Summary
يقدم هذا العمل بروتوكولا لإنتاج ثقافات الخلايا المتجانسة لمحرك للعين الاوليه ، والخلية العصبية الحركية الشوكية. يمكن استخدام هذه الثقافات للتحليلات المقارنة للخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية في العين والعمود الفقري.
Abstract
الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) يحمل مقاومه ملحوظة للامراض العصبية التنكسية الحركية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) بالمقارنة مع الخلايا العصبية الحركية الشوكي (SMNs). القدرة علي عزل وثقافة الماوس الأساسي CN3s ، CN4s ، و SMNs من شانه ان يوفر نهجا لدراسة أليات الكامنة وراء هذه الثغرة الانتقائية. وحتى الآن ، تستخدم معظم البروتوكولات ثقافات الخلايا غير المتجانسة ، التي يمكن ان تجد تفسيرا للنتائج التجريبية. وللتقليل إلى ادني حد من المشاكل المرتبطة بمجموعات الخلايا المختلطة ، لا غني عن الثقافات البحتة. هنا ، يصف البروتوكول الأول بالتفصيل كيفيه تنقيه وزراعه CN3s/CN4s بالاضافه إلى نظراء SMNs من نفس الاجنه باستخدام اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: أجنه الفئران المحورة وراثيا gfp. ويوفر البروتوكول تفاصيل عن تشريح الانسجه والتفكك ، وعزل الخلايا القائم علي FACS ، وزراعه الخلايا في المختبر من CN3/CN4 ونوى SMN. يضيف هذا البروتوكول رواية في المختبر CN3/CN4 نظام الثقافة إلى البروتوكولات القائمة ويوفر في وقت واحد ثقافة SMN الأنواع النقية والمطابقة للعمر للمقارنة. التحليلات التي تركز علي الخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية ممكنة في هذا النظام الثقافي. هذا البروتوكول سوف تمكن البحوث في أليات التي تحدد تطوير الخلايا العصبية الحركية ، والضعف الانتقائي ، والمرض.
Introduction
ثقافة الخلايا العصبية الحركية الاوليه هي أداه قويه تمكن من دراسة تطور الخلايا العصبية ، وظيفة ، والقابلية للإجهادات الخارجية. الثقافات العصبية الحركية مفيده بشكل خاص لدراسة الامراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)1,2, الذي أليات المرض غير مفهومه تماما. ومن المثير للاهتمام ، علي الرغم من وفاه خليه كبيره من الخلايا العصبية الحركية الشوكية (smns) في كل من المرضي als والفئران نموذج als ، وفاه الخلية في الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) نادرهنسبيا1،3،4،5،6 ولذلك ، فان التحليلات المقارنة للثقافات المحضة CN3s/CN4s و SMNs يمكن ان توفر أدله هامه حول أليات الكامنة وراء الضعف النسبي. ولسوء الحظ ، كان العائق الرئيسي لهذه التحاليل هو عدم القدرة علي زراعه الثقافات المنقية لهذه الخلايا العصبية الحركية.
وقد تم وصف العديد من البروتوكولات لتنقيه SMNs من النماذج الحيوانية. معظم هذه البروتوكولات استخدام التدرج الكثافة طرد10،11،12 و/أو p75ntr-الأجسام المضادة القائمة علي الخلية فرز تقنيات بالغسل13،14،15،16. طرد التدرج الكثافة يستغل حجم أكبر من SMNs نسبه إلى الخلايا الشوكية الأخرى ، في حين p75Ntr هو بروتين خارج الخلية التي أعرب عنها حصرا smns في الحبل الشوكي. وقد تم توليد ما يقرب من 100 ٪ من الثقافات smn نقيه من قبل واحد أو كل من هذين البروتوكولين11،12،14. ومع ذلك ، لم تنجح هذه البروتوكولات في توليد ثقافات CN3/CN4 لان CN3s/CN4s لا تعبر عن p75Ntr، ولم يتم تحديد علامات CN3/CN4 محدده أخرى. كما انها أصغر من SMNs ، التالي ، أكثر صعوبة لعزل استنادا إلى حجم. وبدلا من ذلك ، اعتمدت الدراسات المختبرية لCN3s أو الCN4s علي الفصل17، و18، و19، و20، و21، و17، و22،و 23، و24، و25، و26، والشريحة27،و28 ثقافة ، والتي تتكون من أنواع خلايا غير متجانسة ، ولم توجد بروتوكولات العزلة والثقافة الاوليه CN3s أو CN4s.
هنا ، يوصف بروتوكول لتصور ، والعزلة ، وتنقيه ، وزراعه CN3s ، CN4s ، وsmns من نفس اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: gfp الفئران المحورةوراثيا29 (الشكل 1، الشكل 2ا). IslMN: gfp تسمي علي وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مع gfp farnesylated التي تقوم بالتمركز إلى غشاء الخلية. هذا البروتوكول يمكن مقارنه الأنواع والعمر مطابقه لأنواع متعددة من الخلايا العصبية الحركية من أجل توضيح أليات المرضية في مرض الخلايا العصبية الحركية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع التجارب التي تستخدم المختبرات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للصحة والصحة لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية وبموافقه لجنه رعاية الماشية والاستخدام من مستشفي بوسطن للأطفال.
1. اعداد الفواصل الزمنيه قبل تشريح
- لتوليد الفئران الجنينية قبل الولادة لحصاد الخلايا العصبية الحركية ، تزن كل الإناث الماوس واعداد التزاوج في الوقت المناسب بين الكبار IslMN: gfp الفئران المحورة وراثيا 11.5 يوما قبل يوم من عزله الخلايا العصبية. لغرض تطوير هذا البروتوكول ، 129 S1/C57BL/6J IslMN: تم استخدام الفئران gfp ، الذين تتراوح أعمارهم بين 2 و 9 أشهر ، وتم اعداد التزاوج الموقوت في المساء.
- افحص الفئران الانثويه للسدادة المهبلية في الصباح التالي. النظر في التاريخ الذي يتم تحديد المكونات كيوم الجنينية (E) 0.5.
- تزن الفئران الإناث وفحص للجراء باستخدام الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) بين e 8.5 − 11. تحقق من علامات التزاوج الناجح.
- تاكيد التزاوج ناجحه عن طريق الكشف عن زيادة الوزن في الفئران الإناث (عاده > 1.5 ز علي E 9.5 إذا كان هناك أكثر من 5 − 6 الاجنه).
- تاكيد بصريا الاجنه تحت الموجات فوق الصوتية. يمكن اكتشاف الاجنه بسهوله عن طريق الموجات فوق الصوتية بعد E 9.5. يتم اجراء الموجات فوق الصوتية فقط علي الإناث التي اكتسبت الوزن لأنها في كثير من الأحيان الحوامل من تلك التي لا.
ملاحظه: يمكن للفئران الإناث زيادة الوزن لأسباب أخرى غير الحمل ، لذلك فان زيادة الوزن وحدها ليست مؤشرا موثوقا به للحمل. تاكيد الموجات فوق الصوتية يمنع التضحية غير الضرورية للإناث غير الحوامل ولكن ليست حاسمه إذا لم تكن متوفرة.
2. تشريح الشروط واعداد الاداهات
- أداء جميع الطلاء (باستثناء حمض التنظيف من الشفتين) ، واعداد وسائل الاعلام ، وتفكك الانسجه (باستثناء طرد والحضانة) ، والعمل الثقافي في غطاء التيار الرقائقي لضمان العقم من وسائل الاعلام والخلايا العصبية الحركية الجنينية.
- مع الاهتمام الدقيق لتقنية عقيمه ، واجراء تشريح الانسجه خارج غطاء المحرك الرقائقي التدفق مع الحد الأدنى من خطر التلوث.
- تعقيم واحده لوحه تشريح ، زوج واحد من مقص ميكروتشريح ، زوج واحد من ملقط الإبهام خلع الملابس ، واثنين من أزواج من دومون #5 ملاقط ، واحد سكين ميكروتشريح ، واحده Moria ملعقة مثقبه صغيره من خلال غمر في 70 ٪ الايثانول قبل الاستخدام.
3. PDL/Laminin طلاء من الاطباق/Coverslips
ملاحظه: الثقافة فصل الخلايا العصبية الحركية الاوليه في 96 جيدا أو 24 لوحات جيدا ، اعتمادا علي عدد من الخلايا المطلوبة للتطبيق. يمكن ان تكون الخلايا غير مباشره في لوحه ثقافة الانسجه دون استخدام الشفتين إذا كانت الآبار شفافة بصريا وسمك متوافقة مع التصوير.
- للتطبيقات التي تتطلب الشفتين ، واعداد حمض تنظيفها ، تعقيم ، والمجففة الهواء الشفتين علي الأقل 2 أيام قبل عزل الخلايا العصبية كما هو موضح سابقا30. يمكن اعداد مجموعات من الشفتين بهذه الطريقة بشكل جيد في وقت مبكر من التجارب ويمكن تخزينها حتى 6 أشهر دون التاثير علي الجودة التجريبية.
- اعداد حل العمل من 20 ميكروغرام/مل بولي D-يسين (PDL) في الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 2 أيام قبل عزل الخلايا العصبية.
- Aliquot PDL (1 مغ/مل) مقدما وتخزين في-20 درجه مئوية كحل الأسهم.
- تغطيه سطح كل كوفيرسليب أو بئر من لوحه ثقافة الانسجه مع ما يكفي من حلول pdl حل العمل (علي سبيل المثال ، 100 μl لكل بئر علي 96 لوحات جيده أو 500 μl لكل بئر علي 24 لوحات جيدا مع أو بدون الشفتين). احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- في اليوم التالي يغسل 3x مع المياه المعقمة.
- ختم لوحات مع الفيلم البارافين وتخزين لوحات PDL المغلفة غسلها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 1 شهر إذا كانت تجفف تماما بعد الغسيل النهائي.
- اعداد حل العمل مع 10 μL من laminin (1.1 − 1.2 mg/mL) في 1.2 مل من تلفزيوني.
- Aliquot laminin الأسهم (1.1 − 1.2 mg/mL) مقدما وتخزين في-80 درجه مئوية.
- تغطيه سطح كل كوفيرسليب أو جيدا مع ما يكفي من محلول laminin لمعطف بالتساوي السطح. احتضان لمده 2 ساعة علي الأقل عند 37 درجه مئوية قبل الاستخدام.
ملاحظه: PDL/laminin المغلفة لوحات والشفتين يمكن تخزين ما يصل إلى 1 الأسبوع في 37 درجه مئوية ، ولكن الlaminin المغلفة الطازجة هو المفضل. أزاله laminin مباشره قبل الطلاء30. يجب عدم السماح لLaminin بالجفاف. إذا كانت لوحات ليتم تخزينها لأكثر من عده ساعات ، ينبغي ان تكون ملفوفه في فيلم البارافين.
4. اعداد تشريح ، الحركية العصبية وسائل الاعلام الثقافة ، وحلول التفكك
ملاحظه: وتشير التركيزات الواردة بين قوسين إلى التركيزات النهائية لكل كاشف.
- اعداد المتوسط تشريح.
- الذوبان في مصل الحصان الحرارة المعطلة بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية ، واعداد 1 مل aliquots ، وتخزين في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
- تخزين B27-الملحق (50x) في 1 مل قسامات في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام. تجنب دورات التجميد/الذوبان.
- الملحق الجلوتامين المخزن (100x) في 4 درجه مئوية أو-20 درجه مئوية. يقسم إلى 0.5 مل من الارصفه الغذائية في حاله التخزين عند-20 درجه مئوية.
- مخزن البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/ml) في 1 مل قسامات في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
- 100 100 200 200 9.4 استخدام هذه الوسيلة لجمع الانسجه تشريح وجعل التعليق النهائي من الخلايا المنفصلة.
- أضافه 500 μL من تشريح المتوسطة إلى الفردية 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي لجمع الانسجه في اليوم السابق للعزل الخلايا العصبية. اعداد أنبوب واحد لكل نوع الانسجه التي سيتم جمعها (علي سبيل المثال ، السيطرة الايجابيه ، والسيطرة السلبية ، CN3/CN4 ، SMN) وتخزين في 4 درجه مئوية قبل الاستخدام.
- الجمع بين 49 mL من السبات E وسائل الاعلام منخفضه الفلورية مع 1 مل من الملحق B27 (1x) وملء 24 لوحه جيدا مع هذا المتوسط (2 مل/بئر) في اليوم السابق للعزل الخلايا العصبية. استخدم هذا الطبق لجمع أجنه الفئران. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
- اعداد العصبية الحركية المتوسطة الثقافة.
- اعداد 250 μl القسامات من 25 ملم 2-mercaptoethanol في L15 المتوسطة leibovitz. يخزن عند-20 درجه مئوية.
- توليد 5 μl قسامات من 100 ميكروغرام/مل حلول bdnf ، cntf ، و gdnf المخفف في المياه المعقمة. يخزن في-80 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
- اعداد محلول فورسكولين 10 مم عن طريق أضافه 64 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) إلى 5 ملغ (1.0670 μM) من فورسكولين ودوامه جيدا لأذابه تماما. ثم أضافه المياه المعقمة (1.003 مل) إلى الحل DMSO ودوامه جيدا. تخزين 12 μl القسامات من 10 مم فورسكولين في-20 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
- اعداد 12 μl القسامات من 100 mM ايزوبوتييلميثيلزانسيني (ibmx) المخفف في dmso. يخزن عند-20 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
- لجعل ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة ، مزيج 9.4 مل من متوسط نيوروقاعدي مع 200 μL من مصل الحصان (2 ٪) ، 200 μL من 50x B27 الملحق (1x) ، 100 μL من 100x الجلوتامين الملحق (1x) ، 100 μL من 10,000 U/m: البنسلين-ستربتوميسين (100 U/mL) ، و 20 μL من 25 ملم 2-mercaptoethanol (50 μM) ، ويفضل مباشره قبل الاستخدام. يمكن تنفيذ هذه الخطوة حتى يوم واحد قبل عزل الخلايا العصبية.
- فقط قبل استخدام, أضافه 1 μL كل من 100 ميكروغرام/مل BDNF (10 نانوغرام/مل), CNTF (10 نانوغرام/مل), و GDNF (10 نانوغرام/مل) و 10 μL من 10 مم فورسكولين (10 μM), و 10 μL من 100 mM IBMX (100 μM) لثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة. يسخن الوسط إلى 37 درجه مئوية.
- اعداد حلول التفكك.
- اعداد الحل بابين (20 ش/مل بابين و 0.005 ٪ dnase) ومحلول مثبط الزلال-ovomucoid (1 ملغ/مل المثبط ovomucoid ، 1mg/ml الزلال ، و 0.005 ٪ dnase) اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- اعداد 500 μl القسامات من كل من مثبطات ovomucoid وحلول بابين وتخزين في-80 درجه مئوية. ذوبان الجليد في 37 درجه مئوية علي الفور قبل الاستخدام.
5. بطني الدماغ النصفي وتشريح الحبل الشوكي
ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات التالية باستثناء الخطوات 5.1.1 − 5.1.3 و 5.1.5 − 5.1.6 تحت مجسم تشريح الفلورية. الوقت الإجمالي لتشريح التجربة هو عاده 3 − 5 ساعة ، اعتمادا علي الكفاءة في تقنيه التشريح وعدد الخلايا العصبية الحركية المطلوبة لكل تجربه.
- تشريح منتصف الدماغ البطني
- موت ببطء الماوس الحامل تقريبا 11.5 أيام بعد الإخصاب بغاز ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
- رش البطن جيدا مع الايثانول وأزاله الرحم باستخدام مقص التشريح المجهري وملقط الإبهام خلع الملابس. يغسل الرحم لفتره وجيزة في العقيمة التلفزيونية ، ثم نقل إلى لوحه تشريح مليئه المبردة المعقمة تلفزيونيا.
- أزاله IslMN: gfp-الاجنه الايجابيه بعناية من الرحم باستخدام مقص المجهرية العقيمة ، ملقط خلع الملابس الإبهام ، والملقط دومونت #5 في الجليد الباردة العقيمة التي تحت ضوء مشرق من المجهر. باستخدام المعقمة Moria مصغره مثقبه ملعقة ، نقل كل جنين إلى بئر منفصلة من 24 لوحه جيدا مليئه المبردة السبات-E منخفضه المتوسطة الفلورية تستكمل مع 1x B27. الحفاظ علي 24 لوحه جيدا علي الجليد.
- نقل جنين واحد إلى لوحه تشريح معقمه وتغطيه تماما مع الجليد الباردة عقيمه المحلول الملحي المتوازن هانك (HBSS).
- تاكد من ان يتم اجراء الخطوات تشريح تحت فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC) الاضاءه من المجهر. باستخدام ملاقط ، وأزاله الذيل ووجه الجنين دون الاضرار بالدماغ الوسطي (الشكل 2Ba). وضع الجنين عرضه مع أطرافه تمتد تحت والذيل مشيرا نحو الجبهة من المجهر ، نحو مشرح (المشار اليها بالنجمة ، الشكل 2Bb).
- باستخدام ملاقط ، شق فتح سقف البطين الرابع من أجل توليد فتحه صغيره. استخدم هذا الفتح لربط ملاقط في المساحة التي تم إنشاؤها بين البطين الرابع وسقفه. تشريح علي طول السطح الظهري من منقاري الجنين إلى القشرة والجانبية إلى لوحه الأرض وعمود المحرك (الشكل 2Ca, b). افتح النسيج الذي تم تشريحه بطريقه الكتاب المفتوح للكشف عن CN3 الايجابيه GFP و CN4 النوى.
ملاحظه: سيتم الآن كشف قطعه صغيره من الانسجه من الدماغ النصفي البطني التي تحتوي علي المسسبي ، CN3 ، و CN4. - افصل المخ البطني بعناية عن الجنين وأزل الانسجه السحائية باستخدام ملاقط وسكين ميكروتشريح. تشريح الثنائية CN3 ايجابيه GFP و CN4 نوى بعيدا عن لوحه الكلمة وغيرها من الانسجه المحيطة GFP السلبية باستخدام ملاقط وسكين ميكروتشريح (الشكل 2د). تعظيم عدد من الخلايا العصبية الحركية الايجابيه GFP في الانسجه المثيرة ولكن تجنب لمس أو اتلافها.
- إذا كان من المرغوب فيه مجموعه من نوى منفصلة CN3 و CN4 ، قطع علي طول الخط الأوسط من هذه النوى اثنين (الخط الأصفر المنقط في الشكل 2د). باستخدام ماصه P1000 ، وجمع الانسجه البطنية النصفية تشريحها مع HBSS الحد الأدنى ووضعها في المسمي 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير مليئه تشريح المتوسطة (انظر الخطوة 4.1.5). يخزن علي الجليد حتى التفكك.
- استمر في تجميع العقول الوسطي البطنية من أجنه اضافيه في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية (راجع الخطوة 8 للحصول علي أرقام الخلايا المثالية).
ملاحظه: مجموعه مجمعه من ما لا يقل عن 10 العقول الوسطي البطنية التي تنتج ما يقرب من 1 × 104 CN3/CN4 الخلايا العصبية الحركية الموصي بها لان الانسجه تخضع للإجهاد اثناء التفكك والفرز.
- تشريح الحبل الشوكي بطني
- الحفاظ علي الجنين عرضه مع الراس الذي يواجه الجبهة من المجهر ، نحو dissector. عقد الجنين مع زوج واحد من ملاقط وادراج غيض من الزوج الآخر من ملاقط في الجزء الذي لم يتم فتحها من البطين الرابع.
- فتح بقية الدماغ المؤخر والحبل الشوكي دورسالي علي مدي روروكاودال كامل من الجنين. فتح عن طريق قطع الانسجه الظهرية ، بدءا من البطين الرابع والعمل نحو القناة المركزية من الحبل الشوكي الذيليه باستخدام ملقط كمقص (الشكل 2Ca ، b). توخي الحذر لتجنب لمس أو اتلاف الحبل الشوكي البطني خلال هذا الاجراء.
- عقد الجنين مع زوج واحد من ملاقط وقرصه قباله رفرف من الانسجه الظهرية علي كل جانب مع زوج آخر من ملاقط (الشكل 2Ea ، b).
ملاحظه: تحتوي الانسجه الظهرية المثيرة علي الجلد الظهري ، والمسسبي ، والعقدة الجذرية الظهرية (DRGs) ، والدماغ الخلفي الظهري ، والحبل الشوكي. أزاله أكبر قدر ممكن من هذه الانسجه دون الاضرار النوى SMN ، لأنها لاصقه ويمكن اعتراض Smn اثناء تصفيه أو تسبب انسداد اثناء الفرز FACS. - أزاله الحبل الشوكي بطني باستخدام سكين تشريح المجهرية إلى بيرس مباشره تحت SMN ايجابيه GFP. رفع الحبل الشوكي البطني مع حركات تشبه المنشار علي كلا الجانبين (الشكل 2Fa, b). قطع الحبل الشوكي البطني العائمة بشكل مستعرض مباشره فوق C1 ، حيث أول المشاريع القرن الامامي ايجابيه GFP (الشكل 2ز). أيضا ، وقطع بشكل مستعرض في الحدود العليا من الطرف السفلي (الشكل 2ز). أزاله عنق الرحم (C1)-قطني (L2-L3) جزء من الحبل الشوكي البطني بعد هذا الاجراء.
- ضع الحبل الشوكي البطني في الجانب الظهري وامسك بالضغط علي النسيج السلبي GFP بين الاعمده SMN الايجابيه GFP مع زوج واحد من ملاقط. أزاله المتبقية mesسبي المرفقة ، DRGs ، والحبل الشوكي الظهرية عن طريق تقليم كلا الجانبين من العمود SMN ايجابيه GFP مع سكين التشريح المجهري (الشكل 2ح). رعاية لتعظيم الخلايا العصبية الحركية الايجابيه GFP دون الاضرار بها.
- باستخدام ماصه P1000 ، وجمع انسجه الحبل الشوكي البطني تشريحها مع HBSS الحد الأدنى ومكان في SMN-المسمي 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير مليئه تشريح المتوسطة. يخزن علي الجليد حتى التفكك. الاستمرار في تجميع الحبال الشوكية البطنية من أجنه اضافيه في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية.
ملاحظه: جمع ما لا يقل عن ثلاثه الحبال الشوكي البطني الغلة تقريبا 2.1 x 104 smn ينصح لان الانسجه تخضع للإجهاد اثناء التفكك والفرز. - جمع الخلايا العصبية الحركية الوجه والأطراف من IslMN: gfp الاجنه الماوس كما gfp-الايجابيه والسلبية gfp الضوابط لفرز الخلايا المنشطة فلوري (facs) ، علي التوالي. الأطراف هي السلبية GFP لان المحاور الايجابيه GFP من SMNs لم تمتد حتى الآن إلى الأطراف في هذه السن الجنينية.
6. تفكك الانسجه
ملاحظه: إجمالي وقت التفكك عاده 1.5 h لكل تجربه.
- الدافئة بابين والزلال-ovomucoid المانع المحلول قسامات إلى 37 درجه مئوية 30 دقيقه قبل التفكك.
- تدور بإيجاز أسفل الانسجه المجهرية بسرعة منخفضه.
- باستخدام ماصه P100 ، وأزاله بعناية قدر السبات E ممكن دون شفط الانسجه.
ملاحظه: تاكد من أزاله جميع المتبقية اسبات E بعد هذه الخطوة لتجنب الحد من فعاليه التفكك بابين في الخطوة التالية. - أضافه الحجم المناسب من الحل بابين (الجدول 1) لكل من أنابيب الطرد المركزي 1.7 mL التي تحتوي علي عينات الانسجه ميكروتشريح.
ملاحظه: تم تحديد الحجم المناسب من بابين لتفكك من أجل تعظيم التفكك الفعال مع تقليل الضغط علي الخلايا. - تريرات برفق 8x مع ماصه P200. تنفيذ جميع الخطوات تريلوريشن بلطف للحفاظ علي سلامه الخلايا العصبية الحركية.
- احتضان الأنابيب التي تحتوي علي الانسجه لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية ، والتحريض عن طريق الاصبع الوخز 10x كل 10 دقيقه. تريرات بلطف كل تعليق 8x مع ماصه P200 بعد الحضانة. تدور أسفل الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق.
- لضمان فعاليه تثبيط ovomucoid في الخطوة التالية ، استخدم ماصه P1000 لأزاله وتجاهل أكبر قدر ممكن من ماده طافي دون شفط الانسجه.
- أعاده التعليق الكريات في الحجم المناسب من الزلال-ovomucoid المثبط الحل (الجدول 1) بلطف تريريتينغ 8x مع ماصه P200.
- الانتظار لمده 2 دقيقه للسماح لأي قطعه المتبقية من الانسجه غير المنفصلة لتسويه إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- جمع أكبر قدر ممكن ماده طافي دون الشفط الانسجه غير المنفصلة باستخدام ماصه P200. نقل ماده طافي إلى جديد 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير.
- إذا بقيت بعض قطع الانسجه غير منفصلة بعد الخطوة 6.10 ، كرر الخطوات 6.8 − 6-10 للانسجه غير المنفصلة التي تبقي في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.7 mL الاصليه لتعظيم الغلة النهائية للخلايا المنفصلة مع تقليل الضغط علي الخلايا فصل سابقا ، الواردة في ماده طافي من الخطوة 6.10.
- تدور الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق بعناية أزاله وتجاهل ماده طافي باستخدام ماصه P1000.
- أعاده تعليق بيليه في الحجم المناسب من المتوسطة تشريح (الجدول 1) عن طريق التنضيد 8x باستخدام ماصه P1000. تم تحديد الحجم المناسب من التعليق النهائي بحيث كثافة الخلية لا تتجاوز 107 خلايا/مل ، والتي يمكن ان تسد تيار اله تدفق الخلوي ، ولكن أيضا بحيث لا تضعف الخلايا بشكل مفرط ، مما يؤدي إلى تباطؤ سرعه الفرز.
- تصفيه التعليقات من خلال مصافي الخلية 70 μm للقضاء علي اي كتل كبيره أو الانسجه غير مهضوم. نقل تعليق إلى 5 مل جولة أسفل أنابيب البوليسترين اختبار وتخزين علي الجليد حتى المطلوبة.
7-الفرز الخلوي المنشط الفلوري (FACS)
ملاحظه: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام فأرز FACS مجهزه 15 ميغاواط 405 nm الليزر البنفسجي, 100 mw 488 nm الليزر الأزرق, 75 mw 594 nm البرتقالي الليزر, و 40 mw 640 nm الليزر الأحمر. تم فرز الخلايا كما السائل غمد في العقيمة التلفزيونية تحت ظروف العقيم من خلال فوهه 100 μm. من أجل تقليل إجهاد الخلايا ، تم تعيين معدل التدفق إلى ضغط عينه من 1 − 3 ، بحيث تم الحصول علي الحد الأقصى من الاحداث 1000 − 4000 في الثانية. وعاده ما يكون الوقت الإجمالي لهذه الاختبارات 1 − 2 h لكل تجربه.
- اعداد الفولتية للامام والجانب مبعثر بحيث يمكن تصور السكان الخلية بشكل صحيح. اعداد الفولتية المناسبة لفرز الخلايا معقده ويتطلب عامل التشغيل FACS من ذوي الخبرة.
- للتمييز بين مجموعات الخلايا المختلفة ، وخلايا المؤامرة علي أساس الحجم كما هو محدد من قبل منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل التعقيد الداخلي كما هو محدد من قبل منطقه مبعثر الجانب (SSC-A). رسم بوابه حول الخلايا الحية كما هو مبين في الشكل 3Aa والشكل Ba لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة. تجميع الخلايا داخل المنطقة المسورة كعدد السكان 1 (P1).
- لاستبعاد كتل الخلايا والمشككات ، ارسم الخلايا P1 التالية استنادا إلى عرض التشتت الجانبي (SSC-W) مقابل SSC-A. بوابه السكان من خلايا واحده كما السكان 2 (P2) (الشكل 3Ab والشكل Bb).
- مؤامرة الخلايا P2 استنادا إلى العرض المبعثر إلى الامام (FSC-W) مقابل FSC-A وبوابه السكان من خلايا واحده كما السكان 3 (P3) (الشكل 3Ac والشكل Bc).
ملاحظه: استخدام بوابتين متتاليتين في 7.3 و 7.4 يستبعد كتل الخلية والمشككات (عاليه FSC-W وارتفاع FSC-A). - البوابة P3 الخلايا علي أساس GFP مقابل الوفيكوسيانين (APC). تكتشف قناه APC الفلورية التلقائية. النابض علي هذه القناة يتجنب التقاط الخلايا الفلورية التلقائية. استخدام الخلايا السلبية GFP لضبط الجهد لقناات الفلورسنت FITC/GFP. من الناحية المثالية ، وضع بوابات لهذه الخلايا السكان حوالي 102. حدد عتبات البوابة للسكان الإيجابيين من GFP 4 (P4) بشكل فردي لكل نوع من الخلايا العصبية الحركية (الشكل 3الإعلان والشكل Bd).
ملاحظه: تعيين بوابه GFP اعلي بكثير ل SMNs من ل CN3s/CN4s من أجل الحصول علي ثقافة نقيه (الشكل 3الإعلان والشكل Bd). وهناك بوابه اقل GFP للثقافات SMN يؤدي إلى تلوث الثقافات من قبل الخلايا العصبية غير المتحركة وغير الحركية. وهذا من المرجح لان هناك منخفضه المستوي التعبير GFP في بعض الخلايا العصبية غير الحركية وغير حركيه بسبب المروج راشح. النسبة المئوية للخلايا الموجبة GFP بالمقارنة مع إجمالي الخلايا عاده 0.5 − 1.5% ل CN3s/CN4s و 1.5 − 2.5% ل SMNs. إذا كان تشريح ناجحه ، ويمكن استخدام هذه الأرقام كمعيار لتحديد الموقف المناسب لبوابه ايجابيه GFP (الشكل 3Ae والشكل يكون). - تنفيذ FACS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. جمع الخلايا P4 في جديده 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي الصغيرة مليئه 500 μL من المحركات العصبية المتوسطة للثقافة. يخزن علي الثلج حتى الطلاء.
ملاحظه: علي الرغم من ان الخلايا يمكن فرزها مباشره في الآبار ، وهذا يؤدي إلى عدد غير متساو من الخلايا في البئر. فرز الخلايا في 1.75 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير ومن ثم لوحه يدويا من أجل تحقيق توزيع أكثر حتى الطلاء.
8. ثقافة المحركات العصبية الاوليه المنقية
- تمييع FACS-معزولة CN3/CN4 والمعلقات SMN مع ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة الحرارة إلى 37 درجه مئوية إلى كثافة من 5 × 103 و 1 × 104 خلايا/مل ، علي التوالي.
ملاحظه: واحده [ا] 11.5 ينتج جنين تقريبا 1 [اكس] 103 CN3/CN4 و 7 [اكس] 103 [سمن]. ومع ذلك ، هذه الغلة تعتمد بشكل كبير علي نقاء الانسجه تشريح ، ودقه تفكك الخلية ، والدرس المناسب من بوابات GFP خلال FACS. - نقل 96 لوحات جيدا بريكواتد مع pdl و laminin من 37 درجه مئوية الانسجه الثقافة حاضنه إلى غطاء المحرك الرقائقي ويستنشق laminin من كل بئر. استخدام لوحات والشفتين علي الفور دون غسل.
- أضافه 200 μL من المخفف CN3/CN4 والمعلقات SMN في كل بئر من PDL/laminin المغلفة بشكل جيد 96 لوحات. يجب ان تكون كثافة الخلايا النهائية 1 × 103 و 2 × 103 خلايا/بئر ل CN3/CN4 و smn ، علي التوالي.
ملاحظه: 96 - ثقافة الخلايا العصبية في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
- تغذيه الخلايا العصبية كل 5 أيام عن طريق أزاله نصف وسائل الاعلام القديمة (100 μL) واستبدال مع نفس الحجم من المحركات الطازجة ثقافة الخلايا العصبية المتوسطة. تاكد من ان العمليات العصبية تصبح مرئية علي 1 DIV وتصبح أكثر سمكا وأطول بنسبه 14 DIV (الشكل 4). وتصبح أجسام الخلايا العصبية متضخمة وتميل إلى التجميع في الثقافات الطويلة الأجل ، ولا سيما بالنسبة إلى SMNs (الشكل 4).
ملاحظه: اجراء جميع التغييرات المتوسطة والحل عن طريق ترك نصف حجم المتوسطة الاصليه من أجل تجنب فصل الخلايا المثقفة. ويشمل ذلك خطوات التثبيت والكيمياء المناعية (ICC). إذا تمت أزاله جميع وسائل الاعلام ، بغض بالطريقة التي بلطف ، فان معظم الخلايا فصل ويتم غسلها بعيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذا البروتوكول هو تنقيه عاليه والثقافة علي حد سواء الابتدائية CN3s/CN4s و SMNs طويلة الأجل لتمكين التحليلات المقارنة للأليات الكامنة وراء اضطرابات الخلايا العصبية الحركية (انظر الشكل 1 والشكل 2 لنظره عامه).
وبمجرد ان تم بنجاح عزل الخلايا العصبية وزراعتها في الثقافة ، تم الحصول علي ثقافات CN3/CN4 و SMN الاوليه النقية تقريبا (الشكل 5 ا،ب) وابقي عليها لما لا يقل عن 14 DIV (الشكل4 والشكل 6). وكانت نقاء CN3/CN4 والثقافات SMN في 2 DIV 93.5 ± 2.2 ٪ و 86.7 ± 4.7 ٪ ، علي التوالي ، عند تقييمها من قبل ICC باستخدام علامة الخلايا العصبية الحركية Islet1 وعلامة الخلايا العصبية TUJ1 (الشكل 5ب). ومع ذلك ، اعتمدت هذه النقاء العالية بشكل كبير علي عمر الاجنه وعلي تحديد عتبات مناسبه لبوابات GFP خلال الإطار العام للمخاطر (الرسم البياني 3). تشريح الاجنه في E 10.5 أكثر صعوبة من تشريح في E 11.5 بسبب زيادة ليونة والتصاق الانسجه ، مما ادي إلى انخفاض غله الخلايا العصبية الحركية. ومع ذلك ، كانت نقاء البريد 10.5 CN3s/CN4s و SMNs مماثله لتلك الخاصة بالاجنه من المجموعة 11.5 (92.8 في المائة و 82.2 في المائة في 2 من الرتبة الكترونيه ، علي التوالي ؛ البيانات التي تم الحصول عليها من تجربه واحده). نقاء CN3s/CN4s و SMNs انخفضت بشكل كبير عندما تم استخدام الاجنه E 13.5 ، حتى لو تم جمع اعلي السكان ايجابيه GFP فقط (20.7 ٪ و 7.4 ٪ في 2 DIV ، علي التوالي ؛ البيانات التي تم الحصول عليها من تجربه واحده) ، ربما بسبب التعبير عن GFP في الخلايا العصبية غير الحركية (الشكل 7 وكان هذا الاتجاه نفسه صحيحا أيضا بالنسبة للثقافات E 12.5 ، علي الرغم من انها كانت اقل دراماتيكية بكثير. ولذلك ، فان الاجنه عند 12.5 أو أكثر غير مناسبه للاستخدام في تنقيه الخلايا العصبية الحركية باستخدام هذا البروتوكول.
الثقافات العصبية الحركية النقية هي قيمه لفهم أنماط النمو المعزولة ، والسلوكيات ، ونقاط الضعف من الخلايا العصبية الحركية. يوضح هذا المثال كيف يمكن استخدام هذه الثقافات لاختبار استجابات الخلايا العصبية الحركية للمعالجة الكيميائية. لتحديد ما إذا كان الاساسيه CN3s/CN4s و SMNs تظهر الاستجابات التفاضلية لعوامل الإجهاد الشبكية الاندوبلازميه (ER) ، تم الحصول علي الاحاديه الاساسيه من CN3s/CN4s و SMNs باستخدام هذا البروتوكول وتعامل مع تركيزات متفاوتة من الإجهاد ER ، حمض سيكلوازينك (CPA). تم التعامل مع الخلايا العصبية مع CPA (5 ، 10 ، 15 ، 20 ، 25 ، أو 30 μM) أو السيطرة علي المركبات (DMSO) في 2 DIV وثابته بعد 3 أيام للمحكمة الجنائية الدولية لتقييم نسب البقاء علي قيد الحياة (الشكل 8ا). وتم حساب عدد الخلايا العصبية القابلة للاستمرار في كل عينه ، وحسبت نسب البقاء علي قيد الحياة باعتبارها عدد الزنزانات القابلة للاستمرار في الآبار المعالجة بالمخدرات مقسوما علي عدد الخلايا القابلة للاستمرار في الآبار المعالجة بواسطة DMSO. وكانت CN3/CN4 الاحاديه أكثر مقاومه بشكل ملحوظ للعلاج بتكلفه الاكتساب (10 − 25 μM) بالمقارنة مع النسبة الاحاديه للعين (الشكل 9 والشكل 8ب)31.
في الختام ، يسمح هذا البروتوكول لتوليد الفاره الابتدائية عاليه النقاء الجنينية CN3/CN4 والثقافات SMN التي توفر نظام قوي وموثوق به للتحقيق في السلوك العصبية.
الشكل 1: مخطط لاعداد الخلايا العصبية الحركية الفئران الجنينية. التخطيطي يوضح الخطوات التي ينطوي عليها العزلة والثقافة من الخلايا العصبية الحركية الماوس الجنينية والوقت التقريبي في ساعات أو أيام لكل خطوه. ترتيب الاجراء تشريح ل CN3/CN4 و SMN هي المسمي كل بالتسلسل 1 إلى 4. المختصرات: CN3/CN4 = محرك للعين العصبية/الخلايا العصبية trochlear; SMN = العصبية الحركية الشوكي; FACS = الفرز الخلوي المنشط الفلوري ؛ h = ساعة ؛ د = اليوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح منتصف الدماغ البطني وعنق الرحم (C1)-القطني (L2-L3) جزء من الحبل الشوكي البطني. (ا) الجانبية (ا) والظهرية (ب) وجات النظر من الخلايا العصبية الحركية الايجابيه Gfp في e 11.5 IslMN: جنين الماوس المحور وراثيا GFP تحت الاضاءه فلوريسئين ايزوثيسيانات (fitc). وقد تم اعداد الجنين بأكمله E 11.5 علي النحو الموصوف سابقا32 من أجل جعل الجنين شفافا. وبعد ذلك ، تم تحليل الجنين بواسطة وضع العلامات المناعية مع تلطيخ المضادة GFP (الأخضر). تم التقاط الصور تحت مجهر بؤري. قضبان المقياس = 200 μm (العرض الجانبي) و 400 μm (الرؤية الظهرية). المختصرات: S = متفوقة; انا = ادني ؛ V = البطني; D = الظهرية. (ب-ح) وأبرزت خطوات تشريح علي الصور من E 11.5 بطني الدماغ وانسجه الحبل الشوكي بطني أخذت مع كاميرا مجهزه تحت الضوء الساطع (Bb) أو الاضاءه FITC باستخدام الفلورية تشريح المجسم. قضبان المقياس = 200 μm (D) ، و 1 مم (ا − C ، E − H). (ب) (ا) أزاله وجه الجنين وذيله بالقطع علي طول الخطوط الحمراء. (ب) الاجنه التي توضع لتشريح الجنين. ويشار إلى تحديد المواقع من الجبهة من المجهر بالنجمة. (ج) قطع علي طول الخط الأحمر الصلبة من أجل شق فتح سقف البطين الرابع (ا) المنظر الجانبي و (ب) الرؤية الظهرية. استخدام هذا الفتح لقطع علي طول سطح الجنين الظهرية إلى الدماغ (المسار المشار اليه من قبل السهم الأحمر متقطع). وهذا يكشف الانسجه التي تحتوي علي المسسبي ، CN3 ، و CN4 ، والتي يمكن ان ترفع من الجمجمة. لتشريح smn ، ادراج ملقط في نفس الفتحة بين البطين الرابع وسقفه ، ثم قطع نحو الجانب الذيليه من الجنين (مسار المشار اليها من قبل السهم الأصفر متقطع). (د) المنظر النهائي للدماغ الوسطي البطني الذي يحتوي علي CN3 الثنائية الايجابيه gfp و CN4 نوى. يتم تمييز حواف النسيج بواسطة مستطيل احمر. قطع علي طول الخط الأصفر المنقط لجمع CN3 و CN4 نوى علي حده ، إذا رغبت في ذلك. (ه) بعد فتح بقية الدماغ المؤخر والحبل الشوكي ، والانسجه الظهرية ترفرف قباله الخطوط الحمراء علي كلا الجانبين مع ملاقط (ا) قبل ، و (ب) بعد. (و) الازاله الثنائية للانسجه الزائدة البطنية إلى الحبل الشوكي علي طول الخط الأحمر (ا) قبل و (ب) بعد. (ز) قطع الحبل الشوكي البطني في الموقعين المشار اليهما بالخطوط الحمراء. علي الجانب منقاري ، وقطع من الحبل الشوكي البطني العائمة بشكل مستعرض فوق C1 حيث أول المشاريع القرن الامامي ايجابيه gfp. قطع من نهاية الذيليه من الحبل الشوكي بشكل مستعرض في الحدود العليا من الطرف السفلي. وبمجرد اجراء هذه التخفيضات ، يمكن تشريح عنق الرحم (C1) من خلال الجزء القطني (L2-L3) من الحبل الشوكي البطني بعيدا. (ح) المنظر النهائي لحبل الشوكي البطني الذي يحتوي علي أعمده smn ايجابيه من gfp. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المؤامرات التمثيلية من الدماغ البطني (A) والحبال الشوكية البطنية (B). (Aa و Ba) منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل منطقه مبعثر الجانب (SSC-A) فرز مؤامرة قبل استبعاد الحطام والخلايا الميتة. (Ab, Bb, Ac, Bc) المؤامرات المفروزة لاستبعاد كتل الخلايا (b) والمشككات (ج) استنادا إلى العرض (ssc-w) مقابل ssc-a والعرض المبعثر إلى الامام (fsc-w) مقابل Fsc-a ، علي التوالي. (Ad و Bd) المؤامرات فرزها لعزل IslMN: gfp -الخلايا العصبية الحركية الايجابيه. من أجل الحصول علي ثقافة نقيه ، يجب تعيين بوابه GFP اعلي ل SMNs (Bd) من ل CN3s/CN4s (Ad). (Ae و Be) النسب المئوية للخلايا المسورة للتجميع بواسطة الفرز FACS. يمثل % الأصل النسبة المئوية للخلايا في المحتوي الحالي المسور بالنسبة إلى عدد الخلايا في محتويات الخلايا المسورة السابقة ، بينما يمثل % total النسبة المئوية للخلايا المسورة نسبه إلى إجمالي الخلايا. النسب المئوية المتوقعة من الخلايا الايجابيه GFP بالمقارنة مع إجمالي الخلايا (محاصر باللون الأحمر) هي 0.5 − 1.5 ٪ ل CN3/CN4 و 1.5 − 2.5 ٪ ل SMN. إذا تم اجراء تشريح بنجاح ، ويمكن استخدام هذه النسب كمعيار لاعداد بوابه ايجابيه GFP في (Ad و Bd). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور علي النقيض من المرحلة الابتدائية CN3/CN4 و SMN الاحاديه في 2 و 7 و 14 DIV. تم التقاط صور التداخل التفاضلي التمثيلي للثقافات CN3/CN4 و SMN الاساسيه في 2 و 7 و 14 DIV مع المجهر الفلوري المقلوب باستخدام برامج الحصول علي الصور المقابلة ومعالجتها وأهداف 40x. أصبحت العمليات العصبية أكثر سمكا وأطول من قبل 14 DIV. أصبحت احجام الخلايا العصبية الجسم الموسع وتميل إلى التجميع في الثقافات علي المدى الطويل ، وخاصه بالنسبة SMNs. ويمكن الحفاظ علي كلا الثقافتين علي الأقل 14 DIV. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: توصيفات الماوس المعزول e 11.5 CN3/CN4 والثقافات SMN. (ا) الصور المناعية التمثيلية من e 11.5 الماوس CN3s/CN4s (اعلي) و smns (أسفل) مثقف ل 2 DIV. وضع العلامات المناعية مع علامة الخلايا العصبية TUJ1 (الأخضر) وعلامة الخلايا العصبية الحركية Islet1 (الأحمر) التي أجريت لتحليل الخلايا العصبية تقريبا كانت جميع الخلايا المثقفة الحركية العصبية (TUJ1 +،Islet1 +). تم القبض علي الصور مع المجهر الفلوري المقلوب باستخدام المقابلة الحصول علي صوره ومعالجه البرمجيات و 20x الأهداف. تم تصميم العينات ومعالجتها لتحقيق اقصي كثافة للاشاره دون البيكسلات المشبعة. وقد أجريت جميع الاعمال المجهرية ومعالجه الصور في الأرقام التالية في هذه الظروف ما لم ينص علي خلاف ذلك. شريط مقياس = 100 μm. (ب) نقاء من e 11.5 الماوس CN3/CN4 والثقافات smn في 2 DIV. وكانت نقاء CN3/CN4 و SMN الثقافات 93.5 ± 2.2 ٪ و 86.7 ± 4.7 ٪ ، علي التوالي. وتم تقييم أجسام الخلايا العصبية الميتة عن طريق فحص المورفولوجية النووية المحرقة وتورم الغشاء. وقد صنفت عمليات الخلايا العصبية علي انها عمليات أزاله التوليد عندما لوحظت علامات الحصى والتورم. واعتبرت الخلايا مع عدم وفاه الجسم الخلية ولا عمليات توليد الخلايا العصبية قابله للحياة غير الحركية (TUJ1 +، Islet1-) أو الخلاياالعصبيةالحركية قابله للحياة (TUJ1 +،Islet1 +)33. تم حساب نقاء ثقافات الخلايا العصبية الحركية كعدد من الخلايا العصبية الحركية القابلة للحياة مقسوما علي العدد الإجمالي للخلايا العصبية غير الحركية القابلة للاستمرار بالاضافه إلى خلايا عصبيه حركيه. تمثل القيم المتوسط ± SEM لثلاث تجارب منفصلة. ليست كبيره (p > 0.05) بواسطة اختبار t الطالب. تم اجراء جرد الخلايا يدويا تحت التكبير 20x. اختصارات: [سم] = خطا معياريه من الوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: المناعية التمثيلية لCN3/CN4 الابتدائية والاحاديه SMN في 2 و 7 و 14 DIV. تم تحليل الاساسيه CN3/CN4 والثقافات SMN في 2, 7, 14 DIV بواسطة وضع العلامات المناعي مع TUJ1 (الأخضر), وكانت النوى الملطخة مع DAPI (الأزرق). العمليات العصبية تصبح أكثر سمكا وأطول من قبل 14 DIV. أصبحت احجام الخلايا العصبية الجسم الموسع وتميل إلى التجميع في الثقافات علي المدى الطويل ، وخاصه بالنسبة SMNs. يمكن الحفاظ علي كل من الثقافات CN3/CN4 و SMN علي الأقل 14 DIV. تم التقاط الصور تحت تكبير 10x. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: توصيف e 13.5 الماوس CN3/CN4 و SMN الثقافات المعزولة. تم عزل e 13.5 CN3/CN4 و SMN ومثقف باستخدام هذا البروتوكول وتحليلها في 2 DIV عن طريق وضع العلامات المناعي مع TUJ1 (الأخضر) و Islet1 (الأحمر) ، وكانت النوى الملطخة مع DAPI (الأزرق). العديد من الخلايا العصبية غير الحركية (TUJ1 +, Islet1-) كانت موجودة (الأسهم) مما ادي إلى انخفاض حاد في كل من CN3/CN4 ونقاء smn, مع انخفاض أكثر وضوحا في الثقافات smn. تم التقاط الصور تحت التكبير 20x. شريط مقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التطبيق التمثيلي للثقافة العصبية الحركية الاوليه مما يدل علي ان CN3s/CN4s هي مقاومه انتقائية للإجهاد الذي يسببه اتفاق السلام الشامل. (ا) المخطط التجريبي: تمت معالجه الCN3 الابتدائية الاوليه/CN4 و smn باستخدام وحده التقييم الشامل أو التحكم في المركبات (dmso) في 2 DIV وقيمت القدرات الخلوية من خلال التحليل المناعي بعد 3 أيام من العلاج. تم تعديل هذا المخطط التفصيلي من العمل المنشور31. (ب) القياس الكمي لنسب البقاء علي قيد الحياة من CN3s/CN4s و smns تعامل مع 5 − 30 ميكرومتر CPA لمده 3 أيام من 2 DIV. تم تحليل الخلايا العصبية بواسطة وضع العلامات المناعية للخلايا مع TUJ1 ، وكانت النوى ملطخه مع dapi. وحسبت نسب البقاء علي قيد الحياة علي انها عدد الخلايا القابلة للاستمرار (انظر الشكل 5ب ) في الآبار المعالجة بالمخدرات مقسوما علي عدد الخلايا القابلة للاستمرار في الآبار التي تحتوي علي مركبه وحدها (dmso). تم اجراء جرد الخلايا يدويا تحت التكبير 20x. تمثل القيم المتوسط ± SEM لأربع تجارب منفصلة. * ف < 0.05 ؛ p < 0.005 بواسطة اختبار t الطالب. وقد تم تعديل هذا الرقم من العمل المنشور سابقا31. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: المناعية التمثيلية لCN3 الابتدائية/CN4 و SMN الاحاديه بعد التعرض لمده 3 أيام لزيادة تركيزات CPA بدءا من 2 DIV. تم تحليل الخلايا العصبية عن طريق وضع العلامات المناعية للخلايا مع TUJ1 (الأخضر) والنوى وكانت ملطخه DAPI (الأزرق). الابتدائية CN3s/CN4s كانت أكثر مقاومه للعلاج CPA من SMNs الاساسيه. تم التقاط الصور تحت تكبير 10x. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| عدد العقول المتوسطة (X) | بابين | ألبومين-ovomucoid | اسبات E | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| عدد الحبال الشوكية (Y) | بابين | ألبومين-ovomucoid | اسبات E | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
الجدول 1: الاحجام المناسبة من الباباين ، الزلال-ovomucoid ، والتعليق النهائي المستخدمة في خطوات التفكك. تم تعديل المجلدات المناسبة من بابين والزلال-ovomucoid لاستخدامها مع اعداد مختلفه من انسجه النخاع الشوكي البطني والبطني البطيني من تعليمات الشركة المصنعة بعد عده جولات من التحسين. لان الانسجه تخضع للإجهاد اثناء التفكك والفرز ، ويوصي مجموعه مجمعه من أكثر من 10 الدماغ النصفي البطني وأكثر من ثلاثه الحبال الشوكية البطنية. تم تحديد حجم بابين من خلال النظر في التوازن بين التفكك الفعال والإجهاد من هذا الاجراء. حجم المحلول المثبط ovomucoid الزلال هو نصف ذلك من papain. تم تحديد الحجم المناسب من اسبات E التعليق النهائي بحيث كثافة الخلية لا يتجاوز 107 خلايا/مل ، ولكن لا تصبح الخلايا المخففة بشكل مفرط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تاريخيا, في المختبر الدراسات من الخلايا العصبية CN3 و/أو CN4 الحركية قد اعتمدت علي ثقافات غير متجانسة مثل الفصل17,18,19,20,21, شرح17,22,23,24,25,26, وشريحة27,28 الثقافات, لان هذه الخلايا لا يمكن تمييزها عن الخلايا المحيطة استنادا إلى الحجم ، ولم يتم الإبلاغ عن علامات محدده لهذه الخلايا. هذا البروتوكول هو وسيله شامله للعزل وثقافة الاوليه E 11.5 murine CN3s/CN4s ، و SMNs من نفس الاجنه وتاكيد نقاء عاليه من الثقافات. من خلال توليد SMN نقيه و CN3/CN4 الثقافات من نفس الاجنه الفئران ، وبروتوكول يتيح مقارنات الخاضعة للرقابة من السلوكيات في المختبر من CN3s/CN4s مقابل Smn معزولة من نوع البرية ، فضلا عن الاجنه متحولة.
الثقافات النقية من CN3s/CN4s و SMNs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول تسمح باجراء دراسات مقارنه للخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية لهذه الخلايا العصبية الحركية.
هناك خطوات متعددة في هذا البروتوكول التي تعتبر حاسمه لتعظيم عدد الخلايا العصبية الحركية النقية والصحية في نظام الثقافة المعزولة. خلال تشريح ، يجب ان تكون الانسجه السلبية GFP (علي سبيل المثال ، المسسبي و DRGs) أزاله الأقصى دون الاضرار بالخلايا العصبية الحركية ، لان هذه الانسجه هي لاصقه ويمكن اعتراض SMNs اثناء تصفيه أو تسبب انسداد اثناء الفرز FACS. اثناء تفكك الانسجه ، يجب استخدام الحد الأدنى من الحجم الأساسي من البابين ، ويجب ان تعامل الخلايا برفق مع الحد الأدنى ولكن كافيه. تم استخدام بابين لخطوه تفكك الانسجه في هذا البروتوكول ، لان البيانات الاوليه أشارت إلى انها اقل تدميرا من التريبسين إلى كل من CN3/CN4 و SMN. نسب البقاء علي قيد الحياة علي أساس أرقام مطليه من CN3s/CN4s و smns في 2 DIV زيادة من 39.5 ٪ إلى 52.7 ٪ ومن 52.3 ٪ إلى 58.4 ٪ ، علي التوالي ، عندما تم استخدام بابين بدلا من التريبسين (0.25 ٪ ، 4 الحضانة دقيقه). علي الرغم من ان هذه الأرقام مشتقه من تجربه واحده أجريت قبل التحسين الكامل, تقارير اضافيه تشير أيضا إلى ان التريبسينهو أمثل أمثل لاستخراج الخلايا من انسجه الجهازالعصبي 12,34,35,36. خلال FACS ، والاصباغ الحيوية الفلورسنت (بروبيديوم يوديد والأزرق calcein) وفوهات الفرز الصغيرة (علي سبيل المثال ، 70 μm) لا ينبغي ان تستخدم ، لأنها تضر ببقاء الخلايا العصبية الحركية. ينصح بشده استخدام فوات الفرز الكبيرة (100 μm أو أكبر) ، لان موت الخلايا SMN يزيد بشكل كبير عند استخدام فوهه 70 μm. وضع عتبات النابضة المناسبة للخلايا الايجابيه GFP في FACS خطوه حاسمه من أجل الحصول علي الثقافات البحتة. وتستكمل ثقافات الخلايا العصبية الحركية مع فورسكولين ، IBMX ، وعوامل النمو (BDNF ، CNTF ، و GDNF). وقد تم الإبلاغ عن فورسكولين و ibmx لتعزيز البقاء علي قيد الحياة smn37,38. البيانات الاوليه من الدراسات الحالية تشير إلى ان فورسكولين و IBMX أيضا زيادة CN3/CN4 البقاء علي قيد الحياة. نسبه البقاء علي قيد الحياة علي أساس أرقام مطليه من CN3s/CN4s في 2 DIV زيادة من 17.5 ٪ إلى 26.9 ٪ ، 31.9 ٪ ، و 37.0 ٪ عندما IBMX ، فورسكولين ، و IBMX + فورسكولين تمت اضافتها ، علي التوالي (وتستند الأرقام علي تجربه واحده يتم تنفيذها قبل الأمثل الكامل للظروف ثقافة الخلية). فمن الأفضل لاجراء جميع التغييرات المتوسطة ويغسل من الخلايا المستزرعة عن طريق ترك نصف حجم الأصلي لتجنب فصل الخلايا المستزرعة. وأخيرا ، بل هو أيضا مثالي للحد من الوقت الذي يقضيه بين تشريح والطلاء من الخلايا العصبية الحركية (علي سبيل المثال ، عن طريق تقصير وقت التشريح باستخدام العديد من التشوات) لتحسين مقومات البقاء للثقافات.
وهناك أربع مشاكل محتمله رئيسيه قد تنشا عند اتباع هذا البروتوكول. الأول هو انخفاض الغلة من الخلايا العصبية الحركية بعد FACS. وتشمل الأسباب المحتملة لانخفاض الغلة استخدام الاجنه الشابة (علي سبيل المثال ، والمشكلة المحتملة الثانية هي النقاء المنخفض لثقافات الخلايا العصبية الحركية ، التي تنشا علي الأرجح من استخدام الاجنه القديمة (علي سبيل المثال ، E 12.5) و/أو من وضع بوابه الايجابيه GFP منخفضه جدا خلال FACS. ثالثا ، يمكن ملاحظه عدد قليل من الخلايا العصبية الحركية المرفقة في الثقافة بسبب الفرز غير المناسب و/أو طلاء PDL/laminin غير كافيه من لوحات/coverslips. رابعا ، يمكن ان تظهر الخلايا العصبية الحركية بقاء منخفضه في الثقافة. كما ان استخدام الكواشف غير الطازجة و/أو التركيزات غير المناسبة يمكن ان يضعف النتائج التجريبية.
وهناك ثلاثه قيود رئيسيه علي هذا البروتوكول. IslMN: gfp الفئران المحورة وراثيا و facs الفرز علي حد سواء مكلفه إلى حد ما. ومع ذلك ، فهي حاسمه بالنسبة لهذا البروتوكول حيث لا توجد حاليا طريقه بديله قادره علي توليد CN3s/CN4s عاليه النقاء بطريقه أكثر اقتصادا. هناك نافذه صغيره E 10.5-E 12.5 العمر للفئران الجنينية ، وانه من الصعب التاكد من ان الاجنه الذين تتراوح أعمارهم بين المناسبة موجودة ، وخاصه إذا كان جهاز الموجات فوق الصوتية غير متوفر. إذا كانت مطلوبه فقط smns نقيه ، فانها يمكن ان تكون مستمده من الاجنه الفاره ه 12.5-15.0 باستخدام أساليب مثل التدرج طرد10،11،12 و/أو p75ntr-الأجسام المضادة القائمة علي خليه فرز تقنيات بالغسل13،14،15،16. وأخيرا ، الاختبارات القائمة علي البروتين التي تتطلب كميه كبيره من مواد البداية ليست ممكنة من هذه الثقافات بسبب الغلة الصغيرة من الخلايا العصبية الحركية (وخاصه CN3s/CN4s). الخلايا الجذعية المستمدة من الخلية العصبية الحركية31،39، والتي يمكن إنشاؤها بشكل غير محدود ، يمكن نظريا ان تستبدل لهذا الغرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر بريجيت Pettmann (Biogen ، كامبريدج ، MA ، الولايات الامريكيه) للتعليم في تقنيات تشريح SMN ؛ A.A. Nugent, A.P. Tenney, ع لي, E.H. نغوين, م فاروقي روز, أعضاء مختبر Engle اضافيه, والمشروع ALS أعضاء الاتحاد للمساعدة التقنية ومناقشه مدروس. تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع ALS. الاضافه إلى ذلك ، تم تمويل R.F. من قبل مؤسسه القلب اليابان/باير ياكوهين منحه البحوث في الخارج ومنحه التدريب المعاهد القومية للصحة في علم الوراثة T32 GM007748 ؛ تم دعم جي جاي من قبل برنامج التدريب المعاهد القومية للصحة/NEI في القواعد الجزيئية للامراض العين (5T32EY007145-16) من خلال Schepens معهد بحوث العين والتنمية العصبية برنامج التدريب دكتوراه زمالة (5T32EY007145-19) من خلال مستشفي الأطفال بوسطن; وكانت الشركة مدعومة من قبل NEI (5K08EY027850) ومؤسسه طب العيون في مستشفي الأطفال (جائزه كليه ديسكفري) ؛ و E.C.E. هو باحث في معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
