Summary
Dette arbeidet presenterer en protokoll for å gi homogene cellekulturer av primære nervus, trochlear, og spinal motor neurons. Disse kulturene kan brukes til sammenlignende analyser av morfologiske, cellulære, molekylære, og elektrofysiologisk karakteristikker av øye og spinal motor neurons.
Abstract
Nervus neurons (CN3s) og trochlear neurons (CN4s) viser bemerkelsesverdig motstand mot degenerative motoriske Nevron sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) sammenlignet med spinal motor neurons (SMNs). Evnen til å isolere og kultur primær mus CN3s, CN4s og SMNs ville gi en tilnærming til studie mekanismer underliggende denne selektive sårbarheten. Til dags dato bruker de fleste protokollene heterogene cellekulturer, som kan forvirre tolkningen av eksperimentelle utfall. For å minimere problemene knyttet til blandet celle populasjoner, rene kulturer er uunnværlig. Her, den første protokollen beskriver i detalj hvordan du effektivt renser og dyrke CN3s/CN4s sammen SMNs kolleger fra samme embryo bruker embryonale dagen 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene Mouse embryo. Protokollen gir detaljer om vevet disseksjon og dissosiasjon, FACS-baserte celle isolasjon, og in vitro dyrking av celler fra CN3/CN4 og SMN kjerner. Denne protokollen legger til en roman in vitro CN3/CN4 kultur system til eksisterende protokoller og samtidig gir en ren Art-og alder-matchet SMN kultur for sammenligning. Analyser som fokuserer på morfologiske, cellulære, molekylære og elektrofysiologisk karakteristikker av motor neurons er gjennomførbart i dette kultur systemet. Denne protokollen vil gjøre forskning i mekanismer som definerer motorisk nerve utvikling, selektiv sårbarhet, og sykdom.
Introduction
Kulturen i primær motor neurons er et kraftig verktøy som gjør det mulig å studere neuronal utvikling, funksjon, og mottakelighet for eksogene stressfaktorer. Motoriske Nevron kulturer er spesielt nyttig for studiet av nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)1,2, hvis sykdom mekanismer er ufullstendig forstått. Interessant, til tross for betydelig celle død spinal motor neurons (SMNs) i både ALS pasienter og ALS modell mus, celle død i nervus neurons (CN3s) og trochlear neurons (CN4s) er relativt knappe1,3,4,5,6,7,8,9. Derfor, komparative analyser av rene kulturer av CN3s/CN4s og SMNs kan gi viktige ledetråder om mekanismer underliggende relative sårbarhet. Dessverre har en stor barriere mot slike analyser vært manglende evne til å vokse renset kulturer av disse motor neurons.
Mange protokoller har blitt beskrevet for rensing av SMNs fra dyremodeller. De fleste av disse protokollene bruker tetthet gradientsentrifugering 10,11,12 og/eller p75ntR-antistoff-basert celle-sortering panorering teknikker13,14,15,16. Density gradient sentrifugering utnytter den større størrelsen på SMNs i forhold til andre spinal celler, mens p75ntR er et ekstracellulære protein uttrykt utelukkende av SMNs i ryggmargen. Nesten 100% ren SMN kulturer har blitt generert av en eller begge av disse protokollene11,12,14. Imidlertid har disse protokollene ikke lykkes i å generere CN3/CN4 kulturer fordi CN3s/CN4s ikke uttrykke p75ntR, og andre spesifikke CN3/CN4 markører har ikke blitt identifisert. De er også mindre enn SMNs, og derfor vanskeligere å isolere basert på størrelse. I stedet har in vitro studier av CN3s eller CN4s stolt på dissosiert17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, og Slice27,28 kulturer, som er sammensatt av heterogene celletyper, og ingen protokoller har eksistert i isolasjon og kultur av primære CN3s eller CN4s.
Her er en protokoll beskrevet for visualisering, isolering, rensing, og dyrking av CN3s, CN4s, og SMNs fra samme embryonale dagen 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene mus29 (figur 1, figur 2a). ISLMN: GFP spesielt etiketter motor NEURONS med en farnesylated GFP som lokaliseres til cellemembranen. Denne protokollen muliggjør arter-og alder-matchet sammenligning av flere typer motor neurons for å belyse patologiske mekanismer i motorisk Nevron sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter utnytte forsøksdyr ble utført i samsvar med NIH retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr og med godkjenning av Animal Care og bruk Committee of Boston Children ' s Hospital.
1. sette opp tidsbestemt siamesere før disseksjon
- For å generere prenatal embryonale mus for motorisk Nevron Harvest, veie hver kvinnelige mus og sette opp tidsbestemt paring mellom voksne ISLMN: GFP transgene mus 11,5 dager før dagen av Nevron isolasjon. For det formål å utvikle denne protokollen, 129S1/C57BL/6J ISLMN: GFP mus, alderen 2 − 9 måneder, ble brukt og tidsbestemt mating ble satt opp på kvelden.
- Undersøk kvinnelige mus for vaginale plugger neste morgen. Vurder datoen pluggen er identifisert som embryonale dagen (E) 0,5.
- Veie kvinnelige mus og undersøke for valper ved hjelp av ultralyd (se tabell over materialer) mellom e 8.5 − 11. Sjekk for tegn på vellykket mating.
- Bekreft vellykket paring ved å oppdage vektøkning hos kvinnelige mus (vanligvis > 1.5 g på E 9.5 hvis det er mer enn 5 − 6 embryo).
- Visuelt bekrefte embryo under ultralyd. Embryo er lett synlig ved ultralyd etter E 9.5. Ultrasounds er utført bare på kvinner som har fått vekt fordi de er oftere gravide enn de som ikke gjør det.
Merk: Kvinnelige mus kan få vekt på andre grunner enn graviditet, så vektøkning alene er ikke en pålitelig indikator på graviditet. Ultralyd bekreftelse hindrer unødvendig offer av kvinner som ikke er gravide, men er ikke avgjørende hvis utilgjengelig.
2. disseksjon betingelser og utarbeidelse av instrumenter
- Utfør alle belegg (unntatt syre-rensing av coverslips), Media forberedelse, vev dissosiasjon (unntatt sentrifugering og inkubasjons), og kulturarbeid i en laminær Flow hette for å sikre sterilitet av media og embryonale motoriske neurons.
- Med nøye fokus på steril teknikk, Utfør vev disseksjon utenfor en laminær med minimal risiko for forurensning.
- Sterilisere en disseksjon tallerken, ett par microdissecting saks, ett par tommelen dressing tang, to par Dumont #5 pinsett, en microdissecting kniv, og en Moria mini perforert skje ved å fordype i 70% etanol før bruk.
3. PDL/Laminin coating av retter/Coverslips
Merk: Kultur dissosiert primære motor neurons i 96 brønn eller 24 brønn plater, avhengig av antall celler som kreves for søknaden. Celler kan bli avbildet direkte i vevet kultur plate uten bruk av coverslips hvis brønnene er optisk gjennomsiktig og tykkelser er kompatible med bildebehandling.
- For programmer som krever coverslips, forberede syre-renset, sterilisert, og luft-tørket coverslips minst 2 dager før Nevron isolasjon som tidligere beskrevet30. Batcher av coverslips kan tilberedes på denne måten i god tid før eksperimenter og kan lagres opp til 6 måneder uten innvirkning på eksperimentell kvalitet.
- Forbered en fungerende løsning på 20 μg/mL Poly D-lysin (PDL) i fosfat bufret saltvann (PBS) 2 dager før Nevron isolasjon.
- Alikvot PDL (1 mg/mL) på forhånd og oppbevares ved-20 ° c som lagerløsning.
- Dekk til overflaten på hver dekkglass eller brønnen på vevs kultur platen med nok en PDL løsning (f.eks. 100 μL per brønn på 96 brønn plater eller 500 μL per brønn på 24 brønn plater med eller uten coverslips). Ruge over natten ved 37 ° c.
- Neste dag vaskes 3x med sterilisert vann.
- Forsegle platene med para fin film og oppbevar de vasket PDL-belagte platene ved 4 ° c i inntil 1 måned hvis de tørkes helt etter siste vask.
- Klargjør en arbeids løsning med 10 μL laminin (1,1 − 1,2 mg/mL) i 1,2 mL av PBS.
- Alikvot laminin aksjer (1,1 − 1,2 mg/mL) på forhånd og oppbevares ved-80 ° c.
- Dekk overflaten av hver dekkglass eller godt med nok laminin løsning for å jevnt pels overflaten. Ruge i minst 2 timer ved 37 ° c før bruk.
Merk: PDL/laminin-belagte plater og coverslips kan oppbevares opp til 1 uke ved 37 ° c, men nylig belagt laminin foretrekkes. Fjern laminin rett før plating30. Laminin skal ikke tørke ut. Hvis platene skal lagres i mer enn flere timer, bør de være innpakket i para fin film.
4. utarbeidelse av disseksjon, motor Nevron kultur Media, og dissosiasjon Solutions
Merk: Konsentrasjoner i parentes indikerer den endelige konsentrasjonen av hver reagens.
- Forbered disseksjon medium.
- Tin det varme inaktive heste serum over natten ved 4 ° c, Klargjør 1 mL alikvoter og oppbevar ved-20 ° c. Tin alikvoter ved RT direkte før bruk.
- Oppbevar B27-tillegg (50x) i 1 mL alikvoter ved-20 ° c. Tin alikvoter ved RT umiddelbart før bruk. Unngå å fryse/tine sykluser.
- Oppbevar glutamin supplement (100) ved 4 ° c eller-20 ° c. Del inn i 0,5 mL alikvoter ved lagring ved-20 ° c.
- Oppbevar penicillin-Streptomycin (10 000 U/mL) i 1 mL alikvoter ved-20 ° c. Tin alikvoter ved RT umiddelbart før bruk.
- For å gjøre det disseksjon mediet, bland 9,4 mL av Hibernate E med 200 μL av heste serum (2%), 200 μL av 50x B27 supplement (1x), 100 μL av 100 x glutamin (1x) (for eksempel GlutaMAX) og 100 μL av 10 000 U/mL penicillin-Streptomycin (100 U/mL). Bruk dette mediet for å samle dissekert vev og gjøre den endelige suspensjon av dissosiert celler.
- Tilsett 500 μL av disseksjon medium til individuelle 1,7 mL mikrosentrifugen rør for vevet samlingen dagen før Nevron isolasjon. Forbered ett rør for hver vevs type som skal samles inn (for eksempel positiv kontroll, negativ kontroll, CN3/CN4, SMN) og oppbevares ved 4 ° c før bruk.
- Kombiner 49 mL av Hibernate E lav fluorescens medier med 1 mL B27 supplement (1x) og fyll en 24 brønn plate med dette mediet (2 mL/Well) dagen før Nevron isolasjon. Bruk denne parabolen for å samle mus embryo. Oppbevares ved 4 ° c før bruk.
- Forbered motoren Nevron kultur medium.
- Forbered 250 μL alikvoter på 25 mM 2-mercaptoethanol i Leibovitz ' s L15 medium. Oppbevares ved-20 ° c.
- Generer 5 μL alikvoter av 100 mikrogram/mL løsninger av BDNF, CNTF og GDNF fortynnet i sterilisert vann. Oppbevares ved-80 ° c og tine alikvoter ved RT umiddelbart før bruk.
- Forbered 10 mM Forskolin løsning ved å tilsette 64 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) til 5 mg (1,0670 μM) av Forskolin og Vortex godt for å oppløse helt. Deretter legger sterilisert vann (1,003 mL) til DMSO-løsningen og Vortex godt. Oppbevar 12 μL alikvoter på 10 mM Forskolin ved-20 ° c og Tin alikvoter ved RT umiddelbart før bruk.
- Forbered 12 μL alikvoter på 100 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) fortynnet i DMSO. Oppbevares ved-20 ° c og tine alikvoter ved RT umiddelbart før bruk.
- For å gjøre motoren Nevron kultur medium, bland 9,4 mL neurobasal medium med 200 μL av heste serum (2%), 200 μL av 50x B27 tillegg (1x), 100 μL av 100 x glutamin (1x), 100 μL av 10 000 U/m: penicillin-Streptomycin (100 U/mL) og 20 μL av 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), fortrinnsvis direkte før bruk. Dette trinnet kan utføres opptil 1 dag før Nevron isolasjon.
- Like før bruk, tilsett 1 μL hver av 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), og GDNF (10 ng/mL) og 10 μL av 10 mM Forskolin (10 μM), og 10 μL av 100 mM IBMX (100 μM) til motor Nevron kultur medium. Prewarm medium til 37 ° c.
- Klargjør dissosiasjon løsninger.
- Klargjør Papain løsningen (20 U/mL Papain og 0,005% DNase) og en albumin-ovomucoid inhibitor løsning (1 mg/mL ovomucoid inhibitor, 1mg/mL albumin, og 0,005% DNase) etter produsentens instruksjoner.
- Klargjør 500 μL alikvoter for hver av ovomucoid hemmere og Papain løsninger og lagre ved-80 ° c. Tin alikvoter ved 37 ° c umiddelbart før bruk.
5. ventrale mellomhjernen og spinal Cord disseksjon
Merk: Utfør alle de følgende trinnene unntatt trinn 5.1.1 − 5.1.3 og 5.1.5 − 5.1.6 under en fluorescens disseksjon stereomikroskopet. Total disseksjon tid per eksperiment er vanligvis 3 − 5 timer, avhengig av dyktighet ved disseksjon teknikk og antall motoriske neurons som kreves for hvert eksperiment.
- Ventrale mellomhjernen disseksjon
- Euthanize en gravid mus ca 11,5 dager postfertilization av karbondioksid gass og cervical forvridning.
- Spray magen grundig med etanol og fjerne livmoren ved hjelp av sterile microdissecting saks og tommelen dressing tang. Vask livmoren kort i steril PBS, deretter overføre til disseksjon plate fylt med prechilled sterile PBS.
- Fjern ISLMN: GFP-positive embryo nøye fra livmoren ved hjelp av sterile microdissecting saks, tommel dressing tang, og Dumont #5 PINSETT i iskaldt sterilt PBS under sterkt lys av mikroskopet. Ved hjelp av en steril Moria mini-perforert skje, overføre hvert embryo til en separat brønn av en 24 brønn plate fylt med prechilled Hibernate-E lav fluorescens medium supplert med 1x B27. Hold 24 brønn plate på isen.
- Overfør ett embryo til en steril disseksjon plate og dekk det helt med iskald steril Hank ' s balansert saltløsning (HBSS).
- Sørg for at de disseksjon trinnene utføres under fluorescein isothiocyanate (FITC)-belysning av mikroskopet. Ved hjelp av pinsett, fjerne halen og ansiktet til fosteret uten å skade mellomhjernen (figur 2ba). Plasser embryo utsatt med lemmer straddled under og halen peker mot fronten av mikroskopet, mot dissector (indikert med en stjerne, figur 2bb).
- Ved hjelp av pinsett, slit åpne taket av fjerde ventrikkel for å generere en liten åpning. Bruk denne åpningen til kroken pinsett inn i rommet opprettet mellom fjerde ventrikkel og taket. Analysere langs rygg flaten av embryo rostral til cortex og lateral til gulvet plate og motor kolonne (figur 2ca, b). Åpne dissekert vev i en åpen bok måte å avdekke GFP-positive CN3 og CN4 kjerner.
Merk: Et lite stykke vev fra ventrale mellomhjernen inneholder mesenchyme, CN3, og CN4 vil nå bli eksponert. - Forsiktig skille ventrale mellomhjernen fra embryo og fjerne meningeal vev ved hjelp av pinsett og en microdissecting kniv. Analysere de bilaterale GFP-positive CN3 og CN4 kjerner bort fra gulvet plate og andre GFP-negative omkringliggende vev ved hjelp av pinsett og en microdissecting kniv (figur 2D). Maksimer antall GFP-positive motor neurons i excised vev, men unngå å berøre eller skade dem.
- Hvis en samling av separate CN3 og CN4 kjerner er ønsket, Skjær langs midtlinjen av disse to kjerner (gul stiplet linje i figur 2D). Ved hjelp av en P1000 pipette, samle dissekert ventrale mellomhjernen vev med minimal HBSS og plassere den i en merket 1,7 mL mikrosentrifugen tube fylt med disseksjon medium (se trinn 4.1.5). Oppbevares på is til dissosiasjon.
- Fortsett pooling ventrale midbrains fra ytterligere embryo i samme rør til det totale antallet oppfyller eksperimentelle kravet (se trinn 8 for ideelle celle tall).
Merk: En gruppert samling av minst 10 ventrale midbrains gir ca 1 x 104 CN3/CN4 motor neurons anbefales fordi vev er utsatt for stress under dissosiasjon og sortering.
- Ventrale ryggmarg disseksjon
- Hold fosteret utsatt med hodet vendt mot fronten av mikroskopet, mot dissector. Hold fosteret med ett par pinsett og sett tuppen av det andre paret med pinsett inn i uåpnet caudal del av fjerde ventrikkel.
- Åpne resten av hindbrain og ryggmargen dorsalt over hele rostrocaudal omfanget av fosteret. Åpne ved å skjære rygg vev, starter fra fjerde ventrikkel og arbeider mot den sentrale kanalen i caudal ryggmargen ved hjelp av pinsett som saks (figur 2ca, b). Pass på å unngå å berøre eller skade ventrale ryggmarg under denne prosedyren.
- Hold fosteret med ett par pinsett og klem av klaffen på rygg vevet på hver side med det andre paret med pinsett (figur 2EA, b).
Merk: Excised rygg vev inneholder rygg-hud, mesenchyme, rygg rot ganglia (DRGs), rygg hindbrain og ryggmarg. Fjern så mye av disse vev som mulig uten å skade SMN kjerner, fordi de er lim og kan felle SMNs under filtrering eller forårsake tilstopping under FACS sortering. - Fjern ventrale ryggmargen ved hjelp av microdissection kniven til å Pierce rett under GFP-positive SMN. Løft ventrale ryggmargen med sag-lignende bevegelser på begge sider (figur 2FA, b). Skjær den flytende ventrale ryggmargen tvers rett over C1, hvor de første GFP-positive fremre horn prosjekter (figur 2G). Også kuttet tvers på den øvre grensen av nedre lem (figur 2G). Fjern cervical (C1)-korsrygg (L2-L3) del av ventrale ryggmargen etter denne prosedyren.
- Plasser den ventrale ryggmargen midt på siden opp og hold ved å trykke på det GFP-negative vevet mellom de GFP-positive SMN-kolonnene med ett par pinsett. Fjern de resterende vedlagte mesenchyme, DRGs og ryggmargen ved å trimme begge sider av den GFP-positive SMN-kolonnen med microdissection kniven (figur 2H). Pass på å maksimere GFP-positive motor neurons uten å skade dem.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, samle dissekert ventrale ryggmargen vev med minimal HBSS og plass i SMN-merket 1,7 mL mikrosentrifugen tube fylt med disseksjon medium. Oppbevares på is til dissosiasjon. Fortsett pooling ventrale spinal ledninger fra ytterligere embryo i samme rør til det totale antallet oppfyller de eksperimentelle kravene.
Merk: Samle minst tre ventrale rygg snorer gir ca 2,1 x 104 SMN anbefales fordi vev er utsatt for stress under dissosiasjon og sortering. - Samle ansikts motor neurons og ekstremiteter av ISLMN: GFP Mouse embryo som GFP-positive og GFP-negative kontroller for FLUORESCENS celle sortering (FACS), henholdsvis. Ekstremiteter er GFP-negativ fordi GFP-positive axons av SMNs har ennå ikke utvidet i ekstremiteter på denne embryonale alder.
sjette tissue dissosiasjon
Merk: Total dissosiasjon tid er vanligvis 1,5 t per eksperiment.
- Varm Papain og albumin-ovomucoid inhibitor løsning alikvoter til 37 ° c 30 min før dissosiasjon.
- Snurr kort ned microdissected vev med lav hastighet.
- Ved hjelp av en P100 pipette, forsiktig fjerne så mye Hibernate E som mulig uten aspirating vev.
Merk: Pass på å fjerne alle gjenværende Hibernate E etter dette trinnet for å unngå å redusere effekten av Papain dissosiasjon i neste trinn. - Legg riktig volum av Papain oppløsning (tabell 1) til hver av 1,7 ml mikrosentrifugen rør som inneholder microdissected vevsprøver.
Merk: Det aktuelle volumet av Papain for dissosiasjon ble bestemt for å maksimere den effektive dissosiasjon samtidig som belastningen på cellene minimeres. - Forsiktig triturate 8x med en P200 pipette. Utfør alle trituration skritt forsiktig for å bevare motorisk Nevron levedyktighet.
- Ruge rørene som inneholder vevet i 30 min ved 37 ° c, agitating med fingeren som blar 10x hver 10 min. forsiktig triturate hver suspensjon 8x med en P200 pipette etter inkubasjons. Snurr ned cellene ved 300 x g i 5 min.
- For å sikre effekten av ovomucoid hemming i neste trinn, bruk en P1000 pipette å fjerne og forkaste så mye supernatanten som mulig uten aspirating vev.
- Resuspend pellets i riktig volum av albumin-ovomucoid inhibitor løsning (tabell 1) ved forsiktig triturating 8x med en P200 pipette.
- Vent i 2 min for å tillate eventuelle gjenværende stykker av undissociated vev å bosette til bunnen av røret.
- Samle så mye supernatanten som mulig uten aspirating undissociated vev ved hjelp av en P200 pipette. Overfør supernatanten til friske 1,7 mL mikrosentrifugen rør.
- Hvis noen biter av vev fortsatt undissociated etter trinn 6,10, gjentar trinn 6.8 − 6.10 for undissociated vev som forblir i den opprinnelige 1,7 mL mikrosentrifugen rør for å maksimere den endelige avkastningen av dissosiert celler samtidig minimere stress på cellene dissosiert tidligere, inneholdt i supernatanten av trinn 6,10.
- Snurr ned cellene ved 300 x g i 5 min. Fjern forsiktig og kast supernatanten ved hjelp av en P1000 pipette.
- Resuspend pellet i riktig volum av disseksjon medium (tabell 1) ved pipettering 8x ved hjelp av en P1000 pipette. Det aktuelle volumet av endelig suspensjon ble bestemt slik at celle tetthet ikke overstiger 107 celler/ml, som kan blokkere strømmen av strømnings flowcytometri maskinen, men også slik at cellene ikke er overdrevet fortynnet, noe som resulterer i en redusert sorterings hastighet.
- Filtrer suspensjoner gjennom 70 μm celle siler for å eliminere store klumper eller ufordøyd vev. Overfør suspensjoner i 5 mL rund bunn polystyren test rør og lagre på isen til nødvendig.
7. fluorescens-aktivert Cell sortering (FACS)
Merk: Denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av en FACS Sorter utstyrt med en 15 MW 405 NM fiolett laser, en 100 MW 488 NM blå laser, en 75 MW 594 NM oransje laser, og en 40 MW 640 NM rød laser. Celler ble sortert som skjede væske i steril PBS under aseptisk forhold gjennom et 100 μm munnstykke. For å minimere celle stress ble strømningshastigheten satt til et prøve Trykk på 1 − 3, slik at maksimalt 1000 − 4000 hendelser per sekund ble anskaffet. Total FACS-tid er vanligvis 1 − 2 timer per eksperiment.
- Sett opp spenninger for forover og side scatter, slik at cellen befolkningen kan bli visualisere riktig. Å sette opp egnede spenninger for celle sortering er kompleks og krever en erfaren FACS-operator.
- Hvis du vil skille mellom forskjellige celle populasjoner, tegner du celler basert på størrelse, slik det er bestemt av det fremre Spredningsområdet (FSC-A) kontra intern kompleksitet, som bestemt av side Spredningsområdet (SSC-A). Tegn en port rundt levende celler som indikert i Figur 3AA og figur ba å utelukke rusk og døde celler. Grupper cellene innenfor gated region som populasjon 1 (P1).
- Hvis du vil utelate celle klumper og doublets, tegner du P1-celler neste basert på side sprednings bredden (SSC-W) kontra SSC-A. Gate befolkningen i enkeltceller som befolkning 2 (P2) (Figur 3AB og figur bb).
- Plot P2 celler basert på Forward scatter bredde (FSC-W) versus FSC-A og gate befolkningen i enkeltceller som befolkning 3 (P3) (Figur 3AC og figur BC).
Merk: bruk av to sammenhengende porter i 7,3 og 7,4 utelukker celle klumper og doublets (høy FSC-W og høy FSC-A). - Gate P3-celler basert på GFP versus allofykocyanin (APC). APC-kanalen oppdager autofluorescence. Gating på denne kanalen unngår å fange autofluorescent celler. Bruk GFP-negative celler for å justere spenningen for FITC/GFP fluorescerende kanaler. Ideelt posisjon porter for disse celle populasjoner rundt 102. Velg gate terskler for GFP-positive befolkning 4 (P4) individuelt for hver type motorisk Nevron (Figur 3Ad og figur BD).
Merk: Sett GFP gate mye høyere for SMNs enn for CN3s/CN4s for å få en ren kultur (Figur 3Ad og figur BD). En lavere GFP gate for SMN kulturer fører til forurensning av kulturer ved glia og ikke-motoriske neurons. Dette er sannsynligvis fordi det er lavt nivå GFP uttrykk i noen glia og ikke-motoriske neurons på grunn av en lekk promoter. Prosentandelen av GFP-positive celler sammenlignet med totale celler er vanligvis 0,5 − 1,5% for CN3s/CN4s og 1,5 − 2,5% for SMNs. Hvis disseksjon var vellykket, kan disse tallene brukes som en målestokk for å bestemme riktig posisjon for GFP-positive gate (Figur 3AE og figur være). - Utfør FACS i henhold til produsentens protokoll. Samle P4 celler i frisk 1,7 mL mikrosentrifugen rør fylt med 500 μL av motorisk Nevron kultur medium. Oppbevares på is til plating.
Merk: Selv om cellene kan sorteres direkte inn i brønnene, dette resulterer i et ujevnt antall celler per brønn. Sorter cellene i 1,75 mL mikrosentrifugen rør og deretter plate manuelt for å oppnå en jevnere plating distribusjon.
8. kultur renset primær motor neurons
- Fortynne FACS-isolert CN3/CN4 og SMN suspensjoner med motor Nevron kultur medium prewarmed til 37 ° c til tettheten av 5 x 103 og 1 x 104 celler/ml, henholdsvis.
Merk: En E 11.5 embryo gir ca 1 x 103 CN3/CN4 og 7 x 103 SMN. Imidlertid er disse rentene avhengige av renheten av dissekert vev, grundighet av celle dissosiasjon og passende terskelverdi av GFP porter under FACS. - Transfer 96 brønn plater precoated med PDL og laminin fra 37 ° c vev kultur inkubator til laminær Flow hette og aspirer laminin fra hver brønn. Bruk tallerkener og coverslips umiddelbart uten å vaske.
- Tilsett 200 μL av fortynnet CN3/CN4 og SMN suspensjoner i hver brønn av PDL/laminin-belagt 96 brønn plater. Endelige celle tetthet bør være 1 x 103 og 2 x 103 celler/BRØNN for CN3/CN4 og SMN, henholdsvis.
Merk: Initial plating tetthet av SMNs i 96 brønn plater (2 x 103 celler/brønn) er det dobbelte av CN3s/CN4s (1 x 103 celler/brønn) for å oppnå lignende endelige motoriske Nevron tall og tettheten ved 2 og 9 dager in vitro (div) (4 − 6 x 102 og 2 − 4 x 102 celler per brønn, henholdsvis). - Kultur neurons i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
- Feed neurons hver 5 dager ved å fjerne halvparten av de gamle mediene (100 μL) og erstatte med samme volum av ferske motoriske Nevron kultur medium. Sørg for at neuronal prosessene blir synlige på 1 DIV og bli tykkere og lengre med 14 DIV (Figur 4). Neuronal celle organer blir forstørret og har en tendens til å samle i langsiktige kulturer, spesielt for SMNs (Figur 4).
Merk: Utfør alle medium og løsnings endringer ved å la halvparten av det opprinnelige medium volumet for å unngå å løsne kulturperler celler. Dette inkluderer fiksering og immuncytokjemi (ICC) trinn. Hvis alle medier er fjernet, uansett hvor forsiktig, de fleste av cellene vil løsne og vaskes bort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne protokollen var å svært rense og kultur både primære CN3s/CN4s og SMNs langsiktig for å muliggjøre sammenlignende analyser av mekanismene underliggende motoriske Nevron lidelser (se figur 1 og figur 2 for oversikt).
Når neurons ble vellykket isolert og dyrket i kultur, nesten ren primær CN3/CN4 og SMN kulturer ble innhentet (figur 5a,B) og VEDLIKEHOLDES i minst 14 div (Figur 4 og figur 6). Den renheter av CN3/CN4 og SMN kulturer på 2 DIV var 93,5 ± 2,2% og 86,7 ± 4,7%, henholdsvis når vurdert av ICC ved hjelp av motorisk Nevron markør Islet1 og neuronal markør TUJ1 (figur 5B). Men disse høye renheter støttet seg tungt på alder av embryo og på å sette riktige terskler for GFP porter under FACS (Figur 3). Disseksjon av embryo på E 10.5 er vanskeligere enn disseksjon på E 11.5 på grunn av økt mykhet og klebrighet av vev, noe som resulterer i redusert motorisk Nevron gir. Imidlertid, det renheter av E 10.5 CN3s/CN4s og SMNs var sammenlignbare å dem for E 11.5 embryo (92,8% og 82,2% for 2 DIV, respectively; data oppnådd fra en enkelt eksperiment). Renheter av CN3s/CN4s og SMNs dramatisk redusert når E 13,5 embryo ble brukt, selv om bare den høyeste GFP-positive befolkningen ble samlet (20,7% og 7,4% ved 2 DIV, henholdsvis; data innhentet fra et enkelt eksperiment), sannsynligvis på grunn av uttrykk for GFP i ikke-motoriske neurons (figur 7). Den samme tendensen også holdt sant for E 12,5 kulturer, selv om det var mye mindre dramatisk. Derfor embryo på E 12.5 eller eldre er upassende for bruk i rensing av motoriske neurons bruker denne protokollen.
Ren motoriske Nevron kulturer er verdifulle for å forstå isolerte vekst mønstre, atferd, og sårbarheter av motoriske neurons. Dette eksempelet viser hvordan disse kulturene kan brukes til å teste motoriske Nevron svar på kjemisk behandling. For å avgjøre om primære CN3s/CN4s og SMNs viser differensial svar på endoplasmatiske retikulum (ER)-stressorer, ble primær monokulturer av CN3s/CN4s og SMNs innhentet ved hjelp av denne protokollen og behandlet med varierende konsentrasjoner av en ER-stressor, cyclopiazonic yre (CPA). Neurons ble behandlet med CPA (5, 10, 15, 20, 25, eller 30 μM) eller kjøretøy kontroll (DMSO) ved 2 DIV og faste 3 dager senere for ICC å evaluere overlevelse prosenter (Figur 8A). Antallet levedyktige neurons i hver prøve ble talt og overlevelse prosenter ble beregnet som antall levedyktige celler i stoff-behandlet brønner delt på antall levedyktige celler i brønnene behandlet med DMSO. CN3/CN4 monokulturer var signifikant mer motstandsdyktig mot CPA-behandling (10 − 25 μM) sammenlignet med SMN monokulturer (figur 9 og Figur 8B)31.
Avslutningsvis tillater denne protokollen for generering av høyt renset primær mus embryonale CN3/CN4 og SMN kulturer som gir et kraftig og pålitelig system for etterforskning av neuronal atferd.
Figur 1: ordning for utarbeidelse av musen embryonale motoriske neurons. Den Skjematisk illustrerer trinnene involvert i isolasjon og kultur av mus embryonale motoriske neurons og omtrentlig tid i timer eller dager for hvert trinn. Rekkefølgen av disseksjon prosedyren for CN3/CN4 og SMN er hver merket sekvensielt 1 til 4. Forkortelser: CN3/CN4 = nervus Nevron/trochlear Nevron; SMN = spinal motoriske Nevron; FACS = fluorescens-aktivert celle sortering; h = time; d = dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Disseksjon av ventrale mellomhjernen og cervical (C1)-korsrygg (L2-L3) delen av ventrale ryggmargen. (A) lateral (a) og rygg (b) visninger av GFP motoriske neurons i en e 11.5 ISLMN: GFP transgene Mouse embryo under fluorescein isothiocyanate (FITC) belysning. En hel Mount E 11.5 embryo ble utarbeidet som tidligere beskrevet32 for å gjøre fosteret transparent. Deretter ble fosteret analysert av immunofluorescence merking med anti-GFP farging (grønn). Bilder ble tatt under et konfokalmikroskopi mikroskop. Skala bars = 200 μm (lateral visning) og 400 μm (rygg utsikt). Forkortelser: S = overlegen; I = dårligere; V = ventrale; D = rygg. (B-H) Disseksjon skritt uthevet på bilder av E 11.5 ventrale mellomhjernen og ventrale ryggmargen vev tatt med et utstyrt kamera under sterkt lys (bb) eller FITC belysning ved hjelp av en fluorescens disseksjon stereomikroskopet. Skala stolper = 200 μm (D) og 1 mm (A − C, E − H). (B) (a) fjerning av ansikt og hale av fosteret ved å skjære langs de røde linjene. (b) embryo posisjonert for disseksjon. Plassering av fronten av mikroskopet indikeres med en stjerne. (C) skjæring langs den solide røde linjen for å slit åpne taket av fjerde ventrikkel (a) lateral visning og (b) rygg utsikt. Bruk av denne åpningen til å skjære langs overflaten av embryo rygg til hjernen (bane indikert med stiplet rød pil). Dette eksponerer vevet som inneholder mesenchyme, CN3, og CN4, som kan løftes ut av kraniet. For SMN disseksjon, innsetting av tang i samme åpning mellom fjerde ventrikkel og tak, og deretter skjære mot caudal siden av fosteret (banen indikert av stiplede gule pilen). (D) siste visning av ventrale mellomhjernen inneholder bilaterale GFP-positive CN3 og CN4 kjerner. Kantene av vevet er markert med et rødt rektangel. Skjæring langs gul stiplet linje for å samle CN3 og CN4 kjerner separat, hvis ønskelig. (E) etter åpning resten av hindbrain og ryggmargen, flagrende rygg vev klemt over de røde linjene på begge sider med pinsett (a) før, og (b) etter. (F) bilateralt fjerning av overflødig vev ventrale til ryggmargen langs den røde linjen (a) før, og (b) etter. (G) kutting av den ventrale ryggmargen på de to stedene indikert av de røde linjene. På rostral IDen, skjæring av flytende ventrale ryggmargen tvers over C1 der den første GFP-positive fremre horn prosjekter. Skjæring av den caudal enden av ryggmargen tvers på den øvre grensen av nedre lem. Når disse kuttene er gjort, kan cervical (C1) gjennom korsrygg (L2-L3) del av ventrale ryggmargen bli dissekert unna. (H) siste visning av den ventrale ryggmargen som inneholder GFP-positive SMN-kolonner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant sortere plott av ventrale midbrains (A) og ventrale rygg snorer (B). (AA og ba) Forward scatter-område (FSC-A) versus side Spredningsområde (SSC-A) sorterte plott før utelukkelse av rusk og døde celler. (AB, bb, AC, BC) Sorterte tomter for utelukkelse av celle klumper (b) og doublets (c) basert på bredde (SSC-w) versus SSC-a og Forward scatter bredde (FSC-w) versus FSC-a, henholdsvis. (Ad og BD) Sorterte tomter for å isolere ISLMN: GFP -positive motor neurons. For å få en ren kultur, må GFP porten settes høyere for SMNs (BD) enn for CN3s/CN4s (Ad). (AE og være) Prosenter av celler gated for samling av FACS sortering. % Overordnet representerer prosentandelen av celler i gjeldende gated populasjon i forhold til antall celler i den forrige gated celle populasjonen, mens % totalt representerer prosentandelen av gated Cells i forhold til totalt celler. Forventede prosenter av GFP-positive celler sammenlignet med totalt antall celler (innrammet i rødt) er 0,5 − 1,5% for CN3/CN4 og 1,5 − 2,5% for SMN. Hvis disseksjon ble utført, kan disse prosentene brukes som en målestokk for å sette opp den GFP-positive porten i (Ad og BD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fase kontrast bilder av primær CN3/CN4 og SMN monokulturer ved 2, 7 og 14 div. Representative differensial forstyrrelser kontrast bilder av primær CN3/CN4 og SMN kulturer ble tatt til 2, 7 og 14 DIV med invertert fluorescens mikroskop ved hjelp av tilsvarende bildeoppkjøp og prosessering programvare og 40x mål. Neuronal prosesser ble tykkere og lengre med 14 DIV. neuronal celle kroppsstørrelser ble forstørret og hadde en tendens til å samle i langsiktige kulturer, spesielt for SMNs. Begge kulturer kan opprettholdes minst 14 DIV. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: characterizations av isolerte e 11.5 mus CN3/CN4 og SMN kulturer. (A) representative immuncytokjemi bilder av e 11.5 mus CN3s/CN4s (øverst) og SMNs (nederst) kultivert for 2 div. Immunofluorescence merking med NEURONAL markør TUJ1 (grønn) og motorisk Nevron markør Islet1 (rød) utført for å analysere neurons og kjerner ble COUNTERSTAINED med DAPI (blå). Nesten alle de kultivert cellene var motor neurons (TUJ1+, Islet1+). Bilder ble tatt med en invertert fluorescens mikroskop ved hjelp av tilsvarende bildeoppkjøp og prosessering programvare og 20x mål. Prøvene ble avbildet og behandlet for å oppnå maksimal signal intensitet uten mettede piksler. Alt mikroskopisk arbeid og bildebehandling i følgende tall ble utført i disse forholdene med mindre annet er spesifisert. Scale bar = 100 μm. (B) Renheter av e 11.5 mus CN3/CN4 og SMN kulturer ved 2 div. Den renheter av CN3/CN4 og SMN kulturer var 93,5 ± 2,2% og 86,7 ± 4,7%, henholdsvis. Dead neuronal celle organer ble vurdert av screening for pyknotic kjernefysisk morfologi og membran hevelse. Neuronal prosesser ble klassifisert som degenereres prosesser når tegn på beading og hevelse ble observert. Celler med verken celle kroppen død eller degenereres prosesser ble ansett som levedyktig non-motor neurons (TUJ1+, Islet1-) eller LEVEDYKTIG motor neurons (TUJ1+, Islet1+)33. Renheter av motoriske Nevron kulturer ble beregnet som antall levedyktige motoriske neurons delt på det totale antall levedyktige ikke-motoriske neurons pluss levedyktig motor neurons. Verdier representerer gjennomsnittet ± SEM av tre separate eksperimenter. Ikke signifikant (p > 0,05) av student t test. Celle telling ble utført manuelt under 20x forstørrelse. Forkortelser: SEM = standard feil av gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representative immuncytokjemi for primær CN3/CN4 og SMN monokulturer ved 2, 7 og 14 div. Primær CN3/CN4 og SMN kulturer ble analysert ved 2, 7, 14 DIV av immunofluorescence merking med TUJ1 (grønn), og kjerner ble counterstained med DAPI (blå). Neuronal prosesser blir tykkere og lengre med 14 DIV. neuronal celle kroppsstørrelser ble forstørret og hadde en tendens til å samle i langsiktige kulturer, spesielt for SMNs. Både CN3/CN4 og SMN kulturer kan opprettholdes minst 14 DIV. bilder ble tatt under 10x forstørrelse. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: karakterisering av e 13.5 mus CN3/CN4 og SMN isolerte kulturer. E 13,5 CN3/CN4 og SMN ble isolert og kultivert ved hjelp av denne protokollen og analysert på 2 DIV av immunofluorescence merking med TUJ1 (grønn) og Islet1 (rød), og kjerner ble counterstained med DAPI (blå). Mange ikke-motoriske neuronal celler (TUJ1+, Islet1-) var til stede (piler) som resulterer i en DRASTISK reduksjon i både CN3/CN4 og SMN renhet, med NEDGANGEN mer uttalt i SMN kulturer. Bildene ble tatt under 20x forstørrelse. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: representative anvendelse av primær motoriske Nevron kultur demonstrere at CN3s/CN4s er selektivt motstandsdyktig mot er stress indusert av CPA. (A) eksperimentell disposisjon: primære CN3/CN4 og SMN monokulturer ble behandlet med CPA eller kjøretøy kontroll (DMSO) ved 2 div og celle viabilities ble evaluert gjennom immuncytokjemi analyse etter 3 dager med behandling. Denne disposisjonen er endret fra publisert arbeid31. (B) kvantifisering av overlevelse prosenter av CN3s/CN4s og SMNs behandlet med 5 − 30 μM CPA for 3 dager fra 2 div. neurons ble analysert av immunofluorescent merking av celler med TUJ1, og kjerner ble COUNTERSTAINED med DAPI. Overlevelse prosenter ble beregnet som antall levedyktige celler (se figur 5B Legend) i stoff-behandlet brønner delt på antall levedyktige celler i brønner som inneholder kjøretøy alene (DMSO). Celle telling ble utført manuelt under 20x forstørrelse. Verdier representerer gjennomsnittet ± SEM av fire separate eksperimenter. * p < 0,05; p < 0,005 av studentens t -test. Dette tallet er endret fra tidligere publisert arbeid31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: representative immuncytokjemi av PRIMÆRE CN3/CN4 og SMN monokulturer etter en 3 dagers eksponering for økende konsentrasjoner av CPA begynnelsen på 2 div. Neurons ble analysert av immunofluorescent merking av celler med TUJ1 (grønn) og kjerner ble counterstained med DAPI (blå). Primær CN3s/CN4s var mer motstandsdyktig mot CPA behandling enn primære SMNs. bildene ble tatt under 10x forstørrelse. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antall midbrains (X) | Papain | Albumin-ovomucoid | Dvalemodus E | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| Antall rygg snorer (Y) | Papain | Albumin-ovomucoid | Dvalemodus E | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
Tabell 1: egnede volumer av Papain, albumin-ovomucoid, og endelig suspensjon brukes i dissosiasjon trinn. Den aktuelle volumer av Papain og albumin-ovomucoid som skal brukes med ulike antall ventrale mellomhjernen og ventrale ryggmargen vev ble modifisert fra produsentens instruksjoner etter flere runder med optimalisering. Fordi vev er utsatt for stress under dissosiasjon og sortering, en gruppert samling av mer enn 10 ventrale midbrains og mer enn tre ventrale rygg ledninger anbefales. Volumet av Papain ble bestemt ved å vurdere balansen mellom effektiv dissosiasjon og stresset med denne prosedyren. Volumet av albumin-ovomucoid inhibitor løsning er halvparten av det av Papain. Det aktuelle volumet av Hibernate E endelig suspensjon ble fastslått slik at celle tetthet ikke overstiger 107 celler/ml, men cellene blir ikke overdrevet fortynnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk, in vitro studier av CN3 og/eller CN4 motor neurons har stolt på heterogene kulturer som dissosiert17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, og Slice27,28 kulturer, fordi disse cellene ikke kan skilles fra omkringliggende celler basert på størrelse, og spesifikke markører for disse cellene er ikke rapportert. Den nåværende protokollen er en omfattende metode for isolering og kultur av primære E 11.5 murine CN3s/CN4s, og SMNs fra samme embryo og bekrefte høy renhet av kulturer. Ved å generere rene SMN og CN3/CN4 kulturer fra samme mus embryo, muliggjør protokollen kontrollerte sammenligninger av in vitro atferd av CN3s/CN4s versus SMNs isolert fra vill type så vel som mutant embryo.
Den rene kulturer av CN3s/CN4s og SMNs generert av denne protokollen tillate sammenlignende studier av morfologiske, cellulære, molekylære, og elektrofysiologisk karakteristikker av disse motor neurons. I teorien, fordi andre skallen motor Nevron populasjoner kan bli sett og dissekert fra denne ISLMN: GFP transgene Mouse linje (inkludert abducens, motor Trigeminal, ansiktsbehandling, og hypoglossus), denne protokollen kan utvides for deres isolasjon og kultur også, forutsatt at FACS GFP portene er justert på riktig måte. Til slutt, den FACS-sorterte motoriske neurons avledet fra denne protokollen kan utsettes for genomisk (f. eks, analysen for Transposase-Accessible Kromatin bruker sekvensering, eller ATAC-SEQ) og/eller transcriptomic (f. eks, RNA sekvens31) analyser for å studere normal utvikling og selektiv sårbarhet av spesifikke motoriske Nevron under typer i nevrodegenerative lidelser31.
Det er flere trinn i denne protokollen som er avgjørende for å maksimere antall rene, sunne motor neurons i det isolerte kultur systemet. Under disseksjon, den GFP-negative vev (f. eks, mesenchyme og DRGs) bør maksimalt fjernes uten å skade motoren neurons, fordi disse vev er lim og kan felle SMNs under filtrering eller forårsake tilstopping under FACS sortering. Under vevs dissosiasjon bør det minimale essensielle volumet av Papain brukes, og cellene må behandles forsiktig med minimal, men tilstrekkelig trituration. Papain ble brukt for vevs dissosiasjon trinn i denne protokollen, fordi foreløpige data indikerte at det er mindre ødeleggende enn Trypsin til både CN3/CN4 og SMN. Overlevelse prosenter basert på belagt antallet av CN3s/CN4s og SMNs for 2 DIV forhøyet fra 39,5% å 52,7% og fra 52,3% å 58,4%, respectively, når Papain var anvendt istedet for Trypsin (0,25%, 4 min inkubasjons). Selv om disse tallene er avledet fra et enkelt eksperiment utført før full optimalisering, ytterligere rapporter tyder også på at Trypsin er suboptimal for celle utvinning fra nervesystemet vev12,34,35,36. Under FACS, fluorescerende vitale fargestoffer (propidium iodide og calcein blå) og små sortering dyser (f. eks, 70 μm) bør ikke brukes, fordi de er skadelige til motorisk Nevron overlevelse. Bruk av store sortering dyser (100 μm eller større) er sterkt anbefalt, fordi SMN celle død øker betraktelig når en 70 μm dyse brukes. Å sette de riktige gating terskler for GFP-positive celler i FACS er et kritisk trinn for å oppnå rene kulturer. Motoriske Nevron kulturer suppleres med Forskolin, IBMX, og vekstfaktorer (BDNF, CNTF, og GDNF). Forskolin og IBMX har blitt rapportert å additively fremme SMN overlevelse37,38. Foreløpige data fra dagens studier tyder på at Forskolin og IBMX også additively øke CN3/CN4 overlevelse. Survival ratio basert på belagt antall CN3s/CN4s ved 2 DIV økte fra 17,5% til 26,9%, 31,9%, og 37,0% når IBMX, Forskolin, og IBMX + Forskolin ble lagt til, henholdsvis (tallene er basert på et enkelt eksperiment utført før full optimalisering av cellekultur forhold). Det er best å utføre alle medium endringer og vasker av kulturperler celler ved å la halvparten av det opprinnelige volumet for å unngå frakobling kultivert celler. Til slutt er det også ideelt å redusere tidsbruk mellom disseksjon og plating av motor neurons (f. eks, ved å forkorte disseksjon tid ved hjelp av flere dissectors) for å forbedre levedyktigheten til kulturer.
Det er fire store potensielle problemer som kan oppstå når du følger denne protokollen. Den første er lav avkastning av motor neurons etter FACS. Mulige årsaker til lav avkastning inkluderer bruk av unge embryo (f. eks, E 10.5), som har færre motoriske neurons, utilstrekkelig fjerning av lim GFP-negative vev under disseksjon (f. eks mesenchyme og DRGs), som kan felle motoriske neurons og føre til fjerning deres under filtrering, utilstrekkelig papainization/trituration under dissosiasjon, og/eller sette GFP-positive gate for høy under FACS. Det andre potensielle problemet er lav renhet av motorisk Nevron kulturer, som mest sannsynlig oppstår ved bruk av eldre embryo (f. eks, E 12.5) og/eller fra å sette GFP-positive gate for lavt under FACS. For det tredje kan et lavt antall vedlagte motor neurons i kultur observeres på grunn av upassende FACS sortering og/eller utilstrekkelig PDL/laminin belegg av plater/coverslips. For det fjerde kan motor neurons vise lav levedyktighet i kulturen. Mulige årsaker til lav levedyktighet inkluderer grov og/eller langvarig disseksjon, overdreven papainization/trituration under dissosiasjon, upassende håndtering av celler i hele protokollen (f. eks grov pipettering av celler, unnlatelse av å plassere celler på isen, unnlatelse av å pre-chill PBS og HBSS), og/eller overdreven tid mellom euthanization av gravide mus og endelig plating av cellene. Bruk av reagenser som ikke er ferske og/eller upassende konsentrasjoner, kan også svekke eksperimentelle resultater.
Det er tre store begrensninger av denne protokollen. ISLMN: GFP transgene mus og FACS sortering er begge ganske dyrt. De er imidlertid avgjørende for denne protokollen som det er for øyeblikket ingen alternativ metode i stand til å generere svært renset CN3s/CN4s på en mer økonomisk måte. Det er en liten E 10.5-E 12,5 alder vindu for embryonale mus, og det er vanskelig å bekrefte at riktig alderen embryo er til stede, spesielt hvis en ultralyd maskin er ikke tilgjengelig. Hvis bare ren SMNs er nødvendig, kan de utledes fra e 12.5-15.0 Mouse embryo ved hjelp av metoder som gradient sentrifugering10,11,12 og/eller p75ntR-antistoff-basert celle-sortering panorering teknikker13,14,15,16. Til slutt, protein-baserte analyser som krever en stor mengde Start materiale er ikke gjennomførbart fra disse kulturene på grunn av den lille avkastningen av motor neurons (spesielt CN3s/CN4s). Stem celle-avledet motor neurons31,39, som kan genereres limitlessly, kunne i teorien bli erstattet for dette formålet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) for instruksjon i SMN disseksjon teknikker; The Dana Farber Cancer Institute Flow flowcytometri Facility, den immunologi Division Flow flowcytometri Facility av Harvard Medical School, The Joslin diabetes Center Flow flowcytometri Core, Brigham og Women ' s Hospital Flow flowcytometri Core, og Boston Children ' s Hospital Flow flowcytometri Research Facility for FACS isolering av primær motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, flere Engle laboratorium medlemmer, og Project ALS konsortium medlemmer for teknisk assistanse og gjennomtenkt diskusjon. Denne studien ble støttet av Project ALS. I tillegg R.F. ble finansiert av Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant utlandet og NIH Training stipend i genetikk T32 GM007748; JJ ble støttet av NIH/NEI treningsprogram i den molekylære baser av øyesykdommer (5T32EY007145-16) gjennom Schepens Eye Research Institute og av utviklingsmessige Nevrologi Training program postdoktor Fellowship (5T32NS007473-19) gjennom Boston Children ' s Hospital; M.s. W ble støttet av NEI (5K08EY027850) og Children ' s Hospital Oftalmologi Foundation (fakultet Discovery Award); og E.C.E. er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
