Summary
这项工作提出了一种方案，用于产生原发性耳运动、耳蜗和脊柱运动神经元的同质细胞培养。这些培养物可用于对眼和脊柱运动神经元的形态、细胞、分子和电生理特征进行比较分析。
Abstract
与脊柱运动神经元（SMNs）相比，Oculo运动神经元（CN3s）和血栓神经元（CN4）对退行性运动神经元疾病（如肌萎缩性侧索硬化症（ALS））表现出显著的抵抗力。分离和培养原小鼠CN3、CN4和SM的能力将提供一个研究这种选择性脆弱性背后的机制的方法。迄今为止，大多数协议使用异构细胞培养，这可能混淆实验结果的解释。为了尽量减少与混合细胞种群相关的问题，纯培养物是必不可少的。在这里，第一个协议详细介绍了如何有效地纯化和培养CN3s/CN4s与来自同一胚胎的SMN对应物使用胚胎日11.5（E11.5）Isl MN：GFP转基因小鼠胚胎。该协议提供了关于组织解剖和分离、基于FACS的细胞分离以及CN3/CN4和SMN核细胞体外培养的详细信息。该协议在现有协议中增加了一种新颖的体外CN3/CN4培养系统，同时提供纯物种和年龄匹配的SMN培养物进行比较。以运动神经元的形态、细胞、分子和电生理特性为重点的分析是本培养系统中可行的。该协议将支持研究定义运动神经元发育、选择性脆弱性和疾病的机制。
Introduction
原发性运动神经元的培养是一个强大的工具，它有助于研究神经元发育、功能和对外源应激源的易感性。运动神经元培养对神经退行性疾病的研究特别有用，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）1，2，其疾病机制尚未完全了解。有趣的是，尽管ALS患者和ALS模型小鼠的脊髓运动神经元（SMNs）的细胞死亡显著，但神经运动神经元（CN3s）和脑神经（CN4s）中的细胞死亡相对稀少，1、3、4、5、6、7、8、9。因此，对CN3s/CN4s和SMN的纯文化进行比较分析，可以为相对脆弱性背后的机制提供重要的线索。不幸的是，这种分析的一个主要障碍是无法生长这些运动神经元的纯化培养物。
许多协议已经描述从动物模型净化SBN。这些协议大多使用密度梯度离心10，11，12和/或p75NTR-抗体基细胞分选平移技术13，14，15，16。密度梯度离心利用相对于其他脊髓细胞更大的SMN，而p75NTR是脊髓中SMN专门表达的细胞外蛋白。近100%纯SMN文化是由这些协议11、12、14的一个或两个产生的。然而，这些协议在生成CN3/CN4培养物方面尚未成功，因为CN3s/CN4s没有表达p75NTR，其他特定的CN3/CN4标记尚未识别。它们也比 SMN 小，因此，根据大小更难隔离。相反，CN3s或CN4的体外研究依赖于分离的17，18，19，20，21，除植物17，22，23，24，25，26和切片27，28培养基，这些培养体由异质细胞类型组成，并且不存在任何协议。原发性CN3或CN4的隔离和培养。
在这里，描述了一个协议，用于从同一胚胎日11.5 （E11.5） IslMN：GFP转基因小鼠29（图1，图2A）对CN3、CN4s和SM的可视化、隔离、纯化和培养。IslMN：GFP特别标记运动神经元与远鼻化 GFP，本地化到细胞膜。该协议使多种运动神经元的物种和年龄匹配比较，以阐明运动神经元疾病的病理机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有利用实验室动物的实验都是按照NIH关于照顾和使用实验室动物的准则进行的，并经波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准。
1. 在解剖前设置定时配合
- 为了产生用于运动神经元收获的产前胚胎小鼠，在神经元分离前11.5天对每只雌性小鼠进行称重，并在成年IslMN：GFP转基因小鼠之间建立定时交配。为了开发该协议，使用129S1/C57BL/6J IslMN：GFP小鼠，年龄为2~9个月，并在晚上建立定时交配。
- 第二天早上检查雌性小鼠的阴道塞。考虑插头被确定为胚胎日 （E） 0.5 的日期。
- 称量雌性小鼠，并使用超声波检查E8.5+11之间的小狗（见材料表）。检查成功交配的迹象。
- 通过检测雌性小鼠的体重增加确认成功交配（如果胚胎超过 5⁄6，通常在 E9.5 上增加 1.5 g）。
- 在超声波下目视确认胚胎。胚胎在E9.5之后很容易通过超声波检测。超声波只对体重增加的女性进行，因为她们比那些没有怀孕的女性更经常怀孕。
注：雌性小鼠可能因为怀孕以外的原因增加体重，因此仅靠体重增加不是怀孕的可靠指标。超声波确认可防止不孕女性不必要的牺牲，但如果不可用，则不重要。
2. 仪器的解剖条件和准备
- 在层流罩中执行所有涂层（盖玻片酸清洁除外）、培养物制备、组织分离（离心和孵育除外）和培养工作，以确保介质和胚胎运动神经元的不育性。
- 在仔细注意无菌技术后，在层流罩外进行组织解剖，将污染风险降至最低。
- 消毒一个解剖板，一对微解剖剪刀，一对拇指修整钳，两对杜蒙特#5钳子，一把微解剖刀，和一个Moria迷你穿孔勺浸入70%乙醇使用前。
3. 餐具/表层的 PDL/拉米宁涂层
注：培养分离原运动神经元在96孔或24孔板，取决于应用所需的细胞数量。如果孔在光学上透明且厚度与成像兼容，则细胞可以直接在组织培养板中成像，而无需使用盖玻片。
- 对于需要盖玻片的应用，在神经元分离前至少2天制备酸洗、灭菌和风干覆盖唇，如前所述30。批量盖玻片可以在实验前提前以这种方式制备，并可储存长达6个月，不影响实验质量。
- 在神经元分离前2天，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备20μg/mL多D-赖盐（PDL）的工作溶液。
- 提前使用量计 PDL （1 mg/mL），并储存在 -20°C 作为库存解决方案。
- 用足够的 PDL 溶液工作溶液覆盖每个盖玻片或组织培养板的孔的表面（例如，96 孔板上每孔 100 μL，或带或不带盖玻片的 24 个孔板上每孔 500 μL）。在37°C下孵育过夜。
- 第二天用消毒水洗3次。
- 用石蜡薄膜密封板，并将洗过的 PDL 涂层板在 4°C 下存放长达 1 个月，如果它们在最终洗涤后完全干燥。
- 在1.2 mL的PBS中制备10μL的层宁（1.1±1.2mg/mL）的工作溶液。
- 盐碱层（1.1~1.2毫克/升）提前储存在-80°C。
- 覆盖每个盖玻片的表面，或用足够的层压溶液均匀地覆盖表面。使用前在37°C下孵育至少2小时。
注：PDL/层膜涂层板和盖玻片可在37°C下储存长达1周，但最好采用新涂层的层宁。在电镀30之前直接去除拉明宁。不应允许拉米宁干燥。如果板材要存放几个小时以上，则应用石蜡薄膜包裹。
4. 解剖准备、运动神经元培养和分离解决方案
注：括号中的浓度表示每个试剂的最终浓度。
- 准备解剖介质。
- 在4°C下解冻热灭活马血清过夜，制备1mL等分，并储存在-20°C。使用前直接在 RT 上解冻等分。
- 将 B27 补充剂 （50x） 储存在 1 mL 等分在 -20°C 下。使用前立即在 RT 解冻等分。避免冻结/解冻循环。
- 储存谷氨酰胺补充剂（100x）在4°C或-20°C。如果储存在-20°C下，则分为0.5 mL等分。
- 将青霉素-链霉素（10，000 U/mL）储存在1mL等分在-20°C。使用前立即在 RT 解冻等分。
- 要使解剖介质， 将 9.4 mL 的 Hibernate E 与 200 μL 的马血清 （2%）、200 μL 的 50x B27 补充剂 （1x）、100 μL 的 100x 谷氨酰胺补充剂 （1x）和 100 μL 的 10，000 U/mL 青霉素-链霉素 （100 U/mL） 混合。使用这种媒介收集解剖组织，使分离细胞的最终悬浮。
- 在神经元分离前一天将500μL的解剖介质添加到单个1.7 mL微离心管中，用于组织收集。为将收集的每种组织类型准备一个管子（例如，正对照、阴性控制、CN3/CN4、SMN），并在使用前储存在4°C。
- 结合49 mL的Hibernate E低荧光介质与1 mL的B27补充剂（1x），并在神经元分离前一天用这种介质（2 mL/孔）填充24孔板。使用此菜收集小鼠胚胎。使用前，在4°C下储存。
- 准备运动神经元培养基。
- 在莱博维茨的L15介质中制备250μL等分25m2-mercapto乙醇。储存在-20°C。
- 在消毒水中稀释BDNF、CNTF和GDNF溶液的5μL等分100微克/mL溶液。在 -80°C 下储存，在使用前立即在 RT 解冻等分。
- 通过在5毫克（1.0670μM）的福司林和涡旋井中加入64μL的二甲基亚硫酸盐（DMSO），制备10mM的用于斯科林溶液，使其完全溶解。然后向 DMSO 溶液和涡流井中加入灭菌水 （1.003 mL）。在-20°C下储存12μL等分10mM forskolin，并在使用前在RT解冻等分。
- 制备在DMSO中稀释的12μL等分100mM等值子等值的亚丁基甲基苯丙胺（IBMX）。在 -20°C 下储存，在使用前立即在 RT 解冻等分。
- 要使运动神经元培养基，将9.4 mL的神经巴管培养基与200 μL的马血清（2%）、200 μL的50x B27补充剂（1x），100μL的100x谷氨酰胺补充剂（1x）， 100 μL 10，000 U/m：青霉素-链霉素（100 U/mL），20 μL 2mM 2-mercaptoto醇（50μM），最好直接使用。此步骤可在神经元分离前 1 天执行。
- 在使用前，在电机神经元培养介质中，将100 μg/mL BDNF（10纳克/mL）、CNTF（10纳克/mL）和GDNF（10纳克/mL）和10μL的10 mM forskolin（10μM）和10μL的10μL IBMX（100μM）加入。将介质预热至 37°C。
- 准备解散解解决方案。
- 按照制造商的说明，制备木瓜素溶液（20 U/mL 木瓜素和0.005%DNase）和白蛋白-欧莫酮抑制剂溶液（1mg/mL排卵酮抑制剂、1mg/mL白蛋白和0.005%DNase）。
- 准备500μL等分物，每种排卵激素抑制剂和木瓜素溶液，并储存在-80°C。在使用前立即在37°C下解冻等分。
5. 心室中脑和脊髓切除
注：在荧光解剖立体显微镜下执行除步骤 5.1.1×5.1.3 和 5.1.5±5.1.6 之外的所有以下步骤。每个实验的总解剖时间通常为 3~5 小时，具体取决于解剖技术的熟练程度和每个实验所需的运动神经元数量。
- 心室中脑解剖
- 通过二氧化碳气体和宫颈脱位使怀孕小鼠受精后约11.5天。
- 用乙醇彻底喷洒腹部，并使用无菌微切除剪刀和拇指敷料钳切除子宫。在无菌PBS中短暂清洗子宫，然后转移到充满预冷无菌PBS的解剖板。
- 使用无菌微解剖剪刀、拇指敷料钳，在显微镜的明亮光线下，用冰冷的无菌PBS将IslMN：GFP-阳性胚胎从子宫中取出，并用无菌的微解剖剪刀、拇指敷料钳子和杜蒙特#5钳子。使用无菌 Moria 迷你穿孔勺子，将每个胚胎转移到 24 孔盘的单独井中，该孔盘上装满了预冷却的 Hibernate-E 低荧光介质，辅以 1x B27。把24口井板放在冰上。
- 将一个胚胎移植到无菌解剖板，用冰冷的无菌汉克的平衡盐溶液（HBSS）完全覆盖。
- 确保解剖步骤在显微镜的荧光异体素 （FITC） 照明下执行。使用钳子，去除胚胎的尾巴和面部，而不会损坏中脑（图2Ba）。将四肢横跨在下方的胚胎放在显微镜的前面，朝向分离区（用星号表示，图2Bb）。
- 使用钳子，切开第四个心室的屋顶，以产生一个小开口。使用此开口将钳子钩入第四心室和屋顶之间创建的空间。沿着胚胎的背表面解剖到皮层，并横向到地板和运动柱（图2Ca，b）。以开放书籍的方式打开解剖组织，揭示GFP阳性CN3和CN4核。
注：来自腹腔中脑的一小块组织含有美因、CN3和CN4，现在将暴露。 - 小心地将腹腔中脑与胚胎分离，并使用钳子和微解剖刀去除脑组织。使用钳子和微解剖刀将双边GFP阳性CN3和CN4核从地板和其他GFP阴性周围组织分离（图2D）。最大化切除组织中的 GFP 阳性运动神经元的数量，但避免接触或损坏它们。
- 如果需要单独的 CN3 和 CN4 核集合，则沿这两个核的中线切割（图 2D中的黄色虚线）。使用P1000移液器，用最少的HBSS收集解剖的腹腔中脑组织，并将其放入标有1.7 mL的微离心管中，管中填充了解剖介质（参见步骤4.1.5）。储存在冰上，直到分离。
- 继续在同一管中从额外的胚胎中汇集腹腔中脑，直到总数满足实验要求（有关理想的细胞数，请参阅步骤 8）。
注：建议至少收集10个腹腔中脑，产生大约1 x 104 CN3/CN4运动神经元，因为组织在解离和分拣过程中受到压力。
- 心性脊髓切除
- 保持胚胎容易与头部面对显微镜的前面，朝向分裂区。用一对钳子握住胚胎，并将另一对钳子的尖端插入第四个心室未开封的牛头部分。
- 打开胚胎的整个囊中膜的后脑和脊髓的余下部分。通过切割背道组织打开，从第四心室开始，用钳子作为剪刀作用，向牛脊髓的中央管道工作（图2Ca，b）。在此过程期间，小心避免接触或损坏腹脊髓。
- 用一对钳子握住胚胎，用另一对钳子捏住两侧的背组织皮瓣（图2Ea，b）。
注：切除的背道组织包含背皮、美感、背根结膜 （DRG）、背毛后脑和脊髓。尽可能多地去除这些组织，而不会损坏 SMN 核，因为它们是粘合剂，在过滤过程中可能会捕获 SMN，或在 FACS 分拣过程中造成堵塞。 - 使用微解剖刀取出腹腔脊髓，直接刺穿 GFP 阳性 SMN 下方。用锯状运动两侧提起腹腔脊髓（图2Fa，b）。切割浮动腹腔脊髓横向直于C1上方，其中第一个GFP阳性前角项目（图2G）。此外，在下肢的上边界横向切割（图2G）。手术后，切除腹脊髓的颈椎 （C1）-腰椎 （L2-L3） 部分。
- 将腹腔脊髓背侧向上放置，用一对钳子按GFP阳性SMN柱之间的GFP阴性组织保持。用微分切刀修剪GFP阳性SMN柱的两侧，去除剩余的附加的中位体、DRG和背脊髓（图2H）。小心最大化GFP阳性运动神经元，而不会损害它们。
- 使用 P1000 移液器，用最少的 HBSS 收集解剖的腹脊髓组织，并放置在贴有 SMN 标签的 1.7 mL 微离心管中，管中填充了解剖介质。储存在冰上，直到分离。继续在同一管中从额外的胚胎中汇集腹腔脊髓，直到总数满足实验要求。
注：建议收集至少三条产生约 2.1 x 104 SMN 的腹脊髓，因为组织在解离和分拣过程中会承受压力。 - 收集面部运动神经元和四肢的IslMN：GFP小鼠胚胎作为GFP阳性和GFP阴性对照荧光激活细胞分类（FACS），分别。四肢是GFP阴性，因为在这个胚胎年龄，SMN的GFP阳性斧头尚未扩展到四肢。
6. 组织分离
注：每个实验的总解散时间通常为 1.5 小时。
- 在解散前30分钟，将温胶和白蛋白-欧莫霉素抑制剂溶液等分到37°C。
- 以低速短暂旋转微分裂组织。
- 使用 P100 移液器，小心地去除尽可能多的 Hibernate E，而不使组织吸气。
注：在此步骤后，请务必删除所有残留的冬眠 E，以避免在下一步中降低木瓜分离的功效。 - 将适当体积的木瓜溶液（表1）加入含有微解剖组织样本的1.7 mL微离心管中。
注：确定用于解散的适当体积，以最大化有效的解散，同时尽量减少对细胞的压力。 - 用 P200 移液器轻轻三聚8倍。轻轻执行所有三角步骤，以保持运动神经元的生存能力。
- 在37°C下孵育含有组织的管子30分钟，每10分钟用手指轻拂10倍搅拌。 孵育后用P200移液器轻轻三聚每个悬浮液8x。以 300 x g旋转细胞 5 分钟。
- 为了确保在下一步中排卵酮抑制的功效，请使用P1000移液器去除和丢弃尽可能多的上清液，而不使组织脱光。
- 用P200移液器轻轻三聚8倍，在白蛋白-欧莫酮抑制剂溶液的适当体积中重新悬浮颗粒（表1）。
- 等待 2 分钟，让任何剩余的未结缔组织块稳定到管的底部。
- 收集尽可能多的上清液，不要使用P200移液器吸气未结组织。将上清液转移到新鲜的1.7 mL微离心管。
- 如果步骤 6.10 后某些组织块保持未分离状态，则对留在原始 1.7 mL 微离心管中的未结缔组织重复步骤 6.8_6.10，以最大化分离细胞的最终产量，同时最大限度地减少对细胞的压力先前分离，包含在步骤 6.10 的上清。
- 以300 x g旋转电池5分钟。使用P1000移液器小心地取出并丢弃上清液。
- 使用P1000移液器移液8倍，将颗粒重新悬浮在适当的解剖介质体积中（表1）。确定了适当的最终悬浮量，使细胞密度不超过107细胞/mL，这可以阻止流式细胞测定机的流，但也使细胞不会过度稀释，从而导致分拣速度减慢。
- 通过 70 μm 细胞过滤器过滤悬浮液，以消除任何大块或未消化的组织。将悬架转移到 5 mL 圆形底部聚苯乙烯试管中，并储存在冰上，直到需要为止。
7. 荧光激活细胞分拣 （FACS）
注：该协议使用配备 15 mw 405 nm 紫色激光器、100 mw 488 nm 蓝色激光器、75 mw 594 nm 橙色激光器和 40 mw 640 nm 红色激光器进行了优化。细胞在无菌条件下通过100μm喷嘴在无菌的PBS中分类为护套液。为了最小化细胞应力，流速设置为1⁄3的样本压力，因此每秒最多可获得1，000~4，000个事件。每个实验的总 FACS 时间通常为 1⁄2 小时。
- 设置正向和侧散射的电压，以便正确可视化电池群。为单元分拣设置适当的电压非常复杂，需要经验丰富的 FACS 操作员。
- 要区分不同的细胞群，根据正向散射区域 （FSC-A） 确定的大小与侧散射区域 （SSC-A） 确定的内部复杂性绘制单元格。如图 3Aa和图 Ba所示，在活细胞周围绘制一个门，以排除碎屑和死细胞。将封闭区域内的单元格分组为总体 1 （P1）。
- 要排除单元格块和双精度值，根据侧散射宽度 （SSC-W） 与 SSC-A 绘制下一个 P1 单元格。将单个细胞群作为总体 2 （P2） （图 3Ab和图Bb） 进行门。
- 根据正向散射宽度 （FSC-W） 与 FSC-A 绘制 P2 像元，并将单个单元的组成作为总体 3 （P3） （图 3Ac和图 Bc） 进行门控。
注： 在 7.3 和 7.4 中使用两个连续的门不包括细胞团块和双子（高 FSC-W 和高 FSC-A）。 - 基于GFP与环子青素（APC）的P3门细胞。APC 通道检测自荧光。在此通道上浇注可避免捕获自荧光细胞。使用 GFP 负极电池调整 FITC/GFP 荧光通道的电压。理想情况下，定位门为这些细胞群约102。为每种运动神经元分别选择GFP阳性总体4（P4）的栅极阈值（图3广告和图Bd）。
注：为 SM 建立比 CN3s/CN4 更高的 GFP 门，以获得纯文化（图3Ad和图 Bd）。SMN 培养的较低 GFP 门会导致胶质神经元和非运动神经元对培养物的污染。这可能是因为由于泄漏的启动子，某些胶质神经元和非运动神经元中有低水平的GFP表达。GFP阳性细胞与总细胞的百分比在CN3s/CN4s中一般为0.5-1.5%，SMN为1.5~2.5%。如果解剖成功，这些数字可用作基准，以确定 GFP 正门的适当位置（图 3Ae和图 Be）。 - 根据制造商的协议执行 FACS。将P4细胞收集到充满500μL运动神经元培养培养基的新鲜1.7 mL微离心管中。储存在冰上，直到电镀。
注：虽然细胞可以直接分类到井中，但这导致每口井的细胞数量不均匀。将电池分类到 1.75 mL 微离心管中，然后手动板，以实现更均匀的电镀分布。
8. 纯化原马达神经元培养
- 稀释FACS隔离的CN3/CN4和SMN悬浮液与运动神经元培养基预热到37°C，密度分别为5 x 103和1 x 104细胞/mL。
注：一个 E11.5 胚胎产生大约 1 x 103 CN3/CN4 和 7 x 103 SMN。然而，这些产量严重依赖解剖组织的纯度、细胞分离的彻底性以及FACS期间GFP门的适当阈值。 - 将96孔板预涂有PDL和层宁从37°C组织培养箱转移到层状流量罩，并从每个孔中吸升拉明宁。立即使用板和盖玻片，无需清洗。
- 将 200 μL 的稀释 CN3/CN4 和 SMN 悬浮液添加到 PDL/层宁涂层 96 孔板的每个孔中。对于CN3/CN4和SMN，最终细胞密度应分别为1 x 103和2 x 103细胞/孔。
注：96孔板（2 x 103细胞/孔）中SPN的初始电镀密度是CN3s/CN4s（1 x 103细胞/孔）的两倍，以便在2天和9天体外（DIV）（4⁄6 x 102和2⁄4 x 102细胞/孔）获得类似的最终运动神经元数和密度。 - 培养神经元在37°C，5%CO2孵化器。
- 每5天通过去除一半的旧介质（100μL）并替换为相同体积的新鲜运动神经元培养基来喂养神经元。确保神经元过程在 1 DIV 上变得可见，并且变厚和更长 14 DIV （图 4）。神经元细胞体变大，往往在长期培养中聚集，特别是对于SMN（图4）。
注：通过保留原始介质体积的一半来执行所有介质和溶液更改，以避免分离培养单元。这包括固定和免疫细胞化学 （ICC） 步骤。如果所有介质都被删除，无论使用何种方式，大多数细胞将分离并洗掉。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议的目的是高度净化和培养初级CN3s/CN4s和SMN长期，以便能够比较分析运动神经元紊乱背后的机制（见图1和图2概述）。
一旦神经元在培养中成功分离和生长，几乎纯原发的CN3/CN4和SMN培养物获得（图5A，B），并维持至少14DIV（图4和图6）。当ICC使用运动神经元标记岛1和神经元标记TUJ1（图5B）评估时，2 DIV的CN3/CN4和SMN培养的纯度分别为93.5±2.2%和86.7±4.7%。然而，这些高纯化在很大程度上依赖于胚胎的年龄，以及在FACS期间为GFP门设置适当的阈值（图3）。在E10.5处解剖胚胎比在E11.5解剖更困难，因为组织的柔软性和粘性增加，导致运动神经元产量下降。然而，E10.5 CN3s/CN4s和SMN的纯度与E11.5胚胎的纯度相当（2 DIV分别为92.8%和82.2%;从单个实验获得的数据）。使用E13.5胚胎时，CN3s/CN4s和SMN的纯度急剧下降，即使只收集了最高的GFP阳性群体（分别为20.7%和7.4%）;从单个实验获得的数据，可能是由于GFP在非运动神经元中的表达（图7）。这种趋势也适用于E12.5文化，尽管它没有那么戏剧化。因此，E12.5或以上胚胎不适合使用该协议净化运动神经元。
纯运动神经元培养物对于理解运动神经元的孤立生长模式、行为和脆弱性有价值。此示例演示如何使用这些培养物来测试运动神经元对化学处理的反应。为了确定原发性CN3s/CN4s和SMN是否表现出对内质环子（ER）压力的微分反应，使用该协议获得CN3s/CN4s和SMN的初级单一培养物，并采用不同浓度的ER压力、环视酸（CPA）进行治疗。神经元在2 DIV时接受CPA（5、10、15、20、25或30 μM）或车辆控制（DMSO）治疗，3天后固定为ICC评估存活率（图8A）。计算了每个样本中可存活神经元的数量，并将存活率计算为药物处理井中存活细胞的数量除以使用DMSO治疗的井中的活细胞数。与SMN单一培养相比，CN3/CN4单一培养对CPA治疗（10~25μM）的抵抗力明显增强（图9和图8B）31。
总之，该协议允许生成高度纯化的原生小鼠胚胎CN3/CN4和SMN培养物，为神经行为调查提供了强大而可靠的系统。
图1：小鼠胚胎运动神经元的制备方案。原理图说明了小鼠胚胎运动神经元的分离和培养所涉及的步骤，以及每个步骤的大致时间（以小时或天）。CN3/CN4 和 SMN 的解剖程序顺序为 1 到 4。缩写：CN3/CN4 = 耳运动神经元/耳蜗神经元;SMN = 脊髓运动神经元;FACS = 荧光活性细胞分拣;h = 小时;d = 天。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：解剖腹腔中脑和宫颈（C1）-腰椎（L2-L3）部分的腹脊髓。（A） 在荧光异体素 （FITC） 照明下 E11.5 IslMN：GFP转基因小鼠胚胎中 GFP 阳性运动神经元的横向 （a） 和背侧 （b） 视图。整个安装E11.5胚胎被准备如前面描述的32，以使胚胎透明。随后，通过免疫荧光标记对胚胎进行分析，并带有抗GFP染色（绿色）。图像是在共聚焦显微镜下拍摄的。刻度条 = 200 μm（横向视图）和 400 μm（背视图）。缩写： S = 上级;I = 低等;V = 通风口;D = 背。（B-H）在 E11.5 腹腔中脑和腹脊髓组织的图像上突出显示的解剖步骤，这些图像使用配备的摄像机在强光 （Bb） 或 FITC 照明下使用荧光解剖立体显微镜拍摄。刻度条 = 200 μm （D） 和 1 mm（A+C，E+H）。（B） （a） 沿红线切割胚胎的面部和尾部。（b） 适合解剖的胚胎。显微镜前部的位置用星号表示。（C） 沿实心红线切割，以切开第四心室的屋顶 （a） 侧视图和 （b） 背视图.使用此开口沿胚胎背表面切割到大脑（由虚线红色箭头指示的轨迹）。这暴露了含有美感、CN3和CN4的组织，这些组织可以从颅骨中取出。对于 SMN 解剖，将钳子插入第四个心室和其屋顶之间的同一开口，然后切割到胚胎的牛侧（由虚线黄色箭头指示的轨迹）。（D） 包含双边GFP阳性CN3和CN4核的腹腔中脑的最终视图。组织的边缘由红色矩形突出显示。沿黄色虚线切割，根据需要分别收集 CN3 和 CN4 核。（E） 打开后脑和脊髓的其余部分后，在两侧的红线上方拍打的背道组织，在之前和（b）之后。（F） 在红线 （a） 之前和 （b） 之后双边去除脊髓的多余组织心室 .（G） 在红线指示的两个位置切割腹脊髓。在玫瑰侧，切割浮动腹腔脊髓横向高于C1，其中第一个GFP阳性前角项目。下肢上边界处脊髓的刀端横切。一旦这些切口，颈椎（C1）通过腰椎（L2-L3）部分的腹脊髓可以解剖走。（H） 包含GFP阳性SMN柱的腹脊髓的最终视图。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：腹腔中脑（A）和腹脊髓（B）的代表性排序图。（Aa和Ba）在排除碎片和死细胞之前，向前散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 排序图。（Ab， Bb， Ac， Bc）根据宽度 （SSC-W） 与 SSC-A 和正向散射宽度 （FSC-W） 与 FSC-A 相比，分别对单元格组块 （b） 和双子 （c） 进行分类的图。（广告和Bd）分类图以分离IslMN：GFP-阳性运动神经元。为了获得纯文化，GFP 门必须设置为 SMN（Bd） 高于 CN3s/CN4s （广告）。（Ae和Be）通过 FACS 排序进行收集的单元格的百分比。%Parent表示当前封闭填充中单元格相对于上一个封闭单元格总体中的单元格数的百分比，而%Total表示门控单元格相对于总单元格的百分比。GFP阳性细胞与总细胞（盒装为红色）的预期百分比为CN3/CN4的0.5±1.5%，SMN为1.5~2.5%。如果解剖成功，这些百分比可用作在（Ad和Bd） 中设置 GFP 正门的基准。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：2、7 和 14 DIV 的初级 CN3/CN4 和 SMN 单一培养的相位对比图像。使用相应的图像采集和处理软件和40倍物镜，在2、7和14 DIV用倒荧光显微镜捕获原初级CN3/CN4和SMN培养物的代表性差分干扰对比度图像。神经元过程变得更厚，更长由14 DIV.神经细胞体的大小变得扩大，并倾向于聚合在长期培养，特别是对于SMN。两种培养物至少可以保持14 DIV。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：分离E11.5鼠标CN3/CN4和SMN培养物的特征。（A） E11.5 小鼠 CN3s/CN4s（顶部）和 SMN（下图）的代表性免疫细胞化学图像，为 2 DIV 培养。免疫荧光标记与神经元标记 TUJ1（绿色）和运动神经元标记岛 1（红色）执行，以 DAPI（蓝色）进行反染。几乎所有的培养细胞都是运动神经元（TUJ1=，岛1+）。使用相应的图像采集和处理软件和20倍物镜用倒荧光显微镜捕获图像。对样品进行成像和处理，实现无饱和像素的最大信号强度。除非另有说明，否则以下图中的所有微观工作和图像处理均在这些条件下执行。刻度条 = 100 μm. （B） E11.5 鼠标 CN3/CN4 和 SMN 培养在 2 DIV 的纯度。CN3/CN4和SMN培养物的纯度分别为93.5~2.2%和86.7~4.7%。通过筛选皮球核形态和膜肿胀，对死神经元细胞体进行评估。当观察到珠子和肿胀的迹象时，神经元过程被归类为退化过程。细胞体死亡或退化过程都被认为是可行的非运动神经元（TUJ1 +，Islet1-）或可行的运动神经元（TUJ1+，岛1+）33。运动神经元培养的纯度计算为活的运动神经元数除以可存活的非运动神经元加上可存活的运动神经元的总数。值表示三个独立实验的平均值 = SEM。学生不考试不显著（p > 0.05）。细胞计数在20倍放大倍率下手动执行。缩写：SEM = 均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：2、7和14 DIV原发性CN3/CN4和SMN单一培养的代表性免疫细胞化学。通过使用TUJ1（绿色）的免疫荧光标记在2、7、14 DIV处对原发CN3/CN4和SMN培养物进行分析，核与DAPI（蓝色）进行反污染。神经元过程变得更厚，更长14 DIV.神经细胞体的大小变大，并倾向于在长期培养中聚集，特别是对于SMN。CN3/CN4 和 SMN 培养物至少可以保持 14 DIV。图像在 10 倍放大倍率下被捕获。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：E13.5鼠标CN3/CN4和SMN分离培养物的特征。E13.5 CN3/CN4 和 SMN 使用该协议进行分离和培养，并通过使用 TUJ1（绿色）和岛1（红色）的免疫荧光标记在 2 DIV 下进行分析，核与 DAPI（蓝色）进行反污染。许多非运动神经元细胞（TUJ1+，Islet1-） 存在（箭头），导致CN3/CN4和SMN纯度急剧下降，在SMN培养中下降更为明显。图像在 20 倍放大倍数下拍摄。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：主要运动神经元培养的代表性应用，表明CN3s/CN4有选择性地抵抗CPA引起的ER应力。（A） 实验提纲：在2 DIV时用CPA或车辆控制（DMSO）处理原发性CN3/CN4和SMN单一培养，3天后通过免疫细胞化学分析对细胞活力进行评估。本大纲已由已发表的工作31修改。（B）用5~30μM CPA处理的CN3s/CN4s和SMN的存活率定量，从2DIV中处理3天。用TUJ1对细胞进行免疫荧光标记分析神经元，核与DAPI进行反污染。存活率计算为药物处理井中存活细胞的数量（见图5B图例）除以仅含车辆管药的井中的活细胞数（DMSO）。细胞计数在20倍放大倍率下手动执行。值表示四个独立实验的平均值 = SEM。*p < 0.05;p < 0.005 通过学生考试。这个数字已由先前发表的工作31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图9：初级CN3/CN4和SMN单一培养的代表性免疫细胞化学，在3天接触增加的CPA浓度后，从2 DIV开始。通过用TUJ1（绿色）和核与DAPI（蓝色）对细胞的免疫荧光标记来分析神经元。初级CN3s/CN4s对CPA治疗的抵抗力比初级SPN高。图像在10倍放大倍率下被捕获。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 中脑数量 （X） | 木瓜 蛋白酶 | 白蛋白-欧莫克 | 休眠 E | |||||||||
| 10 × X ± 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ±30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ±40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 脊髓数量 （Y） | 木瓜 蛋白酶 | 白蛋白-欧莫克 | 休眠 E | |||||||||
| 3 = Y ±5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ±10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ±15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
表1：在分离步骤中使用的适当体积的木瓜素、白蛋白-欧莫酮和最终悬浮液。经过几轮优化后，从制造商的说明中修改了与各种数量的腹腔中脑和腹脊髓组织一起使用的适当体积的木瓜蛋白和白蛋白-欧莫酮。由于组织在解离和分拣过程中受到应力，因此建议收集 10 多个腹腔中脑和三个以上腹腔脊髓。木瓜的体积是通过考虑有效解散和本程序的压力之间的平衡来确定的。白蛋白-欧莫克抑制剂溶液的体积是帕金的一半。确定了Hibernate E最终悬浮液的适当体积，使细胞密度不超过107细胞/mL，但细胞不会过度稀释。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从历史上看，CN3和/或CN4运动神经元的体外研究依赖于异质培养物，如分离17、18、19、20、21、外植17、22、23、24、25、26和切片27、28培养体，因为这些细胞无法与基于大小周围的细胞，以及这些细胞的特定标记尚未报告。本协议是分离和培养原发性E11.5鼠C3/CN4s和来自同一胚胎的SMN的综合方法，确认培养物的高纯度。通过从同一小鼠胚胎生成纯SMN和CN3/CN4培养物，该协议能够控制CN3s/CN4s的体外行为与从野生型和突变胚胎分离的SMN进行比较。
该协议产生的CN3s/CN4s和SMN的纯培养物允许对这些运动神经元的形态、细胞、分子和电生理特性进行比较研究。从理论上讲，由于其他颅脑运动神经元群可以从这个IslMN：GFP转基因小鼠线（包括腺体、运动三叉、面部和低光泽）进行可视化和解剖，因此，只要FACS GFP门得到适当调整，该协议也可以针对它们的隔离和培养进行扩展。最后，从该协议衍生的FACS排序的运动神经元可以进行基因组（例如，使用测序的转氨酶-可访问色母的测定）和/或转录组（例如，RNA序列31）分析，以研究神经退行性疾病中特定运动神经元亚型的正常发育和选择性脆弱性31。
该协议中有多个步骤对于最大化隔离培养系统中纯、健康的运动神经元数量至关重要。在解剖过程中，应最大限度地去除GFP阴性组织（例如，同相和DRG），而不损害运动神经元，因为这些组织是粘合剂，在过滤过程中会捕获SM，或在FACS分拣期间造成堵塞。在组织分离过程中，应使用木瓜的最小基本体积，并且细胞必须用最小但足够的三聚处理轻轻处理。帕帕因用于该协议中的组织分离步骤，因为初步数据表明，它比胰蛋白酶对CN3/CN4和SMN的破坏性要小。基于CN3s/CN4s和2 DIV的SMN的镀值的存活率从39.5%提高到52.7%，从52.3%增加到58.4%，当使用木瓜代替胰蛋白酶（0.25%，4分钟孵育）。虽然这些数字来自在完全优化之前进行的单个实验，但额外的报告也表明，胰蛋白酶在从神经系统组织中提取细胞时并不理想，即12、34、35、36。在FACS期间，不应使用荧光重要染料（碘化铀和钙化蓝）和小分拣喷嘴（例如70 μm），因为它们对运动神经元的生存有害。强烈建议使用大型分拣喷嘴（100 μm 或更大），因为使用 70 μm 喷嘴时，SMN 细胞死亡率会显著增加。在 FACS 中为 GFP 阳性细胞设置适当的门控阈值是获得纯培养体的关键步骤。运动神经元培养物辅以福林、IBMX 和生长因子（BDNF、CNTF 和 GDNF）。据报道，福斯科林和IBMX可以促进SMN生存37，38。从目前研究的初步数据表明，福柯林和IBMX也增加CN3/CN4的存活率。分别添加IBMX、Forskolin和IBMX+forskolin时，基于2 DIV中CN3/CN4s的镀值的存活率从17.5%提高到26.9%、31.9%和37.0%（数字基于在细胞培养条件完全优化之前进行的单个实验）。最好通过保留原始体积的一半来执行所有培养细胞的介质变化和分部，以避免分离培养的细胞。最后，减少运动神经元的解剖和电镀之间的时间（例如，通过使用多个分界法缩短解剖时间）也是理想的，以提高培养物的生存能力。
遵循此协议时可能会出现四个主要的潜在问题。第一种是FACS之后的运动神经元的低收率。产量低的潜在原因包括使用年轻的胚胎（例如E10.5），这些胚胎的运动神经元较少，在解剖过程中去除的粘合剂GFP阴性组织（例如，共和体和DRG）的去除不足，这些胚胎会捕获运动神经元并导致在过滤过程中去除它们;在分离过程中，帕帕分化/三聚体不足，以及/或将GFP阳性门设置在FACS期间过高。第二个潜在的问题是运动神经元培养物纯度低，这很可能是由于使用较老的胚胎（例如E12.5）和/或在FACS期间将GFP正门设置得太低。第三，由于FACS分类不当和/或板/盖玻片的PDL/层宁涂层不足，文化中可能观察到少量附加运动神经元。第四，运动神经元在培养中表现出低活力。存活率低的潜在原因包括粗糙和/或长期解剖、分离过程中过度的细胞分裂/三化、在整个协议中对细胞处理不当（例如，细胞的粗移移、未能将细胞放在冰上、未能预冷却PBS和HBSS）和/或怀孕小鼠安乐死与细胞最终电镀之间的时间过长。使用不新鲜和/或浓度不当的试剂也会损害实验结果。
该协议有三个主要限制。IslMN：GFP转基因小鼠和FACS分类都相当昂贵。然而，它们对于该协议至关重要，因为目前没有任何替代方法能够以更经济的方式生成高度纯化的CN3/CN4s。对于胚胎小鼠来说，有一个很小的E10.5-E12.5年龄窗口，很难确认存在适当的老化胚胎，尤其是在没有超声波机的情况下。如果只需要纯SMN，它们可以从E12.5-15.0小鼠胚胎中提取，使用梯度离心10、11、12和/或p75NTR-抗体基细胞分选平移技术13、14、15、16等方法。最后，由于运动神经元（特别是CN3s/CN4s）产量小，需要大量起始材料的基于蛋白质的检测不可行。干细胞衍生的运动神经元31，39，可以无限地产生，理论上可以替代这个目的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢布里吉特·佩特曼（生物根，剑桥，马萨诸塞州，美国）在SMN解剖技术的指导;达纳法伯癌症研究所流式细胞测定设施、哈佛医学院免疫学部门流式细胞测定设施、乔斯林糖尿病中心流式细胞测定中心、布里格姆和妇女医院流动细胞学核心，以及波士顿儿童医院流式细胞测定研究设施，用于FACS对原发性运动神经元进行FACS分离;A.A. Nugent、A.P.Tenney、A.S.Lee、E.H.Nguyen、M.F.Rose、其他恩格尔实验室成员和项目ALS联盟成员提供技术援助和深思熟虑的讨论。这项研究得到了ALS项目的支持。此外，R.F.还由日本心脏基金会/拜耳雅库因海外研究赠款和NIH遗传学T32 GM007748培训赠款资助;J.J.通过舍彭斯眼科研究所和开发神经学训练计划博士后奖学金（5T32NS0007473-19）通过波士顿儿童医院，获得美国国家卫生研究院/NEI眼病分子库（5T32EY00714-16）培训项目的支持;M.C.W得到了NEI（5K08EY027850）和儿童医院眼科基金会（教师发现奖）的支持;和E.C.E.是霍华德·休斯医学研究所的调查员
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
