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Neuroscience

जन्म के पूर्व Isl मिलियन से ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की अलगाव और संस्कृति: जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहे

Published: November 12, 2019 doi: 10.3791/60440
Automatic Translation
1,2,3,4,9, 1,2,10, 1,2,3,7, 2,5,6, 1,2,3,4,5,6,7,8
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Summary

यह काम प्राथमिक ओकुलोमोटर, ट्रोक्लोर और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की सजातीय कोशिका संस्कृतियों को उपज देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इन संस्कृतियों का उपयोग नेत्र और रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Abstract

रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स (एसएमएनएस) की तुलना में ओकुलोमोटर न्यूरॉन्स (CN3s) और ट्रोक्लोर न्यूरॉन्स (CN4s) अपक्षयी मोटर न्यूरॉन्स रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) के लिए उल्लेखनीय प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। प्राथमिक माउस CN3s, CN4s, और SMNs को अलग करने और संस्कृति करने की क्षमता इस चयनात्मक भेद्यता अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करेगी। आज तक, अधिकांश प्रोटोकॉल विषम कोशिका संस्कृतियों का उपयोग करते हैं, जो प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या को चकित कर सकते हैं। मिश्रित-कोशिका आबादी से जुड़ी समस्याओं को कम करने के लिए, शुद्ध संस्कृतियां अपरिहार्य हैं। यहां, पहला प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि भ्रूण दिवस ११.५ (E11.5) IslMN:GFP ट्रांसजेनिक माउस भ्रूण का उपयोग कर एक ही भ्रूण से एक ही भ्रूण से SMNs समकक्षों के साथ CN3s/CN4s को कुशलतापूर्वक शुद्ध और खेती करने के लिए । प्रोटोकॉल ऊतक विच्छेदन और विच्छेदन, FACS आधारित सेल अलगाव, और CN3/CN4 और SMN नाभिक से कोशिकाओं की विट्रो खेती पर विवरण प्रदान करता है । यह प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए विट्रो CN3/CN4 संस्कृति प्रणाली में एक उपन्यास जोड़ता है और एक साथ तुलना के लिए एक शुद्ध प्रजातियों और उंर मिलान SMN संस्कृति प्रदान करता है । मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित करने वाले विश्लेषण इस संस्कृति प्रणाली में व्यवहार्य हैं। यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन विकास, चयनात्मक भेद्यता और रोग को परिभाषित करने वाले तंत्रों में अनुसंधान को सक्षम करेगा।

Introduction

प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स की संस्कृति एक शक्तिशाली उपकरण है जो न्यूरोनल विकास, कार्य और एक्सोजेनस तनावके अध्ययन को सक्षम बनाता है। मोटर न्यूरॉन संस्कृतियां न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस)1,2के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, जिनकी रोग तंत्र को अधूरा समझा जाता है। दिलचस्प बात यह है कि एएलएस रोगियों और एएलएस मॉडल चूहों दोनों में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (एसएमएनएस) की महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु के बावजूद, ओकुलोमोटर न्यूरॉन्स (सीएन3एस) और ट्रोक्लोर न्यूरॉन्स (सीएन4) में सेल डेथ अपेक्षाकृत दुर्लभ1,3,4,5,7,7,8,9हैं। इसलिए, CN3s/CN4s और SMNs की शुद्ध संस्कृतियों के तुलनात्मक विश्लेषण सापेक्ष भेद्यता अंतर्निहित तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकता है । दुर्भाग्य से, इस तरह के विश्लेषण के लिए एक प्रमुख बाधा इन मोटर न्यूरॉन्स की शुद्ध संस्कृतियों को विकसित करने में असमर्थता रही है ।

पशु मॉडल ों से एसएमएनएस के शुद्धिकरण के लिए कई प्रोटोकॉल बताए गए हैं। इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल घनत्व ढाल केंद्रीकरण10,11,12 और/या p75एनटीआर-एंटीबॉडीआधारित सेल-छंटाई पैनिंग तकनीक13,14,15,16का उपयोग करते हैं । घनत्व ढाल केंद्रीकरण अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के सापेक्ष एसएमएनएस के बड़े आकार का शोषण करता है, जबकि p75एनटीआर रीढ़ की हड्डी में एसएमएनएस द्वारा विशेष रूप से व्यक्त किया गया एक बाह्य प्रोटीन है। इनमें से एक या दोनों प्रोटोकॉल 11,12,14द्वारा लगभग 100% शुद्ध स्एम संस्कृतियों का उत्पादन किया गया है . हालांकि, ये प्रोटोकॉल CN3/CN4 संस्कृतियों को पैदा करने में सफल नहीं रहे हैं क्योंकि CN3s/CN4s p75NTRव्यक्त नहीं करते हैं, और अन्य विशिष्ट CN3/CN4 मार्कर की पहचान नहीं की गई है । वे भी SMNs से छोटे है और इसलिए, और अधिक आकार के आधार पर अलग करने के लिए मुश्किल है । इसके बजाय, CN3s या CN4s के इन विट्रो अध्ययन ों ने17,18,19,20,21,एक्सप्लांट17,22,23,24,25,26,और स्लाइस27,28 संस्कृतियों पर भरोसा किया है, जो विषम कोशिका प्रकारों से बने हैं, और कोई प्रोटोकॉल के लिए मौजूद नहीं है प्राथमिक CN3s या CN4s के अलगाव और संस्कृति।

यहां, एक प्रोटोकॉल एक ही भ्रूण दिन 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ट्रांसजेनिक चूहों29 (चित्रा 1, चित्रा 2ए)से CN3s, CN4s, और SMNs की कल्पना, अलगाव, शुद्धिकरण और खेती के लिए वर्णित है। आईएसएलएमएन:जीएफपी विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स को एक फर्राटेदार जीएफपी के साथ लेबल करता है जो कोशिका झिल्ली को स्थानीयता देता है। यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन रोग में रोग तंत्र को स्पष्ट करने के लिए कई प्रकार के मोटर न्यूरॉन्स की प्रजातियों और आयु-मिलान तुलना को सक्षम बनाता है।

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Protocol

प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए और बोस्टन चिल्ड्रन अस्पताल की पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ NIH दिशा निर्देशों के अनुसार सभी प्रयोग किए गए थे ।

1. विच्छेदन से पहले समय पर संभोग स्थापित करना

  1. मोटर न्यूरॉन फसल के लिए जन्म के पूर्व भ्रूण चूहों उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक महिला माउस का वजन करें और न्यूरॉन अलगाव के दिन से 11.5 दिन पहले वयस्क आईएसएलएमएन:जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों के बीच समय पर संभोग स्थापित करें। इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के उद्देश्य से, 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP चूहों, 2−9 महीने की आयु, इस्तेमाल किया गया था और समय पर संभोग शाम को स्थापित किया गया था ।
  2. योनि प्लग के लिए महिला चूहों की जांच अगले सुबह प्लग। उस तारीख पर विचार करें जिस पर प्लग की पहचान भ्रूण दिवस (ई) 0.5 के रूप में की जाती है।
  3. महिला चूहों का वजन करें और E8.5−11 के बीच अल्ट्रासाउंड (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके पिल्ले की जांच करें। सफल संभोग के संकेतों की जांच करें।
    1. महिला चूहों में वजन बढ़ने का पता लगाकर सफल संभोग की पुष्टि करें (आमतौर पर E9.5 पर 1.5 ग्राम यदि 5−6 से अधिक भ्रूण हैं)।
    2. नेत्रहीन अल्ट्रासाउंड के तहत भ्रूण की पुष्टि करें। E9.5 के बाद अल्ट्रासाउंड द्वारा भ्रूण का आसानी से पता लगाया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड केवल उन महिलाओं पर आयोजित किए जाते हैं जिन्होंने वजन प्राप्त किया है क्योंकि वे उन लोगों की तुलना में अधिक बार गर्भवती होती हैं जो नहीं करते हैं।
      नोट: महिला चूहों गर्भावस्था के अलावा अन्य कारणों के लिए वजन हासिल कर सकते हैं, तो अकेले वजन बढ़ाने गर्भावस्था का एक विश्वसनीय संकेतक नहीं है। अल्ट्रासाउंड पुष्टि उन महिलाओं के अनावश्यक बलिदान को रोकती है जो गर्भवती नहीं हैं लेकिन अनुपलब्ध होने पर महत्वपूर्ण नहीं हैं।

2. विच्छेदन की स्थिति और उपकरणों की तैयारी

  1. सभी कोटिंग (कवरस्लिप की एसिड-सफाई को छोड़कर), मीडिया की तैयारी, ऊतक विच्छेदन (केंद्रीकरण और ऊष्मायन को छोड़कर), और संस्कृति मीडिया और भ्रूणीय मोटर न्यूरॉन्स की नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए एक लेमिनार प्रवाह हुड में काम करती है।
  2. बाँझ तकनीक पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने के साथ, संदूषण के न्यूनतम जोखिम के साथ लैमिनार प्रवाह हुड के बाहर ऊतक विच्छेदन का संचालन करें।
  3. एक विच्छेदन प्लेट, माइक्रोडिसेकिंग कैंची की एक जोड़ी, अंगूठे ड्रेसिंग संदंश की एक जोड़ी, डुमोंट #5 चिमटी के दो जोड़े, एक माइक्रोडिसेकिंग चाकू, और उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल में विसर्जित करके एक मोरिया मिनी छिद्रित चम्मच।

3. पीडीएल/लेमिनिन कोटिंग ऑफ डिश/कवरस्लिप

नोट: संस्कृति ९६ अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से प्लेटों में प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स विसोशिएट, आवेदन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर । कोशिकाओं को सीधे ऊतक संस्कृति प्लेट में कवरस्लिप के उपयोग के बिना चित्रित किया जा सकता है यदि कुएं ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी हैं और मोटाई इमेजिंग के साथ संगत हैं।

  1. कवरस्लिप की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए, न्यूरॉन अलगाव से कम से कम 2 दिन पहले एसिड-साफ, निष्फल और हवा में सूखे कवरस्लिप तैयार करें जैसा कि पहले30वर्णित था। कवरस्लिप के बैचों को प्रयोगों से पहले इस तरीके से तैयार किया जा सकता है और प्रायोगिक गुणवत्ता पर प्रभाव के बिना 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. न्यूरॉन आइसोलेशन से 2 दिन पहले फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) में 20 μg/mL पॉली डी-लाइसिन (पीडीएल) का वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें ।
    1. अलीकोट पीडीएल (1 मिलीग्राम/एमएल) एडवांस में स्टोर करें और स्टॉक सॉल्यूशन के तौर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  3. प्रत्येक कवरस्लिप की सतह या ऊतक संस्कृति प्लेट की अच्छी तरह से पर्याप्त पीडीएल समाधान कार्य समाधान (उदाहरण के लिए, 96 अच्छी प्लेटों पर प्रति अच्छी तरह से 100 μL या 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर 500 μL के साथ या बिना कवरस्लिप के) कवर करें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. अगले दिन निष्फल पानी के साथ 3x धोएं।
    1. प्लेटों को पैराफिन फिल्म के साथ सील करें और धोए गए पीडीएल-कोटेड प्लेटों को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि वे अंतिम धोने के बाद पूरी तरह से सूख जाते हैं।
  5. पीबीएस के 1.2 मिलीग्राम में 10 माइक्रोन लेमिनिन (1.1−1.2 मिलीग्राम/एमएल) के साथ एक कार्य समाधान तैयार करें।
    1. अलीकोट लेमिनिन स्टॉक्स (1.1−1.2 मिलीग्राम/मिलीग्राम) एडवांस में और स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. सतह को समान रूप से कोट करने के लिए पर्याप्त लेमिनिन समाधान के साथ प्रत्येक कवरस्लिप की सतह या अच्छी तरह से कवर करें। उपयोग करने से पहले कम से कम 2 घंटे कम से कम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: पीडीएल/लेमिनिन-कोटेड प्लेट्स और कवरस्लिप को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 हफ्ते तक स्टोर किया जा सकता है, लेकिन हौसले से लेमिनकोटेड लेमिनको पसंद किया जाता है। 30चढ़ाना से पहले सीधे टुकड़े टुकड़े निकालें । लैमिनिन को सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। अगर प्लेटों को कई घंटे से ज्यादा स्टोर करना है तो उन्हें पैराफिन फिल्म में लपेटा जाना चाहिए।

4. विच्छेदन, मोटर न्यूरॉन संस्कृति मीडिया, और विच्छेदन समाधान की तैयारी

नोट: कोष्ठक में सांद्रता प्रत्येक अभिकर्मक की अंतिम सांद्रता का संकेत देती है।

  1. विच्छेदन माध्यम तैयार करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम गल, 1 mL aliquots तैयार है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । उपयोग से पहले सीधे आरटी पर गल aliquots ।
    2. स्टोर B27-पूरक (50x) में 1 mL aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर। उपयोग से तुरंत पहले आरटी पर गल aliquots । फ्रीज/गल चक्र से बचें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूटामाइन सप्लीमेंट (100x) स्टोर करें। यदि -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण किया जाता है तो 0.5 एमएल एलिकोट्स में विभाजित करें।
    4. स्टोर पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू/एमएल) में 1 एमएल aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर। उपयोग से तुरंत पहले आरटी पर गल aliquots ।
    5. विच्छेदन माध्यम बनाने के लिए, घोड़े सीरम (2%), के 200 माइक्रोन के साथ हाइबरनेट ई के 9.4 मिलील मिलाएं, 200 माइक्रोन ऑफ 50x बी 27 सप्लीमेंट (1x), 100x ग्लूटामाइन सप्लीमेंट (1x) (जैसे, ग्लूटामैक्स) का 100 माइक्रोन और 10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू/एमएल) का 100 माइक्रोन। विच्छेदित ऊतकों को इकट्ठा करने और विसोसिएट कोशिकाओं का अंतिम निलंबन करने के लिए इस माध्यम का उपयोग करें।
    6. न्यूरॉन आइसोलेशन से एक दिन पहले ऊतक संग्रह के लिए विच्छेदन माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए एक ट्यूब तैयार करें जिसे एकत्र किया जाएगा (उदाहरण के लिए, सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, CN3/CN4, SMN) और उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. B27 पूरक (1x) के 1 mL के साथ हाइबरनेट ई कम फ्लोरेसेंस मीडिया के 49 मिलील गठबंधन और न्यूरॉन अलगाव से पहले दिन इस माध्यम (2 mL/well) के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली भरें। माउस भ्रूण इकट्ठा करने के लिए इस पकवान का प्रयोग करें। उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. मोटर न्यूरॉन कल्चर मीडियम तैयार करें।
    1. लीबोविट्ज के L15 मीडियम में 25 एमएम 2-मर्काप्टोथेनॉल के 250 माइक्रोन एलिकोस तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. बीडीएनएफ, सीएनटीएफ और जीडीएनएफ के 100 माइक्रोन/एमएल समाधानों के 5 माइक्रोन एलिकोस उत्पन्न करें। उपयोग से तुरंत पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आरटी पर गल एलिकोट्स करें।
    3. डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के 64 माइक्रोन को 5 मिलीग्राम (1.0670 माइक्रोन) फोरस्कोलिन और भंवर अच्छी तरह से जोड़कर 10 एमएम फोरस्कोलिन समाधान तैयार करें। फिर डीएमएसओ समाधान और भंवर अच्छी तरह से निष्फल पानी (1.003 मीटर) जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 एमएम फोरस्कोलिन के 12 माइक्रोन एलिकोट्स स्टोर करें और उपयोग से तुरंत पहले आरटी पर गल एलिकोट्स करें।
    4. डीएमएसओ में पतला 100 एमएम आइसोबुटिलमेथिलक्क्सिनथिन (आईबीएमएक्स) के 12 माइक्रोनएल एलिकोस तैयार करें। उपयोग से तुरंत पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आरटी पर गल एलिकोट्स करें।
    5. मोटर न्यूरॉन संस्कृति को माध्यम बनाने के लिए, घोड़े सीरम (2%), के 200 माइक्रोन के साथ न्यूरोबेसल माध्यम के 9.4 मिलील मिलाएं, 50x B27 पूरक (1x), 100x ग्लूटामाइन पूरक (1x) के 100 माइक्रोन, 10,000 यू/एम के 100 माइक्रोन के 200 μL: पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू/एमएल), और 25 एमएम 2-मर्कैप्टोएनॉल (50 माइक्रोन) के 20 μL, अधिमानतः उपयोग से पहले। यह कदम न्यूरॉन आइसोलेशन से 1 दिन पहले तक किया जा सकता है।
    6. उपयोग से ठीक पहले, मोटर न्यूरॉन कल्चर मीडियम में 100 माइक्रोन/एमएल बीडीएनएफ (10 एनजी/एमएल), सीएनटीएफ (10 एनजी/एमएल), और जीडीएनएफ (10 एनजी/एमएल) और 10 मीटर के 10 माइक्रोनल (10 माइक्रोन) और 100 मीटर आईबीएमएक्स (100 माइक्रोएम) के 10 माइक्रोन लमें जोड़ें। मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।
  3. वियोजन समाधान तैयार करें।
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पाकिन समाधान (20 यू/एमएल पापाकिन और 0.005% डीएनस) और एक एल्बुमिन-ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल ओमोमुकोइड अवरोधक, 1mg/mL एल्बुमिन, और 0.005% DNase) तैयार करें।
    2. प्रत्येक ओवोमुकोइड अवरोधक और पाकिन समाधानों के 500 माइक्रोन एलिकोस तैयार करें और - 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से तुरंत पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर गल एलिकोकोट करता है।

5. वेंट्रल मिडब्रेन और स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन

नोट: फ्लोरेसेंस विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत चरण5.1.1−5.1.3 और 5.1.5−5.1.6 को छोड़कर निम्नलिखित सभी चरणों का प्रदर्शन करें। प्रति प्रयोग कुल विच्छेदन समय आम तौर पर 3−5 घंटे होता है, जो विच्छेदन तकनीक में प्रवीणता और प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक मोटर न्यूरॉन्स की संख्या के आधार पर होता है।

  1. वेंट्रल मिडब्रेन विच्छेदन
    1. कार्बन डाइऑक्साइड गैस और सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा लगभग 11.5 दिन पोस्टफर्टिलाइजेशन गर्भवती माउस को इच्छामृत्यु दें।
    2. पेट को इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से स्प्रे करें और बाँझ माइक्रोडिसेकिंग कैंची और अंगूठे ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करके गर्भाशय को हटा दें। गर्भाशय को बाँझ पीबीएस में संक्षेप में धोएं, फिर प्रीचिल्ड बाँझ पीबीएस से भरी विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें।
    3. IslMNनिकालें: GFP-सकारात्मकभ्रूण ध्यान से गर्भाशय से बाँझ microdissecting कैंची, अंगूठे ड्रेसिंग संदंश, और Dumont #5 माइक्रोस्कोप की उज्ज्वल रोशनी के तहत बर्फ में चिमटी #5 । एक बाँझ मोरिया मिनी छिद्रित चम्मच का उपयोग करना, प्रत्येक भ्रूण को 1x B27 के साथ पूरक प्रीचिलाड हाइबरनेट-ई कम फ्लोरेसेंस माध्यम से भरी 24 अच्छी तरह से प्लेट के एक अलग कुएं में स्थानांतरित करें। बर्फ पर 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
    4. एक भ्रूण को बाँझ विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे पूरी तरह से बर्फ-ठंडे बाँझ हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) के साथ कवर करें।
    5. सुनिश्चित करें कि विच्छेदन कदम माइक्रोस्कोप के फ्लोरोसेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफवाईटीसी) रोशनी के तहत किए जाते हैं। चिमटी का उपयोग करना, मिडब्रेन(चित्रा 2बीए)को नुकसान पहुंचाए बिना पूंछ और भ्रूण के चेहरे को हटा दें। भ्रूण को नीचे पैर पसारने वाले अंगों और पूंछ के नीचे पैर रखकर, अक्षेत्र की ओर रखें (एक तारक, चित्रा 2बीबीद्वारा इंगित)।
    6. चिमटी का उपयोग करना, एक छोटे से उद्घाटन उत्पन्न करने के लिए चौथे वेंट्रिकल की छत को खोलें। चौथे वेंट्रिकल और इसकी छत के बीच बनाई गई जगह में चिमटी हुक करने के लिए इस उद्घाटन का उपयोग करें। भ्रूण रोस्ट्रल की पृष्ठीय सतह के साथ कॉर्टेक्स और पार्श्व को फर्श प्लेट और मोटर कॉलम(चित्रा 2सीए, बी)में विच्छेदन करें। जीएफपी-पॉजिटिव CN3 और CN4 नाभिक प्रकट करने के लिए विच्छेदित ऊतक को खुली पुस्तक तरीके से खोलें।
      नोट: मेसेनचिम, CN3 और CN4 युक्त वेंट्रल मिडब्रेन से ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा अब उजागर हो जाएगा ।
    7. ध्यान से भ्रूण से वेंट्रल मिडब्रेन अलग करें और चिमटी और एक माइक्रोडिसेकिंग चाकू का उपयोग करमेनिंगल ऊतक को हटा दें। द्विपक्षीय GFP-सकारात्मक CN3 और CN4 नाभिक फर्श की थाली और अन्य GFP नकारात्मक आसपास के ऊतकों चिमटी और एक microdissecting चाकू(चित्रा 2डी)का उपयोग कर से दूर विच्छेदन । उत्पादित ऊतकमें जीएफपी-पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करें लेकिन उन्हें छूने या नुकसान पहुंचाने से बचें।
    8. यदि अलग CN3 और CN4 नाभिक का संग्रह वांछित है, तो इन दो नाभिक (चित्रा 2डीमें पीले बिंदीदार रेखा) के मिडलाइन के साथ कट जाएं। P1000 पिपेट का उपयोग करके, न्यूनतम एचबीएसके साथ विच्छेदित वेंट्रल मिडब्रेन ऊतक एकत्र करें और इसे विच्छेदन माध्यम से भरे लेबल वाले 1.7 एमएएल माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखें (चरण 4.1.5 देखें)। विसोजन तक बर्फ पर स्टोर करें।
    9. एक ही ट्यूब में अतिरिक्त भ्रूण से वेंट्रल मिडब्रेन पूलिंग जारी रखें जब तक कि कुल संख्या प्रायोगिक आवश्यकता को पूरा नहीं करती (आदर्श सेल संख्या के लिए चरण 8 का उल्लेख करें)।
      नोट: लगभग 1 x 104 CN3/CN4 मोटर न्यूरॉन्स उपज कम से 10 वेंट्रल मिडब्रेन का एक पूल्ड संग्रह की सिफारिश की जाती है क्योंकि ऊतक ों को वियोजन और छंटाई के दौरान तनाव के अधीन किया जाता है ।
  2. वेंट्रल रीढ़ की हड्डी विच्छेदन
    1. भ्रूण को माइक्रोस्कोप के सामने का सामना करने वाले सिर के साथ, विक्षेत्र की ओर प्रवण रखें। चिमटी की एक जोड़ी के साथ भ्रूण पकड़ो और चौथे वेंट्रिकल के बिना खोले कौडल भाग में चिमटी की दूसरी जोड़ी की नोक डालें ।
    2. भ्रूण की पूरी रोस्ट्रोकेडल सीमा पर हिंदब्रेन और रीढ़ की हड्डी के बाकी हिस्सों को डोर्सली खोलें। पृष्ठीय ऊतक को काटकर खुला, चौथे वेंट्रिकल से शुरू होकर कैंची के रूप में संदंश का उपयोग करके कॉडल रीढ़ की हड्डी की केंद्रीय नहर की ओर काम करना(चित्रा 2Ca, b)। इस प्रक्रिया के दौरान वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को छूने या नुकसान पहुंचाने से बचने का ध्यान रखें।
    3. चिमटी की एक जोड़ी के साथ भ्रूण पकड़ो और चिमटी की दूसरी जोड़ी के साथ प्रत्येक पक्ष पर पृष्ठीय ऊतक के फ्लैप से चुटकी(चित्रा 2Ea, बी)।
      नोट: उत्पादित पृष्ठीय ऊतकों में पृष्ठीय त्वचा, मेसेनचिम, पृष्ठीय जड़ गंगलिया (डीआरजी), पृष्ठीय हिंदब्रेन और रीढ़ की हड्डी होती है। एसएमएन नाभिक को नुकसान पहुंचाए बिना जितना संभव हो उतना इन ऊतकों को हटा दें, क्योंकि वे चिपकने वाले हैं और एफएसीएस छंटाई के दौरान फ़िल्टरिंग या क्लोजिंग के दौरान एसएमएनएस को ट्रैप कर सकते हैं।
    4. जीएफपी-पॉजिटिव SMN के नीचे सीधे छेदकरने के लिए माइक्रोडिसेक्शन चाकू का उपयोग करवेंट्रल रीढ़ की हड्डी को हटा दें। दोनों तरफ आरी की तरह आंदोलनों के साथ वेंट्रल रीढ़ की हड्डी लिफ्ट(चित्रा 2एफए, बी)। फ्लोटिंग वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को सीधे C1 से ऊपर काट ें, जहां पहले जीएफपी-पॉजिटिव पूर्वकाल सींग परियोजनाएं(चित्रा 2जी)। इसके अलावा, निचले अंग(चित्रा 2जी)की ऊपरी सीमा पर ट्रांसवर्सी काटें। इस प्रक्रिया के बाद वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के सर्वाइकल (C1) - काठ (एल2-एल3) हिस्से को हटा दें।
    5. वेंट्रल रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें और चिमटी की एक जोड़ी के साथ GFP-सकारात्मक SMN स्तंभों के बीच GFP-नकारात्मक ऊतक दबाकर पकड़ें। माइक्रोडिसेक्शन चाकू(चित्रा 2एच)के साथ जीएफपी-पॉजिटिव एसएमएन कॉलम के दोनों किनारों को ट्रिम करके शेष संलग्न मेसेनचिम, डीआरजी और पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी को हटा दें। उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना जीएफपी-पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स को अधिकतम करने का ध्यान रखें।
    6. P1000 पिपेट का उपयोग करके, विच्छेदन वाले वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को न्यूनतम एचबीएसएसएस के साथ इकट्ठा करें और विच्छेदन माध्यम से भरे एसएमएन-लेबल वाले 1.7 मिलीएम माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखें। विसोजन तक बर्फ पर स्टोर करें। कुल संख्या प्रायोगिक आवश्यकताओं को पूरा करने तक एक ही ट्यूब में अतिरिक्त भ्रूण से वेंट्रल रीढ़ की हड्डी पूलिंग जारी रखें।
      नोट: लगभग 2.1 x 104 SMN उपज कम से कम तीन वेंट्रल रीढ़ की हड्डी का संग्रह करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि ऊतक ों को वियोजन और छंटाई के दौरान तनाव के अधीन हैं।
    7. आईएसएलएमएन के चेहरे के मोटर न्यूरॉन्स और चरम ों को एकत्र करें: जीएफपी माउस भ्रूण क्रमशः फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) के लिए जीएफपी-पॉजिटिव और जीएफपी-नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। चरम GFP-नकारात्मक हैं क्योंकि एसएमएन के जीएफपी-पॉजिटिव एक्सोन ने अभी तक इस भ्रूणीय उम्र में चरम में विस्तार नहीं किया है।

6. ऊतक विच्छेदन

नोट: कुल वियोजन समय आमतौर पर प्रति प्रयोग 1.5 घंटे होता है।

  1. गर्म पाओमिन और एल्बुमिन-ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान विच्छेदन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस 30 मिन तक होता है।
  2. संक्षेप में कम गति से माइक्रोडिसेक्ड ऊतकों को नीचे स्पिन करें।
  3. P100 पिपेट का उपयोग करके, ध्यान से ऊतकों को एस्पिरेटिंग किए बिना जितना संभव हो उतना हाइबरनेट ई हटा दें।
    नोट: अगले चरण में पापन वियोजन की प्रभावकारिता को कम करने से बचने के लिए इस कदम के बाद सभी अवशिष्ट हाइबरनेट ई को हटाना सुनिश्चित करें।
  4. माइक्रोडिसेटेड ऊतक नमूनों वाले 1.7 मिलीएम माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में पाकिन समाधान(टेबल 1)की उचित मात्रा जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं पर तनाव को कम करते हुए प्रभावी वियोजन को अधिकतम करने के लिए विच्छेदन के लिए पाओन की उचित मात्रा निर्धारित की गई थी।
  5. धीरे से एक P200 पिपेट के साथ 8x triturate । मोटर न्यूरॉन व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए धीरे से सभी त्रिचरन कदम प्रदर्शन करें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए ऊतकों युक्त ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, उंगली से हर 10 x 10x को फ्लिकिंग करके आंदोलन करते हैं। ऊष्मायन के बाद प्रत्येक निलंबन 8x को पी 200 पिपेट के साथ धीरे से त्रिकोणीय करें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
  7. अगले चरण में ओवोमुकोइड अवरोध की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, ऊतकों को एस्पिरेट किए बिना जितना संभव हो उतना अधिनेत हटाने और त्यागने के लिए P1000 पिपेट का उपयोग करें।
  8. एक P200 पिपेट के साथ धीरे-धीरे 8x को ट्रिम करके एल्बुमिन-ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान(टेबल 1)की उचित मात्रा में छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  9. 2 मिन के लिए प्रतीक्षा करें कि ट्यूब के नीचे बसने के लिए अादित ऊतक के किसी भी शेष टुकड़े की अनुमति दें।
  10. P200 पिपेट का उपयोग करके असामाजिक ऊतकों को एस्पिरेटिंग किए बिना जितना संभव हो उतना अधिनेत लीजिए। सुपरनेटेंट को ताजा 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  11. यदि ऊतक का कुछ हिस्सा चरण 6.10 के बाद असामाजिक रहता है, तो कोशिकाओं पर तनाव को कम करते हुए विसोशिएट कोशिकाओं की अंतिम उपज को अधिकतम करने के लिए मूल 1.7 मिलीएम माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों में रहने वाले अडिससोशिएटोज ऊतकों के लिए 6.8−6.10 चरणदोहराएं पहले से विसोसिएट, चरण 6.10 के अधिस्थान में निहित है।
  12. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें। पी1000 पिपेट का उपयोग करके सुपरनेट को सावधानी से हटा दें और त्यागें।
  13. P1000 पिपेट का उपयोग करके 8x पाइपिंग करके विच्छेदन माध्यम(तालिका 1)की उचित मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। अंतिम निलंबन की उचित मात्रा निर्धारित की गई थी ताकि सेल घनत्व १०७ कोशिकाओं/mL से अधिक न हो, जो प्रवाह साइटोमेट्री मशीन की धारा को अवरुद्ध कर सके, लेकिन यह भी कि कोशिकाओं को जरूरत से ज्यादा पतला नहीं कर रहे हैं, जो एक धीमी छंटाई गति में परिणाम ।
  14. किसी भी बड़े झुरमुट या पचाए गए ऊतकों को खत्म करने के लिए 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें। निलंबन को 5 मिलीआर राउंड बॉटम पॉलीस्टीरिन टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें और आवश्यकता होने तक बर्फ पर स्टोर करें।

7. फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS)

नोट: इस प्रोटोकॉल को 15 मेगावाट 405 एनएम वायलेट लेजर, 100 मेगावाट 488 एनएम ब्लू लेजर, 75 मेगावाट 594 एनएम ऑरेंज लेजर और 40 मेगावाट 640 एनएम लाल लेजर से लैस एक FACS सॉर्टर का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। कोशिकाओं को 100 माइक्रोन नोजल के माध्यम से एसेप्टिक स्थितियों के तहत बाँझ पीबीएस में म्यान तरल पदार्थ के रूप में हल किया गया था। सेल तनाव को कम करने के लिए, प्रवाह दर को 1−3 के नमूना दबाव के लिए सेट किया गया था, जैसे कि प्रति सेकंड अधिकतम 1,000−4,000 घटनाओं का अधिग्रहण किया गया था। कुल FACS समय आम तौर पर प्रति प्रयोग 1−2 घंटे है।

  1. आगे और साइड स्कैटर के लिए वोल्टेज सेट करें ताकि सेल की आबादी की ठीक से कल्पना की जा सके। सेल छंटाई के लिए उचित वोल्टेज की स्थापना जटिल है और एक अनुभवी FACS ऑपरेटर की आवश्यकता है ।
  2. विभिन्न सेल आबादी को अलग करने के लिए, साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) द्वारा निर्धारित आंतरिक जटिलता बनाम फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) द्वारा निर्धारित आकार के आधार पर भूखंड कोशिकाओं को प्लॉट करें। मलबे और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए चित्रा 3एए और फिगर बीए में इंगित के रूप में जीवित कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट ड्रा करें। जनसंख्या 1 (P1) के रूप में gated क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं को समूह ।
  3. सेल झुरमुट और डबल्स को बाहर करने के लिए, एसएससी-ए बनाम साइड स्कैटर चौड़ाई (एसएससी-डब्ल्यू) के आधार पर अगले P1 कोशिकाओं को प्लॉट करें। जनसंख्या 2 (P2)(चित्रा 3एबी और चित्रा बीबी)के रूप में एकल कोशिकाओं की आबादी गेट ।
  4. FSC-ए बनाम फॉरवर्ड स्कैटर चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू) बनाम प्लॉट पी 2 कोशिकाएं और जनसंख्या 3 (पी 3)(चित्रा 3एसी और फिगर बीसी)के रूप में एकल कोशिकाओं की आबादी को गेट करें।
    नोट: 7.3 और 7.4 में लगातार दो फाटकों का उपयोग सेल झुरमुट और डबल्स (उच्च एफएससी-डब्ल्यू और उच्च एफएससी-ए) शामिल नहीं है।
  5. गेट P3 कोशिकाओं GFP बनाम allophycocyanin (एपीसी) पर आधारित है । एपीसी चैनल ऑटोफ्लोरेसेंस का पता लगाता है । इस चैनल पर गेटिंग ऑटोफ्लोरोसेंट कोशिकाओं को कैप्चर करने से बचता है। एफएफसी/जीएफपी फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए वोल्टेज को समायोजित करने के लिए जीएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करें । आदर्श रूप से, 102के आसपास इन सेल आबादी के लिए स्थिति द्वार। प्रत्येक प्रकार के मोटर न्यूरॉन(चित्रा 3विज्ञापन और चित्रा बीडी)के लिए व्यक्तिगत रूप से जीएफपी-पॉजिटिव जनसंख्या 4 (पी 4) के लिए गेट थ्रेसहोल्ड का चयन करें।
    नोट: एक शुद्ध संस्कृति प्राप्त करने के लिए CN3s/CN4s की तुलना में SMNs के लिए GFP गेट बहुत अधिक सेट करें(चित्रा 3विज्ञापन और चित्रा बीडी)। SMN संस्कृतियों के लिए एक कम GFP गेट ग्लिया और गैर मोटर न्यूरॉन्स द्वारा संस्कृतियों के संदूषण की ओर जाता है । यह संभावना है क्योंकि एक टपका हुआ प्रमोटर के कारण कुछ ग्लिया और गैर मोटर न्यूरॉन्स में निम्न स्तर की जीएफपी अभिव्यक्ति है। कुल कोशिकाओं की तुलना में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत आमतौर पर CN3s/CN4s के लिए 0.5−1.5% और एसएमएनएस के लिए 1.5−2.5% है। यदि विच्छेदन सफल रहा, तो इन नंबरों का उपयोग जीएफपी-पॉजिटिव गेट(चित्रा 3एई और फिगर बी)के लिए उपयुक्त स्थिति निर्धारित करने के लिए एक बेंचमार्क के रूप में किया जा सकता है।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार FACS करें। मोटर न्यूरॉन संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोन से भरे ताजा 1.7 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबों में P4 कोशिकाओं को इकट्ठा करें। चढ़ाना तक बर्फ पर स्टोर करें।
    नोट: हालांकि कोशिकाओं को सीधे कुओं में हल किया जा सकता है, इसके परिणामस्वरूप प्रति कोशिकाएं असमान संख्या में होती हैं। कोशिकाओं को 1.75 मीटर माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूबों में सॉर्ट करें और फिर अधिक प्लेटिंग वितरण प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से प्लेट करें।

8. शुद्ध प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स की संस्कृति

  1. पतला FACS-अलग CN3/CN4 और मोटर न्यूरॉन संस्कृति माध्यम के साथ SMN निलंबन क्रमशः 5 x 103 और 1 x 104 कोशिकाओं/mL के घनत्व के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्वगरम ।
    नोट: एक E11.5 भ्रूण पैदावार लगभग 1 x 103 CN3/CN4 और 7 x 103 SMN । हालांकि, ये पैदावार विच्छेदित ऊतकों की शुद्धता, सेल विच्छेदन की पूर्णता और एफएसीएस के दौरान जीएफपी गेट्स की उपयुक्त थ्रेसहोल्डिंग पर काफी भरोसा करती है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर से लेमिनार फ्लो हुड और प्रत्येक कुएं से एस्पिरेट लैमिनिन तक पीडीएल और लेमिनिन के साथ प्रीकोटेड 96 अच्छी प्लेटें स्थानांतरित करें। बिना धोए तुरंत प्लेट और कवरस्लिप का इस्तेमाल करें।
  3. पीडीएल/लैमिनिन-लेपित ९६ अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में पतला CN3/CN4 और SMN निलंबन के २०० μL जोड़ें । अंतिम सेल घनत्व क्रमशः CN3/CN4 और SMN के लिए 1 x 103 और 2 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से होना चाहिए ।
    नोट: 96 अच्छी प्लेटों (2 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) में एसएमएनएस का प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व CN3s/CN4s (1 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) के दोगुने है ताकि 2 और 9 दिनों में इसी तरह के अंतिम मोटर न्यूरॉन नंबर और घनत्व प्राप्त करने के लिए क्रमशः विट्रो (DIV) (4−6 x 102 और 2−4 x 102 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) ।
  4. संस्कृति न्यूरॉन्स एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में।
  5. पुराने मीडिया (100 माइक्रोन) के आधे हिस्से को हटाकर और ताजा मोटर न्यूरॉन कल्चर मीडियम की एक ही मात्रा के साथ बदलकर हर 5 दिन में न्यूरॉन्स खिलाएं। सुनिश्चित करें कि न्यूरोनल प्रक्रियाएं 1 DIV पर दिखाई देती हैं और 14 DIV(चित्रा 4)द्वारा मोटा और लंबी हो जाती हैं। न्यूरोनल सेल निकाय बढ़े हुए हो जाते हैं और विशेष रूप से एसएमएनएस(चित्रा 4)के लिए दीर्घकालिक संस्कृतियों में एकत्र होते हैं।
    नोट: अलग सुसंस्कृत कोशिकाओं से बचने के लिए मूल मध्यम मात्रा के आधे छोड़ कर सभी मध्यम और समाधान परिवर्तन करें। इसमें फिक्सेशन और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) कदम शामिल हैं। यदि सभी मीडिया को हटा दिया जाता है, तो भले ही धीरे-धीरे, अधिकांश कोशिकाएं अलग हो जाएंगी और धोई जाएंगी।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अत्यधिक शुद्ध और संस्कृति दोनों प्राथमिक CN3s/CN4s और SMNs दीर्घकालिक मोटर न्यूरॉन विकारों अंतर्निहित तंत्र के तुलनात्मक विश्लेषण सक्षम करने के लिए किया गया था (देखें चित्रा 1 और अवलोकन के लिए 2 चित्रा) ।

एक बार न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति में बड़े हो गए थे, लगभग शुद्ध प्राथमिक CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों प्राप्त किए गए(चित्रा 5A,बी)और कम से 14 DIV(चित्रा 4 और चित्रा 6)के लिए बनाए रखा । 2 DIV में CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों की शुद्धता क्रमशः 93.5 ± 2.2% और 86.7 ± 4.7% थी, जब आईसीसी द्वारा मोटर न्यूरॉन मार्कर Islet1 और न्यूरोनल मार्कर TUJ1(चित्रा 5बी)का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। हालांकि, इन उच्च शुद्धताओं भ्रूण की उम्र पर भारी भरोसा किया और FACS(चित्रा 3)के दौरान GFP फाटकों के लिए उपयुक्त थ्रेसहोल्ड स्थापित करने पर । E10.5 पर भ्रूण का विच्छेदन ऊतकों की बढ़ी हुई कोमलता और चिपकने के कारण E11.5 पर विच्छेदन से अधिक कठिन है, जिसके परिणामस्वरूप मोटर न्यूरॉन की पैदावार में कमी आई है। हालांकि, E10.5 CN3s/CN4s और SMNs की शुद्धता E11.5 भ्रूण (क्रमशः 2 DIV पर ९२.८% और ८२.२%) के लिए उन लोगों के लिए तुलनीय थे; एक ही प्रयोग से प्राप्त डेटा) । CN3s/CN4s और SMNs की शुद्धता नाटकीय रूप से कम हो गई जब E13.5 भ्रूण का उपयोग किया गया था, भले ही केवल उच्चतम GFP-सकारात्मक आबादी एकत्र की गई थी (2 DIV पर क्रमशः 2.7% और 7.4%; एक ही प्रयोग से प्राप्त डेटा), शायद गैर मोटर न्यूरॉन्स में GFP की अभिव्यक्ति के कारण(चित्र7 चित्र7)। यह वही प्रवृत्ति भी E12.5 संस्कृतियों के लिए सही आयोजित किया, हालांकि यह बहुत कम नाटकीय था । इसलिए, E12.5 या पुराने पर भ्रूण इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर मोटर न्यूरॉन्स के शुद्धिकरण में उपयोग के लिए अनुपयुक्त हैं।

शुद्ध मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों अलग विकास पैटर्न, व्यवहार, और मोटर न्यूरॉन्स की कमजोरियों को समझने के लिए मूल्यवान हैं । यह उदाहरण दर्शाता है कि कैसे इन संस्कृतियों रासायनिक उपचार के लिए मोटर न्यूरॉन प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह निर्धारित करने के लिए कि प्राथमिक CN3s/CN4s और एसएमएनएस एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनावके लिए अंतर प्रतिक्रियाएं दिखाते हैं, CN3s/CN4s और एसएमएनएस की प्राथमिक मोनोकल्चर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त की गई थी और ईआर तनाव, साइक्लोपियाजोनिक एसिड (सीपीए) की अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। न्यूरॉन्स सीपीए (5, 10, 15, 20, 25, या 30 μM) या वाहन नियंत्रण (DMSO) के साथ 2 DIV में इलाज किया गया और 3 दिन बाद आईसीसी के लिए निर्धारित करने के लिए अस्तित्व अनुपात का मूल्यांकन(चित्रा 8ए)। प्रत्येक नमूने में व्यवहार्य न्यूरॉन्स की संख्या गिना गया था और जीवित रहने के अनुपात की गणना डीएमएसओ के साथ इलाज किए गए कुओं में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से विभाजित दवा-उपचारित कुओं में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के रूप में की गई थी। सीएन 3/CN4 मोनोकल्चर एसएमएन मोनोकल्चर(चित्रा 9 और चित्रा 8बी)31की तुलना में सीपीए उपचार (10−25 माइक्रोन) के लिए काफी अधिक प्रतिरोधी थे ।

निष्कर्ष में, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध प्राथमिक माउस भ्रूण CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो न्यूरोनल व्यवहार की जांच के लिए एक शक्तिशाली और विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स की तैयारी के लिए योजना। योजनाबद्ध अलगाव और माउस भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स की संस्कृति में शामिल कदम और घंटे या दिनों में अनुमानित समय प्रत्येक कदम के लिए दिखाता है । CN3/CN4 के लिए विच्छेदन प्रक्रिया के आदेश और SMN के लिए प्रत्येक क्रमिक रूप से 1 से 4 लेबल हैं । संक्षिप्त: CN3/CN4 = oculomotor न्यूरॉन/ SMN = रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन; FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई; ज = घंटा; d = दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वेंट्रल मिडब्रेन का विच्छेदन और ग्रीवा (C1) - काठ (L2-L3) वेंट्रल रीढ़ की हड्डी का हिस्सा। (क)पार्श्व(ए)और पृष्ठीय(ख)एक E11.5 Islएमएन में GFP-सकारात्मक मोटर न्यूरॉन्स के विचार: फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (फिटसी) रोशनी के तहत GFP ट्रांसजेनिक माउस भ्रूण । भ्रूण को पारदर्शी बनाने के लिए पहलेवर्णित ३२ के रूप में एक पूरे माउंट E11.5 भ्रूण तैयार किया गया था । बाद में, भ्रूण का विश्लेषण प्रतिरक्षण द्वारा एंटी-जीएफपी धुंधला (हरे) के साथ किया गया। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कैप्चर किया गया था। स्केल बार = 200 माइक्रोन (पार्श्व दृश्य) और 400 माइक्रोन (पृष्ठीय दृश्य)। संक्षिप्त: एस = बेहतर; मैं = अवर; V = वेंट्रल; D = पृष्ठीय। (बी-एच) एक फ्लोरेसेंस विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके उज्ज्वल प्रकाश (बीबी) या फिटसी रोशनी के तहत एक सुसज्जित कैमरे के साथ उठाए गए E11.5 वेंट्रल मिडब्रेन और वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की छवियों पर प्रकाश डाला गया विच्छेदन कदम। स्केल बार = 200 माइक्रोन (डी), और 1 मिमी (ए−सी, ई−एच)। (ख)(क)लाल रेखाओं के साथ काटकर भ्रूण के चेहरे और पूंछ को हटाना । (ख)विच्छेदन के लिए तैनात भ्रूण। माइक्रोस्कोप के सामने की स्थिति एक तारक द्वारा इंगित किया जाता है। (ग)ठोस लाल रेखा के साथ काटना चौथे वेंट्रिकल(ए)पार्श्व दृश्य और(ख)पृष्ठीय दृश्य की छत को खोलने के लिए। भ्रूण पृष्ठीय की सतह के साथ मस्तिष्क में कटौती करने के लिए इस उद्घाटन का उपयोग (धराशायी लाल तीर द्वारा इंगित प्रक्षेपवक्र)। यह मेसेनचिम, सीएन 3 और सीएन 4 युक्त ऊतक को उजागर करता है, जिसे कपाल से बाहर निकाला जा सकता है। SMN विच्छेदन के लिए, चौथे वेंट्रिकल और उसकी छत के बीच एक ही खोलने में संदंश का सम्मिलन, तो भ्रूण के कौडल पक्ष की ओर काटने (धराशायी पीले तीर द्वारा इंगित प्रक्षेपवक्र) । (D)द्विपक्षीय जीएफपी-पॉजिटिव सीएन 3 और CN4 नाभिक वाले वेंट्रल मिडब्रेन का अंतिम दृश्य । ऊतक के किनारों को लाल आयत द्वारा हाइलाइट किया जाता है। यदि वांछित हो, तो CN3 और CN4 नाभिक को अलग से इकट्ठा करने के लिए पीले बिंदीदार लाइन के साथ काटना। (ई)हिंदब्रेन और रीढ़ की हड्डी के बाकी खोलने के बाद, पृष्ठीय ऊतकों को चिमटी(ए)से पहले, और(ख)के बाद दोनों तरफ लाल रेखाओं के ऊपर से चुटकी ली । (एफ)द्विपक्षीय रूप से लाल रेखा के साथ रीढ़ की हड्डी में अतिरिक्त ऊतक वेंट्रल को हटाने(क)से पहले, और(ख)के बाद । (जी)लाल रेखाओं द्वारा इंगित दो स्थानों पर वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को काटना । रोस्ट्रल साइड पर, C1 के ऊपर फ्लोटिंग वेंट्रल रीढ़ की हड्डी को काटना जहां पहले जीएफपी-पॉजिटिव पूर्वकाल सींग परियोजनाएं होती हैं। रीढ़ की हड्डी के कौडल अंत को काटना निचले अंग की ऊपरी सीमा पर ट्रांसवर्सी से। एक बार इन कटौती कर रहे हैं, गर्भाशय ग्रीवा (C1) काठ (L2-L3) वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के हिस्से के माध्यम से दूर विच्छेदन किया जा सकता है । (ज)जीएफपी-पॉजिटिव SMN कॉलम वाले वेंट्रल रीढ़ की हड्डी का अंतिम दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि वेंट्रल मिडब्रेन (ए) और वेंट्रल रीढ़ की हड्डी (बी) के भूखंडों की तरह । (एए और बीए) फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) बनाम साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) ने मलबे और मृत कोशिकाओं के बहिष्कार से पहले प्लॉट को सुलझाया । (एबी, बीबी, एसी, बीसी) सेल झुरमुट(बी)और डबल्स(सी)के बहिष्कार के लिए क्रमशः एसएससी-ए और फॉरवर्ड स्कैटर चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू) बनाम एफएससी-ए के आधार पर सुदा हुआ भूखंड। (विज्ञापन और बीडी) आईएसएलएमएन:जीएफपी -पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए हल किए गए भूखंड। एक शुद्ध संस्कृति प्राप्त करने के लिए, जीएफपी गेट CN3s/CN4s(विज्ञापन)की तुलना में एसएमएनएस(बीडी)के लिए उच्च स्थापित किया जाना चाहिए । (एई और बी) FACS छंटाई द्वारा संग्रह के लिए gated कोशिकाओं का प्रतिशत। % माता-पिता पिछले गेटेड सेल आबादी में कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष वर्तमान गेटेड आबादी में कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि% कुल कुल कोशिकाओं के सापेक्ष गेटेड कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। कुल कोशिकाओं (लाल रंग में बॉक्स्ड) की तुलना में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का अपेक्षित प्रतिशत CN3/CN4 के लिए 0.5−1.5% और SMN के लिए 1.5−2.5% है। यदि विच्छेदन सफलतापूर्वक किया गया था, तो इन प्रतिशतों का उपयोग जीएफपी-पॉजिटिव गेट इन(विज्ञापन और बीडी)स्थापित करने के लिए एक बेंचमार्क के रूप में किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 2, 7, और 14 DIV में प्राथमिक CN3/CN4 और SMN मोनोकल्चर की चरण-विपरीत छवियां । प्राथमिक CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों के प्रतिनिधि अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवियों को 2, 7, और 14 DIV पर उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ इसी छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर और 40x उद्देश्यों का उपयोग कर पर कब्जा कर लिया गया । न्यूरोनल प्रक्रियाएं 14 DIV तक मोटी और लंबी हो गईं। न्यूरोनल सेल शरीर का आकार बढ़ा हुआ हो गया और विशेष रूप से एसएमएनएस के लिए दीर्घकालिक संस्कृतियों में एकत्रित हो गया। दोनों संस्कृतियों को कम से कम 14 DIV रखा जा सकता है। Scale bar = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अलग E11.5 माउस CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों के लक्षण वर्णन । (क)E11.5 माउस CN3s/CN4s (ऊपर) और एसएमएनएस (नीचे) के प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री छवियां 2 DIV के लिए सुसंस्कृत । न्यूरोनल मार्कर TUJ1 (ग्रीन) और मोटर न्यूरॉन मार्कर Islet1 (लाल) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग न्यूरॉन्स और नुक्लिसी का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया DAPI (नीले) के साथ प्रतिदागित किया गया । लगभग सभी सुसंस्कृत कोशिकाएं मोटर न्यूरॉन्स (TUJ1+, Islet1+)थीं। छवियों को इसी छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर और 20x उद्देश्यों का उपयोग करके एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ कैप्चर किया गया था। संतृप्त पिक्सल के बिना अधिकतम सिग्नल तीव्रता प्राप्त करने के लिए नमूनों को चित्रित और संसाधित किया गया था। निम्नलिखित आंकड़ों में सभी सूक्ष्म कार्य और छवि प्रसंस्करण इन स्थितियों में तब तक किए गए थे जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न किया जाए। स्केल बार = 100 माइक्रोन.(बी)2 DIV में E11.5 माउस CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों की शुद्धता। CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों की शुद्धता क्रमशः 93.5 ± 2.2% और 86.7 ± 4.7% थी। मृत न्यूरोनल सेल निकायों पायनॉटिक परमाणु आकृति विज्ञान और झिल्ली सूजन के लिए स्क्रीनिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया । जब बीडिंग और सूजन के लक्षण देखे गए तो न्यूरोनल प्रक्रियाओं को अपक्षयी प्रक्रियाओं के रूप में वर्गीकृत किया गया था। न तो कोशिका शरीर की मृत्यु और न ही अपक्षय प्रक्रियाओं वाली कोशिकाओं को व्यवहार्य गैर - मोटर न्यूरॉन्स (TUJ1+, आइलेट1-)या व्यवहार्य मोटर न्यूरॉन्स (TUJ1+, आइलेट1+)33माना जाता था । मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों की शुद्धता की गणना व्यवहार्य मोटर न्यूरॉन्स की संख्या के रूप में की गई थी जो व्यवहार्य गैर-मोटर न्यूरॉन्स प्लस व्यवहार्य मोटर न्यूरॉन्स की कुल संख्या से विभाजित थी। मान तीन अलग-अलग प्रयोगों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। छात्र की टी परीक्षा से महत्वपूर्ण नहीं (पी एंड जीटी;0.05) । सेल गिनती मैन्युअल रूप से 20x आवर्धन के तहत किया गया था । संक्षिप्त रूप: एसईएम = मतलब की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्राथमिक CN3/CN4 के प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और 2, 7, और 14 DIV में SMN मोनोकल्चर । प्राथमिक CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों TUJ1 (हरे) के साथ प्रतिरक्षण लेबलिंग द्वारा 2, 7, 14 DIV में विश्लेषण किया गया, और नाभिक DAPI (नीले) के साथ प्रतिदागित थे । न्यूरोनल प्रक्रियाएं 14 DIV तक मोटी और लंबी हो जाती हैं। न्यूरोनल सेल शरीर के आकार बढ़े हुए हो गए और विशेष रूप से एसएमएनएस के लिए दीर्घकालिक संस्कृतियों में एकत्रित हो गए। CN3/CN4 और SMN संस्कृतियों दोनों को कम से 14 DIV बनाए रखा जा सकता है । छवियों को 10x आवर्धन के तहत कैप्चर किया गया था । स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: E13.5 माउस CN3/CN4 और SMN अलग संस्कृतियों के लक्षण वर्णन । E13.5 CN3/CN4 और SMN अलग और इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सुसंस्कृत थे और TUJ1 (हरे) और Islet1 (लाल) के साथ प्रतिकार लेबलिंग द्वारा 2 DIV में विश्लेषण किया, और नाभिक DAPI (नीले) के साथ प्रतिदागित थे । कई गैर मोटर न्यूरोनल कोशिकाओं (TUJ1+,Islet1-) मौजूद थे (तीर) दोनों CN3/CN4 और SMN शुद्धता में भारी कमी के परिणामस्वरूप, कमी के साथ और अधिक SMN संस्कृतियों में स्पष्ट । छवियों को 20x आवर्धन के तहत कैप्चर किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: प्राथमिक मोटर न्यूरॉन संस्कृति के प्रतिनिधि आवेदन का प्रदर्शन है कि CN3s/CN4s चुनिंदा ईआर सीपीए द्वारा प्रेरित तनाव के लिए प्रतिरोधी हैं । (A)प्रायोगिक रूपरेखा: प्राथमिक CN3/CN4 और SMN मोनोकल्चर का इलाज सीपीए या वाहन नियंत्रण (डीएमएसओ) के साथ 2 DIV में किया गया और 3 दिनों के उपचार के बाद इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री विश्लेषण के माध्यम से सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया गया । इस रूपरेखा को प्रकाशित कार्य31से संशोधित किया गया है । (ख)2 DIV से 3 दिनों के लिए 5−30 माइक्रोएम सीपीए के साथ इलाज किया CN3s/CN4s और SMNs के अस्तित्व के अनुपात की मात्रा । न्यूरॉन्स का विश्लेषण TUJ1 के साथ कोशिकाओं की प्रतिकार लेबलिंग द्वारा किया गया, और नाभिक DAPI के साथ प्रतिदागित थे । जीवित रहने के अनुपात की गणना अकेले वाहन (डीएमएसओ) युक्त कुओं में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से विभाजित दवा-उपचारित कुओं में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 5बी किंवदंती देखें) के रूप में की गई थी। सेल गिनती मैन्युअल रूप से 20x आवर्धन के तहत किया गया था । मान चार अलग-अलग प्रयोगों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। * पी एंड एलटी; 0.05; पी एंड एलटी; 0.005 छात्र टी टेस्ट द्वारा। इस आंकड़े को पहले प्रकाशित कार्य31से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: 2 DIV में शुरू सीपीए की बढ़ती सांद्रता के लिए 3 दिन के जोखिम के बाद प्राथमिक CN3/CN4 और SMN मोनोकल्चर के प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री । न्यूरॉन्स का विश्लेषण TUJ1 (हरे) और नाभिक के साथ कोशिकाओं की प्रतिकार लेबलिंग द्वारा किया गया था DAPI (नीले) के साथ प्रतिदागित किया गया । प्राथमिक CN3s/CN4s प्राथमिक SMNs की तुलना में सीपीए उपचार के लिए अधिक प्रतिरोधी थे । छवियों को 10x आवर्धन के तहत पकड़ा गया था । स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मिडब्रेन की संख्या (एक्स) पापिन एल्बुमिन-ओवोमुकोइड हाइबरनेट ई
10 ♫ X ‧20 200 माइक्रोन 100 माइक्रोन 600 माइक्रोन
20 < X ‧30 300 माइक्रोन 150 माइक्रोन 700 माइक्रोन
30 < X ‧40 400 माइक्रोन 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन
रीढ़ की हड्डी की संख्या (वाई) पापिन एल्बुमिन-ओवोमुकोइड हाइबरनेट ई
3 ♫ वाई ‧5 200 माइक्रोन 100 माइक्रोन 500 माइक्रोन
5 < Y ‧10 400 माइक्रोन 200 माइक्रोन 800 माइक्रोन
10 < Y ‧15 600 माइक्रोन 300 माइक्रोन 1200 माइक्रोन

तालिका 1: पापिन, एल्बुमिन-ओवोमुकोइड और अंतिम निलंबन की उपयुक्त मात्रा, जो विसोशन चरणों में उपयोग की जाती हैं। वेंट्रल मिडब्रेन और वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की विभिन्न संख्याओं के साथ उपयोग किए जाने वाले पाकिन और एल्बुमिन-ओवोमुकोइड की उचित मात्रा को अनुकूलन के कई दौर ों के बाद निर्माता के निर्देशों से संशोधित किया गया था। क्योंकि ऊतकों को वियोजन और छंटाई के दौरान तनाव के अधीन हैं, 10 से अधिक वेंट्रल मिडब्रेन का एक पूल्ड संग्रह और तीन से अधिक वेंट्रल रीढ़ की हड्डी की सिफारिश की जाती है। पापिन की मात्रा प्रभावी वियोजन और इस प्रक्रिया के तनाव के बीच संतुलन पर विचार करके निर्धारित की गई थी। एल्बुमिन-ओवोमुकोइड अवरोधक समाधान की मात्रा पाकिन के आधे हिस्से की है। हाइबरनेट ई अंतिम निलंबन की उचित मात्रा इस तरह निर्धारित की गई थी कि सेल घनत्व १०७ कोशिकाओं/mL से अधिक नहीं है, लेकिन कोशिकाओं को जरूरत से ज्यादा पतला नहीं हो जाते हैं ।

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Discussion

ऐतिहासिक रूप से, CN3 और/या CN4 मोटर न्यूरॉन्स के इन विट्रो अध्ययन ों ने विषम संस्कृतियों जैसे असंतुष्ट17,18,19,20,21,एक्सप्लांट17,22,23,24,25,26,और स्लाइस27,28 संस्कृतियों पर भरोसा किया है, क्योंकि इन कोशिकाओं से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है आकार के आधार पर आसपास की कोशिकाओं, और इन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट मार्कर की सूचना नहीं दी गई है । वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक E11.5 murine CN3s/CN4s के अलगाव और संस्कृति के लिए एक व्यापक तरीका है, और एक ही भ्रूण से SMNs और संस्कृतियों की उच्च शुद्धता की पुष्टि करते हैं । एक ही माउस भ्रूण से शुद्ध SMN और CN3/CN4 संस्कृतियों पैदा करके, प्रोटोकॉल CN3s के इन विट्रो व्यवहार की नियंत्रित तुलना सक्षम बनाता है/

इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न CN3s/CN4s और एसएमएनएस की शुद्ध संस्कृतियां इन मोटर न्यूरॉन्स की रूपात्मक, सेलुलर, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के तुलनात्मक अध्ययन की अनुमति देती हैं । सिद्धांत रूप में, क्योंकि अन्य कपाल मोटर न्यूरॉन आबादी की कल्पना की जा सकती है और इस आईएसएलएमएन से विच्छेदित किया जा सकता है: जीएफपी ट्रांसजेनिक माउस लाइन (एड्यूसेंस, मोटर ट्राइजेमिनल, फेशियल और हाइपोग्लॉसल सहित), इस प्रोटोकॉल को उनके अलगाव और संस्कृति के लिए भी विस्तारित किया जा सकता है, बशर्ते कि FACS GFP गेट्स उचित रूप से समायोजित किए जाएं। अंत में, इस प्रोटोकॉल से प्राप्त एफएसीएस-सॉर्ट किए गए मोटर न्यूरॉन्स को जीनोमिक (उदाहरण के लिए, अनुक्रमण, या ATAC-seq) और/या ट्रांसक्रिप्टोमिक (जैसे, आरएनए अनुक्रम31)का अध्ययन करने के लिए सामान्य विकास और न्यूरोडीजेनेरेटिव डिसऑर्डर में विशिष्ट मोटर न्यूरॉन उपप्रकारों की चयनात्मक संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए ट्रांसपोसे-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख के अधीन किया जा सकता है31

इस प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जो अलग संस्कृति प्रणाली में शुद्ध, स्वस्थ मोटर न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। विच्छेदन के दौरान, जीएफपी-नकारात्मक ऊतकों (उदाहरण के लिए, मेसेनचिम और डीआरजी) को मोटर न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचाए बिना अधिकतम हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि ये ऊतक चिपकने वाले होते हैं और एफएस सॉर्टिंग के दौरान एसएमएनएस को फ़िल्टर करने या कारण पैदा करने के दौरान फंसा सकते हैं। ऊतक विच्छेदन के दौरान, पापिन की न्यूनतम आवश्यक मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए, और कोशिकाओं को न्यूनतम लेकिन पर्याप्त त्रिचरन के साथ धीरे से इलाज किया जाना चाहिए। Papain इस प्रोटोकॉल में ऊतक वियोजन कदम के लिए इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि प्रारंभिक डेटा संकेत दिया है कि यह दोनों CN3/CN4 और SMN के लिए ट्राइप्सिन से कम विनाशकारी है । 2 DIV पर CN3s/CN4s और SMNs की चढ़ाया संख्या के आधार पर अस्तित्व अनुपात ३९.५% से बढ़कर ५२.७% और ५२.३% से ५८.४% हो गया, जब पैपिन का उपयोग ट्राइप्सिन (०.२५%, 4 मिन इन्क्यूबेशन) के बजाय किया गया था । यद्यपि ये संख्याएं पूर्ण अनुकूलन से पहले किए गए एक प्रयोग से प्राप्त होती हैं, अतिरिक्त रिपोर्टयह भी बताती है कि तंत्रिका तंत्र के ऊतकों12,34,35,36से सेल निष्कर्षण के लिए ट्राइप्सिन सबऑप्टिमस है। FACS के दौरान, फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण रंगों (प्रोपिडियम आयोडाइड और कैल्सिन ब्लू) और छोटे छंटाई नोजल (जैसे, 70 माइक्रोन) का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे मोटर न्यूरॉन अस्तित्व के लिए हानिकारक हैं। बड़े छंटाई नोजल (100 माइक्रोन या उससे बड़ा) का उपयोग अत्यधिक अनुशंसित है, क्योंकि 70 माइक्रोन नोजल का उपयोग किए जाने पर एसएमएन सेल मृत्यु में काफी वृद्धि होती है। एफएसीएस में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए उपयुक्त गेटिंग थ्रेसहोल्ड स्थापित करना शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों को फोर्सोलिन, आईबीएमएक्स और विकास कारकों (बीडीएनएफ, सीएनटीएफ और जीडीएनएफ) के साथ पूरक किया जाता है। फोर्सोलिन और आईबीएमएक्स को SMN अस्तित्व37,38को बढ़ावा देने के लिए योजक रूप से सूचित किया गया है । वर्तमान अध्ययनों के प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि forskolin और आईबीएमएक्स भी additively CN3/CN4 अस्तित्व में वृद्धि । 2 DIV पर CN3s/CN4s की चढ़ाया संख्या के आधार पर अस्तित्व अनुपात १७.५% से बढ़कर २६.९%, ३१.९%, और ३७.०% जब आईबीएमएक्स, forskolin, और आईबीएमएक्स + forskolin जोड़ा गया, क्रमशः (संख्या एक एकल प्रयोग पर आधारित है सेल संस्कृति की स्थिति के पूर्ण अनुकूलन से पहले प्रदर्शन किया) । सुसंस्कृत कोशिकाओं को अलग करने से बचने के लिए मूल मात्रा का आधा हिस्सा छोड़कर सभी मध्यम परिवर्तनों और संस्कारी कोशिकाओं के वॉश करना सबसे अच्छा है। अंत में, संस्कृतियों की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए कई विच्छेदन का उपयोग करके विच्छेदन समय को छोटा करके मोटर न्यूरॉन्स (उदाहरण के लिए, कई विच्छेदन का उपयोग करके) के विच्छेदन और चढ़ाना के बीच बिताए गए समय को कम करना भी आदर्श है।

इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय चार प्रमुख संभावित समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं । पहले FACS के बाद मोटर न्यूरॉन्स की कम उपज है। कम पैदावार के लिए संभावित कारणों में युवा भ्रूण का उपयोग करना शामिल है (उदाहरण के लिए, E10.5), जिसमें कम मोटर न्यूरॉन्स होते हैं, विच्छेदन (जैसे, मेसेनचिम और डीआरजी) के दौरान चिपकने वाले जीएफपी-नकारात्मक ऊतकों को अपर्याप्त रूप से हटाना, जो मोटर न्यूरॉन्स को ट्रैप कर सकता है और निस्पंदन के दौरान उनके निष्कासन का कारण बन सकता है, विच्छेदन के दौरान अपर्याप्त पापीकरण/त्रियुग्म, और/या एफएससीएस के दौरान जीएफपी-पॉजिटिव गेट को बहुत अधिक स्थापित कर सकता है। दूसरी संभावित समस्या मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों की कम शुद्धता है, जो सबसे अधिक संभावना पुराने भ्रूण के उपयोग से उठता है (जैसे, E12.5) और/या GFP-सकारात्मक फाटक की स्थापना से FACS के दौरान बहुत कम है । तीसरा, संस्कृति में संलग्न मोटर न्यूरॉन्स की एक कम संख्या अनुचित FACS छंटाई और/या अपर्याप्त पीडीएल/प्लेटों/कवरस्लिप के लैमिनिन कोटिंग के कारण देखा जा सकता है । चौथा, मोटर न्यूरॉन्स संस्कृति में कम व्यवहार्यता दिखा सकते हैं। कम व्यवहार्यता के संभावित कारणों में किसी न किसी और/या लंबे समय तक विच्छेदन, अत्यधिक पापीकरण/विच्छेदन के दौरान त्रिचरन, प्रोटोकॉल भर में कोशिकाओं की अनुचित हैंडलिंग (जैसे, कोशिकाओं की किसी न किसी पाइपिंग, बर्फ पर कोशिकाओं को रखने में विफलता, पूर्व ठंडा पीबीएस और एचबीएस) में विफलता), और/या गर्भवती चूहों के इच्छामृत्यु और कोशिकाओं के अंतिम चढ़ाना के बीच अत्यधिक समय शामिल हैं । अभिकर्मकों का उपयोग जो ताजा और/या अनुचित सांद्रता नहीं हैं, वे भी प्रायोगिक परिणामों को ख़राब कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल की तीन प्रमुख सीमाएं हैं । IslMN:GFP ट्रांसजेनिक चूहों और FACS छंटाई दोनों काफी महंगे हैं । हालांकि, वे इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वर्तमान में अधिक किफायती फैशन में अत्यधिक शुद्ध CN3s/CN4s पैदा करने में सक्षम कोई वैकल्पिक तरीका नहीं है । भ्रूण चूहों के लिए एक छोटी E10.5-E12.5 आयु खिड़की है, और यह पुष्टि करना मुश्किल है कि उचित रूप से वृद्ध भ्रूण मौजूद हैं, खासकर यदि अल्ट्रासाउंड मशीन उपलब्ध नहीं है। यदि केवल शुद्धएसएमएनएस की आवश्यकता होती है, तो उन्हें 10,11,12 और/या p75एनटीआर-एंटीबॉडी-आधारितसेल-छंटाई पैनिंग तकनीक13,14,15,16जैसे तरीकों का उपयोग करके E12.5-15.0 माउस भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, प्रोटीन आधारित परख है कि शुरू सामग्री की एक बड़ी राशि की आवश्यकता मोटर न्यूरॉन्स (विशेष रूप से CN3s/CN4s) की छोटी उपज के कारण इन संस्कृतियों से संभव नहीं हैं । स्टेम सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स31,39,जिसे असीम रूप से उत्पन्न किया जा सकता है, सिद्धांत रूप में इस उद्देश्य के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम SMN विच्छेदन तकनीकों में निर्देश के लिए ब्रिजित पेटमैन (बायोजेन, कैम्ब्रिज, एमए, यूएसए) का शुक्रिया अदा करते हैं; दाना फारबर कैंसर संस्थान फ्लो साइटोमेट्री सुविधा, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल की इम्यूनोलॉजी डिवीजन फ्लो साइटोमेट्री सुविधा, जोस्लिन डायबिटीज सेंटर फ्लो साइटोमेट्री कोर, ब्रिघम और महिला अस्पताल फ्लो साइटोमेट्री कोर, और बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल फ्लो साइटोमेट्री रिसर्च फैसिलिटी प्राइमरी मोटर न्यूरॉन्स के FACS अलगाव के लिए; ए ए Nugent, ए. पी. Tenney, एएस ली, ईएच गुयेन, M.F. गुलाब, अतिरिक्त Engle प्रयोगशाला के सदस्यों, और तकनीकी सहायता और विचारशील चर्चा के लिए परियोजना ALS कंसोर्टियम के सदस्यों । इस अध्ययन को प्रोजेक्ट एएलएस द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अलावा, आरएफ जापान हार्ट फाउंडेशन/बायर Yakuhin अनुसंधान अनुदान विदेशों में और NIH प्रशिक्षण अनुदान आनुवंशिकी T32 GM007748 द्वारा वित्त पोषित किया गया था; जेजे को बोस्टन चिल्ड्रन अस्पताल के माध्यम से और विकासात्मक न्यूरोलॉजी प्रशिक्षण कार्यक्रम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (5T32NS007473-19) द्वारा नेत्र रोगों के आणविक ठिकानों (5T32EY007145-16) में NIH/NEI प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था; M.C.W NEI (5K08EY027850) और बच्चों के अस्पताल नेत्र विज्ञान फाउंडेशन (संकाय डिस्कवरी पुरस्कार) द्वारा समर्थित था; और ईसीई एक हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट अन्वेषक है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience - This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon - Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
Rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon - Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss - Confocal image of the embryo was captured with these equipments

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References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J.… More

Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).

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