Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Questo articolo presenta un protocollo di centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità per separare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici per l'analisi proteomica quantitativa, risulta in un campione mitocondriale di alta qualità e un'analisi proteomica quantitativa ad alta capacità di riproduzione e ad alta riproducibilità di un proteoma mitocondriale del cancro ovaricoterrestre umano.

Abstract

Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Un metodo di preparazione mitocondriale efficace accoppiato con un tag isobarico per la quantificazione quantitativa relativa e assoluta (ITRAQ) proteomica quantitativa sono presentati qui per analizzare il cancro ovarico umano e controllare i proteomi mitocondriali, compresa la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con la trippsina, l'etichettatura iTRAQ, la forte frazionazione di scambio di cation (SCX), la cromatografia liquida (LC), la spettrometria di massa tandem (MS/ MS), analisi del database e analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Molte proteine sono state identificate con successo per massimizzare la copertura del proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano e per ottenere il profilo proteico mitocondriale espresso in modo differenziale nei tumori ovarici umani.

Introduction

Il cancro ovarico è un cancro ginecologico comune con elevata mortalità ma meccanismo molecolare poco chiaro1,2. La maggior parte dei tumori ovarici sono diagnosticati in fase avanzata, che ostacola seriamente la terapia. I cambiamenti mitocondriali sono un segno distintivo dei tumori ovarici umani e i mitocondri sono i centri del metabolismo energetico, della segnalazione cellulare e dello stress ossidativo3,4,5,6,7. Approfondimenti sui cambiamenti del proteoma mitocondriale nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico beneficeranno una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari del cancro ovarico e la scoperta di biomarcatori e bersagli terapeutici efficaci e affidabili. Il metabolismo mitocondriale è stato proposto e riconosciuto come un obiettivo per la terapia del cancro, e la terapia antimitocondriale potrebbe in ultima analisi essere molto utile per prevenire la ricorrenza e la metastasi del cancro8. La profilazione metabolica individuale è già praticata come strumento utile per la stratificazione del cancro e le strategie predittive9,10.

L'obiettivo a lungo termine di questa ricerca è quello di sviluppare e utilizzare un metodo proteomico mitocondriale quantitativo per studiare il cancro ovarico per chiarire le alterazioni del proteoma mitocondriale tra il cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici, e le loro alterazioni della rete molecolare da un angolo multio-omico sistematico11,12, che si tradurrà nella scoperta di biomarcatori molecolari mirati ai mitocondri13 per chiarire i meccanismi molecolari del cancro ovarico, previsione e trattamento personalizzato dei pazienti affetti da cancro ovarico. I tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) che etichettano3,4 sono un metodo efficace per quantificare i cambiamenti delle proteine mitocondriali. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti ovarici di controllo sono il prerequisito per l'analisi quantitativa iTRAQ dei proteomi mitocondriali3. La preparazione mitocondriale abbinata alla proteomica quantitativa iTRAQ è stata utilizzata con successo in programmi di ricerca a lungo termine sul proteoma mitocondriale del cancro ovarico umano, tra cui l'istituzione di mappe di riferimento proteoma mitocondriali3, l'analisi dei profili mitocondriali espressi in modo differenziale4,14 e modifiche post-traduzionali, compresa la fosforolanazione, che ha già portato alla scoperta di importanti percorsi di segnalazione cambiamenti di rete nei tumori ovarici umani5, comprese le alterazioni del metabolismo energetico4, metabolismo dei lipidi e mitofagia dei sistemi di percorsi3.

Studi precedenti hanno scoperto che la centrifugazione differenziale-velocità in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità è un metodo efficace per isolare e purificare i mitocondri dal cancro ovarico umano e controllare i tessuti ovarici3,4,5,14. L'etichettatura iTRAQ abbinata a un forte scambio di cation (SCX)-liquid qromatotry (LC)-tandem mass spectromate (MS/MS) è la tecnica chiave per rilevare, identificare e quantificare le proteine dai campioni mitocondriali preparati.

Qui vengono descritti protocolli dettagliati per la preparazione mitocondriale abbinati a proteomica quantitativa iTRAQ. Questi sono stati utilizzati con successo nell'analisi dei proteomi mitocondriali del tessuto ovarico umano. I protocolli includono la preparazione di campioni, la centrifugazione a velocità differenziale, la centrifugazione del gradiente di densità, la valutazione della qualità dei campioni mitocondriali, la digestione delle proteine con trippsina, l'etichettatura iTRAQ, la frazione SCX, l'LC, la MS/MS, la ricerca nel database e l'analisi quantitativa delle proteine mitocondriali. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per analizzare altri proteomi mitocondriali del tessuto umano.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Per questo protocollo sono stati utilizzati campioni di tessuto ovarico, compresi i tessuti del cancro ovarico (n . 7) e i tessuti ovarici di controllo normale (n . 11). L'attuale protocollo3,4,5 è approvato dal Comitato Di Etica Medica Ospedale Xiangya della Università Centro-Sud, Cina.

1. Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico umano

  1. Preparare 250 mL del buffer di isolamento mitocondriale mescolando 210 mm mannitol, 70 mM di saccarosio, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diacido nocitico acido tetraceo (EDTA), 0,1 mM etilene glicole bis(2-aminoethyl ether)acido tetraacetico (EGTA), 1 mM fenilmetathanesulfonyl fluoruro (PMSF) inibitore della proteasi, 2 MM di ortovanada (V) e 0,2% albumina di siero bovino (BSA), pH 7,4.
  2. Mettere 1,5 g di tessuti tumorali ovarici in un piatto di vetro pulito.
  3. Aggiungere 2 mL del cuscinetto di isolamento mitocondriale pre-raffreddato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto 3x.
  4. Utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in circa 1 mm3 pezzi e trasferire i tessuti tritati in un tubo centrifuga di 50 mL.
  5. Aggiungere 13,5 mL di buffer di isolamento mitocondriale contenente 0,2 mg/mL di nagarse, quindi utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare (usare la scala 2, 10 s 6x, l'intervallo 10 s) i tessuti macinati (2 min, 4 gradi centigradi).
  6. Aggiungere altri 3 mL di buffer di isolamento mitocondriale negli omogenei tissutali e mescolarli bene pipettando.
  7. Centrifugare l'omogenea del tessuto preparato (1.300 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere la frazione nucleare grezza (cioè il pellet) e mantenere il supernatante.
  8. Riconstate il supernatante (10.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere i microsomi (cioè il supernatante) e mantenere il pellet.
  9. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale e risospendere bene il pellet con tubi leggeri.
  10. Centrifugare la sospensione del pellet (7.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e mantenere i mitocondri grezzi (cioè il pellet).
  11. Aggiungere 12 mL di mezzo gradiente di densità del 25% (cioè Nycodenz) per rispendere i mitocondri grezzi estratti.
  12. Creare un gradiente di densità discontinuo riempiendo un tubo dal basso verso l'alto con 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi dal passo 1.11), 8 mL del 23% e 3 mL di mezzo di pendenza 20% e centrifugarlo (52.000 x g, 90 min, 4 C).
  13. Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati all'interfaccia tra il mezzo di pendenza a densità 25% e 30% in un tubo pulito.
  14. Aggiungere buffer di isolamento mitocondriale nei mitocondri raccolti per diluirlo in un volume triplo. Centrifuga (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi) e scartare il supernatante.
  15. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere il pellet e centrifugare (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e tenere il pellet.
  16. Raccogliere il pellet finale (cioè i mitocondri purificati) e conservarlo a -20 gradi centigradi.
    NOTA: Combinare tutti i mitocondri purificati dal tessuto del cancro ovarico come campione di mitocondri per l'analisi proteomica quantitativa.

2. Preparazione dei mitocondri dai tessuti ovarici del controllo umano

  1. Preparare 250 mL del buffer di isolamento mitocondriale come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Mettere 1,5 g di tessuti ovarici di controllo normale in una teglia di vetro pulito.
  3. Aggiungere 2 mL di cuscinetto di isolamento mitocondriale pre-raffreddato per lavare leggermente il sangue dalla superficie del tessuto 3x.
  4. Utilizzare forbici oftalmiche pulite per tritare completamente il tessuto in circa 1 mm3 pezzi e trasferire i tessuti tritati in un tubo centrifuga di 50 mL.
  5. Aggiungere 8 mL di 0,05% trypsin/20 mM EDTA in salina con buffer fosfati (PBS) ai tessuti di controllo macinati e digerire (30 min, temperatura ambiente), che aiuta a lizzare i tessuti e le cellule e rilasciare mitocondri. Quindi centrifuga (200 x g, 5 min). Scartare il super-atuante e mantenere i tessuti e le cellule.
  6. Aggiungere 13,5 mL di buffer di isolamento mitocondriale contenente 0,2 mg/mL di nagarse, quindi utilizzare un omogeneizzatore elettrico per omogeneizzare (usare la scala 2, 10 s 6x, l'intervallo 10 s) i tessuti macinati (2 min, 4 gradi centigradi).
  7. Aggiungere altri 3 mL di buffer di isolamento mitocondriale negli omogenei tissutali e mescolarli bene pipettando.
  8. Centrifugare l'omogenea del tessuto preparato (1.300 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere la frazione nucleare grezza (cioè il pellet) e mantenere il supernatante.
  9. Riconstateil supernatante (10.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Rimuovere i microsomi (cioè il supernatante) e mantenere il pellet.
  10. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere bene il pellet con il pipettaggio leggero.
  11. Centrifugare la sospensione del pellet (7.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi). Scartare il supernatante e mantenere i mitocondri grezzi (cioè il pellet).
  12. Aggiungere 12 mL di mezzo sfumato a densità 25% per rispendere i mitocondri grezzi estratti.
  13. Creare una pendenza di densità discontinua riempiendo un tubo dal basso verso l'alto con 8 mL del 38%, 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi dal passo 2.12), 8 mL del 23%, e 3 mL del mezzo di pendenza 20% di densità, e centrificarlo (52.000 x g, 90 min, 4 gradi).
  14. Utilizzare una siringa lunga e smussata per raccogliere i mitocondri purificati nell'intervallo dall'interfaccia tra il 25% e il 30% all'interfaccia tra il 34% e il 38% in un tubo pulito.
  15. Aggiungere buffer di isolamento mitocondriale nei mitocondri raccolti per diluirlo in un volume triplo. Centrifuga (15.000 x g, 20 min, 4 gradi centigradi) e scartare il supernatante.
  16. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento mitocondriale per risospendere il pellet e centrificarlo (15.000 x g, 20 min, 4 . Scartare il supernatante e tenere il pellet.
  17. Raccogliere il pellet finale (cioè i mitocondri purificati) e conservarlo a -20 gradi centigradi.
    NOTA: Combinare tutti i mitocondri purificati dal tessuto ovarico di controllo come campioni mitocondriali per l'analisi proteomica quantitativa.

3. Verifica della qualità dei campioni mitocondriali dei tessuti purificati

  1. Prendete un tubo di campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dei tessuti del cancro ovarico dal passo 1.16 e i tessuti ovarici di controllo dal passo 2.17) per la verifica con microscopia elettronica (EM).
    NOTA: il protocollo dettagliato è stato descritto in precedenza15,16.
  2. Preparare il buffer di estrazione delle proteine mitocondriali mescolando 8 M di urea, 2 M di thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM dithiothreitol (DTT) e 4% (w:v) 3-(3-cholamidopropyl) dimetuope)-1-propanefonazione (CHAPS). Regolare il pH a 8,52.
  3. Prendere un tubo di campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dai tessuti del cancro ovarico al passo 1.16 e i tessuti ovarici di controllo nel passaggio 2.17) e aggiungere il buffer di estrazione delle proteine mitocondriali (campioni mitocondriali al buffer di estrazione delle proteine, 1:5) a risospendere il pellet. Congelare i campioni in azoto liquido 3x e conservarli a temperatura ambiente per 2 ore.
  4. Centrifuga a 12.000 x g, 30 min, 4 gradi centigradi, raccolgono il supernatante (cioè il campione di proteine mitocondriali estratto) e misurano il contenuto proteico con un kit di appagamento proteico dell'acido bicinchoninico (BCA).
  5. Preparare 50 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) mescolando 9,08 g di Tris e 40 mL di ddH2O, regolando il pH a 8,8 utilizzando HCl e aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 50 mL. Conservare a 4 gradi centigradi.
  6. Preparare 50 mL di 1 M Tris-HCl (pH 6.8) mescolando 6,06 g di Tris e 40 mL di ddH2O, regolando il pH a 6,8 utilizzando HCl e aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 50 mL. Conservare a 4 gradi centigradi.
  7. Preparare 100 mL di soluzione acrilamide-bis del 30% mescolando 29 g di acrilammide, 1 g di bis acrilammide e 80 mL di ddH2O e aggiungendo ddH2O a un volume finale di 100 mL. Conservarlo in una bottiglia marrone a 4 gradi centigradi.
  8. Preparare 1.000 mL di 10x cuscinetto di elettroforesi tris-glicina mescolando 29 g di glicina, 58 g di Tris, 3,7 g di solfato di sodio dodecyl (SDS) e 800 mL di ddH2O, e quindi aggiungendo ddH2O ad un volume finale di 1.000 mL.
  9. Preparare 10 mL di buffer di carico mescolando 2 mL di glicerina, 0,02 g di blu bromofenolo, 0,4 g di SDS, 2 mL di Tris-HCl pH 6.8 e 7 mL di ddH2O, e quindi aggiungendo ddH2O a un volume finale di 10 mL.
  10. Preparare 10 mL di 10% di sodio solfato-polyacrilimide gel elettroforesi (SDS-PAGE) gel di risoluzione mescolando 4 mL di ddH2O, 3,3 mL di soluzione acrilamide-Bis del 30%, 2,5 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 mL di 10% SDS, 0,1 mL del 10% di persoletta di ammonio e 0,004 mL di tetrametilililethydidia (TEMEDMED). Versare la soluzione gel di risoluzione SDS-PAGE nella piastra tra le lastre di vetro al livello del fondo del pettine. Aggiungere 2 mL di alcool isopropile sulla parte superiore. Lasciare agire per 30 min.
  11. Rimuovere l'alcool isopropile e lavare la parte superiore con ddH2O 3x. Versare la soluzione di gel di concentrazione del 5% contenente 4,1 mL di ddH2O, 1,0 mL di soluzione acylamide-bis del 30%, 0,75 mL di 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 mL di 10% SDS, 0,06 mL di 10% di ammoniaca persulfat e 0,006 mL di TEMED. Inserire immediatamente il pettine nella soluzione di gel di concentrazione, lasciare per 30 min, e poi estrarre il pettine.
  12. Preparare il buffer 1x di elettroforesi Tris-glicina didiluindo 100 mL di 10x buffer di elettroforesi Tris-glicina con 900 mL di ddH2O e versare nel serbatoio elettroforetico.
  13. Mescolare i 30 g delle proteine mitocondriali del cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici dal passo 3.4 con il buffer di carico per raggiungere un volume finale di 20 gradi. Quando il blu del bromphenol raggiunge il fondo, fermare l'elettroforesi.
  14. Preparare 1,5 L di buffer di trasferimento elettroforetico mescolando 150 mL di 10x buffer di elettroforesi Tris-glicina, 1.050 mL di ddH2O e 300 mL di metanolo.
  15. Immergere la membrana PVDF in metanolo 100% per 10 min e nel buffer di trasferimento elettroforetico per almeno 5 min.
  16. Estrarre il gel SDS-PAGE contenente le proteine e immergerlo nel buffer di trasferimento elettroforetico per 10 min.
  17. Fare una cassetta di trasferimento posizionando una spugna bagnata sulla piastra bianca, tre fogli di carta da filtro bagnato, la membrana PVDF, il gel SDS-PAGE con le proteine, due fogli di carta da filtro bagnato e la spugna bagnata dal basso verso l'alto. Evitare le bolle.
  18. Posizionare la cassetta di trasferimento nel serbatoio elettroforetico, versare nel buffer di trasferimento elettroforetico, quindi trasferire per 2 h sotto una corrente costante di 200 mA.
  19. Preparare la soluzione di riserva 10x Tris-buffered (TBS) mescolando 12.114 g di Tris, 29.22 g di NaCl, e l'aggiunta di ddH2O ad un volume finale di 500 mL. Preparare 2 L di 1x TBST mescolando 200 mL di 10x TBS, 2 mL di Tween-20 e 1.798 mL di ddH2O. Preparare 100 mL di soluzione di blocco mescolando 100 mL di TBST e 5 g di BSA.
  20. Dopo il trasferimento, estrarre la membrana PVDF, lavare leggermente in TBST per 5 min, quindi bloccarla in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
  21. Incubare la membrana PVDF (4 gradi durante la notte) con diversi anticorpi primari specifici di diverse orgine subcellulari, tra cui lamina B (nucleo cellulare; anticorpo anti-umano di capra 1: 1.000 soluzione di blocco), flotillin-1 (citomembrana; coniglio anti-umano anticorpo 1:500 soluzione di blocco), COX4I1 (mitocondrione; coniglio anti-umano 1:1.000 soluzione di blocco), GM130 (Golgi apparatus; topo anti-umano anticorpo 1:1,000 soluzione di blocco), catalasi (perossiama; anticorpo anti-umano del coniglio 1:1,000 blocco e cathepsina B (lysososome; coniglio anti-umano anticorpo 1:1.000 soluzione di blocco). Lavare leggermente in TBST per 5 min 3x.
  22. Incubare la membrana PVDF per 1 h a temperatura ambiente con gli anticorpi secondari corrispondenti (anti-capra del coniglio, capra anti-coniglio o capre anti-topo). Lavare leggermente in TBST per 5 min 3x. Visualizzarlo con elettrochemiluminescenza (ECL).

4. analisi iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

NOTA: le procedure dettagliate per la sezione 4 si riferiscono alle istruzioni iTRAQ (Tabella dei materiali).

  1. Aggiungere il buffer SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 e 100 mM DTT) ai campioni mitocondriali purificati (cioè i pellet dei tessuti del cancro ovarico dal punto 1.16 e i tessuti ovarici di controllo dal passo 2.17). Vorticare il campione fino a quando non vi è alcun precipitato visibile.
    NOTA: il campione mitocondriale al rapporto buffer SDT deve essere 1:5.
  2. Far bollire il campione trattato con SDT per 5 min, raffreddare il campione sul ghiaccio, quindi centrifugare (2.000 x g, 2 min).
  3. Raccogli il supernatante come campione di proteine mitocondriali estratto e misura il contenuto proteico con un kit di test proteici BCA.
  4. Prendiamo le proteine mitocondriali estratte da SDT (200 g per ogni campione) per la riduzione, l'alchilazione, la digestione con la trypsina, la desalinizzazione e la liofilizzazione3,4. Eseguire tre repliche per ogni campione.
  5. Trattare i peptidi tripici (100 g di ogni campione) dal punto 4.4 con 100 mM di soluzione di bromuro di ammonio tetraeli (pH 8.5) ed etichettare i peptidi tripitici con uno dei reagenti iTRAQ a 6 plex secondo le sue istruzioni3,4. Etichettare ogni campione 3x.
  6. Mescolare ugualmente 6 campioni di peptidi tripptici etichettati (tre dai tessuti del cancro ovarico e tre dai tessuti ovarici di controllo), e asciugare con un concentratore di vuoto.
  7. Frazionare i peptidi misti con etichetta iTraQ con cromatografia SCX in 60 frazioni (una frazione per 1 min), quindi combinare ogni due frazioni come un campione frazionato SCX (n - 30).
  8. Sottoporre ogni campione frazionato SCX all'analisi LC-MS/MS su uno spettrometro di massa3,4 accoppiato con un sistema Nano LC all'interno di un gradiente di separazione LC di 60 minuti per ottenere dati MS/MS.
  9. Cercare i dati MS/MS per identificare le proteine con il motore di ricerca (Tabella dei materiali).
  10. Utilizzare le intensità degli ioni di reporter iTRAQ per quantificare ogni proteina e determinare le proteine mitocondriali espresse in modo differenziale (mtDEP) con una modifica di >1.5 o <-1.5 piega e p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C'era una differenza nella preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici. Questo studio ha trovato che era molto più facile preparare i mitocondri dai tessuti del cancro ovarico che dal controllo dei tessuti ovarici3,4. Alcuni miglioramenti dovevano essere apportati al protocollo per la preparazione dei mitocondri dai tessuti ovarici di controllo. In primo luogo, prima dell'omogeneizzazione dei tessuti, era necessario aggiungere 8 mL di 0,05% di trypsin/20 mM EDTA nella soluzione PBS aggiunta ai tessuti di controllo macinati, seguita dalla digestione per 30 min a temperatura ambiente e fugazione a 200 x g per 5 min (vedi passo protocollo 2.5). Questo ha migliorato la preparazione dei mitocondri. In secondo luogo, il gradiente di densità discontinuo era diverso per la preparazione di mitocondri da tessuti ovarici di controllo e tessuti di cancro ovarico (Figura 1). Per i tessuti del cancro ovarico è stato preparato aggiungendo 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi), 8 mL del 23% e 3 mL del 20% di pendenza media media dal basso verso l'alto in un tubo. I mitocondri purificati sono stati trovati nell'interfaccia tra il 25% e il 30% dopo la centrifugazione (Figura 1A, vedere i passaggi del protocollo 1.12 e 1.13). Per i tessuti ovarici di controllo è stato preparato aggiungendo 8 mL del 38%, 5 mL del 34%, 8 mL del 30%, 12 mL del 25% (contenente i mitocondri grezzi del 23% e 3 mL del mezzo gradiente di densità del 20% dal basso verso l'alto in un tubo. In questo caso, i mitocondri purificati erano nell'intervallo tra il 25% e il 30% all'interfaccia tra il 34% e il 38% dopo la centrifugazione (Figura 1B, vedere i passaggi di protocollo 2.13 e 2.14).

Il protocollo ha obatinato campioni mitocondriali di alta qualità. I campioni mitocondriali di alta qualità sono il prerequisito per la proteomica mitocondriale quantitativa. Questo studio ha valutato la qualità dei mitocondri preparati con centrifugazione differenziale e centrifugazione del gradiente di densità tramite EM (Figura 2) e macchie occidentali (WB, Figura 3). Le immagini EM hanno dimostrato che sia nei tumori ovarici che nei tessuti ovarici di controllo gli organelli principali isolati erano mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi. La morfologia dei mitocondri è cambiata più nei tumori ovarici che nel controllo del tessuto ovarico (Figura 2). Le immagini WB hanno dimostrato che il componente principale nei campioni mitocondriali preparati dai tumori ovarici e dalle ovaie di controllo era i mitocondri, ad eccezione di una piccola quantità di perossisomi (Figura 3). I risultati WB sono stati coerenti con i risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei risultati dei Era ragionevole che i perossisomi fosse contenuti nei mitocondri preparati, perché i mitocondri interagiscono ampiamente con i perossisomi3,17,18, che a loro volta riflettono la completezza funzionale dei mitocondri. Questi risultati hanno dimostrato l'alta qualità dei campioni mitocondriali preparati.

La quantità di proteine mitocondriali preparate con questo protocollo era adeguata per ulteriori analisi. È necessario ottenere una quantità sufficiente di campioni mitocondriali dal cancro ovarico e controllare i tessuti ovarici. Questo studio ha combinato i campioni mitocondriali preparati da sette tessuti di cancro ovarico e da 11 tessuti ovarici di controllo3. Per i tumori ovarici sono stati ottenuti un totale di 2.409 g di proteine mitocondriali e 4.440 g di campione proteico mitocondriale per il tessuto ovarico di controllo (Tabella 1). In genere, per la proteomica quantitativa iTRAQ, ogni campione ha bisogno di almeno 600 g di proteine (200 proteine g per ogni etichettatura iTRAQ, 3 repliche). Pertanto, i campioni di proteine mitocondriali preparati erano sufficienti per l'analisi proteomica quantitativa iTRAQ.

Il raggiungimento del numero massimo di proteine quantificate beneficia l'indagine approfondita dei mitocondri nel cancro ovarico umano. Questo studio ha rilevato, identificato e quantificato 5.115 proteine nei tumori ovarici rispetto al controllo del tessuto ovarico, di cui 2.565 (50,14%) proteine upregolate (rapporto tra tumori e controlli >1) e 2.550 (49,86%) proteine downregolate (rapporto tra tumori e controlli <1)3 (Tabella 2). Inoltre, questo studio ha determinato 1.198 mtDEPs tra tumori ovarici e ovaie di controllo con variazioni >1.5 o <-1,5 pieghe (p < 0,05), di cui 523 (43,66%) proteine upregolate e 675 (56,34%) proteine downregolate4 (tabella 2). Questi dati sono attualmente il più grande profilo di proteoma mitocondriale nel cancro ovarico.

Figure 1
Figura 1: I mitocondri grezzi sono stati purificati con una centrifugazione discontinua gradiente di densità per il cancro ovarico (A) e tessuti ovarici di controllo (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine micrografica elettronica dei mitocondri isolati dal cancro ovarico (A) e controllo dei tessuti ovarici (B ). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: immagini di macchie occidentali basate su anticorpi specifici di Organelle di mitocondri isolati dal cancro ovarico (A) e tessuti ovarici di controllo( B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione di proteine mitocondriali Volume (L) Concentrazione (g/l) Proteine (g)
Tessuto del cancro ovarico 530 4.545 2,409
Controllo del tessuto ovarico 750 5.92 4,440

Tabella 1: La quantità di campioni di proteine mitocondriali preparati.

Categoria Il numero totale di proteine Il numero di proteine espresse in modo differenziale
Up-regolazione 2,565 (50.14%) 523 (43.66%)
Down-regolazione 2,550 (49.86%) 675 (56.34%)
Totale 5,115 (100.0%) 1,198 (100.0%)
Il rapporto tra tumori e controlli è >1 per l'up-regulation, <1 per il down-regulation.
# Il rapporto tra tumori e controlli è di >1,5 per l'up-regulation e <-1.5 per la regolazione verso il basso.

Tabella 2: Il numero di proteine identificate da iTRAQ da campioni mitocondriali preparati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le alterazioni mitocondriali sono un segno distintivo del cancro ovarico. La preparazione di campioni mitocondriali di alta qualità dal cancro ovarico umano e dai tessuti di controllo per la proteomica quantitativa su larga scala beneficia la comprensione approfondita della funzione mitocondriale nella patogenesi del cancro ovarico e nei cambiamenti della rete molecolare mitocondriale e aiuta a chiarire il suo meccanismo molecolare per la successiva scoperta della terapia bersaglio e biomarcatori efficaci basati sui mitocondri4,5,8. La centrifugazione a velocità differenziale in combinazione con la centrifugazione del gradiente di densità ha efficacemente isolato e purificato i mitocondri dal cancro ovarico umano e dai tessuti ovarici di controllo. I campioni mitocondriali preparati erano di altissima qualità ed erano adatti per un'ulteriore analisi proteomica quantitativa.

I campioni mitocondriali preparati contenevano una piccola quantità di perossisomi3,17,18 e proteine citosoliche19,20. Questo non deve essere semplicemente considerato contaminazione, perché interagiscono o aderiscono direttamente o indirettamente con i mitocondri per lasciare che i mitocondri funzionino più completamente. Gli studi hanno scoperto che i mitocondri interagiscono ampiamente con il citoscheletro dell'actina19,20 e perossisomi17,18. È inevitabile che alcune proteine citosoliche e proteine perossisomi siano contenute in campioni mitocondriali isolati.

La tecnica chiave per rilevare, identificare e quantificare le proteine dai campioni mitocondriali preparati è stata l'etichettatura iTRAQ-SCX-LC-MS/MS. Questo studio ha identificato e quantificato 5.115 proteine mitocondriali3,tra cui 1.198 mtDEP4,14. Il gran numero di proteine mitocondriali presenti nei tessuti del cancro ovarico include quelle che possono aiutare a comprendere il ruolo dei mitocondri nella patogenesi del cancro ovarico e anche essere una risorsa per la scoperta di una terapia target personalizzata basata sul metabolismo mitocondriale8, e anche trovare biomarcatori efficaci sulla base della genomica mitocondriale, proteomica e metabolomica da un angolo multio-omico sistematico9,11,12,13. Inoltre, con l'introduzione di concetti di specie proteoforme e proteiche nel proteoma, un'esplorazione approfondita delle proteoforme mitocondriali o delle specie proteiche potrebbe portare direttamente alla scoperta di biomarcatori efficaci e affidabili e di bersagli terapeutici per il cancro ovarico10,21,22.

Inoltre, gli attuali protocolli nell'analisi dei proteomi mitocondriali del tessuto ovarico umano descritti qui sono facilmente tradotti per studiare altri proteomi mitocondriali della malattia umana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Hunan Provincial Hundred Talent Plan (a X.Z.), Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (a X ) ), la National Natural Science Foundation of China (Grant no. (Grant n. 2014AA020610-1 a X ) e la Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant n. 14JJ7008 a X . X.Z. ha concepito il concetto per il presente manoscritto, ha ottenuto i dati proteomici quantitativi iTRAQ dei campioni di mitocondri, ha scritto e rivisto il manoscritto, ha coordinato l'opera pertinente ed è stato responsabile del sostegno finanziario e dei corrispondenti Lavoro. H.L. ha preparato campioni di mitocondri. S.Q. ha partecipato a lavori parziali. Alla scrittura e alla modifica della lingua inglese, X.H. ha partecipato alla scrittura e alla modifica della lingua inglese. N.L. ha analizzato i dati proteomici iTRAQ. Tutti gli autori hanno approvato il manoscritto finale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

Tags

Ricerca sul cancro numero 153 cancro ovaricotico mitocondri centrifugazione differenziale-velocità mediazione del gradiente di densità tag isobarico per l'etichettatura di quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ) forte scambio di cation (SCX) cromatografia liquida (LC) spettrometria di massa tandem (MS/MS) proteoma mitochondriale
Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter