर्घकालिक अनुसंधान कार्यक्रमों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम संदर्भ मानचित्र3की स्थापना सहित, विभेदित रूप से व्यक्त माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल4,14 और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का विश्लेषण, जिसमें फॉस्फोरिलेशन शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप पहले ही महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्ग की खोज हुई है मानव अंडाशय के कैंसर 5 में नेटवर्कपरिवर्तन,ऊर्जा चयापचय4में परिवर्तन सहित, लिपिड चयापचय, और mitophagy मार्ग-सिस्टम3.

पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि घनत्व ढाल केंद्रीकरण के संयोजन में अंतर-गति केंद्रीकरण मानव अंडाशय के कैंसर से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग और शुद्ध करने और ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है3,4,5,14। आईटीआरक्यू लेबलिंग के साथ-साथ मजबूत cation एक्सचेंज (SCX)-लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी)-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों से प्रोटीन का पता लगाने, पहचानने और उसकी मात्रा निर्धारित करने की प्रमुख तकनीक है ।

यहां, माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ITRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के साथ मिलकर किया गया है। मानव अंडाशय के कैंसर ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के विश्लेषण में इनका सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। प्रोटोकॉल में नमूने तैयार करना, अंतर-गति केंद्रीकरण, घनत्व ग्रेडेंट सेंट्रलिजन, माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों का गुणवत्ता आकलन, ट्राइप्सिन के साथ प्रोटीन पाचन, ITRAQ लेबलिंग, SCX अंश, एलसी, एमएस/एमएस, डाटाबेस खोज, और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन का मात्रात्मक विश्लेषण शामिल है । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल आसानी से अन्य मानव ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम का विश्लेषण करने के लिए अनुवाद करता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के लिए ओवेरियन कैंसर ऊतकों (एन = 7) और सामान्य नियंत्रण अंडाशय ऊतकों (एन = 11) सहित ओवेरियन ऊतक नमूनों का उपयोग किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल3,4,5 को चीन के मध्य दक्षिण विश्वविद्यालय की जियांग्या अस्पताल मेडिकल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. मानव अंडाशय के कैंसर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी

  1. 210 एमएम मैनिटॉल मिलाकर माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का 250 मीटर तैयार करें, 70 mM सुक्रोज, 100 मीटर पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 50 एम ट्रिस-एचसीएल, 1 एमएम डायमाइन टेट्रासेटिक एसिड (EDTA), 0.1 m एथिलीन ग्लाइकोल बीआईएस (2-अमीनोएथिल ईथर) टेट्रासेटिक एसिड (ईसीटीए), 1 एमएम फिनाइलमेथेनसल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) प्रोटीज़ अवरोधक, 2 एमएम सोडियम ऑर्थोनाडेट (वी), और 0.2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), पीएच 7.4।
  2. एक साफ ग्लास डिश में अंडाशय के कैंसर के ऊतकों के ~ 1.5 ग्राम रखें।
  3. ऊतक सतह 3x से रक्त को हल्के से धोने के लिए पूर्व-ठंडा माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का 2 मिलील जोड़ें।
  4. ऊतक को पूरी तरह से लगभग 1 मिमी3 टुकड़ों में कीमा बनाने के लिए साफ नेत्र कैंची का उपयोग करें, और कीमा बनाए गए ऊतकों को 50 मिलील अपकेंद्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 13.5 मिलीग्राम में 0.2 मिलीग्राम/एमएल नगरशामिल करें, और फिर समरूप (उपयोग स्केल 2, 10 एस 6x, अंतराल 10 एस) कीमा बनाया हुआ ऊतक (2 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक इलेक्ट्रिक होमोजेनेज़र का उपयोग करें।
  6. ऊतक समरूपों में माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का एक और 3 मिलील जोड़ें और उन्हें पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. सेंट्रलाइज तैयार टिश्यू होमोजेनेट (1,300 x ग्राम,10 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस)। क्रूड न्यूक्लियर अंश (यानी गोली) निकालकर सुपरनेटेंट रखें।
  8. हाल ही में सुपरनेटेंट (10,000 x g,10 min, 4 डिग्री सेल्सियस) रिफ्यूज किया गया है। माइक्रोसोम्स (यानी सुपरनेटेंट) निकालें और पैलेट रखें।
  9. माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 2 मिलील जोड़ें और हल्के पाइपटिंग द्वारा पैलेट को अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें।
  10. पैलेट सस्पेंशन (7,000 x g,10 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) को सेंट्रलाइज किया गया। अधिनायक को त्यागें और क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया (यानी, गोली) रखें।
  11. निकाले गए क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया को फिर से सस्पेंड करने के लिए 25% डेंसिटी रेडिएंट मीडियम (यानी, नायकोडेंज) के 12 मिलील जोड़ें।
  12. नीचे से ऊपर तक एक ट्यूब भरकर 34%, 8 मिलील 30%, 12 मिलीएल के 25% (1.11 कदम से क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया युक्त), 23% का 8 एमएल, और 20% घनत्व ढाल माध्यम का 3 मिलीएल, और सेंट्रलाइज आईटी (52,000 डिग्री ग्राम,90 00 0, 4, 4) के साथ एक ट्यूब भरकर एक सतत घनत्व ढाल बनाएं।
  13. एक साफ ट्यूब में 25% और 30% घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफेस पर शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया इकट्ठा करने के लिए एक लंबी और कुंद सिरिंज का प्रयोग करें।
  14. इसे तीन गुना मात्रा में पतला करने के लिए एकत्र ित माइटोकॉन्ड्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर जोड़ें। सेंट्रलाइज (15,000 x ग्राम,20 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
  15. गोली को फिर से निलंबित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का 2 मिलील जोड़ें, और अपकेंद्रित्र (15,000 x ग्राम,20 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस)। अधिनायक को त्यागें और गोली रखें।
  16. अंतिम गोली (यानी, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया) को इकट्ठा करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया नमूने के रूप में ओवेरियन कैंसर ऊतक से सभी शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को मिलाएं।

2. मानव नियंत्रण अंडाशय ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी

  1. कदम 1.1 में वर्णित माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 250 मीटर तैयार करें।
  2. एक साफ ग्लास डिश में सामान्य नियंत्रण अंडाशय ऊतकों के ~ 1.5 ग्राम रखें।
  3. ऊतक सतह 3x से रक्त को हल्के से धोने के लिए पूर्व-ठंडा माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 2 मिलील जोड़ें।
  4. ऊतक को पूरी तरह से लगभग 1 मिमी3 टुकड़ों में कीमा बनाने के लिए साफ नेत्र कैंची का उपयोग करें, और कीमा बनाए गए ऊतकों को 50 मिलील अपकेंद्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कीमा बनाया हुआ नियंत्रण ऊतकों में फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) में 0.05% ट्रिप्सिन/20 एमएम ईटीए के 8 मिलीएल जोड़ें, और डाइजेस्ट (30 मिन, कमरे का तापमान), जो ऊतकों और कोशिकाओं को ले जाने और माइटोकॉन्ड्रिया को छोड़ने में मदद करता है। फिर अपकेंद्री (200 x ग्राम,5 मिन)। अधिनेता को त्यागें, और ऊतकों और कोशिकाओं को रखें।
  6. माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 13.5 मिलीग्राम में 0.2 मिलीग्राम/एमएल नगरशामिल करें, और फिर समरूप (उपयोग स्केल 2, 10 एस 6x, अंतराल 10 एस) कीमा बनाया हुआ ऊतक (2 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक इलेक्ट्रिक होमोजेनेज़र का उपयोग करें।
  7. ऊतक समरूपों में माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का एक और 3 मिलील जोड़ें और उन्हें पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  8. तैयार ऊतक होमोजेनेट (1,300 x ग्राम,10 0 0, 4 डिग्री सेल्सियस) को सेंट्रलाइज करें। क्रूड न्यूक्लियर अंश (यानी गोली) निकालकर सुपरनेटेंट रखें।
  9. हाल ही में सुपरनेटेंट (10,000 x g,10 min, 4 डिग्री सेल्सियस) रिफ्यूज किया गया है। माइक्रोसोम्स (यानी सुपरनेटेंट) निकालें और पैलेट रखें।
  10. प्रकाश पाइपिंग द्वारा गोली को अच्छी तरह से निलंबित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर के 2 मिलील जोड़ें।
  11. पैलेट सस्पेंशन (7,000 x g,10 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) को सेंट्रलाइज किया गया। अधिनायक को त्यागें और क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया (यानी, गोली) रखें।
  12. निकाले गए क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया को फिर से सस्पेंड करने के लिए 25% घनत्व ढाल माध्यम के 12 मिलील जोड़ें।
  13. 38% के 8 मिलील के साथ नीचे से ऊपर तक एक ट्यूब भरकर एक सतत घनत्व ढाल बनाओ, 34%, 30% का 5 एमएल, 25% का 12 मिलीएल (2.12 कदम से क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया युक्त), 23% का 8 एमल, और 20% घनत्व ढाल माध्यम का 3 मिलीएल, और इसे (52,000 x जी,90 000, 4 डिग्री सेल्सियस)।
  14. एक साफ ट्यूब में 34% और 38% के बीच इंटरफ़ेस के लिए 25% और 30% के बीच इंटरफ़ेस से सीमा में शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया इकट्ठा करने के लिए एक लंबी और कुंद सिरिंज का उपयोग करें।
  15. इसे तीन गुना मात्रा में पतला करने के लिए एकत्र ित माइटोकॉन्ड्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर जोड़ें। सेंट्रलाइज (15,000 x ग्राम,20 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
  16. गोली को फिर से निलंबित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आइसोलेशन बफर का 2 मिलील जोड़ें, और इसे (15,000 x ग्राम,20 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस) केंद्रित करें। अधिनायक को त्यागें और गोली रखें।
  17. अंतिम गोली (यानी, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया) को इकट्ठा करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों के रूप में नियंत्रण अंडाशय के ऊतकों से सभी शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को मिलाएं।

3. शुद्ध ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की गुणवत्ता का सत्यापन

  1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के साथ सत्यापन के लिए शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों (यानी, चरण 1.16 से अंडाशय के कैंसर ऊतकों से छर्रों और चरण 2.17 से नियंत्रण अंडाशय ऊतकों) की एक ट्यूब लें।
    नोट: विस्तृत प्रोटोकॉल पहले15,16वर्णित किया गया था ।
  2. माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एक्सट्रैक्शन बफर को 8 एम यूरिया, 2 एम थिओरिया, 40 एमएम ट्रिस, 1 एमएम ईटीए, 130 एमएम डिथिओथ्रिटॉल (डीटीटी) और 4% (डब्ल्यू:वी) 3-(3-कोलमिडोप्रोपिल) डाइमेथिलम्मोनियो- 1-प्रोपेनसल्फोनेट (चैप्स) मिलाकर तैयार करें। पीएच को 8.52 तक समायोजित करें।
  3. शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की एक ट्यूब लें (यानी, चरण 1.16 में अंडाशय के कैंसर के ऊतकों से छर्रों और चरण 2.17 में नियंत्रण अंडाशय ऊतक) और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन निष्कर्षण बफर (प्रोटीन निष्कर्षण बफर के लिए माइटोकॉन्ड्रियल नमूने, 1:5) जोड़ें गोली को फिर से निलंबित करें। तरल नाइट्रोजन 3x में नमूनों फ्रीज और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  4. 12,000 x g,30 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज, सुपरनेटेंट (यानी, निकाले गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सैंपल) को इकट्ठा करें, और प्रोटीन की मात्रा को बिकिनोनिनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट के साथ मापें।
  5. 1.5 मीटर ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.8) के 50 मीटर तैयार करें, 9.08 ग्राम ट्रिस और डीडीएच2ओ के 40 एमएल को मिलाकर, एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 8.8 में समायोजित करें, और डीएच2ओ को 50 मीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8) के 50 मिलील को ट्रिस के 6.06 ग्राम और डीडीएच2ओ के 40 एमएल को मिलाकर, एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 6.8 में समायोजित करके, और डीएच2ओ को 50 मिलील की अंतिम मात्रा में जोड़कर तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. एक्रिलैमाइड के 29 ग्राम, बीआईएस-एक्रिलामाइड के 1 ग्राम और डीडीएच2ओ के 80 मिलीग्राम को मिलाकर 30% एक्रिलैमाइड-बीआईएस समाधान का 100 मीटर तैयार करें, और डीडीएच2ओ को 100 मिलील की अंतिम मात्रा में जोड़ें। इसे भूरे रंग की बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. ग्लाइसिन के 29 ग्राम, 58 ग्राम ट्रिस, 3.7 ग्राम सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडी) और डीडीएच2ओ के 800 मिलीग्राम को मिलाकर 10x ट्रिस-ग्लाइसिन इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर के 1,000 मीटर तैयार करें और फिर डीएच2ओ को 1,000 मीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
  9. ग्लिसरीन के 2 मिलीग्राम, ब्रोमेनोल ब्लू के 0.02 ग्राम, एसडीएस के 0.4 ग्राम, ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.8 के 2 एमएल, और डीडीएच2ओ के 7 मिलीग्राम को मिलाकर लोडिंग बफर के 10 मीटर तैयार करें, और फिर डीडीएच2ओ को 10 मीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
  10. 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) के 10 mL तैयार डीडीएच2ओ के 4 mL को मिलाकर जेल को हल करें, 3.3 एमएल का 30% एक्रिलामाइड-बीआईएस समाधान, 1.5 मीटर ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.8), 10% एसडीएस का 0.1 एमएल, 10% अमोनियम परसल्फाइड का 0.1 एमएल, और टेट्रामेथेथेथिलीनीनमाइन (टेमईडी) का 0.004 एमएल। ग्लास प्लेटों के बीच प्लेट में एसडीएस-पेज हल जेल समाधान को कंघी के नीचे के स्तर तक डालें। शीर्ष पर आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 2 mL जोड़ें। 30 मिन के लिए छोड़ दें।
  11. आइसोप्रोपिल अल्कोहल निकालें और ddH2O 3x के साथ शीर्ष धो लें। 5% एकाग्रता जेल समाधान डालो जिसमें डीडीएच2ओ का 4.1 एमएल, 30% एसिलामाइड-बीआईएस समाधान का 1.0 एमएल, 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 6.8), 10% एसडी एसडीएस का 0.06 एमएल, 0.06 एमएल ऑफ 10% एमोनियम परसल्फेट, और 0.006 एमएल टेमडी का एल शामिल है। तुरंत एकाग्रता जेल समाधान में कंघी डालें, 30 मिन के लिए छोड़ दें, और फिर कंघी को बाहर निकालें।
  12. 10x ट्रिस-ग्लाइसिन इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर को डीएच2ओ के 900 मीटर के साथ 10x ट्रिस-ग्लाइसिन इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर को पतला करके तैयार करें और इलेक्ट्रोफोरेटिक टैंक में डालें।
  13. ओवेरियन कैंसर से माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के 30 μg मिलाएं और 20 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए लोडिंग बफर के साथ चरण 3.4 से ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करें। 5 मिन के लिए मिश्रण उबालें, फिर इसे 100 वी के निरंतर वोल्टेज का उपयोग करके 10% एसडीएस-पेज हल जेल के साथ अलग करें। जब ब्रोमेनोल ब्लू नीचे तक पहुंच जाए तो इलेक्ट्रोफोरेसिस बंद कर दें।
  14. 10x ट्रिस-ग्लाइसिन इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर के 150 मिलीग्राम, डीडीएच2ओ के 1,050 मिलीग्राम और मेथनॉल के 300 मिलीग्राम को मिलाकर इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर बफर के 1.5 एल तैयार करें।
  15. पीवीडीएफ झिल्ली को 10 0 0 0 0 के लिए 100% मेथनॉल में और इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर बफर में कम से कम 5 मिन के लिए भिगो दें। 1x एलेक्रोफोरेटिक ट्रांसफर बफर में फिल्टर पेपर की पांच शीट कम से कम 5 मिन के लिए भिगोएं।
  16. प्रोटीन युक्त एसडीएस-पेज जेल को बाहर निकालें, और इसे इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर बफर में 10 मिन के लिए भिगो दें।
  17. सफेद प्लेट पर गीला स्पंज रखकर ट्रांसफर कैसेट, गीले फिल्टर पेपर की तीन चादरें, पीवीडीएफ झिल्ली, प्रोटीन के साथ एसडीएस-पेज जेल, गीले फिल्टर पेपर की दो चादरें और नीचे से ऊपर तक गीला स्पंज। किसी भी बुलबुले से बचें।
  18. स्थानांतरण कैसेट को इलेक्ट्रोफोरेटिक टैंक में रखें, इलेक्ट्रोफोरेटिक ट्रांसफर बफर में डालें, और फिर लगातार 200 एमए वर्तमान के तहत 2 एच के लिए स्थानांतरित करें।
  19. 10x ट्रिस-बफरेड लवण (टीबीएस) स्टॉक समाधान 12.114 ग्राम ट्रिस, 29.22 ग्राम नैल को मिलाकर तैयार करें और डीडीएच2ओ को 500 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा में जोड़ें। 10x टीबीएस के 200 मिलीएल, ट्वीन-20 के 2 एमएल और डीडीएच2ओ के 1,798 मिलील को मिलाकर 1x टीबीएसटीएसटी के 2 एल तैयार करें, जो टीबीएसटी के 100 मिलीएल और बीएसए के 5 जी को मिलाकर 100 मिलीग्राम ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें।
  20. स्थानांतरण के बाद, पीवीडीएफ झिल्ली को बाहर निकालें, 5 न्यूनतम के लिए TBST में हल्के से धोएं, फिर इसे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध करने में अवरुद्ध करें।
  21. विभिन्न उपसेलुलर ऑर्गेनेल्स के लिए विशिष्ट विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पीवीडीएफ झिल्ली (4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात) को इनक्यूबेट करें, जिनमें लेमिन बी (सेल नाभिक; बकरी विरोधी मानव एंटीबॉडी 1: 1,000 अवरुद्ध समाधान), फ्लोटिन-1 (साइटोझिल्ली; खरगोश विरोधी मानव शामिल हैं एंटीबॉडी 1:500 अवरुद्ध समाधान), COX4I1 (माइटोकॉन्ड्रिन; खरगोश विरोधी मानव 1:1,000 अवरुद्ध समाधान), GM130 (गोल्गी उपकरण; माउस एंटी-ह्यूमन एंटीबॉडी 1:1,000 अवरुद्ध समाधान), कैटालास (पेरिक्सिसोम; खरगोश विरोधी मानव एंटीबॉडी 1:1,000 अवरुद्ध समाधान), और कैथेप्सिन बी (लाइसोसोम; खरगोश एंटी-ह्यूमन एंटीबॉडी 1:1,000 अवरुद्ध समाधान)। 5 मिन 3x के लिए TBST में हल्के से धोलें।
  22. इसी माध्यमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी बकरी, बकरी विरोधी खरगोश, या बकरी विरोधी माउस) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीवीडीएफ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। 5 मिन 3x के लिए TBST में हल्के से धोलें। इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) के साथ इसकी कल्पना करें।

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS विश्लेषण

नोट: धारा 4 के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं iTRAQ निर्देशों(सामग्री की तालिका) कोसंदर्भित करें ।

  1. शुद्ध माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में एसडीटी बफर (4% एसडी, 100 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.6, और 100 एमएम डीटीटी) जोड़ें (यानी, चरण 1.16 से ओवेरियन कैंसर ऊतकों से छर्रों और चरण 2.17 से नियंत्रण अंडाशय ऊतक)। भंवर नमूना जब तक वहां कोई दिखाई उपजी है ।
    नोट: एसडीटी बफर अनुपात के लिए माइटोकॉन्ड्रियल नमूना 1:5 होना चाहिए।
  2. एसडीटी का इलाज नमूना 5 मिन के लिए उबालें, बर्फ पर नमूना ठंडा करें, और फिर अपकेंद्री (2,000 x ग्राम,2 मिन)।
  3. निकाले गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूनों के रूप में अधिनेत लीजिए और बीसीए प्रोटीन परख किट के साथ प्रोटीन सामग्री को मापें।
  4. कमी, एल्किलेशन, ट्राइप्सिन के साथ पाचन, विलवणीकरण, और लियोफिलाइजेशन3,4के लिए एसडीटी-निकाले गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन (प्रत्येक नमूने के 200 माइक्रोन) लें। प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतिकृति करें।
  5. 100 एम टेट्राथाइल अमोनियम ब्रोमाइड समाधान (पीएच 8.5) के साथ चरण 4.4 से ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स (प्रत्येक नमूने का 100 माइक्रोन) का इलाज करें, और इसके निर्देशों के अनुसार 6-प्लेक्स iTRAQ अभिकर्मकों में से एक के साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स लेबलकरें3,4। प्रत्येक नमूना 3x लेबल करें।
  6. समान रूप से 6 लेबल वाले ट्राइप्टिक पेप्टाइड नमूने (ओवेरियन कैंसर ऊतकों से तीन और नियंत्रण अंडाशय के ऊतकों से तीन), और वैक्यूम केंद्रित के साथ सूखें।
  7. एससीएक्स क्रोमेटोग्राफी के साथ मिश्रित iTRAQ-लेबल पेप्टाइड्स को 60 अंशों (प्रति 1 मिनट) में मिलाएं, फिर हर दो अंशों को एससीएक्स-आंशिक नमूने (एन = 30) के रूप में मिलाएं।
  8. एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर3,4 पर एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए प्रत्येक SCX-आंशिक नमूना विषय एक ६०-मिनट एलसी जुदाई ढाल के भीतर एक नैनो एलसी प्रणाली के साथ मिलकर एमएस/एमएस डेटा प्राप्त करने के लिए ।
  9. खोज इंजन(सामग्रीकी तालिका) के साथ प्रोटीन की पहचान करने के लिए एमएस/एमएस डेटा खोजें ।
  10. प्रत्येक प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए iTRAQ रिपोर्टर आयन तीव्रता का उपयोग करें और माइटोकॉन्ड्रियल विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीन (एमटीडीईपी) का निर्धारण करें और 1.5 या <-1.5 गुना, और पी एंड एलटी; 0.05 के बदलाव के साथ।

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Representative Results

ओवेरियन कैंसर के ऊतकों और नियंत्रण अंडाशय ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी में अंतर था। इस अध्ययन में पाया गया कि ओवेरियन ऊतकों से 3,4के नियंत्रण की तुलना में ओवेरियन कैंसर ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया तैयार करना बहुत आसान था । नियंत्रण अंडाशय ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल में कुछ सुधार किए जाने थे। सबसे पहले, ऊतक समरूपता से पहले, पीबीएस समाधान में 0.05% ट्रिप्सिन/20 एमएम ईटीए के 8 मिलीएल को जोड़ना आवश्यक था, जिसके बाद कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए पाचन, और 5 न्यूनतम के लिए 200 x ग्राम पर केंद्रीकरण (प्रोटोकॉल चरण 2.5 देखें)। इससे माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी में सुधार हुआ। दूसरा, नियंत्रण अंडाशय ऊतकों और अंडाशय के कैंसर के ऊतकों(चित्रा 1)से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी के लिए असतत घनत्व ढाल अलग था। ओवेरियन कैंसर ऊतकों के लिए इसे 34%, 30%के 8 मिलीएल, 25% के 12 मिलीएल (क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया युक्त), 23% के 8 मिलीएल और एक ट्यूब में नीचे से ऊपर तक 20% घनत्व ढाल माध्यम के 3 मिलील जोड़कर तैयार किया गया था। शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया केंद्रीकरण के बाद 25% और 30% के बीच इंटरफेस पर पाया गया(चित्रा 1ए,प्रोटोकॉल चरण 1.12 और 1.13 देखें)। नियंत्रण अंडाशय ऊतकों के लिए इसे 38%, 34%के 5 मिलीएल, 30% के 8 मिलीएल, 25% के 12 मिलील (क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया युक्त), 23% के 8 मिलील और एक ट्यूब में नीचे से ऊपर तक 20% घनत्व ढाल माध्यम के 3 एमएल जोड़कर तैयार किया गया था। इस मामले में, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया 25% और 30% के बीच इंटरफेस से लेकर 34% और 38% के बीच इंटरफ़ेस तक थे, केंद्रीकरण के बाद(चित्रा 1बी,प्रोटोकॉल चरण 2.13 और 2.14 देखें)।

प्रोटोकॉल ने उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों को पुराना कर दिया। उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूने मात्रात्मक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओमिक्स के लिए शर्त हैं। इस अध्ययन ने माइटोकॉन्ड्रिया की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया जो ईएम(चित्रा 2)और पश्चिमी दाग (डब्ल्यूबी, चित्रा 3)के माध्यम से अंतर-गति केंद्रीकरण और घनत्व ढाल केंद्रीकरण के साथ तैयार किए गए थे। EM छवियों ने दिखादिया कि ओवेरियन कैंसर और नियंत्रण दोनों में ओवेरियन ऊतकअलग मुख्य ऑर्गेनेल्स माइटोकॉन्ड्रिया थे, सिवाय कम मात्रा में पेरोक्सीसोम्स। माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान नियंत्रण अंडाशय ऊतक(चित्रा 2)की तुलना में ओवेरियन कैंसर में अधिक बदल गई। डब्ल्यूबी छवियों ने दिखादिया कि अंडाशय के कैंसर और नियंत्रण अंडाशय से तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में प्रमुख घटक माइटोकॉन्ड्रिया था, सिवाय कम मात्रा में पेरोक्सीसोम्स(चित्रा 3)को छोड़कर। डब्ल्यूबी परिणाम ईएम परिणामों के अनुरूप थे। तैयार माइटोकॉन्ड्रिया में छिद्रों को नियंत्रित करने के लिए यह उचित था, क्योंकि माइटोकॉन्ड्रिया पेरोक्सीसोम्स3,17,18के साथ बड़े पैमाने पर बातचीत करते हैं, जो बदले में माइटोकॉन्ड्रिया की कार्यात्मक पूर्णता को दर्शाते हैं। इन परिणामों ने तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की उच्च गुणवत्ता का प्रदर्शन किया।

इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की मात्रा आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त थी। ओवेरियन कैंसर से माइटोकॉन्ड्रियल नमूने की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करना और अंडाशय के ऊतकों को नियंत्रित करना आवश्यक है। इस अध्ययन में सात अंडाशय के कैंसर के ऊतकों से तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों को संयुक्त किया गया, और 11 नियंत्रण अंडाशय ऊतकोंसे 3। ओवेरियन कैंसर के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूना का कुल 2,409 माइक्रोन प्राप्त किया गया था, और नियंत्रण अंडाशय के ऊतकों(तालिका 1)के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूना के 4,440 μg। आम तौर पर, ITRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए, प्रत्येक नमूने को कम से कम 600 μg प्रोटीन (प्रत्येक iTRAQ लेबलिंग के अनुसार 200 μg प्रोटीन, 3 प्रतिकृति) की आवश्यकता होती है। इसलिए, तैयार माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूने ITRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए पर्याप्त थे।

अधिक से अधिक मात्रा में मात्रा में प्रोटीन की उपलब्धि मानव अंडाशय के कैंसर में माइटोकॉन्ड्रिया की गहन जांच को लाभ पहुंचाती है। इस अध्ययन का पता चला, पहचान की, और २,५६५ (५०.१४%) अपरेविनियमित प्रोटीन (नियंत्रण और gt;1 के लिए कैंसर का अनुपात) और 2,550 (49.86%) डाउनरेक्रेड प्रोटीन (कैंसर का अनुपात नियंत्रण और एलटी;1)3 (तालिका 2)। इसके अलावा, इस अध्ययन में अंडाशय के कैंसर और नियंत्रण अंडाशय के बीच 1,198 एमटीडीईपी का निर्धारण किया गया है। अपरेविनियमित प्रोटीन और 675 (56.34%) डाउनरेक्रेड प्रोटीन4 (टेबल 2)। ये डेटा वर्तमान में ओवेरियन कैंसर में सबसे बड़ा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम प्रोफाइल है।

Figure 1
चित्रा 1: क्रूड माइटोकॉन्ड्रिया को ओवेरियन कैंसर(ए)और नियंत्रण अंडाशय(बी)ऊतकों के लिए असतत घनत्व ढाल केंद्रीकरण के साथ शुद्ध किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ओवेरियन कैंसर(ए)और नियंत्रण अंडाशय(बी)ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ओवेरियन कैंसर(ए)और नियंत्रण अंडाशय(बी)ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की ऑर्गेनेले-विशिष्ट एंटीबॉडी आधारित पश्चिमी दाग छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूना वॉल्यूम (μL) एकाग्रता (μg/μL) प्रोटीन (μg)
ओवेरियन कैंसर ऊतक 530 4.545 2,409
ओवेरियन ऊतक को नियंत्रित करें 750 5.92 4,440

तालिका 1: तैयार माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन नमूनों की मात्रा।

श्रेणी कुल प्रोटीन की संख्या * अंतर व्यक्त प्रोटीन की संख्या#
अप-रेगुलेशन 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
डाउन-रेगुलेशन 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
कुल 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
* नियंत्रण के लिए कैंसर का अनुपात अप-नियमन के लिए >1 है, और डाउन-रेगुलेशन के लिए एलटी; 1।
# नियंत्रण के लिए कैंसर का अनुपात अप-नियमन के लिए 1.5 गुना और डाउन-रेगुलेशन के लिए 1.5 गुना है।

तालिका 2: तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों से ITRAQ-पहचान प्रोटीन की संख्या।

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Discussion

माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन अंडाशय के कैंसर की एक पहचान है। मानव अंडाशय के कैंसर से उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों की तैयारी और बड़े पैमाने पर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए ऊतकों को नियंत्रित करने से ओवेरियन कैंसर रोगजनकऔर माइटोकॉन्ड्रियल आणविक नेटवर्क में परिवर्तन में माइटोकॉन्ड्रियल कार्य की गहराई से समझ को लाभ होता है, और माइटोकॉन्ड्रिया4,5,8के आधार पर लक्ष्य चिकित्सा और प्रभावी बायोमार्कर की बाद की खोज के लिए अपने आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करते हैं । घनत्व ढाल केंद्रीकरण के संयोजन में अंतर-गति केंद्रीकरण प्रभावी रूप से मानव अंडाशय के कैंसर से अलग और शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया और ओवेरियन ऊतकों को नियंत्रित करता है। तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूने बहुत उच्च गुणवत्ता के थे और आगे मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए उपयुक्त थे।

तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में कम मात्रा में पेरोक्सीसोम्स3,17,18 और साइटोसोलिक प्रोटीन19,20थे . इसे केवल संदूषण नहीं माना जाना चाहिए, क्योंकि वे माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से बातचीत करते हैं या माइटोकॉन्ड्रिया का पालन करते हैं ताकि माइटोकॉन्ड्रिया को अधिक पूरी तरह से कार्य करने दिया जा सके। अध्ययनों में पाया गया है कि माइटोकॉन्ड्रिया19,20 और पेरोक्सीसोम्स17,18के साथ बड़े पैमाने पर बातचीत करते हैं । कुछ साइटोसोलिक प्रोटीन और पेरोक्क्सिसोम प्रोटीन को अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों में समाहित करने के लिए अपरिहार्य है।

तैयार माइटोकॉन्ड्रियल नमूनों से प्रोटीन का पता लगाने, पहचानने और मात्रा निर्धारित करने की प्रमुख तकनीक ITRAQ लेबलिंग-SCX-LC-MS/MS था । इस अध्ययन में 5,115 माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन3की पहचान की गई और उसमें 1,198 एमटीडीईपी4,14शामिल हैं . ओवेरियन कैंसर के ऊतकों में पाए जाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की बड़ी संख्या में वे शामिल हैं जो ओवेरियन कैंसर रोगजनकों में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका को समझने में मदद कर सकते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म8के आधार पर व्यक्तिगत लक्ष्य चिकित्सा की खोज के लिए एक संसाधन भी हो सकते हैं, और यहां तक कि माइटोकॉन्ड्रियल जीनोमिक्स पर आधारित प्रभावी बायोमार्कर ढूंढना, एक व्यवस्थित मल्टी-ओमिक्स कोण9,11,12, 13से प्रोटेओमिक्स, और मेटाबोलोमिक्स। इसके अलावा, प्रोटेम में प्रोटेओफॉर्म और प्रोटीन प्रजातियों की अवधारणाओं की शुरुआत के साथ, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओफॉर्म या प्रोटीन प्रजातियों की गहराई से खोज सीधे ओवेरियन कैंसर10,21,22के लिए प्रभावी और विश्वसनीय बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज का कारण बन सकती है।

इसके अलावा, मानव अंडाशय के कैंसर ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम के विश्लेषण में वर्तमान प्रोटोकॉल यहां वर्णित आसानी से अन्य मानव रोग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेम का अध्ययन करने के लिए अनुवाद ित किए जाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को हुआन प्रांतीय सौ प्रतिभा योजना (X.Z.), प्रतिभा परिचय के लिए Xiangya अस्पताल कोष (XZ के लिए), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ८१५७२२७८ और ८१२७२७९८ XZ के लिए), चीन से अनुदान "८६३" योजना द्वारा समर्थित था परियोजना (अनुदान संख्या 2014A020610-1 XZ के लिए), और चीन के हुआन प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 14JJ7008 XZ के लिए) । X.Z. वर्तमान पांडुलिपि के लिए अवधारणा की कल्पना की, माइटोकॉन्ड्रिया नमूनों के iTRAQ मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स डेटा प्राप्त किया, लिखा था और पांडुलिपि संशोधित, प्रासंगिक काम समंवित, और वित्तीय सहायता और इसी के लिए जिंमेदार था काम. एच.एल. तैयार माइटोकॉन्ड्रिया नमूने। एसक्यू ने आंशिक कार्य में भाग लिया । X.H.Z लेखन और संपादित अंग्रेजी भाषा में भाग लिया । एन.एल. ने ITRAQ प्रोटेओमिक्स डेटा का विश्लेषण किया। सभी लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि को मंजूरी दी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

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References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

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मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण के लिए ओवेरियन कैंसर ऊतकों और नियंत्रण ओवेरियन ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी
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Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

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