Summary
עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.
Abstract
מניע הנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) התערוכה התנגדות יוצאת דופן למחלות ניווניות מוטוריים מנוע כגון טרשת נפוצה amyotrophic (ALS) כאשר לעומת נוירונים מנוע השדרה (smns). היכולת לבודד את העכבר הראשי CN3s, CN4s ו-SMNs יספק גישה למנגנוני לימוד המשמשים את הפגיעות הסלקטיבית. עד היום, רוב הפרוטוקולים משתמשים בתרביות תאים הטרוגנית, שיכולות לבלבל את הפרשנות של תוצאות נסיוניות. כדי למזער את הבעיות הקשורות לאוכלוסיות מעורבות של תאים, תרבויות טהורות הן חיוניות. כאן, הפרוטוקול הראשון מתאר בפרוטרוט כיצד לטהר ביעילות ולטפח CN3s/CN4s לצד SMNs מקבילים מאותם עוברים באמצעות היום העובריים 11.5 (E 18.5) איי: העוברים העכבר הטרנסגניים gfp . הפרוטוקול מספק פרטים על ניתוח והדיסוציאציה של רקמות, בידוד התא מבוסס FACS, ובטיפוח מחוץ גופית של תאים מ CN3/CN4 ו-SMN גרעיני. פרוטוקול זה מוסיף רומן במערכת התרבות CN3/CN4 מתורבת לפרוטוקולים קיימים ובמקביל מספק תרבות SMN טהורה של מינים וגילאים בהתאמה להשוואה. ניתוח התמקדות במאפיינים מורפולוגיים, סלולר, מולקולריים ואלקטרופיסיולוגיים של נוירונים מוטוריים הם אפשריים במערכת זו תרבות. פרוטוקול זה יאפשר מחקר לתוך המנגנונים המגדירים את פיתוח תא העצב המוטורי, פגיעות סלקטיבית ומחלות.
Introduction
התרבות של הנוירונים המוטוריים העיקרי הוא כלי רב עוצמה אשר מאפשר את המחקר של התפתחות עצבית, תפקוד, ורגישות לטרדוגני. תרביות נוירונים מוטוריים שימושיים במיוחד לחקר מחלות ניווניות כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS)1,2, אשר מנגנוני המחלות שלהם מובנים לחלוטין. מעניין, למרות מוות משמעותי התא של נוירונים מנוע השדרה (smns) בשני als חולים ו als מודל עכברים, מוות תאים בנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) הם נדירים יחסית1,3,4,5,6,7,8,9. לפיכך, ניתוח השוואתי של תרבויות טהורות של CN3s/CN4s ו-SMNs יכול לספק רמזים חשובים לגבי מנגנונים בעלי פגיעות יחסית. למרבה הצער, מכשול גדול לניתוחים כאלה כבר חוסר יכולת לצמוח תרבויות מטוהרים של אלה נוירונים מוטוריים.
פרוטוקולים רבים תוארו לטיהור של SMNs מדגמי בעלי חיים. רוב הפרוטוקולים הללו משתמשים בדחיסות מעבר הצבע צנטריפוגה10,11,12 ו/או p75ntr-נוגדנים מבוססי-מיון-הנוגדן טכניקות13,14,15,16. צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה לנצל את הגודל הגדול של SMNs יחסית לתאי השדרה האחרים, בעוד p75Ntr הוא חלבון מתוך מסחטות מבוטא בלעדית על ידי smns בחוט השדרה. כמעט 100% התרביות smn טהור נוצרו על ידי אחד או שניהם פרוטוקולים11,12,14. עם זאת, פרוטוקולים אלה לא הצליחו ביצירת CN3/CN4 בתרבויות משום שCN3s/CN4s אינם מבטאים p75Ntrוסמנים CN3/CN4 ספציפיים אחרים לא זוהו. הם גם קטנים יותר SMNs, ולכן, קשה יותר לבודד בהתבסס על גודל. במקום זאת, במחקרים חוץ גופית של CN3s או CN4s הסתמך על הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,25,26, ו פרוסה27,28 התרבויות, אשר מורכב סוגי תאים הטרוגנית, ולא קיימים פרוטוקולים עבור ה בידוד ותרבות של CN3s ראשי או CN4s.
כאן, פרוטוקול מתואר עבור ההדמיה, בידוד, טיהור, וטיפוח של CN3s, CN4s, ו SMNs מאותו יום עובריים 11.5 (E 11.5) איי: העכברים gfp הטרנסגניים29 (איור 1, איור 2א). איי. איי. אם : gfp במיוחד לתוויות נוירונים מוטוריים עם gfp מקומי המונע את קרום התא. פרוטוקול זה מאפשר למינים-ולגיל השוואה בין סוגים מרובים של נוירונים מוטוריים כדי להבהיר מנגנונים פתולוגיים במחלת העצב המוטורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים ניצול חיות מעבדה בוצעו בהתאם הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש של בית החולים לילדים בבוסטון.
1. הגדרת מעבר מתוזמן לפני החיתוך
- כדי ליצור עכברים עובריים לפני הלידה עבור הקציר המנוע, שוקל כל עכבר נקבה ולהגדיר ההזדווגות מתוזמן בין איי למבוגרים מבוגרים: עכברים הטרנסגניים gfp 11.5 ימים לפני יום של בידוד תא העצב. לצורך פיתוח הפרוטוקול הזה, 129S1/C57BL/6J איי : כגון עכברים gfp, בגילאי 2-9 חודשים, שימשו וההזדווגות הוגדרה בערב.
- לבחון עכברים נקבה עבור אטמי הנרתיק למחרת בבוקר. שקול את התאריך שבו התקע מזוהה כיום עובריים (E) 0.5.
- שוקלים עכברים נשיים ובדקו לגורים באמצעות אולטרסאונד (ראו טבלת חומרים) בין e 8.5-11. . תבדקי את הסימנים להזדווגות מוצלחת
- לאשר את ההזדווגות מוצלחת על ידי זיהוי עלייה במשקל בעכברים נקבה (בדרך כלל > 1.5 g על E 9.5 אם יש יותר מ 5-6 עוברים).
- לאשר באופן חזותי עוברים תחת אולטרסאונד. עוברים ניתן לאתר בקלות על ידי אולטרסאונד לאחר E 9.5. Ultrasounds מתנהלים רק על נקבות שזכו במשקל כי הם לעיתים קרובות יותר בהריון מאשר אלה שלא.
הערה: עכברים נקבה יכולים לעלות במשקל מסיבות אחרות מאשר הריון, אז להרוויח במשקל לבד הוא לא מחוון אמין של ההריון. אישור אולטרסאונד מונע הקרבה מיותרת של נקבות שאינן בהריון, אבל לא קריטי אם אינו זמין.
2. מצבי חיתוך והכנת כלים
- לבצע את כל ציפוי (למעט חומצה ניקוי של שמיכות), הכנה למדיה, רקמת הדיסוציאציה (למעט צנטריפוגה ו דגירה), ועבודת התרבות בתוך כיפה זרם למינארי כדי להבטיח את עקרות התקשורת ונוירונים מוטוריים עובריים.
- בעזרת תשומת לב מדוקדקת לטכניקה סטרילית, לבצע ניתוח רקמות מחוץ למכסה כיסוי של הזרם למינארי עם סיכון מינימלי של זיהום.
- לעקר צלחת חיתוך אחד, זוג אחד של מיקרוסקופ מספריים, זוג אחד של מלקחיים חבישה האגודל, שני זוגות של דומונט #5 מלקחיים, סכין אחת מיקרובתר, ומיני כפית אחת של מוריה מחורר על ידי האישר ב 70% אתנול לפני השימוש.
3. PDL/למינציה של כיסוי מנות/כיסויים
הערה: תרבות המונתק נוירונים מוטוריים הראשי ב 96 היטב או 24 לוחות טוב, בהתאם למספר התאים הדרושים עבור היישום. תאים יכולים להיות מאופטים ישירות בלוח התרבות של הרקמה, ללא שימוש בכיסויים, אם הבארות שקופות והעוביים תואמים להדמיה.
- עבור יישומים הדורשים coverslips, להכין חומצה ניקוי, מעוקר, ואוויר מיובשים שמיכות לפחות 2 ימים לפני בידוד תא העצב כפי שתוארה בעבר30. אצוות של כיסוי יכול להיות מוכן בצורה זו גם מראש של ניסויים ניתן לאחסן עד 6 חודשים ללא השפעה על איכות ניסיוני.
- הכנת פתרון עבודה של 20 μg/mL פולי D-ליזין (PDL) ב מלוחים פוספט מאגור (PBS) 2 ימים לפני בידוד תא העצב.
- הורדה PDL (1 מ"ג/mL) מראש ולאחסן ב-20 ° c כפתרון מניות.
- לכסות את פני השטח של כל שמיכות או את הבאר של הצלחת תרבות רקמות עם פתרון PDL מספיק פתרון עובד (למשל, 100 μL לכל טוב על 96 היטב צלחות או 500 μL לכל טוב על 24 צלחות טוב עם או בלי coverslip). המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
- למחרת לשטוף את 3x עם מים מעוקר.
- לאטום את הצלחות עם הסרט פרפין ולאחסן את הצלחות מצופה PDL ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש אם הם יבשים לחלוטין לאחר השטיפה הסופית.
- הכנת פתרון עבודה עם 10 μL של מלמינציה (1.1-1.2 מ"ג/mL) ב 1.2 mL של PBS.
- ממלאי מקום במניות (1.1-1.2 מ"ג/mL) מראש ובחנות ב-80 ° c.
- מכסים את פני השטח של כל שמיכות או גם עם מספיק למינציה בתמיסה כדי לכסות את המשטח באופן שווה. דגירה לפחות 2 h ב 37 ° צ' לפני השימוש.
הערה: לוחות מצופים PDL/למינציה ושמיכות ניתן לאחסן עד 1 שבוע ב 37 ° c, אבל מצופה למינציה טרי הוא המועדף. הסרת מלמינציה ישירות לפני ציפוי30. אין לאפשר ללמינציה להתייבש. אם יש לאחסן את הלוחות במשך יותר מכמה שעות, הם צריכים להיות עטוף בסרט פרפין.
4. הכנת מדיה לחיתוך, תא עצב מוטורי ופתרונות דיסוציאציה
הערה: ריכוזים בסוגריים מציינים את הריכוזים הסופיים של כל מגיב.
- . הכן את מדיום החיתוך
- הפשרת סרום הסוס התרמי למשך הלילה ב -4 ° c, הכינו 1 מעלות-mL, והחנות ב-20 ° c. הפשרת הלישוב ב-RT ישירות לפני השימוש.
- חנות B27-מוסף (50x) ב 1 mL בשנת-20 ° c. הפשרת הלימטים ב-RT מיד לפני השימוש. הימנע מחזורי הקפאה/הפשרה.
- לאחסן תוספת גלוטמין (100x) ב -4 ° c או-20 ° c. התחלק ל-0.5 mL במידה והוא מאחסן ב-20 ° c.
- חנות פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ב 1 מ"ל מתחת ל-20 ° c. הפשרת הלימטים ב-RT מיד לפני השימוש.
- כדי להפוך את בינונית לחיתוך, לערבב 9.4 mL של E שינה עם 200 μL של סרום סוסים (2%), 200 μL של 50x B27 תוספת (1x), 100 μL של תוספת גלוטמין 100x (1x) (למשל, GlutaMAX), ו-100 μL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL השתמש במדיום זה לאיסוף רקמות גזור ולעשות את ההשעיה הסופית של תאים מושעה.
- הוסף 500 μL של בינוני החיתוך לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים משנת 1.7 mL לאיסוף רקמות יום לפני בידוד תא העצב. הכינו צינור אחד לכל סוג של רקמה שייאספו (למשל, בקרה חיובית, שליטה שלילית, CN3/CN4, SMN) והחנות ב -4 ° צ' לפני השימוש.
- שילוב 49 mL של E שינה מדיה נמוכה זריחה עם 1 mL של תוסף B27 (1x) ולמלא את הצלחת 24 טוב עם זה בינוני (2 מ ל/טוב) יום לפני בידוד תא העצב. השתמש במנה זו עבור איסוף עוברי עכבר. החנות ב -4 ° c לפני השימוש.
- הכינו את מדיום התרבות. של מנוע העצב
- הכינו 250 μL של 25 מ"מ 2-mercaptoethanol במדיום L15 של ליבוביץ '. חנות ב-20 ° c.
- צור 5 μL האליבטים של 100 μg/mL פתרונות של BDNF, CNTF, ו GDNF מדולל במים מעוקרים. חנות ב-80 ° צ' והפשרה ב-RT מיד לפני השימוש.
- הכנת 10 מ"מ פתרון forskolin על ידי הוספת 64 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי 5 מ"ג (1.0670 μM) של forskolin ומערבולת היטב כדי לפזר לחלוטין. ואז להוסיף מים מעוקר (1.003 mL) לפתרון DMSO ומערבולת היטב. חנות 12 μL של 10 מילימטר forskolin ב-20 ° צ' והפשרה מיידית ב-RT מיד לפני השימוש.
- הכינו 12 Μl12$ של 100 מ"מ איזובוטילאקלילך (IBMX) מדולל ב DMSO. אחסן ב-20 ° c והפשרה מיידית ב-RT באופן מיידי לפני השימוש.
- כדי להפוך את מנוע התרבות תא העצב המנוע, לערבב 9.4 mL של מדיום neurobasal סיס עם 200 μL של סרום סוס (2%), 200 μL של תוספת 50x B27 (1x), 100 μL של תוספת גלוטמין 100x (1x), 100 μL של 10,000 U/m: פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL), ו 20 μL של 25 מ"מ 2-mercaptoethanol (50 μM), רצוי ישירות לפני השימוש. שלב זה יכול להתבצע עד יום אחד לפני בידוד הנוירונים.
- , ממש לפני השימוש להוסיף 1 μL כל אחד 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), ו-GDNF (10 ng/mL) ו-10 μL של 10 מילימטר forskolin (10 μM), ו 10 μL של 100 mM IBMX (100 μM) כדי מנוע התרבות תא חמם את המדיום עד 37 ° c.
- הכן את פתרונות הדיסוציאציה.
- להכין את הפתרון פפאין (20 U/mL פפאין ו 0.005% dnase) ו-אלבומין-ovomucoid פתרון מעכב (1 מ"ג/ml ovomucoid מעכב, 1mg/ml, ו 0.005% dnase) בעקבות הוראות היצרן.
- הכינו 500 μL האליבטים של כל אחד מהמעכב והפתרונות המעכבי של ovomucoid והחנות ב-80 ° c. הפשרת הלימטים ב 37 ° c מיד לפני השימוש.
5. המוח הגחוני ובחוט השדרה ניתוח
הערה: בצע את כל השלבים הבאים למעט שלבים 5.1.1-5.1.3 ו-5.1.5-5.1.6 מתחת לstereomicroscope ניתוח של קרינה פלואורסצנטית. זמן הניתוח הכולל לניסוי הוא בדרך כלל 3-5 h, בהתאם לקיאות בטכניקת החיתוך ומספר הנוירונים המוטוריים הדרושים לכל ניסוי.
- ניתוח מוחי בינוני
- המתת חסד עכבר בהריון כ 11.5 ימים postfertilization על ידי גז פחמן דו חמצני פריקה צוואר הרחם.
- לרסס את הבטן ביסודיות עם אתנול ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים חיטוי מיקרובתר ומלקחיים הבוהן. לשטוף את הרחם בקצרה ב-PBS סטרילי, ולאחר מכן להעביר את לוחית הניתוח ממולא PBS מקורר.
- הסר את ה-איי. אס. או.- עוברים בזהירותמהרחם באמצעות מספריים מיקרודטרים סטריליים, מלקחיים לבגדי אגודל, ודומונט #5 מלקחיים ב-PBS מעוקר קר בקרח מתחת לאור הבהיר של המיקרוסקופ. באמצעות כפית סטרילית מיני מחורר מוריה, להעביר כל העובר לבאר נפרדת של 24 צלחת לוחית מלא מקורר שינה-E בינונית נמוכה זריחה בתוספת עם 1x B27. . שמור את הצלחת ה -24 על הקרח
- העבר עובר אחד לצלחת הניתוח סטרילי ולכסות אותו לחלוטין עם תמיסת מלח קר מאוזנת של האנק ההאנק (HBSS).
- ודא כי שלבי החיתוך מתבצעים תחת פלואורואסעין isothiocyanate (FITC) התאורה של המיקרוסקופ. שימוש בפינצטה, מסירים את הזנב ואת פני העובר מבלי לפגוע במוח האמצע (איור 2Ba). מניחים את העובר הנוטה בגפיים מתחת לזנב ומצביעים לעבר חזית המיקרוסקופ, לכיוון הבתר (המסומן בכוכבית, איור 2Bb).
- שימוש בפינצטה, חותך את גג החדר הרביעי כדי ליצור פתח קטן. השתמש בפתח זה כדי לחבר פינצטה לחלל שנוצר בין החדר הרביעי לגג. מנתחים לאורך המשטח הצדדי של העובר rostral לקליפת המוח ולרוחב לצלחת הרצפה ולטור המנוע (איור 2, ב). לפתוח את רקמת לגזור באופן פתוח הספר כדי לחשוף את GFP-חיוביות CN3 ו CN4 גרעינים.
הערה: פיסת רקמה קטנה מהמוח הגחוני המכיל את מCN3, ו-CN4 תיחשף כעת. - הפרידו בזהירות את המוח המורק מהעובר והסירו את רקמת המננגיאל באמצעות מלקחיים וסכין מיקרובתר. נתח את הגרעין הדו GFP-חיוביים CN3 ו CN4 מתוך צלחת הרצפה ו-GFP שליליים אחרים רקמות הסביבה באמצעות מלקחיים וסכין מיקרובתר (איור 2ד). למקסם את מספר הנוירונים GFP-חיוביים מוטוריים ברקמת החפירה, אך להימנע מנגיעה או להזיק להם.
- אם יש צורך באוסף של CN3 ו-CN4 גרעינים נפרדים, גזור לאורך קו האמצע של שני הגרעינים האלה (קו מנוקד צהוב באיור 2ד). באמצעות P1000 פיפטה, לאסוף את רקמת המוח ביניים בחיתוך בראש עם HBSS מינימלי ומניחים אותו בתוך התווית 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה מלאה בינוני לנתיחה (ראה שלב 4.1.5). אחסן על הקרח עד לדיסוציאציה.
- המשך לאחד משני המוחות הגהים מעוברים נוספים באותה צינורית עד שהמספר הכולל עומד בדרישות הנסיוניות (עיין בשלב 8 עבור מספרי תאים אידיאליים).
הערה: אוסף במאגר של לפחות 10 מוחות מיניים הגוניים מניב כ 1 x 104 CN3/CN4 נוירונים מוטוריים מומלץ כי הרקמות כפופות ללחץ במהלך הדיסוציאציה ומיון.
- קרע בחוט השדרה
- שמור על העובר נוטה עם הראש מול המיקרוסקופ, לכיוון הבתר. החזיקו את העובר עם זוג מלקחיים אחד והכניסו את קצה זוג הפינצטה השני לחלק האחר של החדר הרביעי.
- פתח את שאר המוח לאחר השידרה ואת חוט השדרה דורסלי מעל היקף rostrocaudal כולו של העובר. פתח על ידי חיתוך רקמה על גבי, החל החדר הרביעי ועובד לכיוון התעלה המרכזית של החוט השדרה caudal באמצעות מלקחיים כמו מספריים (איור 2Ca, ב). לדאוג להימנע מנגיעה או פגיעה בחוט השדרה הגחוני במהלך הליך זה.
- להחזיק את העובר עם זוג מלקחיים אחד ולצבוט את הכנף של הרקמה הצדדית בכל צד עם זוג מלקחיים אחרים (איור 2Ea, b).
הערה: הרקמות הקדמיות מכילות את העור, המסנכילי, השורש העצמי, וחוט השדרה. הסר מרקמות אלה ככל האפשר מבלי להזיק לגרעיני SMN, משום שהם דבקים ויכולים ללכוד Smn במהלך הסינון או לגרום לסתימת במהלך מיון FACS. - הסר את חוט השדרה הגחוני באמצעות סכין מיקרוחיתוך לחדור ישירות מתחת GFP-חיוביים SMN. הרימו את חוט השדרה הגחוני עם תנועות מראה-כמו בשני הצדדים (איור 2פא, ב). חותכים את חוט השדרה הגחוני הצף באופן ישיר מעל C1, שם הראשון GFP-חיובי הקרן הקדמית פרויקטים (איור 2G). כמו כן, לחתוך בצורה הפוך בגבול העליון של הגפיים התחתונות (איור 2G). הסר את החלק הצווארי (C1)-המותני (L2-L3) של חוט השדרה הגחוני לאחר הליך זה.
- מניחים את חוט השדרה הגחוני ומעלה על ידי לחיצה על הרקמה GFP-שלילית בין העמודות GFP-חיוביים-SMN עם זוג אחד של מלקחיים. הסר את השאר mesenchyme, DRGs, ואת חוט השדרה על ידי גזיזת שני הצדדים של הטור GFP-חיוביים של המיקרו עם סכין החיתוך (איור 2H). לטפל למקסם את הנוירונים מנוע GFP-חיוביים מבלי להזיק להם.
- באמצעות P1000, לאסוף את הרקמה בחוט השדרה בגזור עם HBSS מינימלי ומקום ב-SMN שכותרתו 1.7 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ממולא מדיום לנתיחה. אחסן על הקרח עד לדיסוציאציה. המשך לאחד את מיתרי עמוד השדרה מעוברים נוספים באותה צינורית עד שהמספר הכולל עומד בדרישות הנסיוניות.
הערה: איסוף לפחות שלושה מיתרי עמוד השדרה מניב כ 2.1 x 104 smn מומלץ כי הרקמות הם כפופים לחץ במהלך הדיסוציאציה ומיון. - לאסוף נוירונים מנועי הפנים והגפיים של האיי אן: העוברים העכבר gfp כמו gfp-חיובי ו-gfp-שלילי בקרת מיון תאים פלואורסצנטית (facs), בהתאמה. הגפיים הם GFP-שלילי, כי האקסונים של GFP-חיוביים של SMNs עדיין לא האריכו את הגפיים בגיל הזה מעובריים.
6. רקמת דיסוציאציה
הערה: סה כ זמן דיסוציאציה הוא בדרך כלל 1.5 h לכל ניסוי.
- הפתרון המדכא החמים ו אלבומין-ovomucoid מעכב עד 37 ° c לפני הדיסוציאציה.
- בקצרה לסובב את הרקמות מיקרוגזור במהירות נמוכה.
- באמצעות P100 הצינורות, להסיר בזהירות ככל שינה E הרבה ככל האפשר מבלי למחוק רקמות.
הערה: הקפד להסיר את כל שאריות שינה E לאחר שלב זה כדי למנוע הפחתת היעילות של שארית הדיסוציאציה בשלב הבא. - הוסף את הנפח המתאים של הפתרון פפאין (טבלה 1) לכל אחד הצינורות 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה המכיל דגימות רקמות מיקרו.
הערה: הנפח המתאים של הפאפיין לדיסוציאציה נקבע על מנת למקסם את הדיסוציאציה האפקטיבית תוך צמצום הלחץ על התאים. - בעדינות קצוצות 8x עם פיפטה P200. בצע את כל השלבים נשחקו בעדינות כדי לשמר את הכדאיות המוטורית תא.
- דגירה את הצינורות המכילים את הרקמות עבור 30 דקות ב 37 ° צ', הגונות על ידי מצליף באצבע 10x כל 10 דקות. בעדינות קצוצות כל השעיה 8x עם פיפטה P200 לאחר הדגירה. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות.
- כדי להבטיח את היעילות של עיכוב ovomucoid בשלב הבא, להשתמש בP1000 הצינורות להסיר ולהשליך כמו supernatant הרבה ככל האפשר מבלי להוריד את הרקמות.
- השהה כדורי מחדש בנפח המתאים של הפתרון המדכא של אלבומין-ovomucoid (טבלה 1) על ידי triturating בעדינות 8x עם P200.
- המתן 2 דקות כדי לאפשר את כל החלקים הנותרים של רקמות שלא המונתק כדי להתיישב בתחתית הצינור.
- לאסוף כמו supernatant ככל האפשר ללא אספירין רקמות לא הP200 באמצעות פיפטה. העבר את הסופרנטאנט לטריות 1.7 mL בצינורות המיקרוצנטריפוגה.
- אם מספר נתחי רקמות יישארו ללא הנתק לאחר שלב 6.10, חזור על שלבים 6.8-6.10 עבור הרקמות הבלתי-מסווטות שנשארות בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוריים של 1.7 mL כדי למקסם את התשואה הסופית של תאים לא מסוטים תוך מזעור הלחץ על התאים המונתק בעבר, נכלל ב-supernatant של שלב 6.10.
- לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. בזהירות להסיר ולמחוק את supernatant באמצעות מP1000.
- השהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של בינונית לחיתוך (שולחן 1) על-ידי ליטוף 8x באמצעות פיפטה P1000. הנפח המתאים של ההשעיה הסופית נקבע כך צפיפות התא אינו עולה על 107 תאים/mL, אשר יכול לחסום את הזרם של המכונה cy, הזרמת מכונה, אבל גם כך תאים אינם מדולל ביתר מוגזם, אשר התוצאות מהירות מיון האטה.
- לסנן את השעיות דרך מעבר 70 יקרומטר תאים כדי לחסל גושים גדולים או רקמה מעוסרת. העבר את השבולים לתוך 5 מ"ל בתחתית פוליסטירן מוקצף מבחן צינורות לחנות על הקרח עד הצורך.
7. מיון תאים פלואורסצנטית-פעיל (FACS)
הערה: פרוטוקול זה היה מיטבי באמצעות סדרן FACS מצויד עם 15 mw 405 ננומטר לייזר סגול, a 100 mw 488 nm לייזר כחול, a 75 mw 594 לייזר כתום nm, ו-40 mw 640 לייזר אדום nm. תאים ממוינים כנוזל נדן ב-PBS סטרילי תחת תנאים אספטי באמצעות זרבובית 100 יקרומטר. על מנת למזער את לחץ התאים, שיעור הזרימה נקבע ללחץ מדגם של 1-3, כך שנרכשו מקסימום 1000-4000 אירועים לשניה. סה כ זמן ה-FACS הוא בדרך כלל 1-2 h לכל ניסוי.
- הגדר מתח עבור פיזור קדמי וצדדי כך שאוכלוסיית התא יכולה להיות מדומה כהלכה. הגדרת מתח מתאים למיון תאים היא מורכבת ודורשת אופרטור FACS מנוסה.
- כדי להבחין בין אוכלוסיות תאים שונות, התווה תאים לפי גודל כפי שנקבע על-ידי אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) לעומת המורכבות הפנימית כפי שנקבע על-ידי אזור הפיזור הצדדי (המטה-מאלהאס-א). צייר שער סביב התאים החיים כפי שצוין באיור 3Aa ואיור Ba לא לכלול פסולת ותאים מתים. קבץ את התאים באזור שגודר כאוכלוסיה 1 (P1).
- כדי לא לכלול את גושי התאים וכלי doublets, התווה תאים של P1 בהתאם לרוחב הפיזור הצדדי (התחנה לפני השטח) לעומת ה-האס. פי. שער את אוכלוסיית התאים היחידים כאוכלוסיה 2 (P2) (איור 3Ab ואיור Bb).
- העלילה P2 תאים מבוסס על רוחב פיזור הקדמי (FSC-W) לעומת FSC-A ולשער את האוכלוסייה של תאים בודדים כמו אוכלוסייה 3 (P3) (איור 3Ac ו איור Bc).
הערה: השימוש בשני שערים רצופים ב-7.3 ו-7.4 כולל את גושי התאים ו-doublets (גבוה FSC-W וגבוה FSC-A). - שער P3 תאים מבוסס על GFP לעומת allophycocyanin (APC). ערוץ APC מזהה פלואורסצנטית אוטומטי. הפעולה בערוץ זה נמנעת מלכידת תאי פלורסנט אוטומטיים. השתמש בתאים GFP-שליליים כדי לכוונן את המתח עבור ערוצי פלורסנט של FITC/GFP. באופן אידיאלי, שערים מיקום עבור אוכלוסיות תאים אלה סביב 102. בחר ספי שער עבור אוכלוסייה GFP-חיוביים 4 (P4) בנפרד עבור כל סוג של תא מנוע (איור 3לספירה ואיור Bd).
הערה: הגדר את שער GFP הרבה יותר גבוה עבור SMNs מאשר עבור CN3s/CN4s על מנת לקבל תרבות טהורה (איור 3לספירה ואיור Bd). שער GFP נמוך יותר עבור תרבויות SMN מוביל לזיהום של התרבויות על ידי גליה ונוירונים שאינם מוטוריים. זה סביר כי יש ביטוי GFP ברמה נמוכה בכמה הנוירונים מוטוריים ושאינם בשל מקדם דולף. האחוז של תאים מבוססי GFP-חיוביים לעומת התאים הכולל הוא בדרך כלל 0.5-1.5% עבור CN3s/CN4s ו-1.5-2.5% עבור SMNs. אם הניתוח היה מוצלח, מספרים אלה יכולים לשמש ביצוע ביצועים כדי לקבוע את המיקום המתאים עבור השער GFP-חיוביים (איור 3Ae ודמות להיות). - בצע את FACS בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאסוף תאים P4 לתוך טרי 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות מלאים 500 μL של מנוע התרבות תא עצב בינוני. . לשמור על קרח עד הציפוי
הערה: למרות התאים ניתן למיין ישירות לתוך הבארות, התוצאה היא מספר אחיד של תאים לכל טוב. מיין את התאים לתוך הצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.75 mL ולאחר מכן צלחת ידנית כדי להשיג התפלגות ציפוי אפילו יותר.
8. תרבות מטוהרים הראשי מוטוריים נוירונים
- לדלל FACS-מבודדים CN3/CN4 ו SMN השעיות עם מנוע התרבות תא עצב מוטורית prewarmed עד 37 ° צ' לצפיפויות של 5 x 103 ו-1 x 104 תאים/mL, בהתאמה.
הערה: אחד E 11.5 העובר תשואות בערך 1 x 103 CN3/CN4 ו 7 x 103 smn. עם זאת, תשואות אלה להסתמך בכבדות על הטוהר של בגזור רקמות, את היסודיות של דיסוציאציה תא, ואת הסף המתאים של שערי GFP במהלך FACS. - העבר 96 לוחות היטב מצופה מראש עם PDL ו למינציה מתוך 37 בחממה לתרבות הרקמה ° c לתוך כיסוי הזרם למינארי ולאחר מכן לחות הלמינציה מכל באר. להשתמש בצלחות וכיסוי באופן מיידי ללא כביסה.
- הוסף 200 μL של מדולל CN3/CN4 ו-SMN השעיות לתוך כל באר של PDL/מצופה למינציה 96 היטב צלחות. צפיפות התא הסופית צריכה להיות 1 x 103 ו-2 x 103 תאים/גם עבור CN3/CN4 ו-smn, בהתאמה.
הערה: צפיפות הציפוי הראשונית של SMNs ב 96 לוחות הבאר (2 x 103 תאים/גם) הוא כפול זה של CN3s/CN4s (1 x 103 תאים/גם) על מנת להשיג מספרים מוטוריים הסופי מנוע דומה ו צפיפויות ב 2 ו -9 ימים בחוץ (DIV) (4 על 6 x 102 ו 2 על 4 x 102 תאים - תרבות נוירונים ב 37 ° c, 5% חממה2 .
- להאכיל את הנוירונים כל 5 ימים על ידי הסרת מחצית המדיה הישנה (100 μL) והחלפת עם אותו כמות של בינונית מנוע טרי עצב התרבות. ודא שתהליכים עצביים הופכים לגלויים ב-DIV 1 והופכים לעבים יותר ויותר ב-14 DIV (איור 4). גופי התאים העצביים הופכים להיות מוגדלים ונוטים לצבור בתרבויות ארוכות-טווח, במיוחד עבור SMNs (איור 4).
הערה: בצע את כל השינויים המדיום והפתרון על-ידי השארת חצי מאמצעי האחסון הבינוני המקורי כדי להימנע מניתוק תאים מתורבתים. הדבר כולל שלבים של קיבוע ואימונוטוקוכימיה (ICC). אם כל המדיה תוסר, ללא קשר לאופן הזהירות, רוב התאים ייתנתקו ויישטף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת הפרוטוקול הזה היה לטהר ולתרבות הן העיקרי CN3s/CN4s ו-SMNs לטווח ארוך כדי לאפשר ניתוח השוואתי של המנגנונים בבסיס הפרעות נוירונים מוטוריים (ראה איור 1 ואיור 2 לסקירה).
פעם נוירונים היו מבודדים בהצלחה גדל בתרבות, כמעט טהור CN3/CN4 ותרבויות SMN התקבלו (איור 5A,B) ונשמר עבור לפחות 14 DIV (איור 4 ואיור 6). Purities של CN3/CN4 ו-SMN תרבויות ב 2 DIV היו 93.5 ± 2.2% ו 86.7 ± 4.7%, בהתאמה, כאשר הוערך על ידי ICC באמצעות סמן תא העצב מנוע Islet1 ו סמן עצבי TUJ1 (איור 5ב). עם זאת, אלה purities גבוהה הסתמך בכבדות על גיל העוברים ועל הגדרת סף מתאים עבור שערי GFP במהלך FACS (איור 3). ניתוח של עוברים ב-E 10.5 קשה יותר מאשר לנתיחה ב-11.5 בשל רכות מוגברת והפחתה של רקמות, והתוצאה היא ירידה בעורק המנוע המוטוריים. עם זאת, purities של E 10.5 CN3s/CN4s ו-SMNs היו דומים לאלה עבור E 11.5 עוברים (92.8% ו 82.2% ב 2 DIV, בהתאמה; נתונים שהתקבלו מניסוי יחיד). Purities של CN3s/CN4s ו-SMNs ירד באופן דרמטי כאשר E 13.5 העוברים שימשו, גם אם הגבוהה ביותר GFP-חיוביים אוכלוסייה נאסף (20.7% ו 7.4% ב 2 DIV, בהתאמה; נתונים שהתקבלו מניסוי אחד), כנראה בשל הביטוי של GFP בנוירונים שאינם מוטוריים (איור 7). הנטייה הזאת התקיימה גם עבור E 12.5 תרבויות, למרות שזה היה הרבה פחות דרמטי. לכן, עוברים ב-E 12.5 או מעלה אינם מתאימים לשימוש בטיהור של נוירונים מוטוריים באמצעות פרוטוקול זה.
מנוע טהור תרביות המוח הם יקרי ערך להבנת דפוסי גדילה מבודדים, התנהגויות, ופגיעויות של נוירונים מוטוריים. דוגמה זו ממחישה כיצד ניתן להשתמש בתרבויות אלה כדי לבדוק את התגובות של תא העצב המוטורי לטיפול כימי. כדי לקבוע אם הראשי CN3s/CN4s ו-SMNs להראות התגובות הדיפרנציאליות הרשתית (ER) לחצים, מונוטוני העיקרי של CN3s/CN4s ו-SMNs הושגו באמצעות פרוטוקול זה וטיפל בריכוזים שונים של מלחיץ ER, חומצה ציקלופיאזונית (CPA). הנוירונים טופלו ב-CPA (5, 10, 15, 20, 25, או 30 μM) או בקרת רכב (DMSO) ב-2 DIV וקבועים 3 ימים לאחר מכן כדי להעריך את יחסי ההישרדות (איור 8א). מספר הנוירונים בר קיימא בכל מדגם נספר ויחסי הישרדות חושבו כמספר תאים קיימא בארות שטופלו בסמים מחולקים על ידי מספר תאים קיימא בבארות שטופלו DMSO. CN3/CN4 מונוטונות היו עמידים באופן משמעותי יותר לטיפול רואי חשבון (10-25 μM) לעומת SMN monocultures (איור 9 ואיור 8ב)31.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של העכבר הראשי מטוהרים מאוד CN3/CN4 ו SMN תרבויות המספקים מערכת חזקה ואמינה לחקירה של התנהגות עצבית.
איור 1: הערכה להכנת נוירונים מוטוריים העכבר מעובריים. הסכמטי ממחיש את השלבים המעורבים בבידוד ובתרבות של נוירונים מוטוריים העכבר מתחלקים ואת הזמן המשוער בשעות או בימים עבור כל שלב. הסדר של תהליך החיתוך עבור CN3/CN4 ו-SMN הם כל אחד מתויג ברציפות 1 עד 4. קיצורים: CN3/CN4 = תא עצב מניע העיניים/הטרוליר SMN = תא מנוע בעמוד השדרה; FACS = מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית; h = שעה; d = יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: החיתוך של המוח המדחוני והחלק הצווארי (C1)-המותני (L2-L3) של חוט השדרה הגחוני. (A) לרוחב (a) והשקפות (ב) של הנוירונים המוטוריים של מנוע Gfp-חיובית ב-e 11.5 איי: העובר העכבר הטרנסגניים gfp תחת פלואורואסעין isothiocyanate (fitc) תאורה. הר שלם 11.5 העובר הוכן כמתואר בעבר32 על מנת להפוך את העובר שקוף. לאחר מכן, העובר נותחו על ידי תיוג immunofluorescence עם כתמים אנטי-GFP (ירוק). התמונות נלכדו תחת. מיקרוסקופ קונמוקד קנה מידה ברים = 200 יקרומטר (תצוגה לרוחב) ו 400 יקרומטר (תצוגה מתחת). קיצורים: S = מעולה; אני = נחות; V = הגגול; . ד. (ב-ח) שלבים לחיתוך מודגש על תמונות של E 11.5 והמוח באמצע מידות ורקמות השדרה שנלקחו עם מצלמה מצוידת תחת אור בהיר (Bb) או התאורה FITC באמצעות stereomicroscope לנתיחה הזריחה. קנה מידה ברים = 200 יקרומטר (D) ו-1 מ"מ (A-C, E-H). (ב) (א) הסרת הפנים והזנב של העובר על ידי גזירה לאורך הקווים האדומים. (ב) עובר מוצב לניתוח. מיקום חזית המיקרוסקופ מצוין על ידי כוכבית. (ג) חותך לאורך הקו האדום המוצק כדי לשסף את גגהחדרהרביעי (א) לרוחב (א) ולראות את המראה הצדדי. השימוש בפתח זה כדי לחתוך לאורך המשטח של העובר במוח (מסלול המצוין על ידי החץ האדום מקווקו). זה חושף את הרקמה המכילה mesenchyme, CN3, ו CN4, אשר ניתן להוציא מתוך הגולגולת. לניתוח SMN, החדרת מלקחיים לתוך הפתח בין החדר הרביעי לבין גג הבית, ולאחר מכן חיתוך לעבר הצד הקובדל של העובר (מסלול המצוין על ידי חץ צהוב מקווקו). (ד) ההשקפה הסופית של המוח המדחוני המכיל מCN3 וגרעיני CN4 דו-צדדיים. קצות הרקמה מודגשים באמצעות מלבן אדום. חיתוך לאורך קו מנוקד צהוב לאסוף CN3 ו CN4 גרעינים בנפרד, אם תרצה. (ה) לאחר פתיחת שאר המוח הקודם וחוט השדרה, לנופף ברקמות הצטרם מעל הקווים האדומים בשני הצדדים עםמלקחיים (א) לפני, ו (ב) לאחר. (ו) בקיעים הסרת רקמות עודפות לחוט השדרה לאורך הקו האדום (א) לפני, ו (ב) לאחר. (ז) חיתוך חוט השדרה הגחוני בשני המיקומים המסומנים בקווים האדומים. בצד הrostral, חיתוך של חוט השדרה המרחף והצף החוצה מעבר C1 היכן הראשון GFP-חיוביות הקרן הקדמית פרויקטים. חיתוך קצה הזנב של חוט השדרה בגבול העליון של הגפיים התחתונות. לאחר הקיצוצים האלה נעשים, את צוואר הרחם (C1) דרך המותניים (L2-L3) חלק של חוט השדרה הגחוני ניתן לגזור. (ח) השקפה סופית של חוט השדרה הגייתי המכיל את העמודות gfp-חיוביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיון מייצגים של מיתרי השדרה (א) ושדרה (ב). (Aa ו- Ba) אזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (המרכז למניעת החלקה לפני השטח) ממוין לפני אי-הכללה של פסולת ותאים מתים. (אלב, Bb, Ac, Bc) מגרשים ממוינים עבור אי-הכללה של גושי תאים (b) ו-doublets (c) על בסיס רוחב (אס. פי. אס) לעומת מעבר-רוחב (fsc-w) לעומת fsc-a, בהתאמה. (לספירה ו- Bd) מחלקות ממוינות כדילבודד איי . כדי להשיג תרבות טהורה, השער GFP חייב להיות מוגדר גבוה יותר עבור SMNs (Bd) מאשר עבור CN3s/CN4s (Ad). (Ae ו- Be) אחוזי תאים שהיו מגודרת לגבייה על-ידי מיון FACS. % אב מייצג את אחוז התאים באוכלוסיה הסגורה הנוכחית ביחס למספר התאים באוכלוסיית התאים הקודמת שגודרת, בעוד % Total מייצג את אחוז התאים שעברו מגודרת יחסית לתאים הכולל. האחוזים הצפויים של תאים של GFP-חיוביים לעומת התאים הכולל (מסגרת באדום) הם 0.5-1.5% עבור CN3/CN4 ו-1.5-2.5% עבור SMN. אם הניתוח בוצע בהצלחה, ניתן להשתמש באחוזים אלה כביצוע ביצועים כדי להגדיר את השער GFP-חיוביים (Ad ו- Bd). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות חדות פאזה של הראשי CN3/CN4 ו-SMN מונותרבויות ב 2, 7, ו 14 DIV. נציג הפרעות דיפרנציאליות בניגוד לתמונות של העיקרי CN3/CN4 ו SMN התרבויות נתפסו ב 2, 7, ו 14 DIV עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית הפוכה באמצעות רכישת תמונה מתאימה ותוכנה עיבוד ו 40x מטרות. התהליכים העצביים נהיו עבים יותר ויותר על ידי 14 DIV. גדלי הגוף העצבי הפכו להיות מוגדלים ונטו לצבור בתרבויות ארוכות-טווח, במיוחד עבור SMNs. שתי התרבויות ניתן לשמור לפחות 14 DIV. סרגל סרגל = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: המאפיינים של מבודד e 11.5 עכבר CN3/CN4 ו SMN תרבויות. (א) מייצגת את התמונות של ה-E 11.5 mouse CN3s/CN4s (למעלה) ו-smns (למטה) תרבותי עבור 2 DIV. התיוג העצבי עם הסמן TUJ1 (ירוק) ואת תא העצב המנוע Islet1 (אדום) ביצע לנתח נוירונים וגרעינים היו מוכתמים באמצעות dapi (כחול). כמעט כל התאים המתורבתות היו נוירונים מוטוריים (TUJ1+, Islet1+). תמונות נתפסו עם מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטית באמצעות רכישת תמונה מתאימה ותוכנה עיבוד ו 20x יעדים. הדגימות היתה מעובדות ועובדו כדי להשיג עוצמת אות מקסימלית ללא פיקסלים רוויים. כל העבודה המיקרוסקופית ועיבוד התמונה בנתונים הבאים בוצעו בתנאים אלה אלא אם צוין אחרת. סרגל קנה מידה = 100 μm. (ב) Purities של e 11.5 עכבר CN3/CN4 ו smn תרבויות ב 2 DIV. Purities של CN3/CN4 ו-SMN תרבויות היו 93.5 ± 2.2% ו 86.7 ± 4.7%, בהתאמה. העריכו בהקרנה מורפולוגיה גרעינית. ונפיחות בקרום הגוף התהליכים העצביים סווגו כתהליכים בלתי מיוצרים כאשר נצפו סימנים של באגלי ונפיחות. תאים עם גוף תא לא מוות ולא התהליכים הבלתי מיוצרים נחשבו נוירונים מוטוריים אי קיימא (TUJ1+, Islet1-) או נוירונים מוטוריים הקיימא (TUJ1+, Islet1+)33. הpurities של תרבויות תא העצב המוטוריים חושבו כמספר הנוירונים מוטוריים קיימא מחולקים על ידי המספר הכולל של הנוירונים קיימא מוטוריים בתוספת נוירונים מוטוריים קיימא. ערכים מייצגים את הממוצע ± SEM של שלושה ניסויים נפרדים. לא משמעותי (p > 0.05) על ידי מבחן t של הסטודנט. ספירת תאים בוצעה באופן ידני תחת הגדלה של 20x. קיצורים: SEM = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הנציג האימונולוציטוכימיה של הראשי CN3/CN4 ו-SMN מונותרבויות ב 2, 7, ו 14 DIV. ראשי CN3/CN4 ו-SMN תרבויות נותחו ב 2, 7, 14 DIV על ידי תיוג immunofluorescence עם TUJ1 (ירוק), גרעינים היו מוכתמים באמצעות DAPI (כחול). התהליכים העצביים הופכים להיות עבים יותר ויותר על ידי 14 DIV. גדלי הגוף העצבי הפכו להיות מוגדלים ונטו לצבור בתרבויות לטווח ארוך, במיוחד עבור SMNs. הן CN3/CN4 ו-SMN תרבויות ניתן לשמור לפחות 14 DIV. התמונות נלכדו תחת הגדלה 10x. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אפיון של e 13.5 עכבר CN3/CN4 ו-SMN מבודדים תרבויות. E 13.5 CN3/CN4 ו-SMN היו מבודדים ומתורבתים באמצעות פרוטוקול זה ונותחו ב 2 DIV על ידי תיוג מimmunofluorescence עם TUJ1 (ירוק) ו Islet1 (אדום), והגרעינים היו מוכתמים נגד DAPI (כחול). הרבה תאים עצביים שאינם מוטוריים (TUJ1+, Islet1-) היו נוכחים (חיצים) וכתוצאה מכך ירידה דרסטית הן CN3/CN4 ו-smn טוהר, עם ירידה בולטת יותר בתרבויות smn. תמונות נלכדו תחת הגדלה 20x. סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: יישום הנציג של התרבות הראשית מנוע העצב הראשי להפגין כי CN3s/CN4s הם עמידים באופן סלקטיבי לחץ ER הנגרמת על ידי רו ח. (א) ניסיוני חלוקה לרמות: ראשי CN3/CN4 ו-smn מונותרבויות טופלו באמצעות CPA או בקרת רכב (dmso) ב 2 DIV ו-viabilities תא הוערכו באמצעות ניתוח אימונוציטוטוקוכימיה לאחר 3 ימים של טיפול. חלוקה לרמות זו שונתה מעבודה שפורסמה ב-31. (ב) הכמת של יחסי הישרדות של CN3s/CN4s ו smns שטופלו 5-30 ΜM רואי חשבון במשך 3 ימים מ 2 DIV. נוירונים נותחו על ידי מנגנון תיוג של תאים עם TUJ1, וגרעינים היו מוכתמים באמצעות dapi. יחסי הישרדות חושבו כמספר התאים הקיימא (ראה איור 5B מקרא) בבארות שטופלו בסמים מחולקים על ידי מספר תאים קיימא בבארות המכילות רכב לבד (dmso). ספירת תאים בוצעה באופן ידני תחת הגדלה של 20x. ערכים מייצגים את הממוצע ± SEM של ארבעה ניסויים נפרדים. * p < 0.05; p < 0.005 על ידי מבחן t של הסטודנט. איור זה השתנה מהעבודה שפורסמה בעבר בשנת31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: הנציג האימונולוציטוכימיה של הראשי CN3/CN4 ו SMN מונותרבויות לאחר חשיפה של 3 ימים כדי להגדיל את הריכוזים של רו ח מתחיל ב 2 DIV. נוירונים נותחו על ידי תיוג מנגנון של תאים עם TUJ1 (ירוק) ו גרעינים היו מוכתמים באמצעות DAPI (כחול). ראשי CN3s/CN4s היו עמידים יותר לטיפול CPA מאשר SMNs ראשי. תמונות נלכדו תחת הגדלה 10x. סרגל בקנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר מוחות ביניים (X) | פפאין | אלבומין-עובדיה | אי שינה | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 מיקרומטר | 100 מיקרומטר | 600 מיקרומטר | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 מיקרומטר | 150 מיקרומטר | 700 מיקרומטר | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 מיקרומטר | 200 מיקרומטר | 800 מיקרומטר | |||||||||
| מספר מיתרי שדרה (Y) | פפאין | אלבומין-עובדיה | אי שינה | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 מיקרומטר | 100 מיקרומטר | 500 מיקרומטר | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 מיקרומטר | 200 מיקרומטר | 800 מיקרומטר | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 מיקרומטר | 300 מיקרומטר | 1200 מיקרומטר | |||||||||
טבלה 1: הכרכים המתאימים של papain, אלבומין-ovomucoid, ואת ההשעיה הסופית בשימוש בצעדי הדיסוציאציה. הכרכים המתאימים של פפאין ו אלבומין-ovomucoid להיות בשימוש עם מספר שונים של המוח בינוני באמצע ורקמות שדרתי השדרה שונו מהוראות היצרן לאחר מספר סיבובים של אופטימיזציה. מכיוון שרקמות כפופות למתח במהלך הדיסוציאציה והמיון, מומלץ לאסוף אוסף של יותר מ -10 מוחות בינוניים ויותר משלושה מיתרי עמוד שדרה. הנפח של פפאין נקבע על ידי שוקל את האיזון בין הדיסוציאציה האפקטיבית ואת הלחץ של הליך זה. הנפח של תמיסת המדכא של אלבומין-ovomucoid הוא חצי של זה של papain. הנפח המתאים של השעיית הסופי שינה E נקבע כך צפיפות התא אינה עולה על 107 תאים/mL, אבל התאים לא להיות מדולל מוגזמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היסטורית, במחקרים חוץ גופית של CN3 ו/או נוירונים מוטוריים CN4 הסתמך על תרבויות הטרוגנית כגון הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,25,26, ו פרוסה27,28 תרבויות, כי תאים אלה לא ניתן להבדיל מ תאים שמסביב בהתבסס על גודל וסמנים ספציפיים עבור תאים אלה לא דווחו. הפרוטוקול הנוכחי הוא שיטה מקיפה עבור הבידוד והתרבות של E 11.5 murine CN3s/CN4s, ו SMNs מן העוברים אותם ולאשר את הטוהר הגבוה של התרבויות. על ידי יצירת התרבויות הטהורה SMN ו CN3/CN4 מן עוברי העכבר אותו, הפרוטוקול מאפשר השוואות מבוקרת של התנהגויות חוץ גופית של CN3s/CN4s לעומת Smn מבודדים מסוג פראי, כמו גם עוברי מוטציה.
התרבויות הטהורות של CN3s/CN4s ו-SMNs שנוצר על ידי פרוטוקול זה לאפשר מחקרים השוואתיים של מורפולוגית, סלולר, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של אלה נוירונים מוטוריים. בתאוריה, בגלל אחרים מנוע הגולגולת אוכלוסיות מוטוריות יכול להיות דמיינו וגזור מן האיי הזה : gfp העכבר הטרנסגניים (כולל חוטפים, מנוע המנוע, הפנים, ו היפוגלואל), פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עבור הבידוד שלהם תרבות וכן, בתנאי כי שערים facs gfp מותאמים כראוי. לבסוף, FACS-מיון נוירונים מוטוריים הנגזרים פרוטוקול זה יכול להיות נתון גנומית (למשל, שיטת הטרנספט כרומטין נגיש באמצעות רצף, או ATAC-seq) ו/או טראנסקריפט (למשל, ה-RNA רצף31) ניתוחים כדי ללמוד התפתחות נורמלית ואת הפגיעות סלקטיבי של תת תא מנוע ספציפי הפרעות ניווניות31
ישנם מספר שלבים בפרוטוקול זה, כי הם קריטיים כדי למקסם את מספר הנוירונים טהור, בריא מוטוריים במערכת התרבות המבודדת. במהלך הניתוח, הרקמות gfp-שלילי (למשל, מזנכימה ו drgs) יש להסיר באופן מקסימאלי מבלי להזיק הנוירונים מוטוריים, כי הרקמות האלה הם דבקים יכול ללכוד smns במהלך סינון או לגרום לסתימת במהלך מיון facs. במהלך הדיסוציאציה רקמות, נפח חיוני מינימלי של פפאין צריך לשמש, ואת התאים יש לטפל בעדינות עם מינימלי אך מספיק trituration. Papain שימש לשלב הדיסוציאציה הרקמה בפרוטוקול זה, כי נתונים ראשוניים הראו כי הוא פחות הרסני מטריפסין לשני CN3/CN4 ו-SMN. יחסי הישרדות מבוסס על מספרים מצופה של CN3s/CN4s ו-smns ב 2 DIV עלה מ 39.5% כדי 52.7% ו מ 52.3% כדי 58.4%, בהתאמה, כאשר פפאין שימש במקום טריפסין (0.25%, 4 דקות דגירה). למרות שמספרים אלה נגזרים מניסוי בודד שבוצע לפני מיטוב מלא, דיווחים נוספים מצביעים גם על כך שטריפסין הוא תת-אופטימלי להפקת תאים מרקמות מערכת העצבים12,34,35,36. במהלך FACS, צבעים חיוניים פלורסנט (propidium יודיד ו calcein כחול) ו מיון קטן חרירי (g., 70 μm) לא צריך להיות בשימוש, כי הם למחיקה הישרדות הנוירונים המוטוריים. השימוש בחרירי מיון גדול (100 יקרומטר או יותר) מומלץ מאוד, מכיוון שהמוות של תא smn גדל באופן משמעותי כאשר משתמשים בזרבובית של 70 יקרומטר. הגדרת הסיכום המתאים עבור תאים GFP-חיוביים ב-FACS הוא צעד קריטי על מנת להשיג תרבויות טהורות. תרביות תא העצב המוטורי שנוספו עם forskolin, IBMX, וגורמי גדילה (BDNF, CNTF, ו GDNF). Forskolin ו ibmx דווחו לקדם באופן מושלם הישרדות smn37,38. נתונים ראשוניים מן המחקרים הנוכחיים מראים כי forskolin ו IBMX גם להגדיל באופן גמיש CN3/CN4 הישרדות. יחס הישרדות מבוסס על מספרים מצופה של CN3s/CN4s ב 2 DIV עלה מ 17.5% כדי 26.9%, 31.9%, ו 37.0% כאשר IBMX, forskolin, ו IBMX + forskolin נוספו, בהתאמה (מספרים מבוססים על ניסוי אחד שבוצעה לפני אופטימיזציה מלאה של תנאי תרבות התא). מומלץ לבצע את כל השינויים בינוניים ושוטף של תאים מתורבתים על ידי השארת חצי הנפח המקורי כדי למנוע ניתוק תאים מתורבתים. לבסוף, זה גם אידיאלי כדי להקטין את הזמן שהושקע בין החיתוך והציפוי של נוירונים מוטוריים (למשל, על ידי קיצור זמן לנתיחה באמצעות מספר מתנגדים) כדי לשפר את הכדאיות של התרבויות.
קיימות ארבע בעיות פוטנציאליות עיקריות שעלולות להתעורר בעת ביצוע פרוטוקול זה. הראשון הוא תשואה נמוכה של נוירונים מוטוריים לאחר FACS. גורמים פוטנציאליים לתשואות נמוכות כוללים שימוש בעוברים צעירים (למשל, e 10.5), אשר יש פחות נוירונים מוטוריים, הסרת מספיק רקמות gfp-שלילי במהלך הניתוח (למשל, מזנכימה ו drgs), אשר יכול ללכוד נוירונים מוטוריים ולהוביל להסרת שלהם במהלך סינון, מספיק המלחה/trituration במהלך הדיסוציאציה, ו/או הגדרת השער gfp-חיובית הבעיה הפוטנציאלית השנייה היא טוהר נמוך של תרבויות תא העצב המנוע, אשר ככל הנראה עולה מהשימוש של עוברים מבוגרים (למשל, E 12.5) ו/או מתוך הגדרת השער GFP-חיוביים נמוך מדי במהלך FACS. שלישית, מספר נמוך של נוירונים מוטוריים מחוברים בתרבות ניתן לצפות בשל מיון FACS לא הולם ו/או מספיק PDL/למינציה לציפוי של צלחות/coverslips. ארבעה, נוירונים מוטוריים יכולים להראות הכדאיות נמוכה בתרבות. הגורמים הפוטנציאליים לכדאיות נמוכה כוללים ניתוח מחוספס ו/או ממושך, מוגזמת מוגזם/trituration במהלך הדיסוציאציה, טיפול בלתי הולם של תאים ברחבי הפרוטוקול (למשל, ליטוף מחוספס של תאים, אי מקום תאים על קרח, כישלון מראש לצנן PBS ו HBSS), ו/או זמן מופרז בין שימוש של ריאגנטים כי הם לא טריים ו/או ריכוזים לא הולמים יכול גם לפגוע בתוצאות ניסיוני.
ישנן שלוש מגבלות. גדולות לפרוטוקול הזה איי. איי. אן : עכברים משני הצדדים ומיון facs הם יקרים למדי. הם, עם זאת, חיוני עבור פרוטוקול זה כפי שאין כיום שיטה חלופית מסוגל לייצר מאוד מטוהרים CN3s/CN4s בצורה חסכונית יותר. יש a קטן E 10.5-E 12.5 החלון של העכברים העובריים, וקשה לאשר כי עוברים בגיל הנכון נוכחים, במיוחד אם מכונת אולטרסאונד אינה זמינה. אם רק smns טהור נדרשים, הם יכולים להיות נגזר מעוברי העכבר של e 12.5-24.2 באמצעות שיטות כגון הדרגתי צנטריפוגה10,11,12 ו/או p75ntr-נוגדנים מבוססי-מיון-הנוגדן טכניקות13,14,15,16. לבסוף, מבוסס חלבון אומר כי דורשים כמות גדולה של חומר התחלה אינם אפשריים מתרבויות אלה בשל התשואה הקטנה של נוירונים מוטוריים (במיוחד CN3s/CN4s). תא גזע נגזר המנוע נוירונים31,39, אשר ניתן לייצר מגבילים, יכול בתאוריה להיות מוחלף למטרה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
אנו מודים לבריז פטימן (ביוגן, קיימברידג ', MA, ארה ב) להוראה בשיטות הניתוח של SMN; דנה פרבר סרטן המכון זרימה Cy, מתקן לטיפול באימונולוגיה, מתקן המחקר של החטיבה לרפואה של הרווארד, מרכז הסוכרת של חוסה ליבה cy, ובריגהם ובית החולים לנשים הארגון cy, ובוסטון החולים לילדים זרימה cy, מחקר מתקן לבידוד FACS של נוירונים מוטוריים ראשי; א. א. נוג'נט, א. צ. טניי, א. י., א סמולר נגוין, M.F. רוז, מעבדה נוספת Engle, ו-Project ALS הקונסורציום חברים לסיוע טכני ודיון מתחשב. מחקר זה נתמך על ידי Project ALS. בנוסף, ממומן על ידי קרן לב יפן/באייר יאקוהין מחקר מענק בחו ל ומענק הכשרה NIH בגנטיקה T32 GM007748; ג'יג'י נתמכת על ידי תוכנית ההכשרה של NIH/ניי בבסיסים המולקולריים של מחלות עיניים (5T32EY007145-16) דרך מכון מחקר עין של שיעטים ועל ידי הכשרה נוירולוגיה התפתחותית תוכנית מלגת פוסט דוקטורט (5T32EY007145-19) דרך בית החולים לילדים של בוסטון; M. C. W היה נתמך על ידי בני (5K08EY027850) והילדים של בית החולים לרפואת עיניים (פרס דיסקברי הפקולטה); ו-E.C.E. הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
