Summary
Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.
Abstract
Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.
Introduction
El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1,2, cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4s) son relativamente escasas1,3,4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, los análisis comparativos de cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN podrían proporcionar pistas importantes sobre los mecanismos subyacentes a la vulnerabilidad relativa. Desafortunadamente, una barrera importante a tales análisis ha sido la incapacidad para cultivar cultivos purificados de estas neuronas motoras.
Se han descrito muchos protocolos para la purificación de las SMN a partir de modelos animales. La mayoría de estos protocolos utilizan centrifugación de gradiente de densidad10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panoramización de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. La centrifugación de gradiente de densidad explota el mayor tamaño de las SMN en relación con otras células espinales, mientras que p75NTR es una proteína extracelular expresada exclusivamente por las SMN en la médula espinal. Casi 100% cultivos SMN puros han sido generados por uno o ambos de estos protocolos11,12,14. Sin embargo, estos protocolos no han tenido éxito en generar las culturas CN3/CN4 porque los CN3s/CN4 no expresan elNTRp75, y otros marcadores específicos CN3/CN4 no han sido identificados. También son más pequeños que los SMN y, por lo tanto, son más difíciles de aislar en función del tamaño. En cambio, los estudios in vitro de CN3s o CN4 se han basado endesvincular17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y la rebanada27,28 cultivos, que se componen de tipos de células heterogéneas, y no han existido protocolos para el aislamiento y cultura de los CN3 primarios o CN4.
Aquí, se describe un protocolo para la visualización, aislamiento, purificación y cultivo de CN3, CN4 y SMN del mismo día embrionario 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ratones transgénicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que se localiza en la membrana celular. Este protocolo permite la comparación de múltiples tipos de neuronas motoras con el fin de dilucidar los mecanismos patológicos en la enfermedad de las neuronas motoras.
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Protocol
Todos los experimentos que utilizaron animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston.
1. Configuración de apareamientos cronometrados antes de la disección
- Para generar ratones embrionarios prenatales para la cosecha de neuronas motoras, sopesar cada ratón hembra y establecer un apareamiento cronometrado entre ratones adultos IslMN:GFP transgénicos 11,5 días antes del día del aislamiento de la neurona. Con el fin de desarrollar este protocolo, se utilizaron 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP ratones, de 2 a 9 meses de edad, y se estableció el apareamiento cronometrado por la noche.
- Examine a los ratones hembraen en busca de tapones vaginales a la mañana siguiente. Considere la fecha en la que el enchufe se identifica como día embrionario (E) 0.5.
- Pesar ratones hembra y examinar los cachorros mediante ultrasonido (ver Tabla de Materiales)entre E8.5-11. Compruebe si hay signos de apareamiento exitoso.
- Confirme el apareamiento exitoso detectando el aumento de peso en ratones hembra (generalmente >1,5 g en E9.5 si hay más de 5 x 6 embriones).
- Confirmar visualmente embriones bajo ultrasonido. Los embriones son fácilmente detectables por ultrasonido después de E9.5. Los ultrasonidos se llevan a cabo sólo en las mujeres que han aumentado de peso porque están más a menudo embarazadas que las que no lo hacen.
NOTA: Los ratones hembras pueden aumentar de peso por razones distintas al embarazo, por lo que el aumento de peso por sí solo no es un indicador confiable del embarazo. La confirmación por ultrasonido evita el sacrificio innecesario de las hembras que no están embarazadas pero no es crucial si no están disponibles.
2. Condiciones de disección y preparación de instrumentos
- Realizar todo el recubrimiento (excepto la limpieza ácida de los labios de cubierta), la preparación de los medios, la disociación de tejidos (excepto la centrifugación y la incubación), y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad de los medios y las neuronas motoras embrionarias.
- Con una cuidadosa atención a la técnica estéril, lleve a cabo la disección de tejido fuera de una campana de flujo laminar con un riesgo mínimo de contaminación.
- Esterilice una placa de disección, un par de tijeras microdisseccionantes, un par de fórceps de apósito para el pulgar, dos pares de pinzas Dumont #5, un cuchillo microdisosecante y una cuchara perforada Moria al sumergir en 70% de etanol antes de su uso.
3. Recubrimiento PDL/Laminin de Platos/Coverslips
NOTA: Cultivo disociado de las neuronas motoras primarias en 96 pozos o 24 placas de pozo, dependiendo del número de células necesarias para la aplicación. Las células se pueden fotomente directamente en la placa de cultivo de tejido sin el uso de tapas si los pozos son ópticamente transparentes y los espesores son compatibles con la imagen.
- Para aplicaciones que requieren cubreobjetos, prepare los cubredes secados por ácido, esterilizados y secados al aire al menos 2 días antes del aislamiento de la neurona como se describió anteriormente30. Los lotes de coverslips se pueden preparar de esta manera con mucha antelación a los experimentos y se pueden almacenar hasta 6 meses sin afectar a la calidad experimental.
- Preparar una solución de trabajo de 20 g/ml de poli D-lisina (PDL) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) 2 días antes del aislamiento de la neurona.
- Aliquot PDL (1 mg/ml) por adelantado y almacenar a -20 oC como solución de stock.
- Cubra la superficie de cada cubreobjetos o el pozo de la placa de cultivo de tejido con suficiente solución de PDL (por ejemplo, 100 ol por poca en 96 placas de pozo o 500 ml por poca en 24 placas de pozo con o sin tapa). Incubar durante la noche a 37oC.
- Al día siguiente lavar 3veces con agua esterilizada.
- Sellar las placas con película de parafina y guardar las placas lavadas recubiertas de PDL a 4 oC durante un máximo de 1 mes si se secan completamente después del lavado final.
- Preparar una solución de trabajo con 10 l de laminina (1,1 x 1,2 mg/ml) en 1,2 ml de PBS.
- Poblaciones de laminina aliquot (1,1 x 1,2 mg/ml) con antelación y almacenar a -80 oC.
- Cubra la superficie de cada cubreobjetos o bien con suficiente solución laminina para recubrir uniformemente la superficie. Incubar durante al menos 2 h a 37 oC antes de su uso.
NOTA: Las placas y los labios recubiertos con PDL/lamininse se pueden almacenar hasta 1 semana a 37 oC, pero se prefiere laminina recién recubierta. Retire el laminin directamente antes de enchapar30. No se debe permitir que Laminin se seque. Si las placas deben almacenarse durante más de varias horas, deben envolverse en película de parafina.
4. Preparación de la disección, los medios de cultivo de la neurona motora y las soluciones de disociación
NOTA: Las concentraciones entre paréntesis indican las concentraciones finales de cada reactivo.
- Prepare el medio de disección.
- Descongelar el suero de caballo inactivado por calor durante la noche a 4oC, preparar 1 ml de alícuotas y conservara a -20oC. Descongelar alícuotas en RT directamente antes de su uso.
- Almacenar b27-suplemento (50x) en 1 mL alícuotas a -20 oC. Descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso. Evite los ciclos de congelación/descongelación.
- Conservar el suplemento de glutamina (100x) a 4oC o -20oC. Dividir en alícuotas de 0,5 ml si se almacena a -20 oC.
- Conservar penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml) en alícuotas de 1 ml a -20 oC. Descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso.
- Para hacer el medio de disección, Mezclar 9,4 ml de Hibernate E con 200 l de suero de caballo (2%), 200 l de suplemento de 50x B27 (1x), 100 ml de suplemento de glutamina de 100x (1x) (p. ej., GlutaMAX) y 100 ml de 10.000 U/ml de penicilina-estreptomicina (100 U/ml). Utilice este medio para recoger tejidos diseccionados y hacer la suspensión final de las células disociadas.
- Añadir 500 l del medio de disección a tubos de microcentrífuga individuales de 1,7 ml para la recolección de tejido el día antes del aislamiento de la neurona. Preparar un tubo para cada tipo de tejido que se recogerá (por ejemplo, control positivo, control negativo, CN3/CN4, SMN) y almacenar a 4 oC antes del uso.
- Combine 49 ml de medios de baja fluorescencia Hibernate E con 1 ml de suplemento B27 (1x) y llene una placa de 24 pocillos con este medio (2 ml/bien) el día antes del aislamiento de la neurona. Utilice este plato para recoger embriones de ratón. Conservar a 4oC antes de su uso.
- Preparar el medio de cultivo de neuronas motoras.
- Preparar alícuotas de 25 mM 2-mercaptoetanol en el medio L15 de Leibovitz. Conservar a -20oC.
- Generar alícuotas de 5 l de 100 g/ml de bdNF, CNTF y GDNF diluidos en agua esterilizada. Conservar a -80 oC y descongelar alícuotas a RT inmediatamente antes de su uso.
- Preparar 10 mM de solución de forskoline mediante la adición de 64 l de dimetil sulfóxido (DMSO) a 5 mg (1.0670 M) de forskoline y vórtice bien para disolver completamente. A continuación, agregue agua esterilizada (1.003 ml) a la solución DMSO y al pozo de vórtice. Almacene alícuotas de 12 ml de forskoline de 10 mM a -20 oC y descongelar alícuotas en RT inmediatamente antes de su uso.
- Preparar alícuotas de 12 ml de isobutylmethylxantina (IBMX) diluidas en DMSO. Conservar a -20 oC y descongelar alícuotas a RT inmediatamente antes de su uso.
- Para hacer medio de cultivo de la neurona motora, mezcle 9,4 ml de medio neurobasal con 200 ml de suero de caballo (2%), 200 ml de suplemento de 50x B27 (1x), 100 ml de suplemento de glutamina de 100x (1x), 100 l de 10.000 U/m: penicilina-estreptomicina (100 U/ml) y 20 ml de 25 mM de 2-mercaptoetanol (50 m), preferiblemente directamente antes de su uso. Este paso se puede realizar hasta 1 día antes del aislamiento de la neurona.
- Justo antes del uso, añada 1 l cada uno de 100 g/ml bdNF (10 ng/ml), CNTF (10 ng/ml) y GDNF (10 ng/mL) y 10 l de forskoline de 10 mM (10 m) y 10 ml de 100 mM IBMX (100 mL) al medio de cultivo de neuronas motoras. Precalentar el medio a 37 oC.
- Preparar las soluciones de disociación.
- Preparar la solución de papaína (20 U/ml de papaína y 0,005% DNase) y una solución inhibidora de la albúmina-ovomucoide (inhibidor de ovomucoide de 1 mg/ml, albúmina de 1mg/ml y 0,005% DNase) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Preparar alícuotas de 500 ol de cada una de las soluciones de inhibidor de ovomucoide y papaína y almacenar a -80 oC. Descongelar alícuotas a 37 oC inmediatamente antes de su uso.
5. Disección ventral del cerebro medio y de la médula espinal
NOTA: Realice todos los pasos siguientes, excepto los pasos 5.1.1-5.1.3 y 5.1.5-5.1.6 bajo un estereomicroscopio de disección de fluorescencia. El tiempo total de disección por experimento suele ser de 3 a 5 h, dependiendo de la competencia en la técnica de disección y el número de neuronas motoras necesarias para cada experimento.
- Disección ventral del cerebro medio
- Eutanasia un ratón embarazada aproximadamente 11,5 días después de la fertilización por gas de dióxido de carbono y luxación cervical.
- Rocíe bien el abdomen con etanol y retire el útero con tijeras microdissezantes estériles y fórceps de apósito para el pulgar. Lave el útero brevemente en PBS estéril, luego transfiera a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado.
- Retire los embriones positivos islMN:GFPcuidadosamente del útero usando tijeras microdissección estériles, fórceps de apósito para el pulgar y pinzas Dumont #5 en PBS estéril helada bajo la luz brillante del microscopio. Usando una cuchara estéril Moria mini perforada, transfiera cada embrión a un pozo separado de una placa de 24 pozos llena de medio de fluorescencia baja Hibernate-E pretallado complementado con 1x B27. Mantenga el plato de 24 pozos en hielo.
- Transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbralo completamente con la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank estéril en frío.
- Asegúrese de que los pasos de disección se realizan bajo la iluminación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) del microscopio. Con pinzas, retire la cola y la cara del embrión sin dañar el cerebro medio(Figura 2Ba). Coloque el embrión propenso con las extremidades entretrás y la cola apuntando hacia la parte delantera del microscopio, hacia el dessector (indicado por un asterisco, Figura 2Bb).
- Usando pinzas, la hendidura abre el techo del cuarto ventrículo para generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del suelo y la columna del motor(Figura 2Ca,b). Abra el tejido diseccionado de una manera abierta para revelar los núcleos CN3 y CN4 positivos de GFP.
NOTA: Ahora se expondrá un pequeño trozo de tejido del cerebro medio ventral que contiene mesenquima, CN3 y CN4. - Separe cuidadosamente el cerebro medio ventral del embrión y retire el tejido meningeal usando pinzas y un cuchillo microdiselante. Diseccionar los núcleos bilaterales CN3 y CN4 positivos de GFP lejos de la placa del suelo y otros tejidos circundantes GFP negativos utilizando pinzas y un cuchillo microdisocete(Figura 2D). Maximizar el número de neuronas motoras gFP positivas en el tejido extirpado, pero evitar tocarlas o dañarlas.
- Si se desea una colección de núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo de la línea media de estos dos núcleos (línea de puntos amarilla en la Figura 2D). Con una pipeta P1000, recoja el tejido ventral diseccionador del cerebro medio con un HBSS mínimo y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml etiquetado lleno de medio de disección (ver paso 4.1.5). Conservar en hielo hasta la disociación.
- Continúe agrupando los cerebros medios ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con el requisito experimental (consulte el paso 8 para conocer los números celulares ideales).
NOTA: Se recomienda una colección agrupada de al menos 10 cerebros medios ventrales que produzcan aproximadamente 1 x 104 neuronas motoras CN3/CN4 porque los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación.
- Disección de la médula espinal ventral
- Mantenga el embrión propenso con la cabeza hacia la parte delantera del microscopio, hacia el dessector. Sostenga el embrión con un par de pinzas e inserte la punta de las otras pinzas en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo.
- Abra el resto del cerebro trasero y la médula espinal dorsalmente sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión. Abrir cortando el tejido dorsal, comenzando desde el cuarto ventrículo y trabajando hacia el canal central de la médula espinal caudal utilizando los fórceps como tijeras(Figura 2Ca,b). Tenga cuidado de no tocar o dañar la médula espinal ventral durante este procedimiento.
- Sostenga el embrión con un par de pinzas y pellizque la solapa del tejido dorsal a cada lado con el otro par de pinzas(Figura 2Ea,b).
NOTA: Los tejidos dorsales extirpados contienen piel dorsal, mesenquime, ganglios de raíz dorsal (DRG), cerebro dorsal posterior y médula espinal. Retire la mayor cantidad posible de estos tejidos sin dañar los núcleos SMN, ya que son adhesivos y pueden atrapar SMN durante el filtrado o causar obstrucciones durante la clasificación de FACS. - Retire la médula espinal ventral con el cuchillo de microdisección para perforar directamente debajo del SMN gFP positivo. Levante la médula espinal ventral con movimientos similares a la sierra en ambos lados(Figura 2Fa,b). Cortar la médula espinal ventral flotante transversalmente sobre C1, donde se proyecta el primer cuerno anterior GFP positivo(Figura 2G). Además, corte transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior(Figura 2G). Retire la porción cervical (C1)-lumbar (L2-L3) de la médula espinal ventral después de este procedimiento.
- Coloque el lado dorsal de la médula espinal ventral hacia arriba y sostenga presionando el tejido GFP negativo entre las columnas SMN positivas de GFP con un par de pinzas. Retire el mesenquima unido restante, los DRG y la médula espinal dorsal recortando ambos lados de la columna SMN gFP-positiva con el cuchillo de microdisección(Figura 2H). Tenga cuidado de maximizar las neuronas motoras gFP positivas sin dañarlas.
- Con una pipeta P1000, recoja el tejido de la médula espinal ventral diseccionado con un HBSS mínimo y colóquelo en el tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con etiqueta SMN lleno de medio de disección. Conservar en hielo hasta la disociación. Continúe agrupando las médulas espinales ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales.
NOTA: Se recomienda recoger al menos tres médulas ulares ventrales que produzcan aproximadamente 2,1 x 104 SMN porque los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación. - Recoger las neuronas motoras faciales y las extremidades de los embriones de ratón IslMN:GFP como controles GFP positivos y GFP-negativos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), respectivamente. Las extremidades son GFP negativas porque los axons positivos de GFP de las SMN aún no se han extendido a las extremidades a esta edad embrionaria.
6. Disociación de tejidos
NOTA: El tiempo total de disociación suele ser de 1,5 h por experimento.
- Alícuotas cálidas de la solución de papaína e inhibidor de albúmina-ovomucoide a 37 oC 30 min antes de la disociación.
- Espíe brevemente los tejidos microdiseccionados a baja velocidad.
- Con una pipeta P100, retire cuidadosamente la mayor hibernación E posible sin aspirar tejidos.
NOTA: Asegúrese de eliminar toda Hibernación E residual después de este paso para evitar reducir la eficacia de la disociación de papaína en el siguiente paso. - Añadir el volumen adecuado de solución de papaína(Tabla 1) a cada uno de los tubos de microcentrífuga de 1,7 ml que contienen las muestras de tejido microdiseccionado.
NOTA: El volumen adecuado de papaína para la disociación se determinó con el fin de maximizar la disociación efectiva mientras se minimiza el estrés en las células. - Triturar suavemente 8x con una pipeta P200. Realizar todos los pasos de trituración suavemente para preservar la viabilidad de la neurona motora.
- Incubar los tubos que contienen los tejidos durante 30 min a 37 oC, agitando con el dedo parpadeando 10 veces cada 10 min. Triturar suavemente cada suspensión 8veces con una pipeta P200 después de la incubación. Gire las células a 300 x g durante 5 min.
- Para garantizar la eficacia de la inhibición de los ovomucoides en el siguiente paso, utilice una pipeta P1000 para extraer y desechar tanto sobrenadante como sea posible sin aspirar los tejidos.
- Resuspenda los gránulos en el volumen adecuado de solución inhibidora de albúmina-ovomucoide(Tabla 1) triturando suavemente 8x con una pipeta P200.
- Espere 2 minutos para permitir que las piezas restantes de tejido no disociizado se asienten en la parte inferior del tubo.
- Recoger tanto sobrenadante como sea posible sin aspirar tejidos no disociados usando una pipeta P200. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 ml.
- Si algunos trozos de tejido permanecen sin disociarse después del paso 6.10, repita los pasos 6.8 a 6.10 para los tejidos no disociados que permanecen en los tubos de microcentrífuga originales de 1,7 ml para maximizar el rendimiento final de las células disociadas y minimizar la tensión en las células disociado previamente, contenido en el sobrenadante del paso 6.10.
- Gire las células a 300 x g durante 5 min. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta P1000.
- Resuspenda el pellet en el volumen adecuado de medio de disección(Tabla 1) pipeteando 8 veces utilizando una pipeta P1000. Se determinó el volumen adecuado de suspensión final para que la densidad celular no exceda de 107 células/ml, lo que puede bloquear el flujo de la máquina de citometría de flujo, pero también para que las células no se diluyan excesivamente, lo que resulta en una velocidad de clasificación lenta.
- Filtrar las suspensiones a través de coladores celulares de 70 m para eliminar cualquier grumos grandes o tejido no digerido. Transfiera las suspensiones en tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y guárdelas en hielo hasta que sea necesario.
7. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
NOTA: Este protocolo fue optimizado utilizando un clasificador FACS equipado con un láser violeta de 15 mw 405 nm, un láser azul de 100 mw 488 nm, un láser naranja de 75 mw 594 nm y un láser rojo de 40 mw 640 nm. Las células se clasificaron como líquido de vaina en PBS estéril en condiciones asépticas a través de una boquilla de 100 m. Con el fin de minimizar la tensión celular, el caudal se estableció en una presión de muestra de 1 a 3, de tal manera que se adquirió un máximo de 1.000 a 4.000 eventos por segundo. El tiempo total de FACS suele ser de 1 a 2 h por experimento.
- Configure voltajes para la dispersión hacia adelante y lateral para que la población celular se pueda visualizar correctamente. La configuración de voltajes adecuados para la clasificación de celdas es compleja y requiere un operador FACS experimentado.
- Para distinguir diferentes poblaciones de celdas, trace las celdas en función del tamaño determinado por el área de dispersión hacia delante (FSC-A) frente a la complejidad interna determinada por el área de dispersión lateral (SSC-A). Dibuje una puerta alrededor de las células vivas como se indica en la Figura 3Aa y la Figura Ba para excluir escombros y células muertas. Agrupe las celdas dentro de la región cerrada como población 1 (P1).
- Para excluir grumos de celda y dobletes, trace las celdas P1 a continuación en función de la anchura de dispersión lateral (SSC-W) frente a la SSC-A. Gate the population of single cells as population 2 (P2)(Figura 3Ab y Figura Bb).
- Trazar celdas P2 basadas en la Anchura de Dispersión Adelante (FSC-W) frente al FSC-A y gatear la población de células individuales como población 3 (P3)(Figura 3Ac y Figura Bc).
NOTA: El uso de dos puertas consecutivas en 7.3 y 7.4 excluye los grupos y dobletes celulares (fsc-W alto y alto FSC-A). - Células de la puerta P3 basadas en GFP versus alophycocyanin (APC). El canal APC detecta la autofluorescencia. La captura en este canal evita la captura de células autofluorescentes. Utilice celdas GFP negativas para ajustar el voltaje de los canales fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, las puertas de posición para estas poblaciones celulares alrededor de 102. Seleccione los umbrales de compuerta para la población positiva de GFP 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurona motora(Figura 3Anuncio y Figura Bd).
NOTA: Fije la puerta GFP mucho más alta para los SMN que para los CN3s/CN4s para obtener una cultura pura(Figura 3Ad y Figura Bd). Una puerta GFP inferior para los cultivos SMN conduce a la contaminación de los cultivos por la glia y las neuronas no motoras. Esto es probable porque hay expresión de GFP de bajo nivel en algunas neuronas glia y no motor debido a un promotor con fugas. El porcentaje de células gFP positivas en comparación con las células totales es típicamente 0.5-1.5% para CN3s/CN4s y 1.5-2.5% para las SMN. Si la disección fue exitosa, estos números se pueden utilizar como punto de referencia para determinar la posición apropiada para la puerta gFP positiva(Figura 3Ae y Figura Ser). - Realice FACS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Recoger las células P4 en tubos de microcentrífuga frescos de 1,7 ml llenos de 500 ml de medio de cultivo de neuronas motoras. Conservar en hielo hasta que esté enchapado.
NOTA: Aunque las celdas se pueden clasificar directamente en los pozos, esto resulta en un número desigual de celdas por pozo. Ordene las células en tubos de microcentrífuga de 1,75 ml y luego placa manualmente para lograr una distribución de chapado más uniforme.
8. Cultivo de neuronas motoras primarias purificadas
- Diluir suspensiones CN3/CN4 y SMN aisladas por FACS con medio de cultivo de neuronas motoras precalentado a 37 oC a densidades de 5 x 103 y 1 x 104 células/ml, respectivamente.
NOTA: Un embrión E11.5 produce aproximadamente 1 x 103 CN3/CN4 y 7 x 103 SMN. Sin embargo, estos rendimientos dependen en gran medida de la pureza de los tejidos diseccionados, la minuciosidad de la disociación celular y el umbral adecuado de las puertas GFP durante el FACS. - Transfiera 96 placas de pozos precubiertas con PDL y laminina desde la incubadora de cultivo de tejido de 37oC a la campana de flujo laminar y aspire la minin a cada pocal. Use platos y tapas inmediatamente sin lavarse.
- Añadir 200 s de suspensiones CN3/CN4 y SMN diluidas en cada pocal de 96 placas de pozores recubiertas de PDL/laminin. Las densidades de celda final deben ser 1 x 103 y 2 x 103 celdas/bien para CN3/CN4 y SMN, respectivamente.
NOTA: La densidad inicial de chapado de las SMN en 96 placas de pozos (2 x 103 células/pozo) es el doble que la de CN3s/CN4s (1 x 103 células/pozo) con el fin de obtener números y densidades de neuronas motoras finales similares a 2 y 9 días in vitro (DIV) (4 x 6 x 102 y 2 x 4 x 102 células por pozo, respectivamente). - Neuronas de cultivo en una incubadora de 37oC, 5%CO2.
- Alimentar las neuronas cada 5 días mediante la eliminación de la mitad de los medios antiguos (100 l) y la sustitución con el mismo volumen de medio de cultivo de neuronas motoras frescas. Asegúrese de que los procesos neuronales se vuelvan visibles en 1 DIV y se vuelvan más gruesos y más largos por 14 DIV(Figura 4). Los cuerpos celulares neuronales se agrandan y tienden a acumularse en cultivos a largo plazo, particularmente para las SMN(Figura 4).
NOTA: Realice todos los cambios medios y de solución dejando la mitad del volumen medio original para evitar separar las células cultivadas. Esto incluye pasos de fijación e inmunocitoquímica (ICC). Si se retiran todos los medios, independientemente de la suavidad con la que se desprensitúen, la mayoría de las células se separarán y se lavarán.
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Representative Results
El objetivo de este protocolo era purificar y cultivar altamente tanto los CN3/CN4 primarios como los SMN a largo plazo para permitir análisis comparativos de los mecanismos subyacentes a los trastornos de las neuronas motoras (ver Figura 1 y Figura 2 para una visión general).
Una vez que las neuronas se aislaron y cultivaron con éxito, se obtuvieron cultivos primarios casi puros de CN3/CN4 y SMN (Figura 5A,B)y se mantuvieron durante al menos 14 DIV(Figura 4 y Figura 6). Las purezas de los cultivos CN3/CN4 y SMN en 2 DIV fueron de 93,5 a 2,2% y 86,7 a 4,7%, respectivamente, cuando se evaluó por ICC utilizando el marcador de neurona motora Islet1 y el marcador neuronal TUJ1(Figura 5B). Sin embargo, estas altas purezas se basaron en gran medida en la edad de los embriones y en el establecimiento de umbrales adecuados para las puertas de la GFP durante el FACS(Figura 3). La disección de embriones en E10.5 es más difícil que la disección en E11.5 debido al aumento de la suavidad y adherencia de los tejidos, lo que resulta en una disminución del rendimiento de las neuronas motoras. Sin embargo, las purezas de los E10,5 CN3s/CN4 y SMN eran comparables a las de los embriones E11,5 (92,8% y 82,2% a 2 DIV, respectivamente; datos obtenidos de un solo experimento). Las purezas de los CN3/CN4 y los SMN disminuyeron drásticamente cuando se utilizaron embriones E13.5, incluso si sólo se recogió la población más alta de GFP positivo (20,7% y 7,4% a 2 DIV, respectivamente; datos obtenidos de un solo experimento), probablemente debido a la expresión de GFP en neuronas no motoras(Figura 7). Esta misma tendencia también se aplicaba a las culturas E12.5, aunque era mucho menos dramática. Por lo tanto, los embriones en E12.5 o más son inapropiados para su uso en la purificación de neuronas motoras utilizando este protocolo.
Cultivos de neuronas motoras puras son valiosos para entender patrones de crecimiento aislados, comportamientos, y vulnerabilidades de las neuronas motoras. Este ejemplo demuestra cómo estos cultivos se pueden utilizar para probar las respuestas de las neuronas motoras al tratamiento químico. Para determinar si los CN3/CN4 primarios y los SMN muestran respuestas diferenciales a los estresores de retículo endoplasmático (ER), se obtuvieron monadas primarias de CN3s/CN4s y SMN utilizando este protocolo y tratadas con diferentes concentraciones de un estresor ER, ácido ciclopiónico (CPA). Las neuronas fueron tratadas con CPA (5, 10, 15, 20, 25 o 30 m) o control de vehículos (DMSO) a 2 DIV y fijadas 3 días más tarde para que la CPI evaluara las relaciones de supervivencia(Figura 8A). Se contó el número de neuronas viables en cada muestra y se calcularon las relaciones de supervivencia como el número de células viables en pozos tratados con fármacos dividido por el número de células viables en los pozos tratados con DMSO. Los monocultivos CN3/CN4 fueron significativamente más resistentes al tratamiento con CPA (10-25 m) en comparación con los monocultivos SMN(Figura 9 y Figura 8B)31.
En conclusión, este protocolo permite la generación de cultivos embrionarios de ratón primario altamente purificados CN3/CN4 y SMN que proporcionan un sistema potente y confiable para la investigación del comportamiento neuronal.
Figura 1: Esquema para la preparación de neuronas motoras embrionarias de ratón. El esquema ilustra los pasos involucrados en el aislamiento y cultivo de las neuronas motoras embrionarias de ratón y el tiempo aproximado en horas o días para cada paso. El orden del procedimiento de disección para CN3/CN4 y para SMN se etiquetan secuencialmente del 1 al 4. Abreviaturas: CN3/CN4 - neurona oculomotora/neurona trochlear; SMN - neurona motora espinal; FACS - clasificación celular activada por fluorescencia; h - hora; d día. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección del cerebro medio ventral y la porción cervical (C1)-lumbar (L2-L3) de la médula espinal ventral. (A) Vistas laterales(a ) y dorsales (b) de las neuronas motoras positivas en GFP en una iluminación e11.5 IslMN:GFP transgenic mouse mouse under fluorescein isothiocyanate (FITC). Se preparó todo un embrión E11.5 de montaje como se describió anteriormente32 para hacer el embrión transparente. Posteriormente, el embrión fue analizado mediante etiquetado de inmunofluorescencia con tinción anti-GFP (verde). Las imágenes fueron capturadas bajo un microscopio confocal. Barras de escala de 200 m (vista lateral) y 400 m (vista dorsal). Abreviaturas: S - superior; Yo, inferior; V - ventral; D - dorsal. (B-H) Pasos de disección destacados en imágenes de tejidos de la médula espinal ventral y ventral E11.5 tomadas con una cámara equipada bajo luz brillante (Bb) o iluminación FITC utilizando un estereomicroscopio de disección de fluorescencia. Barras de escala a 200 m (D) y 1 mm (A-C, E-H). (B)(a ) Extirpación de la cara y la cola del embrión cortando a lo largo de las líneas rojas. (b) Embryo posicionado para la disección. La colocación de la parte frontal del microscopio se indica con un asterisco. (C) Corte a lo largo de la línea roja sólida para cortar abrir el techo del cuarto ventrículo(a ) vista lateral y (b) vista dorsal. Uso de esta abertura para cortar a lo largo de la superficie del embrión dorsal al cerebro (trayectoria indicada por flecha roja discontinua). Esto expone el tejido que contiene mesenquima, CN3 y CN4, que se puede sacar del cráneo. Para la disección SMN, la inserción de fórceps en la misma abertura entre el cuarto ventrículo y su techo, luego se corta hacia el lado caudal del embrión (trayectoria indicada por una flecha amarilla discontinua). (D) Vista final del cerebro medio ventral que contiene núcleos bilaterales DE GFP-positivos CN3 y CN4. Los bordes del tejido se resaltan con un rectángulo rojo. Corte a lo largo de la línea de puntos amarillo para recoger los núcleos CN3 y CN4 por separado, si se desea. (E) Después de abrir el resto del cerebro trasero y la médula espinal, los tejidos dorsales aleteados se pellizcan por encima de las líneas rojas en ambos lados con pinzas(a ) antes, y (b) después. (F) Eliminación bilateral del exceso de tejido ventral a la médula espinal a lo largo de la línea roja(a ) antes, y (b) después. (G) Corte de la médula espinal ventral en las dos ubicaciones indicadas por las líneas rojas. En el lado rostral, corte de la médula espinal ventral flotante transversalmente por encima de C1 donde se proyecta el primer cuerno anterior GFP positivo. Corte del extremo caudal de la médula espinal transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior. Una vez que se hacen estos cortes, la porción cervical (C1) a través de la lumbar (L2-L3) de la médula espinal ventral se puede diseccionar. (H) Vista final de la médula espinal ventral que contiene columnas SMN gFP positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Parcelas representativas de los cerebros medios ventrales (A) y de las médulas espinales ventrales (B). (Aa y Ba) Parcela ordenada del área de dispersión hacia delante (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A) antes de la exclusión de escombros y células muertas. (Ab, Bb, Ac, Bc) Parcelas ordenadas para la exclusión de grumos de celda (b) y dobletes (c) basados en Anchura (SSC-W) frente a SSC-A y Ancho de dispersión hacia delante (FSC-W) frente a FSC-A, respectivamente. (Anuncio y Bd) Parcelas ordenadas para aislar IslMN:GFP -neuronas motoras positivas. Para obtener una cultura pura, la puerta GFP debe fijarse más alto para los SMN (Bd) que para CN3s/CN4s (Ad). (Ae y Be) Porcentajes de celdas cerradas para su recolección por clasificación FACS. %Parent representa el porcentaje de celdas en la población cerrada actual en relación con el número de celdas de la población de celdas cerradas anterior, mientras que %Total representa el porcentaje de celdas cerradas en relación con el total de celdas. Los porcentajes esperados de células positivas de GFP en comparación con el total de celdas (en cajlas en rojo) son de 0,5 a 1,5% para CN3/CN4 y 1,5 a 2,5% para SMN. Si la disección se realizó correctamente, estos porcentajes se pueden utilizar como punto de referencia para configurar la puerta positiva de GFP en (Ad y Bd). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de contraste de fase de los monocultivos primarios CN3/CN4 y SMN en 2, 7 y 14 DIV. Las imágenes representativas de contraste de interferencia diferencial de los cultivos primarios CN3/CN4 y SMN se capturaron a 2, 7 y 14 DIV con microscopio de fluorescencia invertida utilizando el software de adquisición y procesamiento de imágenes correspondiente y objetivos 40x. Los procesos neuronales se hicieron más gruesos y más largos por 14 DIV. Los tamaños del cuerpo de las células neuronales se agrandaban y tendieron a acumularse en cultivos a largo plazo, especialmente para las SMN. Ambas culturas se pueden mantener al menos 14 DIV. Barra de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterizaciones de cultivos aislados de ratón E11.5 CN3/CN4 y SMN. (A) Imágenes de inmunocitoquímica representativas de E11.5 mouse CN3s/CN4s (arriba) y SMNs (abajo) cultivadas para 2 DIV. Etiquetado de inmunofluorescencia con el marcador neuronal TUJ1 (verde) y el marcador de neurona motora Islet1 (rojo) realizado para analizar neuronas y núcleos fueron contadores con DAPI (azul). Casi todas las células cultivadas eran neuronas motoras (TUJ1+, Islet1+). Las imágenes fueron capturadas con un microscopio de fluorescencia invertido utilizando el software de adquisición y procesamiento de imágenes correspondiente y objetivos 20x. Las muestras se tomaron imágenes y se procesaron para lograr la máxima intensidad de la señal sin píxeles saturados. Todo el trabajo microscópico y el procesamiento de imágenes en las siguientes figuras se realizaron en estas condiciones a menos que se especifique lo contrario. Barra de escala a 100 m. (B) Las purezas de los cultivos CN3/CN4 y SMN de ratón E11.5 en 2 DIV. Las purezas de los cultivos CN3/CN4 y SMN fueron de 93,5 a 2,2% y 86,7 a 4,7%, respectivamente. Los cuerpos celulares neuronales muertos fueron evaluados mediante cribado de morfología nuclear pignómica e hinchazón de la membrana. Los procesos neuronales se clasificaron como procesos degeneradores cuando se observaron signos de cuentas e hinchazón. Las células sin muerte corporal celular ni procesos dedegeneración se consideraron neuronas no motoras viables (TUJ1+, Islet1-) o neuronas motoras viables (TUJ1+, Islet1+)33. Las purezas de los cultivos de neuronas motoras se calcularon como el número de neuronas motoras viables divididas por el número total de neuronas no motoras viables más neuronas motoras viables. Los valores representan la media de SEM de tres experimentos separados. No es significativo (p > 0.05) para la prueba t del estudiante. El conteo celular se realizó manualmente bajo un aumento de 20x. Abreviaturas: SEM - error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inmunocitoquímica representativa de los monocultivos primarios CN3/CN4 y SMN a 2, 7 y 14 DIV. Los cultivos primarios CN3/CN4 y SMN se analizaron a 2, 7, 14 DIV mediante el etiquetado de inmunofluorescencia con TUJ1 (verde), y los núcleos fueron contramanchados con DAPI (azul). Los procesos neuronales se vuelven más gruesos y más largos por 14 DIV. Los tamaños del cuerpo de las células neuronales se agrandaban y tendieron a acumularse en cultivos a largo plazo, particularmente para las SMN. Los cultivos CN3/CN4 y SMN se pueden mantener al menos 14 DIV. Las imágenes fueron capturadas bajo aumento de 10x. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Caracterización de cultivos aislados de ratón E13.5 CN3/CN4 y SMN. E13.5 CN3/CN4 y SMN fueron aislados y cultivados utilizando este protocolo y analizados en 2 DIV mediante etiquetado de inmunofluorescencia con TUJ1 (verde) e Islet1 (rojo), y los núcleos fueron contrarestado con DAPI (azul). Muchas células neuronales no motoras (TUJ1+, Islet1-) estaban presentes (flechas) lo que resulta en una disminución drástica en la pureza CN3/CN4 y SMN, con la disminución más pronunciada en cultivos SMN. Las imágenes fueron capturadas bajo un aumento de 20x. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Aplicación representativa del cultivo de neuronas motoras primarias que demuestran que los CN3/CN4 son selectivamente resistentes al estrés ER inducido por el CPA. (A) Esquema experimental: los monocultivos primarios CN3/CN4 y SMN fueron tratados con CPA o control de vehículos (DMSO) a 2 DIV y las viabilidades celulares se evaluaron mediante análisis de inmunocitoquímica después de 3 días de tratamiento. Este esquema ha sido modificado a partir de la obra publicada31. (B) Cuantificación de las proporciones de supervivencia de CN3s/CN4s y SMN tratados con CPA de 5 a 30 M durante 3 días a partir de 2 DIV. Las neuronas se analizaron mediante etiquetado inmunofluorescente de células con TUJ1, y los núcleos fueron contadores con DAPI. Las proporciones de supervivencia se calcularon como el número de células viables (véase la leyenda de la Figura 5B) en pozos tratados con drogas dividido por el número de células viables en pozos que contienen solo vehículo (DMSO). El conteo celular se realizó manualmente bajo un aumento de 20x. Los valores representan la media de SEM de cuatro experimentos separados. *p < 0.05; p < 0.005 para la prueba t del estudiante. Esta cifra ha sido modificada a partir de la obra publicada anteriormente31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Inmunocitoquímica representativa de los monocultivos primarios CN3/CN4 y SMN después de una exposición de 3 días al aumento de las concentraciones de CPA a partir de 2 DIV. Las neuronas fueron analizadas mediante el etiquetado inmunofluorescente de células con TUJ1 (verde) y los núcleos fueron contrarrestados con DAPI (azul). Los CN3/CN4 primarios eran más resistentes al tratamiento de CPA que a las SMN primarias. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de cerebros medios (X) | Papaína | Albúmina-ovomucoide | Hibernate E | |||||||||
| 10x 20 | 200 l | 100 l | 600 l | |||||||||
| 20 < X 30 | 300 l | 150 l | 700 l | |||||||||
| 30 < X 40 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| Número de médulas espinales (Y) | Papaína | Albúmina-ovomucoide | Hibernate E | |||||||||
| 3 - Y 5 | 200 l | 100 l | 500 l | |||||||||
| 5 < Y 10 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| 10 < Y 15 | 600 l | 300 l | 1200 l | |||||||||
Tabla 1: Volúmenes apropiados de papaína, albúmina-ovomucoide y suspensión final utilizados en los pasos de disociación. Los volúmenes apropiados de papaína y albúmina-ovomucoide para ser utilizados con varios números de tejidos ventrales del cerebro medio y de la médula espinal ventral fueron modificados de las instrucciones del fabricante después de varias rondas de optimización. Debido a que los tejidos están sujetos a estrés durante la disociación y clasificación, se recomienda una colección agrupada de más de 10 cerebros medios ventrales y más de tres médulas espinales ventrales. El volumen de papaína se determinó considerando el equilibrio entre la disociación efectiva y el estrés de este procedimiento. El volumen de la solución inhibidora de albúmina-ovomucoide es la mitad que el de la papaína. El volumen apropiado de la suspensión final de Hibernate E se determinó de tal manera que la densidad celular no exceda de 107 células/ml, pero las células no se diluyen excesivamente.
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Discussion
Históricamente, los estudios in vitro de neuronas motoras CN3 y/o CN4 han recurrido a cultivos heterogéneos como disociados17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y rebanada27,28 cultivos, porque estas células no se pueden distinguir células circundantes en función del tamaño, y no se han notificado marcadores específicos para estas células. El presente protocolo es un método integral para el aislamiento y el cultivo de CN3s/CN4s primarios E11.5 murine, y SMNs de los mismos embriones y confirmar la alta pureza de los cultivos. Mediante la generación de cultivos SMN y CN3/CN4 puros a partir de los mismos embriones de ratón, el protocolo permite comparaciones controladas de los comportamientos in vitro de CN3s/CN4s frente a SMN aislados del tipo salvaje, así como de embriones mutantes.
Los cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN generados por este protocolo permiten estudios comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de estas neuronas motoras. En teoría, debido a que otras poblaciones de neuronas motoras craneales se pueden visualizar y diseccionar de esta línea de ratón transgénico IslMN:GFP (incluyendo abducens, trigémino motor, facial e hipoglossal), este protocolo podría ampliarse para su aislamiento y cultivo también, siempre que las puertas FACS GFP se ajusten adecuadamente. Por último, las neuronas motoras ordenadas por FACS derivadas de este protocolo pueden someterse a análisis genómicos (por ejemplo, Ensayo para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación, o ATAC-seq) y/o análisis transcriptómicos (por ejemplo, secuencia de ARN31) para estudiar el desarrollo normal y la vulnerabilidad selectiva de subtipos de neuronas motoras específicos en trastornos neurodegenerativos31.
Hay varios pasos en este protocolo que son críticos para maximizar el número de neuronas motoras puras y saludables en el sistema de cultivo aislado. Durante la disección, los tejidos GFP negativos (por ejemplo, mesenquima y DRG) deben eliminarse al máximo sin dañar las neuronas motoras, ya que estos tejidos son adhesivos y pueden atrapar las SMN durante el filtrado o causar obstrucciones durante la clasificación de FACS. Durante la disociación tisular, se debe utilizar el volumen mínimo esencial de papaína, y las células deben tratarse suavemente con una trituración mínima pero suficiente. La papaína se utilizó para el paso de disociación tisular en este protocolo, porque los datos preliminares indicaban que es menos destructivo que la trippsina tanto para CN3/CN4 como para SMN. Las proporciones de supervivencia basadas en números chapados de CN3s/CN4s y SMN a 2 DIV aumentaron del 39,5% al 52,7% y del 52,3% al 58,4%, respectivamente, cuando se utilizó la papaína en lugar de la papaína (0,25%, 4 min de incubación). Aunque estos números se derivan de un único experimento realizado antes de la optimización completa, informes adicionales también sugieren que la trippsina es subóptima para la extracción celular de los tejidos del sistema nervioso12,34,35,36. Durante el FACS, no se deben utilizar tintes vitales fluorescentes (yoduro propidium y azul calceína) y pequeñas boquillas de clasificación (por ejemplo, 70 m), ya que son perjudiciales para la supervivencia de las neuronas motoras. Se recomienda el uso de boquillas de clasificación grandes (100 m o más) porque la muerte de células SMN aumenta significativamente cuando se utiliza una boquilla de 70 m. Establecer los umbrales de gating apropiados para las células GFP-positivas en FACS es un paso crítico para obtener cultivos puros. Cultivos de neuronas motoras se complementan con forskoline, IBMX, y factores de crecimiento (BDNF, CNTF, y GDNF). La forskoline y IBMX se han divulgado para promover aditivamente la supervivencia SMN37,38. Los datos preliminares de los presentes estudios sugieren que la forskoline y IBMX también aumentan aditivamente la supervivencia CN3/CN4. Relación de supervivencia basada en números chapados de CN3s/CN4s en 2 DIV aumentó de 17.5% a 26.9%, 31.9%, y 37.0% cuando se agregaron IBMX, forskoline, e IBMX+forskoline, respectivamente (los números se basan en un solo experimento realizado antes de la optimización completa de las condiciones de cultivo celular). Lo mejor es realizar todos los cambios medios y lavados de células cultivadas dejando la mitad del volumen original para evitar separar las células cultivadas. Por último, también es ideal reducir el tiempo dedicado entre la disección y el revestimiento de las neuronas motoras (por ejemplo, acortando el tiempo de disección utilizando múltiples disosectores) para mejorar la viabilidad de los cultivos.
Hay cuatro problemas potenciales importantes que pueden surgir al seguir este protocolo. El primero es el bajo rendimiento de las neuronas motoras después de FACS. Las posibles causas de bajos rendimientos incluyen el uso de embriones jóvenes (por ejemplo, E10.5), que tienen menos neuronas motoras, eliminación insuficiente de tejidos adinad gFP negativos durante la disección (por ejemplo, mesenquima y DRG), que pueden atrapar las neuronas motoras y conducir a su eliminación durante la filtración, parinización/trituración insuficiente durante la disociación, y/o establecer la puerta de La GFP. El segundo problema potencial es la baja pureza de los cultivos de neuronas motoras, que muy probablemente surge del uso de embriones más antiguos (por ejemplo, E12.5) y/o de establecer la puerta positiva de GFP demasiado baja durante el FACS. En tercer lugar, se puede observar un número bajo de neuronas motoras conectadas en el cultivo debido a la clasificación INadecuada de FACS y/o al recubrimiento inadecuado de placas/revestimientos de placas/cubiertas de PDL/laminina. Cuarto, las neuronas motoras pueden mostrar baja viabilidad en el cultivo. Las posibles causas de baja viabilidad incluyen disección áspera y/o prolongada, papainización/trituración excesiva durante la disociación, manejo inapropiado de las células a lo largo del protocolo (por ejemplo, pipeteo áspero de células, falta de colocación de células en el hielo, falla en el preenfriamiento de PBS y HBSS), y/o tiempo excesivo entre la eutanasia de ratones embarazadas y la planación final de las células. El uso de reactivos que no son concentraciones frescas y/o inapropiadas también puede afectar los resultados experimentales.
Hay tres limitaciones principales de este protocolo. IslMN:Los ratones transgénicos GFP y la clasificación FACS son bastante caros. Sin embargo, son cruciales para este protocolo, ya que actualmente no existe un método alternativo capaz de generar CN3s/CN4 altamente purificados de una manera más económica. Hay una pequeña ventana de edad E10.5-E12.5 para los ratones embrionarios, y es difícil confirmar que los embriones de edad adecuada están presentes, especialmente si no hay una máquina de ultrasonido disponible. Si sólo se requieren SMN puros, pueden derivarse de embriones de ratón E12.5-15.0 utilizando métodos como la centrifugación de gradiente10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panorrea de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. Por último, los ensayos a base de proteínas que requieren una gran cantidad de material de partida no son factibles de estos cultivos debido al pequeño rendimiento de las neuronas motoras (especialmente CN3s/CN4s). Neuronas motoras derivadas de células madre31,39, que se puede generar sin límites, en teoría podría ser sustituido para este propósito.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.) la instrucción en técnicas de disección SMN; el Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, el Immunology Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core, y Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neuron; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, miembros adicionales del laboratorio engle y miembros del consorcio Project ALS para asistencia técnica y discusión reflexiva. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ELA. Además, R.F. fue financiado por la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad y NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. contó con el apoyo del programa de capacitación NIH/NEI en las Bases Moleculares de Enfermedades Oculares (5T32EY007145-16) a través del Instituto de Investigación Ocular schepens y el Programa de Capacitación en Neurología del Desarrollo (5T32NS007473-19) a través del Hospital Infantil de Boston; M.C.W contó con el apoyo de NEI (5K08EY027850) y Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); y E.C.E. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
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