Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.
Abstract
I neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) mostrano una notevole resistenza alle malattie dei motoneuroni degenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) rispetto ai motoneuroni spinali (SMN). La capacità di isolare e coltura mouse primario CN3s, CN4s, e SMN fornirebbe un approccio allo studio dei meccanismi alla base di questa vulnerabilità selettiva. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli utilizza colture cellulari eterogenee, che possono confondere l'interpretazione dei risultati sperimentali. Per ridurre al minimo i problemi associati alle popolazioni di cellule miste, le colture pure sono indispensabili. Qui, il primo protocollo descrive in dettaglio come purificare e coltivare in modo efficiente i CN3/CN4 insieme alle controparti SMN dagli stessi embrionali usando embrioni del giorno 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embrionali di topo transgenici. Il protocollo fornisce dettagli sulla dissezione e dissociazione dei tessuti, l'isolamento cellulare basato su FACS e la coltivazione in vitro di cellule dai nuclei CN3/CN4 e SMN. Questo protocollo aggiunge un nuovo sistema di coltura in vitro CN3/CN4 ai protocolli esistenti e fornisce contemporaneamente una cultura SMN pura e abbinata all'età per il confronto. Le analisi incentrate sulle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni sono realizzabili in questo sistema di coltura. Questo protocollo consentirà la ricerca sui meccanismi che definiscono lo sviluppo del motoneurone, la vulnerabilità selettiva e la malattia.
Introduction
La coltura dei motoneuroni primari è un potente strumento che consente lo studio dello sviluppo neuronale, funzione, e suscettibilità a fattori di stress esogeni. Le colture di motoneuroni sono particolarmente utili per lo studio di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1,2, i cui meccanismi di malattia sono incompleti. È interessante notare che, nonostante la significativa morte cellulare dei motoneuroni spinali (SMN) sia nei pazienti affetti da SLA che nei topi modello di SLA, la morte cellulare nei neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) sono relativamente scarsi1,3,4,5,6,7,8,9. Pertanto, analisi comparative delle colture pure di CN3/CN4 e SM potrebbero fornire importanti indizi sui meccanismi alla base della vulnerabilità relativa. Sfortunatamente, un ostacolo importante a tali analisi è stata l'incapacità di coltivare colture purificate di questi motoneuroni.
Molti protocolli sono stati descritti per la purificazione delle sinistenzioni da modelli animali. La maggior parte di questi protocolli utilizza tecniche di panning di smistamento delle cellule basate su media di densità10,11,12 e/o p75NTR-anticorpi -anticorpi- base alle tecniche di panning13,14,15,16. La centrifugazione del gradiente di densità sfrutta le dimensioni maggiori delle snn rispetto ad altre cellule spinali, mentre p75NTR è una proteina extracellulare espressa esclusivamente dalle sren nel midollo spinale. Quasi 100% culture SMN pure sono state generate da uno o entrambi questi protocolli11,12,14. Tuttavia, questi protocolli non sono riusciti a generare impostazioni cultura CN3/CN4 perché i CN3/CN4 non esprimono p75NTRe non sono stati identificati altri marcatori CN3/CN4 specifici. Sono anche più piccole delle smin e, pertanto, più difficili da isolare in base alle dimensioni. Invece, studi in vitro di CN3 o CN4 si sono affidati a dissociati17,18 ,19,20,21, espianto17,22,23,24,25,26, e fetta27,28 culture, che sono composti da tipi di cellule eterogenee, e nessun protocollo sono esistiti per il isolamento e cultura dei CN3 primari o CN4.
In questo caso, viene descritto un protocollo per la visualizzazione, l'isolamento, la purificazione e la coltivazione di CN3, CN4 e SMN dello stesso giorno embrionale 11.5 (E11.5) IslMN:GFP topi transgenici29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillato che si localizza nella membrana cellulare. Questo protocollo consente il confronto di diversi tipi di motoneuroni per chiarire i meccanismi patologici nella malattia dei motoneuroni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti che utilizzano animali da laboratorio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con l'approvazione dell'Animal Care and Use Committee dell'Ospedale pediatrico di Boston.
1. Impostazione degli accoppiamenti a tempo prima della dissezione
- Per generare topi embrionali prenatali per il raccolto del motoneurone, pesare ogni topo femmina e impostare l'accoppiamento a tempo tra topi transgenici adulti IslMN:GFP 11,5 giorni prima del giorno dell'isolamento del neurone. Allo scopo di sviluppare questo protocollo, sono stati utilizzati topi 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP, di età compresa tra 2 e 9 mesi, e l'accoppiamento a tempo è stato istituito la sera.
- Esaminare i topi femminili per i tappi vaginali la mattina seguente. Si consideri la data in cui la spina viene identificata come giorno embrionale (E) 0.5.
- Pesare topi di sesso femminile ed esaminare i cuccioli utilizzando ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali)tra E8.5-11. Verificare la presenza di segni di accoppiamento riuscito.
- Confermare il successo dell'accoppiamento rilevando l'aumento di peso nei topi di sesso femminile (di solito >1,5 g su E9.5 se ci sono più di 5/6 embrioni).
- Confermare visivamente gli embrioni sotto ecografia. Gli embrioni sono facilmente rilevabili dagli ultrasuoni dopo l'E9.5. Gli ultrasuoni sono condotti solo su femmine che hanno guadagnato peso perché sono più spesso incinte di quelle che non lo fanno.
NOT: I topi femminili possono aumentare di peso per motivi diversi dalla gravidanza, quindi l'aumento di peso da solo non è un indicatore affidabile della gravidanza. La conferma degli ultrasuoni impedisce il sacrificio non necessario delle femmine che non sono incinte, ma non è cruciale se non disponibile.
2. Condizioni di dissezione e preparazione degli strumenti
- Eseguire tutti i rivestimenti (ad eccezione della pulizia degli acidi di coverlips), la preparazione dei supporti, la dissociazione dei tessuti (ad eccezione della centrifugazione e dell'incubazione) e il lavoro di coltura in un cofano a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e dei neuroni motori embrionali.
- Con un'attenta attenzione alla tecnica sterile, condurre la dissezione dei tessuti al di fuori di una cappa di flusso laminare con un rischio minimo di contaminazione.
- Sterilizza una piastra di dissezione, un paio di forbici microdissecting, un paio di pinze per medicazione del pollice, due paia di dumont #5 pinzette, un coltello microdisseco e un cucchiaio perforato Moria mini immergendosi nel 70% di etanolo prima dell'uso.
3. PDL/Laminin Coating di piatti/Coverslips
NOT: Coltura dissociato neuroni motori primari in 96 bene o 24 pozzi piastre, a seconda del numero di cellule necessarie per l'applicazione. Le cellule possono essere immagini direttamente nella piastra di coltura dei tessuti senza l'uso di copricapi se i pozze sono otticamente trasparenti e gli spessori sono compatibili con l'imaging.
- Per le applicazioni che richiedono coverlips, preparare le coversi lavate con acido, sterilizzati e essiccati all'aria almeno 2 giorni prima dell'isolamento del neurone, come descritto in precedenza30. I lotti di coverlips possono essere preparati in questo modo con largo anticipo rispetto agli esperimenti e possono essere conservati fino a 6 mesi senza alcun impatto sulla qualità sperimentale.
- Preparare una soluzione di lavoro di 20 g/mL poly D-lysine (PDL) in salina tampina buffered fosfato (PBS) 2 giorni prima dell'isolamento del neurone.
- Aliquota (1 mg/mL) in anticipo e conservare a -20 gradi centigradi come soluzione di stock.
- Coprire la superficie di ogni coperchio o il pozzo della piastra di coltura dei tessuti con soluzione di lavoro sufficiente per la soluzione PDL (ad esempio, 100 -L per pozzo su 96 piastre di pozzo o 500 -L per pozzo su 24 lastre di pozzo con o senza copricoproe). Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Il giorno seguente lavare 3x con acqua sterilizzata.
- Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e conservare le piastre rivestite in PDL lavate a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese se vengono essiccate completamente dopo il lavaggio finale.
- Preparate una soluzione di lavoro con 10 gradi di laminina (1,1,2 mg/mL) in 1,2 mL di PBS.
- Le scorte di laminina dell'Aliquota (1,1,2 mg/mL) in anticipo e conservate a -80 gradi centigradi.
- Coprire la superficie di ogni coperchio o bene con sufficiente soluzione di laminina per rivestire uniformemente la superficie. Incubare per almeno 2 h a 37 gradi centigradi prima dell'uso.
NOT: Le piastre e i coprilabbra rivestiti in PDL/laminin a possono essere conservati fino a 1 settimana a 37 gradi centigradi, ma è preferibile laminina appena rivestita. Rimuovere la laminina direttamente prima della placcatura30. Lamiinina non dovrebbe essere lasciato asciugare. Se le lastre devono essere conservate per più di diverse ore, devono essere avvolte in pellicola di paraffina.
4. Preparazione di dissezione, Motor Neuron Culture Media e Soluzioni di dissociazione
NOT: Le concentrazioni tra parentesi indicano le concentrazioni finali di ciascun reagente.
- Preparare il mezzo di dissezione.
- Scongelare il siero di cavallo inattivato dal calore durante la notte a 4 gradi centigradi, preparare 1 mL e conservare a -20 gradi centigradi. Scongelare l'aliquota a RT direttamente prima dell'uso.
- Conservare B27-supplemento (50x) in 1 mL aliquote a -20 gradi centigradi. Scongelare gli aliquoti a RT immediatamente prima dell'uso. Evitare cicli di congelamento/scongelamento.
- Conservare il supplemento di glutammina (100x) a 4 gradi centigradi o -20 gradi centigradi. Dividere in 0,5 mLs se si conserva a -20 gradi centigradi.
- Conservare la penicillina-streptomycin (10.000 U/mL) in 1 mL a -20 gradi centigradi. Scongelare gli aliquoti a RT immediatamente prima dell'uso.
- Per rendere il mezzo di dissezione, mescolare 9,4 mL di Hibernate E con 200 l di siero di cavallo (2%), 200 l l di supplemento di 50x B27 (1x), 100 -L di supplemento di glutammina 100x (1x) (ad esempio, GlutaMAX) e 100 L di 10.000 U/mL penicillina-streptomicina (100 U/mL). Utilizzare questo mezzo per la raccolta di tessuti sezionati e la sospensione finale delle cellule dissociate.
- Aggiungere 500 l del mezzo di dissezione ai singoli tubi di microcentrifuga da 1,7 ml per la raccolta dei tessuti il giorno prima dell'isolamento del neurone. Preparare un tubo per ogni tipo di tessuto che verrà raccolto (ad esempio, controllo positivo, controllo negativo, CN3/CN4, SMN) e conservare a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
- Combinare 49 mL di Hibernate E supporto a bassa fluorescenza con 1 mL di supplemento B27 (1x) e riempire una piastra 24 bene con questo mezzo (2 mL/bene) il giorno prima dell'isolamento del neurone. Utilizzare questo piatto per la raccolta di embrioni di topo. Conservare a 4 gradi centigradi prima dell'uso.
- Preparare il mezzo di coltura del motoneurone.
- Preparare 250 aliquote di 25 mM 2-mercaptoetanolo nel mezzo L15 di Leibovitz. Conservare a -20 gradi centigradi.
- Generare 5 aliquote di 100 g/mL di BDNF, CNTF e GDNF diluite in acqua sterilizzata. Conservare a -80 gradi centigradi e scongelare a RT immediatamente prima dell'uso.
- Preparare la soluzione forskolin da 10 mM aggiungendo 64 gradi di solforo dimetilo (DMSO) a 5 mg di forskolin e vortice per sciogliere completamente. Quindi aggiungere acqua sterilizzata (1.003 mL) alla soluzione DMSO e vortice bene. Conservare 12 aliquote di 10 m forskolin a -20 gradi centigradi e scongelare l'aliquota a RT immediatamente prima dell'uso.
- Preparare 12 aliquote di isobutylmethylxanthine (IBMX) diluite in DMSO. Conservare a -20 gradi centigradi e scongelare a RT immediatamente prima dell'uso.
- Per rendere il mezzo di coltura del motoneurone, mescolare 9,4 mL di mezzo neurobasale con 200 200 L di 50x B27 supplemento (1x), 100 -L di 100x integratore di glutammina (1x), 100 . Questo passaggio può essere eseguito fino a 1 giorno prima dell'isolamento del neurone.
- Poco prima dell'uso, aggiungere 1 lega ciascuno di 100 g/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL) e 10L di 10 mM forskolin (10 m) e 10 -L di 100 mM IBMX (100 mM) al motoneurone medio. Preriscaldare il mezzo a 37 gradi centigradi.
- Preparare le soluzioni di dissociazione.
- Preparare la soluzione papain (20 U/mL papain e 0.005% DNase) e una soluzione di inibitore di albumin-ovomucoid (1 mg/mL ovomucoid inibitore, 1mg/mL albumin e 0.005% DNase) seguendo le istruzioni del produttore.
- Preparare 500 aliquote di ciascuno degli inibitori ovomucoidi e soluzioni papaine e conservare a -80 gradi centigradi. Scongelare le aliquote a 37 gradi centigradi immediatamente prima dell'uso.
5. Midbrain ventrale e dissezione del midollo spinale
NOT: Eseguire tutti i passaggi seguenti, ad eccezione dei passaggi 5.1.1,1,1 e 5.1.5.5.1.6 sotto uno stereomicroscopio di dissezione di fluorescenza. Il tempo totale di dissezione per esperimento è tipicamente di 3/5 h, a seconda della competenza della tecnica di dissezione e del numero di motoneuroni necessari per ogni esperimento.
- Dissezione cerebrale ventrale
- Eutanasia un topo incinta circa 11,5 giorni dopo la fecondazione da gas di biossido di carbonio e lussazione cervicale.
- Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero utilizzando forbici sterili microdissecting e pinze per medicazione del pollice. Lavare l'utero brevemente in PBS sterile, quindi trasferirlo sulla piastra di dissezione riempita con PBS sterile prefreddo.
- Rimuovere gli embrioni positivi di IslMN:GFPcon attenzione dall'utero utilizzando forbici sterili microdissecting, pinze per medicazione del pollice e pinzette #5 Dumont in PBS sterile ghiacciato sotto la luce brillante del microscopio. Utilizzando un cucchiaio sterile Moria mini-perforato, trasferire ogni embrione in un pozzo separato di un pozzo di 24 ben riempito con prechilled Hibernate-E low fluorescence medium integrato con 1x B27. Tenere il 24 ben piatto sul ghiaccio.
- Trasferire un embrione in una piastra sterile di dissezione e coprirlo completamente con la soluzione di sale bilanciato di Hank (HBSS) sterile a freddo ghiaccio (HBSS).
- Assicurarsi che i passaggi di dissezione siano eseguiti sotto l'illuminazione dell'isotociocinata fluoresceina (FITC) del microscopio. Utilizzando una pinzetta, rimuovere la coda e la faccia dell'embrione senza danneggiare il midbrain (Figura 2Ba). Posizionare l'embrione incline con arti a cavallo sotto e coda che puntano verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore (indicato da un asterisco, Figura 2Bb).
- Utilizzando una pinzetta, aprire il tetto del quarto ventricolo al fine di generare una piccola apertura. Utilizzare questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Dissezio lungo la superficie dorsale dell'embrione rostral alla corteccia e laterale alla piastra del pavimento e alla colonna motoria (Figura 2Ca,b). Aprire il tessuto sezionato in modo open-book per rivelare i nuclei CN3 e CN4 positivi alla GFP.
NOT: Un piccolo pezzo di tessuto dal midbrain ventrale contenente mesenchyme, CN3 e CN4 sarà ora esposto. - Separare con cura il midbrain ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo con una pinzetta e un coltello microdissecting. Dissezionare i nuclei bilaterali GFP-positivi CN3 e CN4 lontano dalla piastra del pavimento e altri tessuti circostanti GFP-negativi utilizzando pinzette e un coltello microdissecting (Figura 2D). Massimizzare il numero di neuroni motori GFP-positivi nel tessuto ascinato, ma evitare di toccarli o danneggiarli.
- Se si desidera una raccolta di nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo la linea mediana di questi due nuclei (linea tratteggiata gialla nella figura 2D). Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto midbrain ventrale sezionato con HBSS minimo e posizionarlo in un tubo di microcentrismo da 1,7 mL etichettato riempito con mezzo di dissezione (vedere il punto 4.1.5). Conservare sul ghiaccio fino alla dissociazione.
- Continuare a raggruppare i midbrain ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale soddisfa il requisito sperimentale (fare riferimento al passaggio 8 per il numero di cellule ideali).
NOT: Si raccomanda una raccolta di almeno 10 midbrain ventrali che producono circa 1 x 104 neuroni motori CN3/CN4 perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento.
- Dissezione del midollo spinale ventrale
- Mantenere l'embrione incline con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio, verso il dissettore. Tenere l'embrione con una coppia di pinzette e inserire la punta dell'altra coppia di pinzette nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo.
- Aprire il resto del cervello posteriore e del midollo spinale dorsalmente su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione. Aperto tagliando il tessuto dorsale, partendo dal quarto ventricolo e lavorando verso il canale centrale del midollo spinale caudale utilizzando le pinze come forbici (Figura 2Ca,b). Fare attenzione a evitare di toccare o danneggiare il midollo spinale ventrale durante questa procedura.
- Tenere l'embrione con un paio di pinzette e pizzicare il lembo del tessuto dorsale su ogni lato con l'altra coppia di pinzette (Figura 2Ea,b).
NOT: I tessuti dorsali eccitati contengono pelle dorsale, mesenchyme, gangli della radice dorsale (DRG), cervello posteriore dorsale e midollo spinale. Rimuovere la maggior parte di questi tessuti possibile senza danneggiare i nuclei SMN, perché sono adesivi e possono intrappolare le sregge durante il filtraggio o causare intasamento durante lo smistamento FACS. - Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello a microdissezione per forare direttamente sotto la SMN gFP-positiva. Sollevare il midollo spinale ventrale con movimenti sega-come su entrambi i lati(Figura 2Fa,b). Tagliare il midollo spinale ventrale galleggiante trasversalmente direttamente sopra C1, dove il primo corno anteriore GFP-positivo proietta (Figura 2G). Inoltre, tagliare trasversalmente al contorno superiore dell'arto inferiore (Figura 2G). Rimuovere la parte cervicale (C1)-lombare (L2-L3) del midollo spinale ventrale dopo questa procedura.
- Posizionare il lato dorsale del midollo spinale ventrale verso l'alto e tenere premuto premendo il tessuto negativo GFP tra le colonne SMN GFP-positive con una coppia di pinzette. Rimuovere il restante compostoda, DRG e midollo spinale dorsale tagliando entrambi i lati della colonna SMN GFP-positiva con il coltello a microdissezione (Figura 2H). Fare attenzione a massimizzare i motoneuroni GFP-positivi senza danneggiarli.
- Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere il tessuto del midollo spinale ventrale sezionato con HBSS minima e posizionare nel tubo di microcentrifuga da 1,7 mL con etichetta SMN, riempito con mezzo di dissezione. Conservare sul ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a raggruppare i midollo spinali ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale soddisfa i requisiti sperimentali.
NOT: La raccolta di almeno tre midollo spinale ventrale che producono circa 2,1 x 104 SMN è raccomandata perché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento. - Raccogliere i motoneuroni facciali e le estremità degli embrioni di topo IslMN:GFP come controlli positivi alla GFP e GFP-negativi per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Le estremità sono negative da GFP perché gli assoni negativi della GFP delle SBN non si sono ancora estesi fino alle estremità a questa età embrionale.
6. Dissociazione dei tessuti
NOT: Il tempo totale di dissociazione è in genere di 1,5 h per esperimento.
- La calda soluzione per papaina e inibizione dell'albumina-ovomucoide è a 37 gradi centigradi prima della dissociazione.
- Brevemente girare giù tessuti microdissected a bassa velocità.
- Utilizzando una pipetta P100, rimuovere con attenzione il maggior numero possibile di Hibernate E senza aspirare i tessuti.
NOT: Assicurarsi di rimuovere tutti i residui Hibernate E dopo questo passaggio per evitare di ridurre l'efficacia della dissociazione papaina nel passaggio successivo. - Aggiungere il volume appropriato della soluzione papaina (Tabella 1) a ciascuno dei tubi di microcentrifuga da 1,7 ml contenenti i campioni di tessuto microconcio.
NOT: Il volume appropriato di papaina per la dissociazione è stato determinato al fine di massimizzare la dissociazione efficace riducendo al minimo lo stress sulle cellule. - Triturare delicatamente 8x con una pipetta P200. Eseguire delicatamente tutti i passaggi di triturazione per preservare la vitalità del motoneurone.
- Incubare i tubi contenenti i tessuti per 30 minuti a 37 gradi centigradi, agitando con le dita segnando 10 volte ogni 10 minuti. triturare delicatamente ciascuna sospensione 8x con una pipetta P200 dopo l'incubazione. Girare verso il basso le cellule a 300 x g per 5 min.
- Per garantire l'efficacia dell'inibizione degli ovomucoidi nella fase successiva, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere e scartare il maggior numero possibile di supernatali senza aspirare i tessuti.
- Resuspend pellets nel volume appropriato della soluzione inibitore albumin-ovomucoid (Tabella 1) triturando delicatamente 8x con una pipetta P200.
- Attendere 2 min per consentire a eventuali pezzi rimanenti di tessuto non sociatto di depositarsi sul fondo del tubo.
- Raccogli il maggior numero possibile di supernatali senza aspirare tessuti non dissociati usando una pipetta P200. Trasferire il supernatante ai tubi di microcentrifuga freschi da 1,7 mL.
- Se alcuni pezzi di tessuto rimangono non divulgati dopo il passaggio 6.10, ripetere i passaggi 6.8-6.10 per i tessuti non dissociati che rimangono nei tubi originali di microcentrifuga da 1,7 mL per massimizzare la resa finale delle cellule dissociate riducendo al minimo lo stress sulle cellule dissociato in precedenza, contenuto nel sovrlente del passo 6.10.
- Ruotare le celle a 300 x g per 5 min. rimuovere e scartare con attenzione il supernatante utilizzando una pipetta P1000.
- Risospendere il pellet nel volume appropriato del supporto di dissezione (Tabella 1) tramite pipetta 8x utilizzando una pipetta P1000. Il volume appropriato della sospensione finale è stato determinato in modo che la densità cellulare non superi 107 celle/mL, che possono bloccare il flusso della macchina di citometria di flusso, ma anche in modo che le cellule non siano eccessivamente diluite, il che si traduce in una velocità di selezione rallentata.
- Filtrare le sospensioni attraverso ceppi cellulari da 70 m per eliminare eventuali grossi grumi o tessuti non digeriti. Trasferire le sospensioni in provette in polistirolo rotondo da 5 mL e conservarle sul ghiaccio fino a quando necessario.
7. Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)
NOT: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando una selezionatrice FACS dotata di un laser viola da 15 mw 405 nm, un laser blu da 100 mw 488 nm, un laser arancione da 75 mw da 594 nm e un laser rosso da 40 mw 640 nm. Le cellule sono state ordinate come liquido di fasiaglia in PBS sterile in condizioni asettiche attraverso un ugello di 100 m. Al fine di ridurre al minimo lo stress cellulare, la portata è stata impostata su una pressione del campione di 1/3, in modo che sia stato acquisito un massimo di 1.000-4.000 eventi al secondo. Il tempo totale faCS è in genere di 1 h per esperimento.
- Impostare le tensioni per la dispersione in avanti e laterale in modo che la popolazione cellulare possa essere visualizzata correttamente. L'impostazione di tensioni appropriate per lo smistamento delle celle è complessa e richiede un operatore FACS esperto.
- Per distinguere le diverse popolazioni di cellule, tracciare le celle in base alle dimensioni determinate dall'area di dispersione in avanti (FSC-A) rispetto alla complessità interna determinata dall'area di dispersione laterale (SSC-A). Disegnare un cancello intorno alle celle vive come indicato nella figura 3Aa e Figura Ba per escludere detriti e cellule morte. Raggruppare le celle all'interno della regione recintata come popolazione 1 (P1).
- Per escludere i ggdi e i doppi e i doppi e i doppi, tracciare le celle P1 successivamente in base alla larghezza di dispersione laterale (SSC-W) rispetto alla SSC-A. Cancellare la popolazione di singole celle come popolazione 2 (P2) (Figura 3Ab e Figura Bb).
- Tracciare le celle P2 in base alla larghezza della dispersione in avanti (FSC-W) rispetto all'FSC-A e a classificare la popolazione delle singole celle come popolazione 3 (P3)(Figura 3Ac e Figura Bc).
NOTA: l'uso di due gate consecutivi in 7.3 e 7.4 esclude i gruppi cellulari e i doppietti (alto FSC-W e alto FSC-A). - Celle Gate P3 basate su GFP contro allophycocyanin (APC). Il canale APC rileva l'autofluorescenza. Gating su questo canale evita di catturare celle autofluorescenti. Utilizzare celle negative GFP per regolare la tensione per i canali fluorescenti FITC/GFP. Idealmente, porte di posizione per queste popolazioni di cellule intorno a 102. Selezionare le soglie di gate per la popolazione GFP-positiva 4 (P4) singolarmente per ogni tipo di motoneurone(Figura 3Ad e Figura Bd).
NOT: Impostare il gate GFP molto più alto per le SM che per i CN3/CN4 per ottenere una cultura pura (Figura 3Ad e Figura Bd). Una porta GFP inferiore per le colture SMN porta alla contaminazione delle colture da parte di glia e neuroni non motori. Questo è probabile perché c'è espressione GFP di basso livello in alcuni valori glia e non-motore a causa di un promotore che perde. La percentuale di cellule GFP-positive rispetto alle celle totali è in genere 0,5,1,5% per CN3/CN4 e 1,5,2,5% per le smog. Se la dissezione ha avuto esito positivo, questi numeri possono essere utilizzati come punto di riferimento per determinare la posizione appropriata per il cancello gFP-positivo (Figura 3Ae e Figura Be). - Eseguire FACS in base al protocollo del produttore. Raccogliere le cellule P4 in tubi freschi di microcentrifuga da 1,7 mL riempiti con 500 - L di mezzo di coltura del motoneurone. Conservare sul ghiaccio fino a quando non placcatura.
NOT: Anche se le cellule possono essere ordinate direttamente nei pozzi, questo si traduce in un numero irregolare di cellule per bene. Ordinare le cellule in tubi di microcentrifuga da 1,75 mL e quindi piastrare manualmente per ottenere una distribuzione di placcatura più uniforme.
8. Cultura dei Motoneuroni primari purificati
- Diluire le sospensioni FACS-isolated CN3/CN4 e SMN con motore di coltura del motoneurone medio preriscaldato a 37 gradi centigradi a densità di 5 x 103 e 1 x 104 cellule/mL, rispettivamente.
NOT: Un embrione E11.5 produce circa 1 x 103 CN3/CN4 e 7 x 103 SMN. Tuttavia, questi rendimenti dipendono fortemente dalla purezza dei tessuti sezionati, dalla completezza della dissociazione cellulare e dall'appropriata soglia dei cancelli GFP durante la FACS. - Trasferire 96 piastre di pozzo prerivestite con PDL e laminina dall'incubatrice di coltura dei tessuti 37 gradi centigradi al cofano a flusso laminare e alla lamininina aspirata da ogni pozzo. Utilizzare piastre e coprilabbra immediatamente senza lavaggio.
- Aggiungere 200 l di sospensioni diluite CN3/CN4 e SMN in ogni pozzo di 96 lastre di pozzo rivestite in PDL/laminin. Densità di cellule finali devono essere 1 x 103 e 2 x 103 cellule / bene per CN3 / CN4 e SMN, rispettivamente.
NOT: La densità di placcatura iniziale delle SMN in 96 pozzetti (2 x 103 celle/pozzo) è doppia quella di CN3s/CN4s (1 x 103 cellule/pozzo) al fine di ottenere numeri di motoneuroni finali simili e densità a 2 e 9 giorni in vitro (DIV) (rispettivamente 4x6 x 102 x 10 x 102 celle). - Neuroni della coltura in un incubatore di 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
- Alimentare i neuroni ogni 5 giorni rimuovendo metà dei vecchi supporti (100 l) e sostituendo con lo stesso volume di mezzo di coltura del motoneurone fresco. Assicurarsi che i processi neuronali diventino visibili su 1 DIV e diventino più spessi e più lunghi di 14 DIV (Figura 4). I corpi cellulari neuronali si ingrandiscono e tendono ad aggregarsi nelle colture a lungo termine, in particolare per le sMN (Figura 4).
NOT: Eseguire tutte le modifiche medie e di soluzione lasciando metà del volume medio originale per evitare lo scollegamento delle celle coltivate. Questo include passaggi di fissazione e immunocitochimica (ICC). Se tutti i supporti vengono rimossi, indipendentemente dalla delicatezza della maggior parte delle cellule si staccheranno e vengono lavati via.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'obiettivo di questo protocollo era quello di purificare e coltura sia i CN3/CN4 primari a lungo termine che le SMN a lungo termine per consentire analisi comparative dei meccanismi alla base dei disturbi del motoneurone (vedere Figura 1 e Figura 2 per una panoramica).
Una volta che i neuroni sono stati isolati con successo e cresciuti in coltura, quasi puro primario CN3/CN4 e SMN culture sono stati ottenuti (Figura 5A,B) e mantenuto per almeno 14 DIV (Figura 4 e Figura 6). Le purità delle colture CN3/CN4 e SMN a 2 DIV sono state rispettivamente del 93,5 e del 2,2% e dell'86,7% e del 4,7% se valutate dalla ICC utilizzando il marcatore del motoneurone Islet1 e il marcatore neuronale TUJ1(Figura 5B). Tuttavia, queste elevate purità si basavano fortemente sull'età degli embrioni e sulla fissazione di soglie appropriate per i cancelli GFP durante laFACS( Figura 3 ). La dissezione degli embrioni a E10.5 è più difficile della dissezione a E11.5 a causa della maggiore morbidezza e dell'adesività dei tessuti, con conseguente diminuzione delle rese dei motoneuroni. Tuttavia, le purità degli E10.5 CN3/CN4 e SM4 erano paragonabili a quelle degli embrioni E11,5 (rispettivamente il 92,8% e l'82,2% a 2 DIV; dati ottenuti da un singolo esperimento). Le purità di CN3/CN4 e SMN sono diminuite drasticamente quando sono stati utilizzati embrioni E13.5, anche se sono state raccolte solo la popolazione più elevata di GFP positivi (20,7% e 7,4% a 2 DIV, rispettivamente; dati ottenuti da un singolo esperimento), probabilmente a causa dell'espressione della GFP nei neuroni non motori(Figura 7). Questa stessa tendenza si è mantenuta vera anche per le culture E12.5, anche se era molto meno drammatica. Pertanto, gli embrioni di E12.5 o più anziani sono inappropriati per l'uso nella purificazione dei motoneuroni utilizzando questo protocollo.
Colture di motoneurone puro sono preziosi per comprendere i modelli di crescita isolati, comportamenti, e vulnerabilità dei motoneuroni. Questo esempio dimostra come queste colture possono essere utilizzate per testare le risposte dei motoneuroni al trattamento chimico. Per determinare se i CN3/CN4 primari e le SM mostrano risposte differenziali ai refattori del reticolo endoplasmico (ER), le monocolture primarie di CN3/CN4 e SM sono state ottenute utilizzando questo protocollo e trattate con concentrazioni variabili di uno stressante ER, acido ciclopiazonico (CPA). I neuroni sono stati trattati con CPA (5, 10, 15, 20, 25 o 30 m) o con il controllo del veicolo (DMSO) a 2 DIV e fissati 3 giorni dopo per l'ICC per valutare i rapporti di sopravvivenza (Figura 8A). Il numero di neuroni vitali in ogni campione è stato contato e i rapporti di sopravvivenza sono stati calcolati come il numero di cellule vitali nei pozzi trattati con farmaci diviso per il numero di cellule vitali nei pozzi trattati con DMSO. Le monocolture CN3/CN4 erano significativamente più resistenti al trattamento della CPA (10-25 m) rispetto alle monocolture SMN(Figura 9 e Figura 8B)31.
In conclusione, questo protocollo consente la generazione di colture embrionali CN3/CN4 e SMN per topi primari altamente purificate che forniscono un sistema potente e affidabile per lo studio del comportamento neuronale.
Figura 1: Schema per la preparazione dei motoneuroni embrionali del topo. Lo schema illustra i passaggi coinvolti nell'isolamento e nella coltura dei motoneuroni embrionali del topo e il tempo approssimativo in ore o giorni per ogni fase. L'ordine della procedura di dissezione per CN3/CN4 e SMN è etichettato in sequenza da 1 a 4. Abbreviazioni: CN3/CN4 - neurone oculomotore/neurone trochleare; SMN - motoneurone spinale; FACS - ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza; h - ora; d - giorno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione del midbrain ventrale e della parte cervicale (C1)-lombare (L2-L3) del midollo spinale ventrale. (A) Vedute laterali(a)e dorsali (b) dei motoneuroni positivi alla GFP in un embrione di topo transgenico E11.5 IslMN:GFP sotto l'illuminazione dell'isotociocionamina fluorescena (FITC). Un intero embrione E11.5 di montaggio è stato preparato come descritto in precedenza32 al fine di rendere l'embrione trasparente. Successivamente, l'embrione è stato analizzato mediante etichettatura immunofluorescenza con colorazione anti-GFP (verde). Le immagini sono state catturate al microscopio confocale. Barre di scala : 200 m (vista laterale) e 400 m (vista dorsale). Abbreviazioni: S - superiore; I - inferiore; V - ventrale; D - dorsale. (B-H) I passaggi di dissezione evidenziati sulle immagini del midbrain ventrale E11.5 e dei tessuti del midollo spinale ventrale prese con una telecamera attrezzata sotto la luce intensa (Bb) o l'illuminazione FITC utilizzando uno stereomicroscopio a dissezione a fluorescenza. Barre di scala: 200 m (D) e 1 mm ( (B) (a) Rimozione del viso e della coda dell'embrione tagliando lungo le linee rosse. (b) Embrione posizionato per dissezione. Il posizionamento della parte anteriore del microscopio è indicato da un asterisco. (C) Taglio lungo la linea rossa continua per aprire il tetto del quarto ventricolo(a) vista laterale e(b)vista dorsale. Uso di questa apertura per tagliare lungo la superficie dell'embrione dorsale al cervello (traiettoria indicata da freccia rossa tratteggiata). Questo espone il tessuto contenente mesenchyme, CN3, e CN4, che può essere sollevato dal cranio. Per la dissezione SMN, l'inserimento di pinze nella stessa apertura tra il quarto ventricolo e il suo tetto, quindi il taglio verso il lato caudale dell'embrione (traiettoria indicata da freccia gialla tratteggiata). (D) Visione finale del midbrain ventrale contenente nuclei bilaterali di CN3 e CN4 positivi alla GFP. I bordi del tessuto sono evidenziati da un rettangolo rosso. Taglio lungo la linea tratteggiata gialla per raccogliere separatamente i nuclei CN3 e CN4, se lo si desidera. (E) Dopo aver aperto il resto del cervello posteriore e del midollo spinale, i tessuti dorsali sbattiti si sono staccati sopra le linee rosse su entrambi i lati con una pinzetta (a) prima e (b) dopo. (F) Rimozione bilaterale del ventre del tessuto in eccesso al midollo spinale lungo la linea rossa (a) prima e (b) dopo. (G) Taglio del midollo spinale ventrale nelle due posizioni indicate dalle linee rosse. Sul lato rostrale, taglio del midollo spinale ventrale galleggiante trasversalmente C1 dove il primo corno anteriore GFP-positivo proietta. Taglio dell'estremità caudale del midollo spinale trasversale al limite superiore dell'arto inferiore. Una volta che questi tagli sono fatti, la cervicale (C1) attraverso lombare (L2-L3) porzione del midollo spinale ventrale può essere sezionato via. (H) Vista finale del midollo spinale ventrale contenente colonne SMN pAPP positive per GFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ordina rappresentazioni ordinano i midbrain ventrali (A) e i midollo spinale ventrale (B). (Aa e Ba) In avanti l'area di dispersione (FSC-A) e l'area di dispersione laterale (SSC-A) ha ordinato il grafico prima dell'esclusione di detriti e cellule morte. (Ab, Bb, Ac, Bc) Grafici ordinati per l'esclusione di ciuffi di celle (b) e doppietto (c) in base rispettivamente a Width (SSC-W) e SSC-A e Forward Scatter Width (FSC-W) e FSC-A. (Ad e Bd) Grafici ordinati per isolare i motoneuroni positivi IslMN:GFP. Per ottenere una cultura pura, il gate GFP deve essere fissato su un valore superiore per le SMN (Bd) rispetto a CN3/CN4 (Ad). (Ae e Be) Percentuali di celle recintate per la raccolta da parte dello smistamento FACS. %Parent rappresenta la percentuale di celle nella popolazione gated corrente rispetto al numero di celle nella popolazione di cellule gated precedente, mentre %Totale rappresenta la percentuale di celle gated rispetto alle celle totali. Le percentuali previste di celle GFP-positive rispetto alle celle totali (boxed in rosso) sono pari allo 0,5-1,5% per CN3/CN4 e all'1,5-2,5% per la SMN. Se la dissezione è stata eseguita con successo, queste percentuali possono essere utilizzate come parametro di riferimento per impostare il cancello gFP-positivo in (Ad e Bd). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini a contrasto di fase delle monocolture primarie CN3/CN4 e SMN a 2, 7 e 14 DIV. Le immagini di contrasto delle interferenze differenziali rappresentative delle culture primarie CN3/CN4 e SMN sono state catturate a 2, 7 e 14 DIV con microscopio a fluorescenza invertita utilizzando il corrispondente software di acquisizione ed elaborazione delle immagini e gli obiettivi 40x. I processi neuronali sono diventati più spessi e più a lungo di 14 DIV. Le dimensioni del corpo cellulare neuronale si sono ingrandite e tendono ad aggregarsi nelle colture a lungo termine, in particolare per le sINistra. Entrambe le impostazioni cultura possono essere mantenute almeno 14 DIV. Barra della scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: caratterizzazioni delle impostazioni cultura E11.5 CN3/CN4 e SMN isolate. (A) Immagini immunocitochimiche rappresentative di E11.5 mouse CN3s/CN4s (superiore) e SMNs (bottom) coltivati per 2 DIV. Immunofluorescenza etichettatura con il marcatore neuronale TUJ1 (verde) e il neurone marcatore motore Islet1 (rosso) eseguita per analizzare neuroni e nuclei sono stati controlasciati con DAPI (blu). Quasi tutte le cellule coltivate erano neuroni motori (TUJ1,Islet1). Le immagini sono state catturate con un microscopio a fluorescenza invertita utilizzando il corrispondente software di acquisizione ed elaborazione delle immagini e 20 volte gli obiettivi. I campioni sono stati analizzati ed elaborati per ottenere la massima intensità del segnale senza pixel saturi. Tutto il lavoro microscopico e l'elaborazione delle immagini nelle seguenti figure sono stati eseguiti in queste condizioni, se non diversamente specificato. Barra di scala - 100 m. (B) Le purezze delle colture E11.5 mouse CN3/CN4 e SMN a 2 DIV. Le purità delle colture CN3/CN4 e SMN erano rispettivamente del 93,5 x il 2,2% e dell'86,7 x il 4,7%. I corpi delle cellule neuronali morte sono stati valutati mediante lo screening della morfologia nucleare piknotica e del gonfiore della membrana. I processi neuronali sono stati classificati come processi degeneranti quando sono stati osservati segni di perline e gonfiore. Le cellule che non hanno né la morte del corpo cellulare né processi degeneranti sono state considerate neuroni non motori vitali (TUJ1,Islet1-) o motoneuroni vitali (TUJ1,Islet1)33. Le purezze delle colture di motoneuroni sono state calcolate come il numero di neuroni motori vitali diviso per il numero totale di neuroni non motori vitali più motoneuroni vitali. I valori rappresentano la media : SEM di tre esperimenti separati. Non significativo (p > 0,05) dal test t di Student. Il conteggio delle cellule è stato eseguito manualmente sotto l'ingrandimento di 20 volte. Abbreviazioni: SEM - errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: immunocitochimica rappresentativa delle monocolture primarie CN3/CN4 e SMN a 2, 7 e 14 DIV. Le culture primarie CN3/CN4 e SMN sono state analizzate a 2, 7, 14 DIV mediante l'etichettatura dell'immunofluorescenza con TUJ1 (verde), e i nuclei sono stati controregistrati con DAPI (blu). I processi neuronali diventano più spessi e più lunghi di 14 DIV. Le dimensioni del corpo cellulare neuronale si sono ingrandite e tendono ad aggregarsi nelle colture a lungo termine, in particolare per le sINIs. Entrambe le culture CN3/CN4 e SMN possono essere mantenute almeno 14 IMMAGINI DIV. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: caratterizzazione delle impostazioni cultura isolate CN3/CN4 e SMN. E13.5 CN3/CN4 e SMN sono stati isolati e colti utilizzando questo protocollo e analizzati a 2 DIV da immunofluorescenza etichettatura con TUJ1 (verde) e Islet1 (rosso), ei nuclei sono stati controordinati con DAPI (blu). Molte cellule neuronali non motorie (TUJ1,Islet1-) erano presenti (frecce) con conseguente drastica diminuzione sia della purezza CN3/CN4 che di sminare, con la diminuzione più pronunciata nelle colture SMN. Le immagini sono state catturate sotto l'ingrandimento di 20 volte. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Applicazione rappresentativa della coltura dei motoneuroni primari dimostrando che i CN3/CN4 sono selettivamente resistenti allo stress ER indotto dalla CPA. (A) Schema sperimentale: le monocolture primarie CN3/CN4 e SMN sono state trattate con CPA o controllo del veicolo (DMSO) a 2 DIV e le vie cellulari sono state valutate attraverso l'analisi immunocitochimica dopo 3 giorni di trattamento. Questa struttura è stata modificata rispetto all'opera pubblicata31. (B) Quantificazione dei rapporti di sopravvivenza di CN3/CN4 e SM trattati con 5-30 CPA per 3 giorni da 2 DIV. I neuroni sono stati analizzati mediante l'etichettatura immunofluorescente delle cellule con TUJ1, e i nuclei sono stati controregistrati con DAPI. I rapporti di sopravvivenza sono stati calcolati come il numero di cellule vitali (vedi legenda 5B) nei pozzi trattati con farmaci diviso per il numero di cellule vitali nei pozzi contenenti solo veicolo (DMSO). Il conteggio delle cellule è stato eseguito manualmente sotto l'ingrandimento di 20 volte. I valori rappresentano la media : SEM di quattro esperimenti separati. < 0,05; p < 0.005 dal test t di Student. Questa cifra è stata modificata dal lavoro precedentemente pubblicato31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: immunocitochimica rappresentativa delle monocolture primarie CN3/CN4 e SMN dopo un'esposizione di 3 giorni a concentrazioni crescenti di CPA a partire da 2 DIV. I neuroni sono stati analizzati mediante l'etichettatura immunofluorescente delle cellule con TUJ1 (verde) e i nuclei sono stati controbilanciati con DAPI (blu). I CN3/CN4 primari erano più resistenti al trattamento della CPA rispetto alle SMN primarie. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero di midbrain (X) | Papaina | Albumina-ovomucoide | Hibernate E | |||||||||
| 10 x 20 USD | 200 l | 100 ll | 600 ll | |||||||||
| 20 < X 30 | 300 lL | 150 lL | 700 ll | |||||||||
| 30 < X 40 | 400 lL | 200 l | 800 ll | |||||||||
| Numero di midollo spinale (Y) | Papaina | Albumina-ovomucoide | Hibernate E | |||||||||
| 3 - Y s 5 | 200 l | 100 ll | 500 lL | |||||||||
| 5 < Y 10 | 400 lL | 200 l | 800 ll | |||||||||
| 10 < Y 15 | 600 ll | 300 lL | 1200 lL | |||||||||
Tabella 1: Volumi appropriati di papaina, albumina-ovomucoid e sospensione finale utilizzati nelle fasi di dissociazione. I volumi appropriati di papaina e albumina-ovomucoid da utilizzare con vari numeri di nanchino ventrale e tessuti del midollo spinale ventrale sono stati modificati dalle istruzioni del produttore dopo diversi cicli di ottimizzazione. Poiché i tessuti sono soggetti a stress durante la dissociazione e lo smistamento, si raccomanda una raccolta in pool di più di 10 midbrain ventrali e più di tre midollo spinale ventrale. Il volume della papaina è stato determinato considerando l'equilibrio tra una dissociazione effettiva e lo stress di questa procedura. Il volume della soluzione inibitore albumin-ovomuid è la metà di quello della papaina. Il volume appropriato della sospensione finale Hibernate E è stato determinato in modo tale che la densità cellulare non superi 107 celle / mL, ma le cellule non diventano eccessivamente diluite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storicamente, gli studi in vitro dei motoneuroni CN3 e/o CN4 si sono affidati a culture eterogenee come dissociate17,18,19,20,21, espiantare17,22,23,24,25,26e tagliare27,28 culture, perché queste cellule non possono essere distinte da cellule circostanti in base alle dimensioni, e marcatori specifici per queste cellule non sono stati segnalati. Il presente protocollo è un metodo completo per l'isolamento e la cultura dei murini CN3/CN4 primari e degli SMN dagli stessi embrioni e conferma l'elevata purezza delle culture. Generando colture SMN e CN3/CN4 pure dagli stessi embrioni di topo, il protocollo consente di confrontare in modo controllato i comportamenti in vitro di CN3/CN4 rispetto alle SMN isolate dal tipo selvaggio e dagli embrioni mutanti.
Le colture pure di CN3/CN4 e SMN generate da questo protocollo consentono studi comparativi delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche di questi motoneuroni. In teoria, poiché altre popolazioni di motoneuroni cranici possono essere visualizzate ed analizzate da questa linea di topi transgenici IslMN:GFP (inclusi abducens, motori trigeminali, viso e ipoglossal), questo protocollo potrebbe essere ampliato anche per il loro isolamento e cultura, a condizione che le porte FACS GFP siano regolate in modo appropriato. Infine, i motoneuroni ordinati in FACS derivati da questo protocollo possono essere sottoposti a genomica (ad esempio, Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, or ATAC-seq) e/o trascrittomica (ad esempio, RNA sequence31) analizza per studiare lo sviluppo normale e la vulnerabilità selettiva di specifici sottotipi di neuroni motori nei disturbi neurogenerativi31.
Ci sono più passaggi in questo protocollo che sono fondamentali per massimizzare il numero di puro, neuroni motori sani nel sistema di coltura isolata. Durante la dissezione, i tessuti GFP-negativi (ad esempio, mesenchyme e DRG) devono essere rimossi al massimo senza danneggiare i motoneuroni, perché questi tessuti sono adesivi e possono intrappolare i smalto durante il filtraggio o causare intasamento durante lo smistamento FACS. Durante la dissociazione dei tessuti, deve essere utilizzato il volume essenziale minimo di papaina e le cellule devono essere trattate delicatamente con una triturazione minima ma sufficiente. Papain è stato utilizzato per la fase di dissociazione dei tessuti in questo protocollo, perché i dati preliminari hanno indicato che è meno distruttivo della trypsin sia per CN3/CN4 che per SMN. I rapporti di sopravvivenza basati su numeri placcati di CN3/CN4 e SM4 a 2 DIV sono aumentati dal 39,5% al 52,7% e rispettivamente dal 52,3% al 58,4% quando veniva utilizzato il papain al posto della trypsin (0,25%, 4 min incubation). Sebbene questi numeri derivino da un singolo esperimento eseguito prima dell'ottimizzazione completa, ulteriori rapporti suggeriscono anche che la trypsin non è ottimale per l'estrazione cellulare dai tessuti del sistema nervoso12,34,35,36. Durante la FACS, non devono essere utilizzati coloranti vitali fluorescenti (iodio di propidio e calcein blu) e piccoli ugelli di smistamento (ad es., 70 m) perché sono deleteri per la sopravvivenza del neurone motorio. Si raccomanda molto l'uso di ugelli di smistamento di grandi dimensioni (100 m o più) perché la morte delle cellule SMN aumenta in modo significativo quando si utilizza un ugello di 70 m. Impostare le soglie di gating appropriate per le celle gFP-positive in FACS è un passo critico per ottenere colture pure. Le colture di motoneuroni sono integrate con forskolin, IBMX e fattori di crescita (BDNF, CNTF e GDNF). Forskolin e IBMX sono stati segnalati per promuovere additivamente la sopravvivenza SMN37,38. I dati preliminari degli attuali studi suggeriscono che anche il forskolin e IBMX aumentano in modo additivo la sopravvivenza di CN3/CN4. Il rapporto di sopravvivenza basato su numeri placcati di CN3/CN4 a 2 DIV è aumentato dal 17,5% al 26,9%, 31,9% e 37,0% quando sono stati aggiunti rispettivamente IBMX, forskolin, e IBMX forskolin (i numeri si basano su un singolo esperimento eseguito prima dell'ottimizzazione completa delle condizioni di coltura cellulare). È meglio eseguire tutte le modifiche medie e gli fusi delle cellule coltivate lasciando metà del volume originale per evitare di scollegare le cellule coltivate. Infine, è anche ideale per ridurre il tempo trascorso tra la dissezione e la placcatura dei motoneuroni (ad esempio, riducendo il tempo di dissezione utilizzando più dissettori) per migliorare la vitalità delle culture.
Ci sono quattro grandi problemi potenziali che possono sorgere quando si segue questo protocollo. Il primo è basso rendimento dei motoneuroni dopo FACS. Le possibili cause di rese basse includono l'uso di embrioni giovani (ad es. E10.5), che hanno meno motoneuroni, rimozione insufficiente dei tessuti adeso negativi GFP durante la dissezione (ad esempio, mesenchime e DRG), che possono intrappolare i motoneuroni e portare alla loro rimozione durante la filtrazione, a non una disinsufficiente papainizzazione / triturazione durante la dissociazione e/o impostare il cancello GFP-positivo troppo alto durante la FACS. Il secondo potenziale problema è la bassa purezza delle colture di motoneuroni, che molto probabilmente deriva dall'uso di embrioni più vecchi (ad esempio, E12.5) e/o dall'impostazione troppo bassa della porta gFP-positiva durante la FACS. In terzo luogo, un basso numero di motoneuroni collegati in coltura può essere osservato a causa di smistamento FACS inappropriato e/o rivestimento inadeguato PDL/lamininin di piastre /coverslips. In quarto luogo, i motoneuroni possono mostrare una bassa vitalità nella cultura. Le potenziali cause di bassa vitalità includono dissezione ruvida e/o prolungata, eccessiva papainizzazione/triturazione durante la dissociazione, gestione inappropriata delle cellule durante tutto il protocollo (ad esempio, tubi ruvidi delle cellule, mancato posizionamento delle cellule sul ghiaccio, mancato rispetto della PBS pre-raffreddamento e HBSS) e/o tempo eccessivo tra l'eutanasia dei topi in gravidanza e la placcatura finale delle cellule. L'uso di reagenti che non sono concentrazioni fresche e/o inappropriate può anche compromettere i risultati sperimentali.
Questo protocollo è costituito da tre limitazioni principali. I topi transgenici IslMN:GFP e lo smistamento FACS sono entrambi piuttosto costosi. Essi sono, tuttavia, cruciali per questo protocollo in quanto attualmente non esiste un metodo alternativo in grado di generare CN3/CN4 altamente purificati in modo più economico. C'è una piccola finestra di età E10.5-E12.5 per i topi embrionali, ed è difficile confermare che sono presenti embrioni opportunamente invecchiati, soprattutto se non è disponibile una macchina ad ultrasuoni. Se sono necessarie solo SM puri, possono essere derivate da embrioni di topo E12.5-15.0 utilizzando metodi quali la centrifugazione del gradiente10,11,12 e/o p75NTR-anticorpale-based soluzioni di panning di smistamento delle cellule13,14,15,16. Infine, i saggi basati sulle proteine che richiedono una grande quantità di materiale di partenza non sono fattibili da queste colture a causa della piccola resa dei motoneuroni (soprattutto CN3/CN4). I motoneuroni derivati dalle cellule staminali31,39, che possono essere generati senza limiti, potrebbero in teoria essere sostituiti con questo scopo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) per l'istruzione nelle tecniche di dissezione SMN; il Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, il Centro di Citometry di flusso della divisione immunologia della Harvard Medical School, il Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e il Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility per l'isolamento FACS dei motovini primari; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membri del laboratorio Engle aggiuntivi e membri del consorzio Project ALS per assistenza tecnica e discussione ponderata. Questo studio è stato sostenuto dal Progetto SLA. Inoltre, R.F. è stato finanziato dalla Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad e dalla NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. è stato supportato dal programma di formazione NIH/NEI nelle basi molecolari delle malattie oculari (5T32EY007145-16) attraverso lo Schepens Eye Research Institute e lo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) attraverso il Boston Children's Hospital; M.C.W è stato supportato da NEI (5K08EY027850) e Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e E.C.E. è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
