Summary
情報コード化されたペプトイドオリゴマーの合成と、アミンとアルデヒドを動的な共有反応物の対とルイス酸性希土類として使用して、これらのペプトイドの分子ラダーへの配列指向の自己集合のためのプロトコルが提示される金属トリフラはマルチロール試薬として
Abstract
このプロトコルは、ルイス酸マルチロール試薬を使用して、相補的な核酸配列の自己集合体に一般的に使用される熱循環を模倣する方法で、対動的共有結合相互作用によって媒介される情報コード化オリゴマー鎖の自己集合中に観察される運動トラップを回避するための使用を提示する。アルデヒドとアミンペンダント部分を有する一次アミン単量体は、動的共有結合反応物対として使用するための直交保護基で機能化される。修飾された自動化ペプチド合成器を使用して、一次アミンモノマーは、固相サブモノマー合成を介してオリゴ(peptoid)鎖にコードされます。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による精製とエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)による特性解析では、配列特異的オリゴマーは、ルイス酸性希土類金属トリフィンドの高負荷を受け、アルデヒド部分を脱保護し、その二本鎖が完全に分離する反応体対平衡に影響を与えます。続いて、ルイス酸の一部を抽出し、相補的配列特異的鎖のアニーリングを可能にし、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI-MS)によって特徴づけられる情報コード分子ラダーを形成する。このレポートで概説されている簡単な手順は、動的共有アセンブリの分野で一般的に経験される運動トラップを回避し、堅牢で複雑なアーキテクチャの将来の設計のためのプラットフォームとして機能します。
Introduction
自己集合体の進歩は、小さなサブユニットが熱力学的に駆動された経路を通じてより大きな建築物を生成するプロセスであり、π積層および水素結合1、2、3、4などの分子間相互作用を利用することによって、一般的にマクロおよび超分子ナノ構造に対する制御を改善した。特に、核酸(すなわち、ポリヌクレオチド)は、ワトソン・クリック塩基の組み合わせによって提供される高い情報密度が、複雑で、配列選択構造4、5の組み立てを可能にするものとして、非常に汎用性の高いナノ構築媒体として出現している。これらの一過性分子間結合の本質的に低強度は、サブユニットの再配列とエラー補正を可能にする一方で、結果として生じる構造は、熱的および機械的分解6の影響を受けやすい場合が多い。対照的に、動的共有結合相互作用7,8,9は、穏やかな条件下で可逆的または再配置可能であり、最近、はしご10、11、12、13、ケージ14、15、16、スタック17のような複雑な高分子を生み出すために採用されている共有結合形成反応のクラスであり、提供する増加した結合強度と堅牢な構造。残念なことに、これらの共有種の比較的低い再配列率によって再配置およびエラーチェックの能力が低下し、自己組み立てのための能力を所望の製品18に抑制する。この運動トラップに対処するために、触媒または過酷な反応条件は、多くの場合、単純なビルディングブロックと組み合わせて利用されます。ここでは、オリゴマー残基配列にコードされた情報によってハイブリダイゼーションが向けられる配列特異的オリゴマーからの分子ラダーの自己集合を可能にする運動トラップを回避するプロセスを報告する。
合成の可能性を考えると、ポリ(N置換グリシン)s(すなわち、ペプトイド)は、分子ラダーが組み立てられるオリゴマー前駆体として19を採用する。ペプトイドは、ペンダント基がα-炭素20と結合されるのではなく、骨格系窒素に貼り付けられているペプチドの構造異性体である。固相合成を用いて、ペプトイド鎖に沿った動的共有ペンダント基の正確な配置が容易に達成され、複雑な超分子構造21に組み立てることができる前駆体オリゴマーの設計を可能にする。
イミン接続性の動的共有再配列は、この手順において、イミン生成縮合反応が、各結合が形成される各結合として質量分析によって自己集合体を特徴付ける便利な手段を提供し、18g/mol22の質量減少をもたらす。さらに、アミンとアルデヒド反応物とイミン生成物との平衡は、酸濃度を変化させることによって変化させることができる。具体的には、希土類金属トリフトは平衡に影響を与えるために使用され、さらにエチレンアセタール保護アルデヒド23、24、25を脱保護する。注目すべきは、スチャンジウム・トリフレートは、動的共有型自己集合体の分野で既に一般的に使用されており、その最近の成功を含め、室温26、27で共有共有有機フレームワーク(COF)の合成を支援する。また、オリゴ(ペプトイド)配列と希土類金属トリフレートの対照的な溶解性により、液状抽出による平衡制御が可能になります。報告されたプロセスは、情報指向の自己集合を防止する運動障壁を回避するためにこの制御を利用する。
Protocol
注意:このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質は、腐食性、可燃性または有毒であり、化学ヒュームフードの下でのみ使用する必要があります。使用前に、適切な個人用保護具を使用し、関連するすべての安全データシート(SDS)をご確認ください。
1. モノマー合成
注:一次アミンは、公開されたアプローチに従って合成されました。
- 4-(2-アミノエチル)-N-(アリルカルボニルオキシ)フェニルアミン(Npam)25,28の合成
- 10%酢酸(水溶液、v/v)の150 mLに4-(2-アミノエチル)アニリンの5.0 g(36.7ミリモル)を追加します。
注:弱酸の使用は、2つのグループ間のpK値の大きな差に起因する脂肪族アミンに影響を与えることなく、芳香族アミンの選択的保護を可能にします。 - 1,4-ジオキサンの150 mLで4.9 g(40.4 mmol;1.1等)のトリアルクロロモル酸の溶液を調製する。
- 500 mLの丸底フラスコに溶液を結合し、磁気攪拌バーを装備し、室温で反応混合物を一晩攪拌します。
- 反応を上げるには、500mLの脱イオン(DI)水で希釈し、ジエチルエーテル(Et2O,300 mL×3)で洗浄する。有機分画を捨てます。
- 水相をpH14に2M NaOH(水溶液)を加えて調整し、Et2O(150mL×3)で抽出した。
- 有機分画を合わせ、DI水(150mL×3)で洗浄します。
- Na2SO4の上に乾燥し、フィルターします。
- 減圧下で乾燥に蒸発する。
- 核磁気共鳴(NMR)分光法により、単離物Npamの同一性を確認する。期待される結果: 1H NMR (500 MHz, CdCl3 ) δ: 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H, Ar), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar), 6.65 (s, 1H, -NH-), 6.04 – 5.89 (m, 1H,-H=Chch) J = 17.1, 1.6 Hz, 1H, -CH=C HH),5.26 (dq, J = 10.5,1.4 Hz, 1H, -CH=CHH),4.66 (dt, J = 5.8, 1.5 Hz, 2H, -CH,H, H 2-NH2) 2.70 (t, J = 6.8 Hz, 2H, -CH2-Ar), 1.04 (s, 2H, -CH2-NH2).13C NMR(125 MHz、CD3OD) δ: 154.85, 137.00, 134.98, 133.51, 129.36, 119.41, 116.92, 65.62, 59.89, 43.47, 38.72.
注:プロダクトは薄黄色の固体であり、69%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
- 10%酢酸(水溶液、v/v)の150 mLに4-(2-アミノエチル)アニリンの5.0 g(36.7ミリモル)を追加します。
- 4-(1,3-ジオキサイクロペント-2-yl)ベンゾニトリル29,30の合成
- トルエン200mLに4-シアベンズアルデヒドの25g(0.19モル)を溶かします。
- エチレングリコールの42.2 mL(0.768ミリモル;4 equiv.)と0.02 g(0.1ミリモル;0.05モル%)を追加反応混合物にトルエン-p-スルホン酸の。
- ディーン・スタークトラップ(すなわち、共沸蒸留)を使用して120°Cで一晩撹拌し、還流し、反応中に発生した水を除去する。
- 反応が完了し、室温まで冷却した後、5%NaHCO 3(w/v)水溶液の40 mLを加えます。
- 有機層を抽出し、3回DI水で洗浄します。
- Na2SO4の上に乾燥し、フィルターします。
- 減圧下で乾燥に蒸発する。
- NMR分光法により、単離された生成物の同一性を確認する。1 HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.67 (d, J = 8.0, 2H, Ar), 7.59 (d, J = 8.4, 2H, Ar), 5.84 (s, 1H, CH), 4.12 - 4.03 (AABB, 4H, Ch2)13C NMR(100 MHz、CDCl3) δ: 143.20, 132.34, 127.30, 118.72, 113.02, 102.56, 65.57.
注:製品は白色の結晶性固体であり、86%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
- 4-(1,3-ジオキサイクロペント-2-yl)ベンジルアミン(Npal)29の合成
- 無水Et2Oの100 mLに4-(1,3-ジオキサイクロペント-2-yl)ベンゾニトリルの溶液を調製する。
- 0°Cの丸底フラスコにLiAlH4の4.3 g(0.11モル;2等剤)を慎重に加えます。よく混合された懸濁液を作成し、アルゴンで満たされた気球を使用して不活性な雰囲気の下でシステムを密封するためにかき混ぜます。計量に使用する装置に対して、エタノールで慎重に残留LiAlH4を入れられます。
注意: 水素化リチウムアルミニウム(LiAlH4)は、軽度のパイロフォアです。不活性ガスの下で処理し、湿気から保護します。 - 4-(1,3-ジオキサイクロペント-2-イル)ベンゾニトリル溶液を、0°Cの温度で反応混合物を維持しながら、追加の漏斗またはシリンジポンプを使用してゆっくりと加えます。
- 反応混合物を0°Cで4時間かき混ぜ、その後室温で12時間攪拌する。
- 反応が完了し、0°Cまで冷却した後、95%エタノール(30mL)をゆっくり加えた。さらに50%エタノールを水に添加してクエンチ(v/v、20mL)。バブラーを使用して、クエンチプロセスを監視できます。
注:適切な攪拌速度を維持するために、必要に応じて無水Et2Oを追加します。 - エーテル上清を分離し、減圧下で乾燥に蒸発させます。
- 0.45 μm シリンジフィルターを使用して、得られたオイルをフィルターします。
- NMR分光法により、単離された生成物の同一性を確認する。次の結果を期待してください: 1H NMR (400 MHz、 CDCl3) δ: 7.44 (d, J = 8, 2H, Ar), 7.32 (d, J = 8, 2H, Ar), 5.80 (s, 1H, CH), 4.14 - 4.0 (AA.BB) , 4H, (CH2O)2), 3.87 (s, 2H, -CH2-NH2).13C NMR(100 MHz、CDCl3) δ: 144.53, 136.53, 127.16, 126.77, 103.72, 65.39, 46.35.
注:製品は黄色の油であり、70%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
- 2-(2-エトキシ)エチルトシル酸29,31の合成
- 20 g (0.15 mol) ジエチレングリコール モノエチル エーテルとテトラヒドロフラン (THF) の 50 mL を磁気スターラーで 250 mL ラウンドボトム フラスコに追加します。
- 0°Cに冷却し、アルゴン充填バルーンを使用して不活性雰囲気下でシステムをシールします。
- 6 M 水性NaOH(2等分)の50 mLを加えます。
- THFの80 mLに54g(0.28モル;2等剤)の塩化トシルを溶解し、反応混合物に溶液を滴下します。0 °Cで1時間かき混ぜます。
- 反応混合物が室温に達し、さらに1時間かき混ぜるようにします。
- Et2O(400mL)で反応混合物を抽出します。
- 有機層を1M NaOHで洗浄し、次いでDI水で洗浄します。
- Na2SO4の上に乾燥し、フィルターします。
- 減圧下で乾燥に蒸発する。
- NMR分光法で単離物の同一性を確認する。1 HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.78 (d, J = 8.0, 2H, -S-C=CH-CH),7.33 (d, J = 8.5, 2H, -S-C=CH-CH),4.15 (t, J = 5.0, 2H, -CH2-CH2-O-Ts), 3.68 (t, J = 5.0, 2H, CH2 -CH2-O-Ts), 3.60-3.42 (m, 6H, O-CH2-CH2 -H 2 -O-CH2-OH, 3H), 2.43 (s, 3H, Ch3),C-CH3)、1.17(t、J = 7.0、3H、O-CH2-CH3)。 13C NMR(100 MHz、CDCl3) δ: 144.79, 132.95, 130.26, 129.80, 127.90, 126.95, 70.75, 69.68, 69.29, 68.61, 66.57, 21.56, 11.11.
注:製品は無色の液体であり、98%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
- 2-(2-エトキシオキシ)エチルアジド29,31の合成
- 2-(2-エトキシ)エチルトシルトシル酸250 mLのジメチルフォルマミド(DMF)を、磁気攪拌機で丸い底フラスコに40g(0.14モル)溶かします。アルゴンで満たされたバルーンを使用して、不活性雰囲気下でシステムをシールします。
- 反応混合物にNaN3の32g(0.49モル;3.5等)を加える。
注意: NaN3の重量を量るときは金属のへらを使用しないでください。NaN3は、高爆発性金属アジドの形成をもたらす鉛および銅と反応する可能性がある。飲み込んだり、皮膚に接触したりすると、急性毒性と致命的です。 - 反応混合物を60°Cに加熱し、36時間実行させます。その後、室温まで冷却します。
- 大量の水(500mL)で希釈し、Et2O(150mL×3)で抽出した。
- 有機層を分離し、水処理を行います。
- Na2SO4の上に乾燥し、フィルターします。
- 減圧下で乾燥に蒸発する。
- NMR分光法で単離物の同一性を確認する。次の結果を期待する: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.64 (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 3.58 (m, ) 2H, N3-CH2-CH2-O), 3.51 (q, J = 7.5, 2H, O-CH2-CH3),3.38 (t, J = 5.0, 2H, N3-CH2-CH2-O), 1.19 (t, J = 7.5, 3H, O-CH 2-CH3).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 70.70, 69.97, 69.80, 66.63, 50.60, 15.08.
注:製品は黄色の液体であり、85%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
- 2-(2-エトキシオキシ)エチルアミン(ニー)29,31の合成
- 2-(2-エトキシ)エチルアジドの20g(0.13モル)をTHFの160mLに20g(0.13モル)を500mLの丸底フラスコに磁気スターラーで溶かします。
- 40 g (0.15 モル, 1.1 等.) トリフェニルホスフィンを加え、アルゴンの下で室温で一晩かき混ぜます.
- 反応混合物を水(220mL)でクエンチし、別の日にかき混ぜるようにします。
- 得られた溶液をトルエンで洗浄し、続いてジクロロメタン(DCM)を洗浄する。
- 真空下で水層を蒸発させます。
- NMR分光法により、単離された製品の同一性を確認する。次の結果を期待してください: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.62-3.42 (m, 8H, NH2-CH2-CH2-O-CH2-O-CH2-CH 2 -CH3), 2.82 (m, 2H, NH2-CH2-CH2-O), 1.48 (s, 2H, NH2),1.16 (t, J = 7.5, 3H, O-CH2-CH3).13C NMR(100 MHz、CDCl3)δ: 73.14, 70.72, 69.64, 66.45, 41.35, 15.00.
注:製品は黄色の液体であり、58%の全体的な収率を有する。さらに精製せずに製品を使用してください。
2. オリゴの固相サブモノマー合成(ペプトイド)
注:固相合成(SPS)へのサブモノマーアプローチは、高い結合効率で配列特異的オリゴマーの製造を可能にする手法を採用しました。ペプチド合成装置を自動で作り上げるのは、オリゴ(ペプトイド)を速やかに生成する。設定は、異なるインスツルメンテーションの変更が必要な場合があります。
- 準備
- Fmoc-Photolabile SS樹脂(0.8ミリモル/gの典型的な負荷、0.1 mmolスケール、100-200メッシュ、1%DVB)の重量を0.125グラム、フリット自動シンセサイザー反応容器に追加します。シンセサイザーのマイクロ波部分に容器を挿入します。
- DMFと脱保護ボトルでメイン溶剤ボトルを20%4-メチルピリジン(v/v)で満たします。空の廃棄物。
- DMFにブロモ酢酸及びN'-ジイソプロピルカルボジミド(DIC)の1M溶液を、総体積1.5mL×(配列内の残基数)+5mLで調製する。余分な5 mLは空気が機械に入らないことを保障する。DMFに0.47mLの無水酢酸を加え、5mLのキャッピング液を作ります。
注意:DICは、深刻な眼の損傷、皮膚の刺激や感作、呼吸器刺激および感作を引き起こす可能性があります。 - 変位工程に使用されるN-メチル-2-ピロリドン(NMP)に、各一次アミン(Npam、Npal、ニー、Nma(2-メトキシアチラミン)の0.5 M溶液を調製する。一次アミン溶液の総体積は2.5mL×(適切な一次アミンの残基数)+2.5mLであるべきである。
- 自動シンセサイザーマニホールドにすべてのソリューションを追加します。
- 合成
注:自動化されたペプチドシンセサイザーを使用して実行します。- DMFの10 mLで5分間室温で樹脂を膨らまします。反応容器を排水します。
- Fmoc群を20%4-メチルピリジン溶液の3mLで75°Cで30s、90°Cで90sで切断します。容器を排水します。繰り返します。DMF(2 mL×2)で洗浄します。
- このゲルの容器に1.5mLのブロモ酢酸溶液と1.5mLのDIC溶液を加える。75°Cで4.5分間加熱し、ブロモアセチル化反応を行う。樹脂(DMF×3の5mL)を洗浄します。
- 反応容器に2.5mLの一次アミンモノマー溶液を添加して変位反応を行う。75°Cで4.5分間洗浄樹脂(5mLのDMF×3)を加熱します。
- 手順 2.2.3 を繰り返します。と 2.2.4.ステップ2.2.4で使用された一次アミンモノマーを順次置換する。オリゴ(ペプトイド)鎖を配列特異的に成長させる。
- 最終変位ステップの後、2.5 mLの無水酢酸溶液と2mLのDIC溶液を加えて配列をキャップする。50°Cで2分間加熱します(5mLのDMF×6)。
- 3ウェイストップコックを装備したフリットガラス反応容器に樹脂を移します。ガラス反応容器は、ビーズが壁に付着するのを防ぐために、あらかじめシリコン化しておく必要があります。ジクロロエタン(DCE)溶液中の5%ジクロロジメチルシラン(v/v)溶液で容器を充填し、30分間座らせて、容器を水切りし、DCEとメタノールで洗浄することによって壁をシラナイズします。使用前の乾燥ガラス容器。
- 樹脂をDCM(5mL×3)で洗い、片腕を通してN2で泡立ち、別のアームで真空を引っ張ります。
- 乾燥し、脱保護と切断まで、乾燥し、取り付けられたオリゴ(ペプトイド)
- アロックアミン脱保護と樹脂からの切断
- 樹脂が1日以上貯蔵されている場合、10分間5mLのDMFでバブリングして樹脂を蓄える。その後、容器を排水し、小さな磁気攪拌バーを追加します。
- ガラスペプチド容器に3mLの乾燥DCMを加えます。
- テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)とアロック族当たりのフェニルシランの25相当の重量を量る。クランプを使用して、溶剤に懸濁したまま樹脂が緩やかに攪拌するように、攪拌板の上の角度で反応容器を配置します。DCMが蒸発するのを防ぐために、反応容器をキャップします。
- 1時間後、溶液をろ過し、樹脂をDCM(3×5mL)で洗い流します。
- 手順 2.3.2 を繰り返します。と 2.3.3.
- メタノールとDCMを2回順に樹脂をリンスします。
- 樹脂と磁気攪拌バーを20 mLバイアルに移します。
- 樹脂をDMFに沈水させ、攪拌し、405nmで約25mW.cm-2で36時間照射下で切断する。樹脂の小さな部分は、アミンの完全なアロック脱保護を確保するために、このステップの前にESI-MSで切断し、特徴付けることができます。Alloc グループが残っている場合は、手順 2.3.2 と 2.3.3 を繰り返します。
- シリンジフィルターを介して樹脂から解放されたオリゴ(peptoid)を分離します。真空下で溶剤を除去します。
- オリゴ(ペプトイド)の精製と特徴付け
- 水/アセトニトリルの50/50混合物でペプトイドを再構成する。
- 逆相分前取りHPLC(C18)で精製する。精製された分画を組み合わせ、凍結し、凍結し、凍結してオフホワイト粉末を生成します。粉末は、さらなる使用のために保存することができる。
- 精製後のESI-MSで分析します。
- 反射光陽イオンモードでMALDI質量分析を行う。10 mgのマトリックスの混合物の混合物の6 μLとサンプル(1 mM)の溶液の2μLを混合 [2-(4-ヒドロキシフェニルラゾ)ベンゾ酸 (HABA)] アセトニトリルの 200 μL.MALDIサンプルプレートにスポットし、空気乾燥を可能にします。
- 純度については、精製オリゴ(ペプトイド)の分析的HPLCを行う。
3. シーケンス選択型ラダー自己アセンブリ
-
解離/抽出/アニーリングによる自己アセンブリ
- 自己組織化に使用される各オリゴ(peptoid)配列の10 mMストック溶液と、無水アセトニトリル中のスチャンジウムトリフレート(Sc(OTf)3)の10 mMストック溶液を調製します。
- 磁気攪拌バーを装備した3 mLバイアルに、各ペプトイドストック溶液の20 μLを加えます。ストック溶液から潜在的なイミン結合あたりSc(OTf)3の1.5 eqを追加します。水とアセトニトリルの合計 200 μL 2% (v/v) を形成するのに十分な水とアセトニトリルを追加します。
- 70°Cで2時間かき混ぜ、アルデヒドのアセタール脱保護とすべてのストランドの解離を行います。
- 200 μLのクロロホルムと2mLの水でバイアルを充電します。やさしく振ります。
- 混合物を立た(少なくとも15分)し、完全な相分離時に、マイクロリットルシリンジで有機層を抽出します。
- オリゴマーアニールのために70°Cで新しいバイアルをかき混ぜ、典型的には6時間、ラダーハイブリダイゼーションはまた、室温で、より長い期間にわたって行うことができます。
-
自己集合種の特性評価
- MALDI-TOF質量分析を、ステップ 3.1.3.、3.1.5.、および 3.1.6 の後の反応混合物溶液に対して行います。反応を監視します。ハイブリダイゼーションが不完全な場合は、ストック溶液から潜在的なイミン結合あたりSc(OTf)3の1.5 eqを追加し、ステップ3.1.3-3.1.6を繰り返します。完了するまで。
- サンプルを窒素の安定した流れの下で乾燥させ、1 mL で 2% 硝酸 (水溶液、v/v) で再構成します。4×106-フォールドをHPLC水で希釈する。誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)を用いて、抽出後のスキンジウム濃度を決定します。
Representative Results
情報化されたペプトイドが分子ラダーに配列選択的動的共有自己集合を受ける能力を実証するために、代表鎖であるH2N-N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nmaを合成し、その相補的なペプトイド配列とハイブリダイズした。モノマーNpamとNpal(1H NMR(500MHz)を特徴とする)を、最終的な自己集合製品の溶解性を助けるニーとの動的共有結合反応性対として採用した。 さらに、市販のNmaモノマーの組み込みは、2つの相補配列間の質量分化を可能にする。固相サブモノマー合成が完了すると、Pd(PPh3)4でアロック基を除去した。脱保護の前および後に、樹脂の部分を405nm光の下で切断し、ESI-MSによって特徴付けた(図2)。配列を、予備HPLCにより精製し、凍結乾燥してオフホワイト粉末を達成し、分析用HPLCで純度を確認した(図3)。オリゴ(peptoid)はその後、MALDI-MSによって確認されたレジストリ内のはしごを与えるために、その相補配列H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2 -Npalでハイブリダイズされ、MALDI-MSによって確認されたレジストリ内のラダーを与えました(図4)。
図1:モノマー合成スキームおよび1H-NMRスペクトル(A)試薬および条件を用いたモノマー合成スキーム:(i)アリルクロロホルム酸塩、10%酢酸水溶液、1,4-ジオキサン、室温、一晩;(ii)エチレングリコール、トルエン-p-スルホン酸、トルエン、還流、一晩;(iii) LiAlH4,無水Et2O, 0 °C 4時間の場合、室温 12時間;(iv)塩化トシル, THF, 0 °C;(v) NaN3, DMF, 60 °C, 36 h;(vi)トリフェニルホスフィン、THF、一晩。(B)モノマー 1H-NMR スペクトル (500 MHz, CDCl3): (i) 4-(2-アミノエチル)-N-(アリルカルボニルオキシ)フェニルアミン(Npam);(ii) 4-(1,3-ジオクサイクロペント-2-yl)ベンジルアミン(Npal);(iii) 2-(2-エトキシオキシ)エチルアミン(ニー)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:配列特異的オリゴ(peptoid)の合成と脱保護(A) H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nmaの構造をアロック保護群除去前後(B)ESI質量スペクトルと共に行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:情報コード化されたペプトイドの精製と特徴付け(A)アセトニトリル(MeCN)と水の線形勾配を有するHPLCを取り込んだ分離HPLCによる鎖のクロマトグラム:(1)30%MeCN、0.1〜2.1分;(2) 30-95% MeCN, 2.1-16.1 分;(3) 95% MeCN, 16.1-23.1 分;(4)95%MeCN、23.1-26.1 min.Peaks iおよびiiは、それぞれ所望の生成物を含む低分子量反応副生成物、主にDIC-尿素、およびオリゴマー種に対応する。(B)分析用HPLCクロマトグラム及び(C)凍結乾燥後のH2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-NmaのESIマススペクトル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:H2 N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nmaとその相補配列の自己集合体, H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal.(A) 2 つのシーケンスの構造と、結果として得られるシーケンス駆動アセンブリ。(B)MALDIの分子ラダーのマススペクトルは、室温で一晩で焼鈍後に行う。質量: 予想 [M+Na]+ = 3306.7, 3306.0 を発見しました;予想される [M-1 イミン+Na]+ = 3324.7, 3323.9 を発見しました;予想される [M-2 イミン+Na]+ = 3342.7, 3342.8 を発見しました;予想される[M-2イミン+CH3OH+H]+=3352.8、3352.0が見つかりました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本明細書では、情報がペンダント基の配列にコードされる情報を持つペプトイドオリゴマーの動的共有集合体を記述する。エチレンアセタール保護アルデヒドモノマーと組み合わせてアロック保護アミンモノマーを使用することで、直交脱保護が可能になり、自己集合反応中にビーズのアロック脱保護とアセタール脱保護を可能にし、オリゴマー精製および特性化の前に合成された配列が早期に反応しないことを保証する。重要なことに、固体相合成は、光陰性樹脂を用いて行われ、UVまたは紫色光照射下でビーズからのオリゴマー切断を可能にし、酸陰唇、エチレンアセタール系保護基の早期脱保護を排除する。いくつかの代替脱保護スキームが考慮される可能性があります。例えば、我々は最初に二重酸陰唇保護基(Bocアミンおよびエチレンアセタールアルデヒド)を採用し、その後、自己集合反応を進行させるために中和を続けて中和した後、その後に、その後に保護解除を意図した。しかし、このアプローチは、塩基の添加時に沈殿物の即時生成をもたらした。あるいは、光陰部保護基を用いたアミンの保護は、2-(2-ニトロフェニル)プロポキシカルボニル(NPPOC)と、精製前にトリフルオロ酢酸(TFA)で処理すると選択的に脱保護できるアルデヒドとして想定した。残念ながら、UV光を有する保護基のその場所での光分解では、感光剤の存在下および延長照射期間25の後でさえ、定量的脱保護を与えなかった。トリメチルシリアスキシカルボニル(すなわち、Teoc)はアミン保護基として使用することができ、希土類金属トリフラテでの治療時に切断の対象となる。しかし、定量的なTeoc脱保護は、エチレンアセタール脱保護に必要なよりもはるかに高い希土類金属トリフレート負荷を必要とします。このプロトコルでは、Teoc-アミンを使用することができますが、定量下アミン脱保護は、より大きな自己集合構造に問題がある可能性があるため、ルイス酸濃度を適宜調整する必要があります。脂肪族官能基は一時的に考慮されたが、脂肪族アルデヒド類の脱保護は、ペプトイド配列32、33を切り捨てる過酷な条件を必要とする。
ニーとNmaを不活性スペーサー残基として組み込むことで、オリゴマーの溶解性を改善し、前駆体オリゴマーのファシリティ質量タグ付けを可能にし、質量分光法による生成された種の同定を可能にする。さらに、隣接するバックボーンセグメントが反対の回転状態を採用して直線的なねじれのないオリゴマー34、35を形成するペプトイドの「Σ-ストランド」コンフォメーションを考えると、動的共有結合と不活性スペーサー残基を交互に組み込んだシーケンスは、再アクティブペンダント基が同じ方向に向いている構造を促進する。サブモノマー法の汎用性を考えると、ペプトイドオリゴマーをさらに修飾するために一次アミンの大規模かつ多様なライブラリを採用することができるが、高い結合効率を維持するためにプロトコルの調整を必要とするかもしれない。
オリゴ(peptoids)はガラス反応容器19で手動で合成することができるのに対し、プロセスの自動化は、各残基添加の時間を数時間から30分に短縮する。さらに、自動化は、市販されていない一次アミンモノマーを使用する場合に特に望ましいモノマーおよび洗浄溶媒廃棄物の量を減少させる。保護されたアミン残基からのアロック切断は効率的な反応であるが、パラジウム酸化は不完全な脱保護をもたらす可能性がある。その結果、樹脂の一部を切断し、ESI-MSで脱保護の程度を特徴付けることを試験することが示唆される。試験切断の場合、405nm照射下で30分で質量分析に十分なペプトイドを放出する。部分的な脱保護は、嫌気性条件の使用または脱保護反応を繰り返す場合に制限することができる。
本稿ではSc(OTf)3を多役割試薬として取り上げ、その他の希土類金属トリフラ(トリフレートイッテルビウムなど)が分子ラダーの情報指向の集合体をうまく媒介することが示されている。特に、Sc(OTf)3は希土類金属トリフラテの中で最もルイス酸です。したがって、他の希土類金属トリフラテ24、36によって与えられる触媒能力の低下のために、完全なエチレンアセタール脱保護および鎖解離に影響を及ぼすため、より大きな同等物が必要とされ得る。必要な同等物の数は、ストランドが完全に解化する点を観察することによってMALDI質量分析法で決定することができる。解離は自己集合過程において重要であり、上昇温度での核酸鎖の融解に類似している。触媒のその後の抽出は、シーケンス固有の二重鎖の組み立てを推進する動的共有結合対の形成と破壊を可能にする。オリゴマー鎖のこの段階的なアニーリングは、他の方法で経験する運動トラップ(分子はしごの場合は、レジストリ外の種または誤ったペア配列を生み出す可能性がある)を回避します。
クロロホルムは、ここで用いられるクロロホルム/アセトニトリル/水三項系における相分離として優れた溶媒であり、自己組織化構造37の沈殿を生じることなくルイス酸の部分的な抽出を促進する。さらに、クロロホルムは、分子ラダー溶解性を維持しながら、イミンの形成を促進する数少ない溶媒の1つです。レジストリ外の数と、正しくペアになっている二重のデュプレックスの微量は、システムの動的な性質のためにしばしば観察される可能性があります。このシステムは、抽出時の希土類金属トリフレート濃度の小さな変動にほとんど影響を受けませんが、場合によっては、不十分な触媒抽出は不完全なハイブリダイゼーションと非特異的オリゴマー結合のかなりの部分を生成します。この場合、一本鎖の完全解離がプロセスに不可欠であるため、最初にさらに1.5当量の触媒と再解離し、再抽出するのではなく、すぐに再抽出するよりも2回目に再解離することが一般的に好ましい。同時にいくつかのユニークな情報コード分子はしごを組み立てるためには、同等物と総反応量を維持するために使用される希土類金属トリフレートストック溶液の濃度を高める必要があるかもしれません。
これらの自己集合体は主に質量分析によって特徴付けられるが、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を含む他の技術は可能である。制限には、必要な材料の量、モノマーの手頃な価格、および信号対雑音比が含まれます。1HNMRのような溶媒を必要とする技術は、さらに自己集合構造の不溶性に苦しむことができる。さらに、抽出後の希土類金属トリフレート濃度は、ICP-MSまたは19F NMRなどの方法を内部標準で測定することができます。
マクロ分子および超分子ナノ構造および材料の制御の改善に向けた進展が進むにつれて、定期的に、しかし変更可能なアセンブリの設計と製作の課題が生じます。本報告に記載されているプロトコルは、動的共有結合相互作用を介して配列選択的な集合体を介してこのようなナノ構造を達成するための経路を提供する。
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、米国エネルギー省、科学部、エネルギー科学省、賞#DESC0012479の下で支援されました。S.C.L.は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムからの支援を認め、A.F.A.はアブダビ国営石油会社(ADNOC)からの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
| 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
| 4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
| 4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
| 4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
| 4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
| 50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
| Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
| All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
| Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
| Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
| Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
| Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
| Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
| Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
| Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
| Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
| Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
| LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
| LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
| LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
| Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
| Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
| Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
| Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
| Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
| N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
| Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
| Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
| Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
| Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
| p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
| Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
| Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
| Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
| Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
| Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
| Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
| Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
| Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
| Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |
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