Summary
Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.
Abstract
Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) vertonen opmerkelijke weerstand tegen degeneratieve motorische neuron ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) in vergelijking met spinale motorneuronen (Smn's). De mogelijkheid om de primaire muis CN3s, CN4s en Smn's te isoleren en te cultuur zou een aanpak bieden voor het bestuderen van mechanismen die aan deze selectieve kwetsbaarheid ten grondslag liggen. Tot op heden maken de meeste protocollen gebruik van heterogene celculturen, wat de interpretatie van experimentele uitkomsten kan Verdoe- Om de problemen in verband met gemengde celpopulaties te minimaliseren, zijn zuivere culturen onmisbaar. Hier beschrijft het eerste protocol gedetailleerd hoe efficiënt CN3s/CN4s naast SMNs-tegenhangers uit dezelfde embryo's te zuiveren en te cultiveren met behulp van embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muis embryo's. Het protocol bevat details over de weefsel dissectie en dissociatie, FACS-gebaseerde celisolatie, en in vitro teelt van cellen uit CN3/CN4 en SMN kernen. Dit protocol voegt een roman in vitro CN3/CN4 cultuur systeem toe aan bestaande protocollen en biedt tegelijkertijd een zuivere soort en leeftijdsgebonden SMN-cultuur ter vergelijking. Analyses gericht op de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van motorneuronen zijn haalbaar in dit cultuur systeem. Dit protocol zal onderzoek mogelijk maken naar de mechanismen die de ontwikkeling van motorische neuron, selectieve kwetsbaarheid en ziekte bepalen.
Introduction
De cultuur van primaire motorneuronen is een krachtig hulpmiddel dat de studie van neuronale ontwikkeling, functie, en gevoeligheid voor exogene stressoren mogelijk maakt. Motorische neuron culturen zijn vooral nuttig voor de studie van neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (als)1,2, waarvande ziekte mechanismen zijn niet volledig begrepen. Belangwekkend, ondanks de significante celdood van wervelkolom motorneuronen (smn's) in zowel als patiënten en als model muizen, celdood in Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) zijn relatief schaars1,3,4,5,6,7,8,9. Daarom kunnen vergelijkende analyses van zuivere culturen van CN3s/CN4s en Smn's belangrijke aanwijzingen geven over mechanismen die onderliggende relatieve kwetsbaarheid vormen. Helaas is een belangrijke barrière voor dergelijke analyses het onvermogen om gezuiverde culturen van deze motorneuronen te kweken.
Veel protocollen zijn beschreven voor de zuivering van Smn's uit diermodellen. De meeste van deze protocollen maken gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren10,11,12 en/of P75NTR-antilichaam-gebaseerde cel-Sorteer pannen technieken13,14,15,16. Met dichtheidsgradiënt centrifugeren wordt de grotere grootte van Smn's ten opzichte van andere spinale cellen benut, terwijl P75NTR een extracellulair eiwit is dat uitsluitend door smn's in het ruggenmerg wordt uitgedrukt. Bijna 100% zuivere SMN-culturen zijn gegenereerd door een of beide van deze protocollen11,12,14. Deze protocollen zijn echter niet gelukt bij het genereren van CN3/CN4-culturen omdat CN3s/CN4s geen P75NTRExpress en andere specifieke CN3/CN4-markeringen niet zijn geïdentificeerd. Ze zijn ook kleiner dan de Smn's en daarom moeilijker te isoleren op basis van grootte. Integendeel, in vitro studies van CN3s of CN4s hebben zich gebaseerd op dissociatie van17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, en slice27,28 culturen, die zijn samengesteld uit heterogene celtypen, en er bestaan geen protocollen voor de isolatie en cultuur van primaire CN3s of CN4s.
Hier wordt een protocol beschreven voor de visualisatie, isolatie, zuivering en teelt van CN3s, CN4s en Smn's van dezelfde embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muizen29 (Figuur 1, Figuur 2a). ISLMN: GFP heeft specifiek betrekking op motorneuronen met een door farnesylated GFP die naar het celmembraan lokaliseert. Dit protocol maakt het mogelijk om soorten en leeftijdgebonden vergelijkingen van meerdere soorten motorische neuronen te verhelderen om pathologische mechanismen in de motorische neuron ziekte uit te leggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met behulp van proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en met de goedkeuring van het Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Boston Children's Hospital.
1. getimede Matings instellen voorafgaand aan de dissectie
- Voor het genereren van prenatale embryonale muizen voor de oogst van de motorische neuron, weeg elke vrouwelijke muis en instellen getimede paring tussen volwassen ISLMN: GFP transgene muizen 11,5 dagen vóór de dag van neuron isolatie. Met het oog op de ontwikkeling van dit protocol, 129S1/C57BL/6J ISLMN: GFP muizen, leeftijd 2 − 9 maanden, werden gebruikt en getimede paring werd ingesteld in de avond.
- Onderzoeken van vrouwelijke muizen voor vaginale stekkers de volgende ochtend. Houd rekening met de datum waarop de stekker is geïdentificeerd als embryonale dag (E) 0,5.
- Weeg vrouwelijke muizen en onderzoeken voor pups met behulp van echografie (Zie tabel van de materialen) tussen e 8.5 − 11. Controleer de tekenen van succesvolle paring.
- Bevestig de succesvolle paring door gewichtstoename bij vrouwelijke muizen te detecteren (meestal > 1.5 g op E 9.5 als er meer dan 5 − 6 embryo's zijn).
- De embryo's onder ECHO visueel te bevestigen. Embryo's zijn na E 9.5 gemakkelijk detecteerbaar door echografie. Ultrasounds worden alleen uitgevoerd op vrouwtjes die gewicht hebben opgedaan omdat ze vaker zwanger zijn dan degenen die dat niet doen.
Opmerking: Vrouwelijke muizen kunnen gewicht krijgen om andere redenen dan zwangerschap, dus gewichtstoename alleen is geen betrouwbare indicator van de zwangerschap. Echografie voorkomt onnodige opoffering van vrouwtjes die niet zwanger zijn, maar is niet cruciaal indien niet beschikbaar.
2. dissectie voorwaarden en voorbereiding van instrumenten
- Voer alle coatings uit (behalve zuurreiniging van dekstroken), media voorbereiding, weefsel dissociatie (behalve centrifugeren en incubatie) en cultuur werk in een laminaire stroom afzuigkap om de steriliteit van de media en embryonale motorneuronen te waarborgen.
- Met zorgvuldige aandacht voor steriele techniek, het uitvoeren van weefsel dissectie buiten een laminaire stroom kap met minimaal risico van besmetting.
- Steriliseer een dissectie plaat, een paar microdissecting schaar, een paar duim dressing Tang, twee paren van Dumont #5 pincet, een microdissecting mes, en een Moria mini geperforeerde lepel door onderdompelen in 70% ethanol vóór gebruik.
3. PDL/laminin coating van gerechten/Dekstroken
Opmerking: Cultuur gezien primaire motorneuronen in 96 goed of 24 goed platen, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is voor de toepassing. Cellen kunnen direct in de weefselcultuur plaat worden afgebeeld zonder het gebruik van dekstroken als de putten optisch transparant zijn en de diktes compatibel zijn met beeldvorming.
- Voor toepassingen waarvoor dekstroken nodig zijn, moet u ten minste 2 dagen vóór de neuron-isolatie, zuur schoongemaakt, gesteriliseerd en Luchtgedroogde dekstroken bereiden zoals eerder beschreven30. Batches van dekstroken kunnen op deze manier goed worden voorbereid op voorhand van experimenten en kunnen worden opgeslagen tot 6 maanden zonder impact op de experimentele kwaliteit.
- Bereid een werkoplossing van 20 μg/mL poly D-Lysine (PDL) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 2 dagen voorafgaand aan de neuron isolatie.
- Aliquot PDL (1 mg/mL) van tevoren en bij-20 °C opslaan als een stamoplossing.
- Bedek het oppervlak van elke afdekplaat of de put van het weefselkweek plaatje met voldoende werkoplossing van de PDL-oplossing (bijv. 100 μL per put op 96 put-platen of 500 μL per put op 24-put platen met of zonder dekstroken). Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
- De volgende dag was 3x met gesteriliseerd water.
- Sluit de platen af met paraffine folie en bewaar de gewassen PDL-gecoate platen bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand als ze na de laatste wasbeurt volledig zijn gedroogd.
- Bereid een werkoplossing met 10 μL laminine (1,1 − 1,2 mg/mL) in 1,2 mL PBS.
- Aliquot laminine aandelen (1,1 − 1,2 mg/mL) van tevoren en bewaren bij-80 °C.
- Bedek het oppervlak van elke afdek of goed met voldoende laminine oplossing om het oppervlak gelijkmatig te bedekken. Inincuberen gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C vóór gebruik.
Opmerking: PDL/laminine-gecoate platen en dekstroken kunnen tot 1 week worden bewaard bij 37 °C, maar vers gecoate laminine heeft de voorkeur. Verwijder laminine direct voor het beplating30. Laminin mag niet uitdrogen. Indien de platen langer dan enkele uren bewaard moeten worden, dienen ze verpakt te worden in paraffine folie.
4. bereiding van dissectie, motor neuron cultuur media en dissociatie oplossingen
Opmerking: De concentraties tussen haakjes duiden op de uiteindelijke concentraties van elk reagens.
- Bereid het dissectie medium voor.
- Ontdooi het met hitte geïnactiveerde paarden serum 's nachts bij 4 °C, bereid 1 mL aliquots voor en bewaar bij-20 °C. De aliquots bij RT direct voor gebruik ontdooien.
- Bewaar B27-supplement (50x) in 1 mL aliquots bij-20 °C. Aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien. Vermijd invriezen/ontdooien.
- Bewaar glutamine supplement (100x) bij 4 °C of-20 °C. Verdeel in 0,5 mL aliquots bij-20 °C.
- Bewaar penicillaire-streptomycine (10.000 U/mL) in 1 mL aliquots bij-20 °C. Aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
- Om het dissectie medium te maken, meng u 9,4 mL slaapstand E met 200 μL paarden serum (2%), 200 μL 50x B27 supplement (1x), 100 μL 100x glutamine supplement (1x) (bijv. GlutaMAX) en 100 μL van 10.000 U/mL penicillaire-streptomycine (100 U/mL). Gebruik dit medium voor het verzamelen van ontleed weefsels en het maken van de uiteindelijke suspensie van gezien cellen.
- Voeg de dag vóór de neuron-isolatie 500 μL van het dissectie medium toe aan individuele 1,7 mL micro centrifugebuizen voor de weefsel verzameling. Bereid één buis voor elk weefseltype dat wordt verzameld (bijv. positieve controle, negatieve controle, CN3/CN4, SMN) en bewaar bij 4 °C voorafgaand aan het gebruik.
- Combineer 49 mL slaapstand E lage fluorescentie media met 1 mL B27 supplement (1x) en vul een 24 goed plaat met dit medium (2 mL/goed) de dag vóór de neuron isolatie. Gebruik dit gerecht voor het verzamelen van muis embryo's. Bewaren bij 4 °C vóór gebruik.
- Bereid de motor neuron kweekmedium.
- Bereid 250 μL aliquots van 25 mM 2-mercaptoethanol uit in Leibovita's L15 medium. Bewaren bij-20 °C.
- Genereer 5 μL aliquots van 100 μg/mL oplossingen van BDNF, CNTF en GDNF, verdund in gesteriliseerd water. Bewaren bij-80 °C en aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
- Bereid 10 mM Forskolin oplossing door toevoeging van 64 μL Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) aan 5 mg (1,0670 μM) van Forskolin en Vortex goed volledig op te lossen. Voeg vervolgens gesteriliseerd water (1,003 mL) toe aan de DMSO-oplossing en Vortex goed. Bewaar 12 μL aliquots van 10 mM Forskolin bij-20 °C en dooi aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid 12 μL aliquots van 100 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) verdund in DMSO. Bij-20 °C bewaren en aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
- Om de motorische neuron kweekmedium te maken, meng 9,4 mL neurobasal medium met 200 μL paarden serum (2%), 200 μL 50x B27 supplement (1x), 100 μL 100x glutamine supplement (1x), 100 μL 10.000 e/m: penicillaire-streptomycine (100 U/mL), en 20 μL van 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), bij voorkeur direct voor gebruik. Deze stap kan tot 1 dag vóór neuron isolatie worden uitgevoerd.
- Voeg vlak voor het gebruik 1 μL van 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) en GDNF (10 ng/mL) en 10 μL 10 mM Forskolin (10 μM) en 10 μL 100 mM IBMX (100 μM) toe aan het kweekmedium van de motor neuron. Prewarm het medium tot 37 °C.
- Bereid de dissociatie oplossingen voor.
- Bereid de papaïne oplossing (20 e/mL papaïne en 0,005% DNase) en een albumine-ovomucoïde remmer oplossing (1 mg/mL ovomucoïde remmer, 1mg/mL albumine, en 0,005% DNase) volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 500 μL aliquots van elk van de ovomucoïde remmer en papaïne-oplossingen en bewaar bij-80 °c. Aliquots op 37 °C ontdooien onmiddellijk voor gebruik.
5. ventrale tussen hersenen en ruggenmerg dissectie
Opmerking: Voer alle volgende stappen uit behalve de stappen 5.1.1 − 5.1.3 en 5.1.5 − 5.1.6 onder een stereomicroscoop met fluorescentie-dissectie. De totale dissectie tijd per experiment is doorgaans 3 − 5 uur, afhankelijk van de vaardigheid bij de dissectie techniek en het aantal motorneuronen dat voor elk experiment is vereist.
- Ventrale veroorzaakt dissectie
- Euthanize een zwangere muis ongeveer 11,5 dagen na de bevruchting door koolzuurgas en cervicale dislocatie.
- Spuit de buik grondig met ethanol en verwijder de baarmoeder met behulp van steriele microdissecting schaar en duim dressing Tang. Was de baarmoeder kort in steriele PBS en breng vervolgens over naar de dissectie plaat gevuld met voorgekoelde steriele PBS.
- Verwijder de ISLMN: GFP-positieve embryo's zorgvuldig uit de baarmoeder met behulp van steriele microdissecting schaar, duim dressing pincet, en Dumont #5 pincet in IJSKOUDE steriele PBS onder het heldere licht van de Microscoop. Gebruik een steriele Moria mini-geperforeerde lepel, breng elk embryo over naar een aparte put van een 24-put gevuld met voorgekoelde slaapstand-E laag fluorescentie medium aangevuld met 1x B27. Houd de 24 goed plaat op ijs.
- Breng een embryo over in een steriele dissectie plaat en bedek het geheel met de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van de ijskoude steriele Hank.
- Zorg ervoor dat de dissectie stappen worden uitgevoerd onder fluoresceïne isothiocyanaten (FITC) verlichting van de Microscoop. Met behulp van een pincet, verwijder de staart en het gezicht van het embryo zonder beschadiging van de veroorzaakt (Figuur 2BA). Plaats het embryo dat gevoelig is met ledematen onder en staart die naar de voorkant van de Microscoop wijst, naar de Dissector (aangeduid met een sterretje, Figuur 2BB).
- Met behulp van pincet, spleet open het dak van de vierde ventrikel om een kleine opening te genereren. Gebruik deze opening om pincet te haken in de ruimte die is gecreëerd tussen de vierde ventrikel en het dak. Ontleden langs het rugoppervlak van het embryo rostrale migratoire naar de cortex en de laterale naar de vloerplaat en de motor kolom (Figuur 2CA, b). Open het ontleed weefsel op een open-boek manier om de GFP-positieve CN3 en CN4 kernen te onthullen.
Opmerking: Een klein stukje weefsel van de ventrale veroorzaakt met Mesenchyme, CN3, en CN4 zal nu worden blootgesteld. - Scheid de ventrale veroorzaakt voorzichtig van het embryo en verwijder het Meningeale weefsel met behulp van een pincet en een microdissecting mes. Ontleden de bilaterale GFP-positieve CN3 en CN4 kernen van de vloerplaat en andere GFP-negatieve omringende weefsels met behulp van een pincet en een microdissecting mes (Figuur 2D). Maximaliseer het aantal GFP-positieve motorneuronen in het bekrachtigd weefsel, maar vermijd het aanraken of beschadigen ervan.
- Als een verzameling van afzonderlijke CN3 en CN4 kernen gewenst is, snijdt u langs de middenlijn van deze twee kernen (gele stippellijn in Figuur 2D). Verzamel met behulp van een P1000-pipet het ontleed ventrale-midhersen weefsel met minimale HBSS en plaats het in een gelabelde micro centrifugebuis van 1,7 mL, gevuld met een dissectie medium (zie stap 4.1.5). Bewaar op ijs tot dissociatie.
- Blijf ventrale midbrains van extra embryo's in dezelfde buis bundelen tot het totale aantal voldoet aan de experimentele eis (zie stap 8 voor ideale celnummers).
Opmerking: Een gepoolde verzameling van ten minste 10 ventrale midbrains die ongeveer 1 x 104 CN3/CN4 motorneuronen oplevert, wordt aanbevolen omdat weefsels onderhevig zijn aan stress tijdens de dissociatie en sortering.
- Ventrale ruggenmerg dissectie
- Houd het embryo gevoelig met het hoofd naar de voorkant van de Microscoop, naar de Dissector. Houd het embryo vast met één paar pincet en steek de punt van het andere paar pincet in het ongeopende caudale deel van de vierde ventrikel.
- Open de rest van de achterhersenen en het ruggenmerg dorsaal over de hele rostrocaudale omvang van het embryo. Open door het snijden van dorsale weefsel, beginnend vanaf de vierde ventrikel en werken naar het centrale kanaal van het caudale ruggenmerg met behulp van de Tang als schaar (Figuur 2CA, b). Wees voorzichtig om te voorkomen dat u het ventrale ruggenmerg aanraakt of beschadigt tijdens deze procedure.
- Houd het embryo vast met één pincet en knijp de flap van het rugweefsel aan elke kant af met het andere paar pincet (Figuur 2EA, b).
Opmerking: Excised dorsale weefsels bevatten dorsale huid, Mesenchyme, rugwortel ganglia (Drg's), dorsale hindbrain en ruggenmerg. Verwijder zoveel mogelijk van deze weefsels zonder de SMN-kernen te beschadigen, omdat ze lijm zijn en Smn's kunnen overlappen tijdens het filteren of verstopping veroorzaken tijdens het sorteren van FACS. - Verwijder het ventrale ruggenmerg met behulp van het microdissection-mes om direct onder de GFP-positieve SMN te boren. Til het ventrale ruggenmerg met zaag achtige bewegingen aan beide zijden (Figuur 2FA, b). Snijd het zwevende ventrale ruggenmerg dwars direct boven C1, waar de eerste GFP-positieve anterieure hoorn projecten (Figuur 2G). Ook, dwars doorsneden op de bovenste grens van de onderste ledemaat (Figuur 2G). Verwijder het cervicale (C1)-lumbale (L2-L3) gedeelte van het ventrale ruggenmerg na deze procedure.
- Plaats het ventrale ruggenmerg van de rugzijde omhoog en houd het vast door het GFP-negatieve weefsel tussen de GFP-positieve SMN-kolommen te drukken met één paar pincet. Verwijder de overgebleven bijgevoegde Mesenchyme, Drg's en rugruggen merg door beide zijden van de GFP-positieve SMN-kolom te trimmen met het microdissection-mes (Figuur 2H). Zorg voor maximale GFP-positieve motorneuronen zonder ze te beschadigen.
- Gebruik een P1000 pipet en verzamel het ontleed ventrale ruggenmerg weefsel met minimale HBSS en plaats in de SMN-gelabelde 1,7 mL micro centrifugebuis gevuld met dissectie medium. Bewaar op ijs tot dissociatie. Blijf de ventrale ruggengraat van andere embryo's in dezelfde buis bundelen tot het totale aantal aan de experimentele eisen voldoet.
Opmerking: Het is raadzaam om ten minste drie ventrale ruggenmerg koorden te verzamelen die ongeveer 2,1 x 104 SMN opleveren, omdat weefsels onderhevig zijn aan stress tijdens dissociatie en sortering. - Verzamel gezichts motorneuronen en extremiteiten van de ISLMN: GFP muis embryo's als GFP-positieve en GFP-negatieve controles voor respectievelijk fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Extremiteiten zijn GFP-negatief omdat de GFP-positieve axonen van de Smn's nog niet zijn uitgebreid tot de extremiteiten op deze embryonale leeftijd.
6. weefsel dissociatie
Opmerking: Totale dissociatie tijd is meestal 1,5 h per experiment.
- Warme papaïne en albumine-ovomucoïde remmer oplossing aliquots tot 37 °C 30 min voorafgaand aan dissociatie.
- Draai kort microdissected weefsels met een lage snelheid.
- Gebruik een P100 pipet en verwijder voorzichtig zo veel mogelijk slaapstand E zonder aspirerende weefsels.
Opmerking: Zorg ervoor dat u alle resterende slaapstand E na deze stap te verwijderen om te voorkomen dat het verminderen van de werkzaamheid van papaïne dissociatie in de volgende stap. - Voeg het juiste volume papaïne-oplossing (tabel 1) toe aan elk van de microcentrifugebuisjes van 1,7 ml die de microdissected-weefselmonsters bevatten.
Opmerking: De juiste hoeveelheid papaïne voor de dissociatie werd bepaald om de effectieve dissociatie te maximaliseren terwijl het minimaliseren van stress op de cellen. - Voorzichtig wrijf 8x met een P200 pipet. Voer alle trituratie stappen zachtjes uit om de levensvatbaarheid van de motor neuron te behouden.
- Inbroed de buisjes met de weefsels gedurende 30 minuten bij 37 °c, met een vinger die 10x elke 10 min. zachtjes wrijf elke suspensie 8x met een P200 pipet na incubatie. Draai de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten.
- Om de werkzaamheid van ovomucoïde remming in de volgende stap te waarborgen, gebruikt u een P1000 pipet om zo veel mogelijk supernatant te verwijderen en weg te gooien zonder de weefsels te aspireren.
- Respendeer pellets in de juiste hoeveelheid albumine-ovomucoïde remmer oplossing (tabel 1) door zachtjes te tritureren 8x met een P200 pipet.
- Wacht 2 min om alle overgebleven stukjes van niet-dissociated weefsel te laten vestigen op de bodem van de buis.
- Verzamel zo veel mogelijk supernatant zonder ongedissocieerde weefsels te gebruiken met een P200 pipet. Breng de supernatant over naar verse 1,7 mL micro centrifugebuizen.
- Als sommige stukjes weefsel na stap 6,10 zonder dissociatie blijven, herhaalt u de stappen 6.8 − 6.10 voor de niet-gezien weefsels die in de originele micro centrifugebuizen van 1,7 ml achterblijven om de uiteindelijke opbrengst van gedisiteerde cellen te maximaliseren, terwijl de stress op de cellen wordt geminimaliseerd eerder in de supernatant van stap 6,10.
- Draai de cellen op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg met een P1000 pipet.
- Rebreng de pellet in de juiste hoeveelheid dissectie medium (tabel 1) door het pipetteren van 8x met een P1000 pipet. Het juiste volume van de uiteindelijke suspensie werd bepaald zodat de celdichtheid niet hoger is dan 107 cellen/ml, die de stroom van de flow cytometrie machine kunnen blokkeren, maar ook zodat cellen niet overmatig worden verdund, wat resulteert in een vertraagde sorteersnelheid.
- Filtreer de suspensies door middel van 70 μm celstrainers om grote klonten of onverteerd weefsel te elimineren. Breng de suspensies in 5 mL ronde bodem polystyreen reageerbuisjes en bewaar op ijs totdat het nodig is.
7. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van een FACS sorteerder uitgerust met een 15 MW 405 nm violet laser, een 100 MW 488 nm blauwe laser, een 75 MW 594 nm oranje laser, en een 40 MW 640 nm rode laser. Cellen werden gesorteerd als mantel vloeistof in steriele PBS onder aseptische condities door middel van een 100 μm nozzle. Om de celbelasting te minimaliseren, werd de stroomsnelheid ingesteld op een steekproef druk van 1 − 3, zodat er maximaal 1000 − 4000 gebeurtenissen per seconde werden verworven. De totale FACS-tijd is meestal 1 − 2 uur per experiment.
- Stel spanningen voor forward en side Scatter in, zodat de celpopulatie correct kan worden gevisualiseerd. Het instellen van de juiste spanningen voor het sorteren van cellen is complex en vereist een ervaren FACS operator.
- Om verschillende celpopulaties te onderscheiden, plot cellen op basis van grootte zoals bepaald door het voorwaartse spreidings gebied (FSC-A) versus interne complexiteit, zoals bepaald door het Zijspreidings gebied (SSC-A). Teken een hek rond de levende cellen zoals aangegeven in Figuur 3AA en figuur ba om puin en dode cellen uit te sluiten. Groepeer de cellen binnen het gated gebied als populatie 1 (P1).
- Plot P1-cellen op basis van de Zijspreidings breedte (SSC-W) versus de SSC-A om celklonten en dubbeltjes uit te sluiten. Poort de populatie van enkelvoudige cellen als populatie 2 (P2) (Figuur 3AB en figuur BB).
- Plot P2-cellen op basis van de voorwaartse Spreidingsbreedte (FSC-W) versus de FSC-A en poort de populatie van enkelvoudige cellen als populatie 3 (P3) (Figuur 3AC en figuur BC).
Opmerking: het gebruik van twee opeenvolgende Gates in 7,3 en 7,4 Sluit celklonten en-dubbeltjes (High FSC-W en High FSC-A) uit. - Poort P3-cellen op basis van GFP versus allophycocyanin (APC). Het APC-kanaal detecteert autofluorescentie. Gating op dit kanaal vermijdt het vastleggen van autofluorescerende cellen. Gebruik GFP-negatieve cellen om de spanning voor FITC/GFP-fluorescerende kanalen aan te passen. Ideaal, positie poorten voor deze celpopulaties rond 102. Selecteer Gate drempels voor GFP-positieve populatie 4 (P4) afzonderlijk voor elk type motor neuron (Figuur 3ad en figuur BD).
Opmerking: Stel de GFP-poort veel hoger in voor Smn's dan voor CN3s/CN4s om een zuivere cultuur te verkrijgen (Figuur 3-advertentie en figuur BD). Een lagere GFP-poort voor SMN-culturen leidt tot besmetting van de culturen door glia en niet-motorische neuronen. Dit is waarschijnlijk omdat er een laag niveau GFP expressie in sommige glia en niet-motorische neuronen als gevolg van een lekkende promotor. Het percentage GFP-positieve cellen in vergelijking met de totale cellen is meestal 0,5 − 1,5% voor CN3s/CN4s en 1,5 − 2,5% voor Smn's. Als de sectie succesvol was, kunnen deze getallen worden gebruikt als benchmark voor het bepalen van de juiste positie voor de GFP-positieve poort (Figuur 3AE en Figure be). - FACS uitvoeren volgens het Protocol van de fabrikant. Verzamel P4-cellen in verse 1,7 mL micro centrifugebuizen gevuld met 500 μL motor neuron kweekmedium. Bewaar op ijs tot het beplating.
Opmerking: Hoewel de cellen rechtstreeks in de putjes kunnen worden gesorteerd, resulteert dit in een ongelijk aantal cellen per putje. Sorteer de cellen in 1,75 mL micro centrifugebuizen en vervolgens plaat handmatig met het oog op een meer gelijkmatige plating verdeling te bereiken.
8. cultuur van gezuiverde primaire motor neuronen
- Verdunde FACS-geïsoleerde CN3/CN4 en SMN suspensies met motor neuron kweekmedium voorverwarmd tot 37 °C tot dichtheden van respectievelijk 5 x 103 en 1 x 104 cellen/ml.
Opmerking: Eén E 11,5 embryo levert ongeveer 1 x 103 CN3/CN4 en 7 x 103 SMN op. Deze opbrengsten zijn echter sterk afhankelijk van de zuiverheid van ontleed weefsels, de grondigheid van celdissociatie en de juiste drempel van GFP-Gates tijdens FACS. - Overdracht 96 goed platen voorgecoat met PDL en laminine van de 37 °c weefselcultuur incubator naar de laminaire flow Hood en aspiraat laminine van elke put. Gebruik platen en dekstroken onmiddellijk zonder te wassen.
- Voeg 200 μL verdunde CN3/CN4 en SMN suspensies toe aan de elk goed van PDL/laminine gecoate 96 well Plates. Uiteindelijke celdichtheden moeten 1 x 103 en 2 x 103 cellen/goed voor respectievelijk CN3/CN4 en SMN zijn.
Opmerking: Initiële plating dichtheid van Smn's in 96 goed platen (2 x 103 cellen/well) is dubbel dat van CN3s/CN4s (1 x 103 cellen/goed) om soortgelijke eind motor neuron getallen en dichtheden te verkrijgen op 2 en 9 dagen in vitro (DIV) (4 − 6 x 102 en 2 − 4 x 102 cellen per put, respectievelijk). - Cultuur neuronen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
- Voer neuronen elke 5 dagen door de helft van de oude media (100 μL) te verwijderen en te vervangen door hetzelfde volume van het kweekmedium van de verse motor neuron. Zorg ervoor dat neuronale processen zichtbaar worden op 1 DIV en dikker en langer worden met 14 DIV (Figuur 4). Neuronale cellichamen worden vergroot en hebben de neiging om te aggregeren in lange-termijn culturen, met name voor Smn's (Figuur 4).
Opmerking: Voer alle medium-en oplossings wijzigingen uit door de helft van het originele medium volume te verlaten om te voorkomen dat gekweekte cellen worden losgekoppeld. Dit omvat fixatie en immunocytochemie (ICC) stappen. Als alle media wordt verwijderd, ongeacht hoe zacht, de meeste van de cellen zal loskoppelen en worden weggewassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit protocol was om zowel de primaire CN3s/CN4s als de KMO op lange termijn te zuiveren en te kweken om vergelijkende analyses mogelijk te maken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorische neuron stoornissen (Zie Figuur 1 en Figuur 2 voor overzicht).
Zodra neuronen met succes werden geïsoleerd en gekweekt in cultuur, werden bijna zuivere primaire CN3/CN4 en SMN-culturen verkregen (figuur 5a,B) en gehandhaafd voor ten minste 14 div (Figuur 4 en Figuur 6). De zuiverheid van CN3/CN4 en SMN-culturen op 2 DIV waren respectievelijk 93,5 ± 2,2% en 86,7 ± 4,7%, bij beoordeling door ICC met behulp van de motorische neuron marker Islet1 en neuronale marker TUJ1 (Figuur 5B). Deze hoge zuiverheid vertrouwden echter zwaar op de leeftijd van de embryo's en op het vaststellen van passende drempels voor GFP-Gates tijdens FACS (Figuur 3). Dissectie van embryo's bij E 10.5 is moeilijker dan dissectie bij E 11.5 als gevolg van verhoogde zachtheid en adhesiviteit van weefsels, resulterend in verminderde motorische neuron opbrengsten. De zuiverheid van E 10.5 CN3s/CN4s en Smn's waren echter vergelijkbaar met die voor E 11.5-embryo's (respectievelijk 92,8% en 82,2% bij 2 DIV; gegevens verkregen uit een enkel experiment). De zuiverheid van CN3s/CN4s en Smn's daalden drastisch wanneer E 13.5-embryo's werden gebruikt, zelfs als alleen de hoogste GFP-positieve populatie werd verzameld (respectievelijk 20,7% en 7,4% bij 2 DIV; gegevens verkregen uit een enkel experiment), waarschijnlijk als gevolg van de uitdrukking van GFP in niet-motorische neuronen (Figuur 7). Diezelfde tendens was ook waar voor E 12.5-culturen, hoewel het veel minder dramatisch was. Daarom zijn embryo's bij E 12.5 of ouder ongeschikt voor gebruik bij de zuivering van motorneuronen die dit protocol gebruiken.
Zuivere motorische neuron culturen zijn waardevol voor het begrijpen van geïsoleerde groeipatronen, gedrag, en kwetsbaarheden van motorneuronen. Dit voorbeeld laat zien hoe deze culturen kunnen worden gebruikt om motorische neuron reacties op chemische behandeling te testen. Om te bepalen of primaire CN3s/CN4s en Smn's differentiële reacties vertonen op endoplasmonisch reticulum (ER) stressoren, werden primaire monoculturen van CN3s/CN4s en Smn's verkregen met behulp van dit protocol en behandeld met verschillende concentraties van een ER stressor, cyclopiazonic acid (CPA). Neuronen werden behandeld met CPA (5, 10, 15, 20, 25 of 30 μM) of voertuig controle (DMSO) bij 2 DIV en 3 dagen later vastgesteld voor ICC om overlevings ratio's te evalueren (Figuur 8A). Het aantal levensvatbare neuronen in elk monster werd geteld en overleving ratio's werden berekend als het aantal levensvatbare cellen in drug-behandelde putten gedeeld door het aantal levensvatbare cellen in de putten behandeld met DMSO. CN3/CN4 monoculturen waren significant beter bestand tegen CPA-behandeling (10 − 25 μM) in vergelijking met SMN monoculturen (Figuur 9 en Figuur 8B)31.
Tot slot, dit protocol maakt het mogelijk voor het genereren van zeer gezuiverde primaire muis embryonale CN3/CN4 en SMN culturen die een krachtig en betrouwbaar systeem voor het onderzoek van neuronale gedrag bieden.
Figuur 1: schema voor de bereiding van de muis embryonale motorneuronen. Het schematisch illustreert de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en cultuur van muizen embryonale motorneuronen en de geschatte tijd in uren of dagen voor elke stap. De volgorde van de dissectie procedure voor CN3/CN4 en voor SMN zijn elk gelabeld opeenvolgend 1 tot en met 4. Afkortingen: CN3/CN4 = Oculomotor neuron/trochlear neuron; SMN = ruggenmerg motor neuron; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; h = uur; d = dag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: dissectie van de ventrale middenhersenen en het cervicale (C1)-lumbale (L2-L3) gedeelte van het ventrale ruggenmerg. A) laterale(a) en rugvin (b) views van GFP-positieve motorneuronen in een e 11.5 ISLMN: GFP transgene muis embryo onder fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) verlichting. Een hele berg E 11.5 embryo werd bereid zoals eerder beschreven32 om het embryo transparant te maken. Vervolgens werd het embryo geanalyseerd door immunofluorescentie labeling met anti-GFP-kleuring (groen). Beelden werden gevangen onder een confocale Microscoop. Schaal staven = 200 μm (laterale weergave) en 400 μm (rugzicht). Afkortingen: S = superieur; I = inferieur; V = ventrale; D = rugklachten. (B-H) Dissectie stappen gemarkeerd op afbeeldingen van E 11.5 ventrale middenhersenen en ventrale ruggenmerg weefsels genomen met een uitgeruste camera onder fel licht (BB) of FITC verlichting met behulp van een fluorescentie dissectie stereomicroscoop. Schaal staven = 200 μm (D) en 1 mm (A − C, E − H). B) a) verwijderingvan het gezicht en de staart van het embryo door langs de rode lijnen te snijden. b) embryo dat voor dissectie is geplaatst. Positionering van de voorkant van de Microscoop wordt aangegeven met een sterretje. C) langs de ononderbroken rode lijn snijden om het dak van de vierde ventrikel (a) laterale weergave te openen en (b) rugzicht. Gebruik van deze opening te snijden langs het oppervlak van de embryonale rugzijde naar de hersenen (traject aangegeven door onderbroken rode pijl). Dit blootstelt het weefsel met Mesenchyme, CN3, en CN4, die kan worden opgeheven uit de cranium. Voor SMN dissectie, inbrengen van de Tang in dezelfde opening tussen de vierde ventrikel en het dak, dan snijden naar de caudal kant van het embryo (traject aangegeven door onderbroken gele pijl). D) de uiteindelijke weergave van de ventrale veroorzaakt die bilaterale GFP-positieve CN3 en CN4 kernen bevat. De randen van het weefsel worden gemarkeerd door een rode rechthoek. Snijden langs gele stippellijn te verzamelen CN3 en CN4 kernen afzonderlijk, indien gewenst. E) na het openen van de rest van de achterhersenen en het ruggenmerg, flappen dorsale weefsels boven de rode lijnen aan beide zijden met een pincet (a) voor, en (b) na. F) bilateraal verwijderen van overtollig weefsel ventrale naar het ruggenmerg langs de rode lijn (a) voor, en (b) na. G) het afsnijden van het ventrale ruggenmerg op de twee door de rode lijnen aangegeven plaatsen. Aan de rostrale migratoire zijde, snijden van het zwevende ventrale ruggenmerg dwars boven C1, waar de eerste GFP-positieve anterieure hoorn projecten. Snijden van het staart uiteinde van het ruggenmerg dwars op de bovenste grens van de onderste ledemaat. Zodra deze bezuinigingen zijn aangebracht, kan de cervicale (C1) door lumbale (L2-L3) deel van het ventrale ruggenmerg worden ontleed. H) definitieve weergave van het ventrale ruggenmerg dat GFP-positieve SMN-kolommen bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve Sorteer percelen van ventrale midbrains (a) en ventrale ruggengraat koorden (B). (AA en BA) Forward Scatter gebied (FSC-A) versus Zijspreidings gebied (SSC-A) gesorteerd plot vóór uitsluiting van puin en dode cellen. (AB, BB, AC, BC) Gesorteerde percelen voor uitsluiting van celklonten (b) en dubbeltjes (c) op basis van breedte (SSC-w) versus SSC-a en voorwaartse Spreidingsbreedte (FSC-w) versus FSC-a, respectievelijk. (Ad en BD) Gesorteerde plots om ISLMNte isoleren: GFP -positieve motorneuronen. Om een zuivere cultuur te verkrijgen, moet de GFP-poort hoger worden ingesteld voor Smn's (BD) dan voor CN3s/CN4s (ad). (AE en be) Percentages cellen die worden gegated voor verzameling door FACS-sortering. % Bovenliggend vertegenwoordigt het percentage cellen in de huidige gated populatie ten opzichte van het aantal cellen in de vorige gated celpopulatie, terwijl % totaal het percentage van de gated cellen ten opzichte van de totale cellen vertegenwoordigt. Verwachte percentages GFP-positieve cellen in vergelijking met totale cellen (boxed in rood) zijn 0,5 − 1,5% voor CN3/CN4 en 1,5 − 2,5% voor SMN. Als de dissectie met succes is uitgevoerd, kunnen deze percentages worden gebruikt als een benchmark voor het instellen van de GFP-positieve Gate in (ad en BD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: phase-contrast beelden van primaire CN3/CN4 en SMN monoculturen bij 2, 7 en 14 div. Representatieve differentiële interferentie contrast beelden van primaire CN3/CN4 en SMN-culturen werden vastgelegd op 2, 7 en 14 DIV met omgekeerde fluorescentiemicroscoop met bijbehorende beeldverwervings-en Verwerkingssoftware en 40x-doelstellingen. Neuronale processen werd dikker en langer door 14 DIV. neuronale cel lichaam maten werd vergroot en de neiging om te aggregeren in lange-termijn culturen, vooral voor de SMNs. Beide culturen kunnen worden gehandhaafd ten minste 14 DIV. schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: karakterisaties van geïsoleerde e 11.5-muizen CN3/CN4 en SMN-culturen. (A) representatieve immunocytochemie beelden van e 11.5 Mouse CN3s/CN4s (boven) en smns (onder) gekweekt voor 2 div. immunofluorescentie labeling met de NEURONALE marker TUJ1 (groen) en de motorische neuron marker Islet1 (rood) uitgevoerd om neuronen en kernen te analyseren waren tegen de DAPI (blauw). Bijna alle gekweekte cellen waren motorische neuronen (TUJ1+, Islet1+). Beelden werden gevangen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met bijbehorende beeldverwervings-en Verwerkingssoftware en 20x-doelstellingen. Samples werden gefotografeerd en verwerkt om maximale signaalintensiteit te bereiken zonder verzadigde pixels. Alle microscopisch werk en beeldverwerking in de volgende cijfers werden uitgevoerd in deze omstandigheden, tenzij anders aangegeven. Schaalbalk = 100 μm.B) de zuiverheid van e 11.5 muis CN3/CN4 en SMN-culturen bij 2 div. De zuiverheid van CN3/CN4 en SMN-culturen waren respectievelijk 93,5 ± 2,2% en 86,7 ± 4,7%. Dode neuronale cellichamen werden beoordeeld door screening op pyknotische nucleaire morfologie en zwelling van het membraan. Neuronale processen werden geclassificeerd als degenererende processen wanneer tekenen van beading en zwelling werden waargenomen. Cellen met noch cellichaam dood noch degenererende processen werden beschouwd als levensvatbare niet-motorische neuronen (TUJ1+, Islet1-) of levensvatbare motorneuronen (TUJ1+, Islet1+)33. De zuiverheid van motorische neuron culturen werden berekend als het aantal levensvatbare motorische neuronen gedeeld door het totale aantal levensvatbare niet-motorische neuronen plus levensvatbare motorneuronen. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van drie afzonderlijke experimenten. Niet significant (p > 0,05) door student t -toets. Het tellen van cellen werd handmatig uitgevoerd onder een vergroting van 20x. Afkortingen: SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve immunocytochemie van primaire CN3/CN4 en SMN monoculturen bij 2, 7 en 14 div. Primaire CN3/CN4 en SMN-culturen werden geanalyseerd op 2, 7, 14 DIV door immunofluorescentie-labeling met TUJ1 (groen), en kernen werden tegen gekleurd met DAPI (blauw). Neuronale processen worden dikker en langer door 14 DIV. de lichaams groottes van neuronale cellen werden vergroot en de neiging om te aggregeren in lange-termijn culturen, met name voor Smn's. Zowel CN3/CN4 als SMN-culturen kunnen ten minste 14 DIV worden gehandhaafd. beelden werden vastgelegd onder 10x vergroting. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: karakterisering van e 13.5 Mouse CN3/CN4 en SMN geïsoleerde culturen. E 13.5 CN3/CN4 en SMN werden geïsoleerd en gekweekt met behulp van dit protocol en geanalyseerd op 2 DIV door immunofluorescentie labeling met TUJ1 (groen) en Islet1 (rood), en de kernen waren tegen gekleurd met DAPI (blauw). Veel niet-motorische neuronale cellen (TUJ1+, Islet1-) waren aanwezig (pijlen) resulterend in een DRASTISCHE afname van zowel CN3/CN4 en SMN zuiverheid, met de daling meer uitgesproken in SMN culturen. Beelden werden vastgelegd onder 20x vergroting. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: representatieve toepassing van de primaire-motorische neuron cultuur die aantoont dat CN3s/CN4s selectief resistent is tegen er stress veroorzaakt door CPA. A) experimentele omtrek: primaire CN3/CN4 en SMN monoculturen werden behandeld met CPA of voertuigcontrole (DMSO) bij 2 div en de celvivaardigheden werden geëvalueerd via immunocytochemie analyse na 3 dagen behandeling. Dit overzicht is gewijzigd van gepubliceerd werk31. B) kwantificering van overlevings Ratio's van CN3s/CN4s en smn's behandeld met 5 − 30 μM CPA gedurende 3 dagen vanaf 2 div. neuronen werden geanalyseerd door immunofluorescentie-labeling van cellen met TUJ1, en kernen waren tegen de DAPI. Overlevings ratio's werden berekend als het aantal levensvatbare cellen (Zie Figuur 5B legende) in met drugs behandelde putjes gedeeld door het aantal levensvatbare cellen in putten die alleen voertuigen bevatten (DMSO). Het tellen van cellen werd handmatig uitgevoerd onder een vergroting van 20x. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van vier afzonderlijke experimenten. * p < 0,05; p < 0,005 door student t -toets. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerd werk31. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: representatieve immunocytochemie van primaire CN3/CN4 en SMN monoculturen na een blootstelling van 3 dagen aan het verhogen van de CPA-concentraties vanaf 2 div. Neuronen werden geanalyseerd door immunofluorescentie-labeling van cellen met TUJ1 (groen) en kernen werden tegen gekleurd met DAPI (blauw). Primaire CN3s/CN4s waren beter bestand tegen CPA-behandeling dan primaire Smn's. beelden werden vastgelegd onder 10x vergroting. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Aantal midbrains (X) | Papaïne | Albumine-ovomucoïde | Slaapstand E | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| Aantal ruggenmerg (Y) | Papaïne | Albumine-ovomucoïde | Slaapstand E | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
Tabel 1: geschikte hoeveelheden papaïne, albumine-ovomucoïde en eind suspensie gebruikt in dissociatie stappen. De juiste volumes papaïne en albumine-ovomucoïde moeten worden gebruikt met verschillende aantallen ventrale tussen hersenen en ventrale ruggenmerg weefsels zijn gewijzigd van de instructies van de fabrikant na verschillende optimalisatie rondes. Omdat weefsels onderhevig zijn aan stress tijdens dissociatie en sortering, wordt een gepoolde verzameling van meer dan 10 ventrale midhersenen en meer dan drie ventrale ruggengraat koorden aanbevolen. Het volume van papaïne werd bepaald door de afweging tussen effectieve dissociatie en de stress van deze procedure. De hoeveelheid albumine-ovomucoïde remmer oplossing is de helft van die van papaïne. De juiste hoeveelheid slaapstand E definitieve suspensie werd bepaald dat de celdichtheid niet hoger is dan 107 cellen/ml, maar de cellen worden niet overmatig verdund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisch gezien, in vitro studies van CN3 en/of CN4 motorneuronen hebben vertrouwd op heterogene culturen zoals gezien17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, en snijd27,28 culturen, omdat deze cellen niet kunnen worden onderscheiden van omringende cellen op basis van grootte en specifieke markeringen voor deze cellen zijn niet gerapporteerd. Het huidige protocol is een uitgebreide methode voor de isolatie en cultuur van primaire E 11.5 Murine CN3s/CN4s, en SMNs van dezelfde embryo's en bevestigt de hoge zuiverheid van de culturen. Door zuivere SMN-en CN3/CN4-culturen van dezelfde muis embryo's te genereren, maakt het protocol gecontroleerde vergelijkingen mogelijk van het in vitro gedrag van CN3s/CN4s versus Smn's geïsoleerd van wild type en Mutant embryo's.
De zuivere culturen van CN3s/CN4s en de door dit protocol gegenereerde Smn's maken vergelijkende studies mogelijk van morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van deze motorneuronen. In theorie, omdat andere craniale motorische neuron populaties kunnen worden gevisualiseerd en ontleed uit deze ISLMN: GFP transgene muis lijn (inclusief ontleden, motor trigeminus, gezichts-en hypoglossal), kan dit protocol worden uitgebreid voor hun isolatie en cultuur, mits de FACS GFP-poorten op de juiste wijze worden aangepast. Tot slot, de aan dit protocol ontleende FACS-gesorteerde motorneuronen kunnen worden onderworpen aan genomische (bijv. assay voor Transposase-toegankelijke Chromatin met behulp van sequencing, of ATAC-SEQ) en/of Transcriptomic (bijv. RNA sequentie31) analyses om de normale ontwikkeling en de selectieve kwetsbaarheid van specifieke motorische neuron subtypen in neurodegeneratieve aandoeningen31te
Er zijn meerdere stappen in dit protocol die essentieel zijn voor het maximaliseren van het aantal zuivere, gezonde motorneuronen in het geïsoleerde cultuur systeem. Tijdens de dissectie moeten de GFP-negatieve weefsels (bijv. mesenchym en drg's) maximaal worden verwijderd zonder de motorneuronen te beschadigen, omdat deze weefsels lijm zijn en smn's kunnen overlappen tijdens het filteren of verstopping veroorzaken tijdens FACS sortering. Tijdens weefsel dissociatie moet het minimale essentiële volume van papaïne worden gebruikt en moeten de cellen voorzichtig worden behandeld met minimale maar voldoende trituratie. Papaïne werd gebruikt voor de weefsel dissociatie stap in dit protocol, omdat voorlopige gegevens aangegeven dat het minder destructief is dan trypsine voor zowel CN3/CN4 als SMN. Overlevings ratio's op basis van vergulde aantallen CN3s/CN4s en Smn's bij 2 DIV stegen van 39,5% naar 52,7% en van 52,3% naar 58,4%, respectievelijk, wanneer papaïne werd gebruikt in plaats van trypsine (0,25%, 4 min incubatie). Hoewel deze nummers zijn afgeleid van een enkel experiment uitgevoerd vóór volledige optimalisatie, suggereren aanvullende rapporten ook dat trypsine suboptimaal is voor celextractie uit zenuwstelsel weefsels12,34,35,36. Tijdens de FACS mogen fluorescerende vitale kleurstoffen (propidium jodide en calceïne Blue) en kleine Sorteer mondstukken (bijv. 70 μm) niet worden gebruikt, omdat ze schadelijk zijn voor de overleving van motorische neuron. Gebruik van grote Sorteer mondstukken (100 μm of groter) wordt sterk aanbevolen, omdat de dood van SMN-cellen aanzienlijk toeneemt wanneer een nozzle van 70 μm wordt gebruikt. Het instellen van de juiste gating drempels voor GFP-positieve cellen in FACS is een kritieke stap om zuivere culturen te verkrijgen. Motorische neuron culturen worden aangevuld met Forskolin, IBMX, en groeifactoren (BDNF, CNTF, en GDNF). Forskolin en ibmx zijn gemeld om te additief bevorderen SMN Survival37,38. Voorlopige gegevens van de huidige studies suggereren dat Forskolin en IBMX ook additief verhogen CN3/CN4 overleving. Overlevings ratio op basis van vergulde getallen van CN3s/CN4s bij 2 DIV verhoogd van 17,5% naar 26,9%, 31,9%, en 37,0% wanneer IBMX, Forskolin, en IBMX + Forskolin werden toegevoegd, respectievelijk (getallen zijn gebaseerd op een enkel experiment uitgevoerd voorafgaand aan volledige optimalisatie van de celcultuur voorwaarden). Het is het beste om alle middelgrote veranderingen en wassingen van gekweekte cellen uit te voeren door het verlaten van de helft van het oorspronkelijke volume om te voorkomen dat de gekweekte cellen loskoppelen. Ten slotte is het ook ideaal om de tijd tussen de sectie en het beplating van motorneuronen te verkorten (bijv. door dissectie tijd te verkorten met behulp van meerdere dissectoren) om de levensvatbaarheid van de culturen te verbeteren.
Er zijn vier belangrijke potentiële problemen die zich kunnen voordoen bij het volgen van dit protocol. De eerste is lage opbrengst van motorische neuronen na FACS. Mogelijke oorzaken voor lage opbrengsten zijn het gebruik van jonge embryo's (bijv. e 10.5), die minder motorneuronen, onvoldoende verwijdering van zelfklevende GFP-negatieve weefsels tijdens dissectie (bv, mesenchym en drg's), die kunnen vangen motorneuronen en leiden tot hun verwijdering tijdens filtratie, onvoldoende papaïnisatie/trituratie tijdens dissociatie, en/of het instellen van de GFP-positieve Gate te hoog tijdens FACS. Het tweede potentiële probleem is de lage zuiverheid van de motorische neuron culturen, die hoogstwaarschijnlijk voortvloeit uit het gebruik van oudere embryo's (bijv. E 12.5) en/of het instellen van de GFP-positieve poort te laag tijdens FACS. Ten derde kan een laag aantal aangesloten motorneuronen in de cultuur worden waargenomen als gevolg van ongepaste FACS sortering en/of ontoereikende PDL/laminincoating van platen/dekstroken. Ten vierde kunnen motorneuronen een lage levensvatbaarheid vertonen in de cultuur. Mogelijke oorzaken van een lage levensvatbaarheid zijn ruwe en/of langdurige dissectie, overmatige papaïnisatie/trituratie tijdens dissociatie, ongepaste behandeling van cellen in het Protocol (bijv. ruw pipetteren van cellen, niet plaatsen van cellen op het ijs, niet-pre-chill PBS en HBSS), en/of overmatige tijd tussen euthanasering van zwangere muizen en uiteindelijke beplating van de cellen. Het gebruik van reagentia die geen verse en/of ongepaste concentraties zijn, kan ook de experimentele uitkomsten aantasten.
Dit protocol kent drie belangrijke beperkingen. ISLMN: GFP TRANSGENE muizen en FACS sorting zijn allebei vrij duur. Ze zijn echter van cruciaal belang voor dit protocol, omdat er momenteel geen alternatieve methode is die zeer gezuiverde CN3s/CN4s kan genereren op een meer economische manier. Er is een klein E 10.5-E 12,5-leeftijds venster voor de embryonale muizen, en het is moeilijk te bevestigen dat geschikte verouderde embryo's aanwezig zijn, vooral als er geen ultrasone machine beschikbaar is. Als alleen zuivere smn's nodig zijn, kunnen ze worden afgeleid van e 12.5-15.0 muis embryo's met behulp van methoden zoals gradiënt centrifugeren10,11,12 en/of P75NTR-antilichaam-gebaseerde cel-Sorteer pannen technieken13,14,15,16. Tot slot, eiwit gebaseerde testen die vereisen een grote hoeveelheid startmateriaal zijn niet haalbaar uit deze culturen als gevolg van de kleine opbrengst van motorische neuronen (vooral CN3s/CN4s). Stamcel-afgeleide motorneuronen31,39, die onbeperkt kunnen worden gegenereerd, kunnen in theorie worden vervangen door dit doel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
We bedanken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, VS) voor instructie in SMN dissectie technieken; het Dana Farber Cancer Institute flow Cytometrie faciliteit, de immunologie divisie flow Cytometry faciliteit van Harvard Medical School, de Joslin Diabetes Center flow Cytometrie kern, Brigham en Women's Hospital flow Cytometrie kern, en Boston Children's Hospital flow Cytometrie onderzoek faciliteit voor FACS isolatie van primaire motorneuronen; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, extra Engle laboratorium leden en project ALS consortium leden voor technische assistentie en doordachte discussie. Deze studie werd ondersteund door project ALS. Daarnaast werd R.F. gefinancierd door de Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant in het buitenland en NIH training Grant in genetica T32 GM007748; J.J. werd gesteund door het NIH/NEI trainingsprogramma in de moleculaire basissen van oogziekten (5T32EY007145-16) via het Schepens Eye Research Institute en door het ontwikkelingsneurologie trainingsprogramma Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) via het Boston Children's Hospital; M. C. W werd gesteund door NEI (5K08EY027850) en Children's Hospital Ophthalmologie Foundation (Faculty Discovery Award); en E.C.E. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
