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Cancer Research

使用二甲基苯甲酸酯和12-O-Tetradecanyl Phorbol-13-醋酸酯(DMBA-TPA)的化学诱导皮肤致癌模型

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60445
* These authors contributed equally

Summary

两阶段皮肤致癌是由两种局部应用的化学物质诱发的。诱变7,12-二甲基苯甲酸酯)导致表皮细胞突变,并持续应用一般生长刺激剂12-O-tetradecanoyl phorbol-13-醋酸酯加速皮肤皮球菌的形成。

Abstract

癌症是人类最具破坏性的疾病之一。实验性癌症模型对于深入了解不同细胞类型和基因在促进肿瘤进展方面的复杂相互作用以及为测试不同治疗方法的疗效提供平台非常重要。最常用的实验性炎症性癌症模型之一是DMBA-TPA两级皮肤致癌模型。在这个模型中,肿瘤的形成是由两种不同的化学物质的局部应用引起的,即7,12-二甲基苯甲酸酯(DMBA)和12-O-tetradecano-phorbol-13-醋酸酯(TPA),这两种化学物质共同导致皮肤中的皮屑瘤形成。由于主要结果是皮肤的皮屑瘤形成,该模型是解决肿瘤启动(无肿瘤生存)和肿瘤进展(可见肿瘤的数量和大小)的理想、可靠和可重复的方法。DMBA-TPA治疗的效果通过炎症机制传播,使得该模型特别适合研究免疫系统在肿瘤形成中的作用。但是,此模型仅限于可应用化学品的皮肤和其他表面。本文提供了一个详细的协议来成功使用模型。

Introduction

癌症是世界上导致死亡的主要原因之一。因此,需要开发可靠的实验性疾病模型,以更好地了解该疾病,并探索潜在的治疗方法。研究皮肤癌发展最常用的实验体内模型之一是化学诱导的两阶段皮肤致癌模型1,2。该模型提供了一个工具,研究肿瘤的启动,促进和进展,除了特定的事件,如免疫细胞渗透和血管生成。

使用两阶段皮肤致癌模型,小鼠的后皮用两种不同的化学物质处理,共同诱导肿瘤形成。该模型以低剂量的诱变剂DMBA启动,随后长期接触肿瘤启动器TPA3(图1)。DMBA通过形成表皮细胞和原发角质细胞4、5、6、7的共价附量随机突变DNA。其中一些随机突变发生在原肿瘤基因中,如Hras1(也检测到Kras和Nras的突变),原肿瘤基因转化为肿瘤基因在适当的刺激下驱动肿瘤形成。TPA,反过来,是最常用的肿瘤生长促进剂。其分子靶点为蛋白激酶C(PKC)8。TPA还激活Wnt/β-卡泰宁信号,这是模型9中肿瘤形成的关键。反复和长时间接触促进剂会导致增强的细胞信号,增加生长因子的产生,以及局部炎症反应,这明显是由于DNA合成增加和炎症细胞渗透在治疗的皮肤。

DMBA-TPA模型的关键炎症介质已经确定了10个。在DMBA-TPA模型11,12中,白细胞介素-17A(IL-17A)已知具有特别肿瘤性。它与白细胞介素6(IL-6)协同工作,并参与巨噬细胞和中性粒细胞的招募13,14。此外,CD4+T细胞和嗜中性粒细胞在DMBA-TPA模型中已被证明是肿瘤性的。最后,巨噬细胞也可以促进肿瘤的产生在模型15,16,17。

在促进阶段,突变细胞的细胞增殖增强,表皮持续增生保持1。这导致皮屑病在10-20周内发展,之后,辣椒开始转化为恶性肿瘤,鳞状细胞癌(SCC)2 。然而,不到10%的辣椒进展恶性,虽然这个百分比也取决于小鼠的遗传背景2,18。几十年来,人们不知道肿瘤中最初突变的细胞类型是什么,尽管一些研究已经报告恶性肿瘤与良性的辣椒瘤19、20相比有明显明显的特征。然而,最近的研究大大增加了我们对DMBA-TPA模型21中肿瘤形成克隆起源的认识22.23.证明骨髓衍生的上皮细胞和毛囊干细胞都对肿瘤形成22有贡献。阶段特定的血统追踪研究已经揭示,良性的辣椒瘤是单克隆起源,但他们招募新的上皮细胞群21,23。然而,只有一个细胞克隆作为致癌的驱动因素;它包含一个Hras突变23。癌症形成的进展与克隆扫描23相关。

致癌物质DMBA启动皮瘤形成,TPA促进肿瘤生长。因此,在TPA治疗期之前中断实验,可以分别研究肿瘤启动与促进。随着肿瘤进展的研究每周,它提供了一个绝佳的机会,详细的肿瘤生长分析在整个研究。由于肿瘤是由外部化学物质产生的,因此没有必要在生殖系中发生致癌突变。因此,研究遗传背景(例如,敲除/转基因与野生类型)对肿瘤发生的影响是直接的2。总之,DMBA/TPA皮肤癌模型是研究免疫系统在肿瘤进展中的作用以及评估肿瘤启动和升级步骤独立或相互依存的一种特别有用的方法。

Figure 1
图1:DMBA-TPA诱发皮肤致癌模型轮廓。致癌物质DMBA在模型的起始阶段被局部地应用来诱导DNA突变。促进生长剂TPA每周施用2次,以提高细胞增殖在促进阶段,导致皮肤的辣椒瘤的发展。根据小鼠的遗传背景,在小鼠反应到达高原后(通常在15-20周内)将动物牺牲。一小部分的辣椒可以在20-50周内进一步发展成SSC。为了研究启动和早期推广阶段的早期事件,可以收集样本(例如,在第二次 TPA 应用后不久)。显示一个代表性照片和血红素和欧辛染色的块状的小鼠皮肤在C57BL/6小鼠皮肤经过19周治疗后。比例尺 = 0.1 mm。请点击此处查看此图的较大版本。

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Protocol

芬兰国家动物伦理委员会批准了上述协议(协议号ESAVI/23659/2018)。

1. 实验动物、试剂和设备

  1. 使用年龄和性别匹配的小鼠。在7-9周的年龄开始研究,因为大多数小鼠的皮肤在2岁左右处于端粒(休息阶段)。
  2. 观察动物在研究期间的行为,如果它们打架,这通常发生在雄性身上,则分开饲养它们。打架可能导致皮肤的割伤,从而促进肿瘤的形成。雌性小鼠是首选,因为它们的侵略性较低。典型的实验组大小在8-20只动物之间,每组24,25,26,27。
    :基于早期研究中所看到的生物方差的功率计算有助于选择足够大的组大小。本文中用作示例的菌株包括 Balb/c 和 C57BL/6。然而,许多其他小鼠菌株,如SENCAR和FVB已经用于DMBA-TPA模型,以及威斯塔和斯普拉格-道利大鼠2,28,29。在开始研究之前,需要国家或地方动物工作委员会颁发许可证。除了一般福利考虑,模型特定的端点通常是鳞状细胞癌 (SCC) 和皮肤感染。在丙酮中应用肿瘤性化学物质后,皮肤因瘙痒而出现瘙痒,这是典型的,但除此之外,动物应该没有不适的迹象。定期称重(例如,每月2次)有助于评估动物的福利。
  3. 使用DMBA和TPA,均用丙酮稀释。DMBA 的工作浓度为 250 g/L。一种动物的剂量为50μg的DMBA在200μL丙酮。TPA的库存浓度为125克/升,治疗浓度为25克/升。一种动物的TPA剂量为5μg,在200μL丙酮中。
    注意:DMBA是有害的,如果吞咽,并可能导致癌症。丙酮迅速蒸发,是易燃的。它可能导致头晕和刺激眼睛。使用呼吸面罩和/或在真空流动下工作。处理任何这些化学品后更换手套。单独通风的笼子可以防止化学物质在小鼠的外壳中扩散。应用后,收集用于处理 DMBA 的移液器吸头,并作为危险废物处理。
    :DMBA必须保护免受光线照射。稀释的TPA储存在-20°C中,最好能防光。
  4. 购买以下设备:秤、毛皮的普通洗头、适当尺寸的移液器和吸头、普通尺子、数码相机、记事本、用于记录教皇的笔或电脑、吸入麻醉系统或鼠标约束器背面有一个开口,还有一个二氧化碳麻醉系统来牺牲老鼠。

2. 皮肤性帕氏瘤诱导与促进

  1. 护下后皮肤,给动物称重。以后,在需要时,在化学品接触时,不要进行皮肤扫描。
    注意:在割过辣椒粉时要小心,避免在皮肤上有任何割伤。每2周对每只动物进行称重,以发现任何潜在的体重减轻。
  2. 剃毛后,使用移液器48小时在剃须区局部涂抹50μg DMBA,以200μL的丙酮。如果需要,使用轻吸入麻醉剂或鼠标抑制剂约束动物。
  3. 7天后,给予第一个TPA剂量。在200μL丙酮中,用移液器每周2x,最好是星期一、周四或周二和周五,在200μL的丙酮中涂抹5μgTPA。
  4. 每周计数、记录和拍摄辣椒。直径大于 1 mm 的明显质量如果停留超过 1 周,则被视为心电皮瘤。在地图上标记每个单独的辣椒瘤,并每周列出其大小。存储数码照片。

3. 动物牺牲和样品收集

  1. 继续治疗,直到肿瘤反应达到高原。一般来说,根据所使用的小鼠菌株,在启动后10-20周内,心用小毛虫负担预计将增加。预计15-20周内将出现高原。一小部分的辣椒瘤(3岁以下)可在20-50周内发展成SSC2。
  2. 在最后一次TPA应用后24小时牺牲动物。使用二氧化碳麻醉与宫颈脱位或其他合适的方法。
  3. 根据研究问题,从动物身上收集适当的样品材料30,31。
    1. 例如,在牺牲前采集血液样本,并分离血浆。
    2. 切割皮肤,用于免疫组织化学(IHC)染色(例如,血氧素和欧辛、增殖或炎症细胞)。
    3. 使用活检打孔收集带有皮粉状瘤组织或非皮屑瘤(治疗)皮肤的皮肤片段,用于基因表达(例如,qPCR)和/或蛋白质分析(例如,西斑或ELISA)。
    4. 如果需要对免疫细胞群进行更详细的分析,则收集一块脾脏和皮肤流失淋巴结,用于流动细胞测定分析。您还可以分离表皮和皮肤层进行进一步分析。

4. 统计数据

  1. 绘制无宗皮瘤时间的卡普兰-迈尔生存曲线,并使用曼特尔-考克斯对数等级测试进行生存。绘制每周辣椒数量的线性曲线。由于这是计数数据,因此请使用非线性回归模型。如果需要,请咨询统计人员。

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Representative Results

主要结果是治疗或基因型组之间的存活时间(即无心瘤)。次要结果是每组每周的辣椒瘤数量(图2)。预期结果是在辣椒瘤自由时间和实验(两个或更多)组之间的皮粉瘤数量的统计显著性差异。建议在推广 (TPA) 阶段计算辣椒瘤的数量并绘制一条曲线,以便了解该阶段各组之间的差异。过早终止实验可能会隐藏统计显著性差异。

Figure 2
图2:DMBA-TPA诱导皮肤致癌模型的主要结果。小鼠皮肤上的辣椒粉的代表性图像和两个主要结果。数据来自四个单独的实验。注:对Balb/C和C57BL/6小鼠的实验分别进行。(A)皮小毛瘤自由时间的生存图。虚线 = 巴尔布/c 和实线 = C57BL/6。(B)每只小鼠的辣椒的平均数量。虚线 = 巴尔布/c 和实线 = C57BL/6。错误条 = SEM.(C)在 DMBA 治疗后 11 周内带辣椒的 Balb/c 小鼠。(D)在 DMBA 治疗后 11 周使用带辣椒的 C57BL/6 小鼠。请点击此处查看此图的较大版本。

可以进行机构学、mRNA以及细胞和蛋白质分析,以探索观察到的差异背后的机制。例如,组织学分析适用于研究皮球菌的结构、皮肤形态(表皮和皮肤厚度)、不同的生物过程(增殖、凋亡、血管生成)或免疫细胞的渗透32(图3)。皮肤是理想的可靠的定量形态和IHC参数由最先进的图像分析系统30,31,32,33。基因和蛋白质表达从(皮洛马)皮肤样品可以很容易地研究与标准方法30。流动细胞测定法是分析脾脏和皮肤流失淋巴结不同免疫细胞群的有用工具,如前文所述。分析方法的选择取决于研究问题,在开始实验之前需要考虑。

Figure 3
图3:DMBA-TPA模型中炎症细胞渗透的组织学分析。DMBA-TPA模型中PFA固定石蜡嵌入皮肤的代表性组织学横截面。皮肤部分被巨噬斑标记F4/80(棕色)染色。刻度条 = 200 μm. (A) 在正常、未经处理的皮肤中只看到少数 F4/80 阳性巨噬细胞。(B) 在癌症促进的早期阶段,在第二次TPA显菌后2周和36小时,真噬菌体渗透在真皮病中明显。此外,表皮增殖在2周时出现,如表皮增厚所示。(C) 19周前非帕氏菌皮肤仍表现出巨噬细胞的显著渗透。(D) 在DMBA-TPA处理动物的真皮下,在食巴瘤下发现巨噬细胞的强烈积累。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

DMBA-TPA诱发皮肤癌是最常用的癌症模型之一,因为它具有很高的可重现性,并提供有关肿瘤从开始到恶性肿瘤进展的信息。关键结果测量,心形瘤形成,是容易和可靠的定量。该模型同时处理肿瘤启动(无肿瘤生存)和进展(肿瘤数量和大小)。该模型适用于研究不同化合物,如潜在的治疗方法,以及单个基因对转基因动物肿瘤进展的影响。在将模型应用于任何给定的菌株时,建议研究现有文献,以了解菌株在模型中的反应(例如,找出第一个辣椒瘤出现的速度)。使用转基因小鼠时,建议使用野生类杂物。使用潜在的额外控制,如取代DMBA或TPA或两者兼而有之,是高度有争议的,因为众所周知,删除DMBA或TPA或颠倒其管理顺序极不可能导致诱导辣椒瘤增长34。当有必要研究肿瘤开始(即单独给DMBA施用)时,可以通过在DMBA剂量后牺牲动物来实现。在研究单个基因在转基因或敲除环境中的影响时,建议从未经处理的动物身上采集样本,以检测基因工程菌株30、31之间在肿瘤形成之前可能存在的可能存在的差异。

尽管 DMBA-TPA 模型在技术上相对简单,但准确计时对于成功至关重要。DMBA的应用和TPA的常规应用对肿瘤的发展都至关重要每周仔细检查辣椒病对于收集所有数据至关重要。需要注意的是,某些治疗或遗传背景可能导致辣椒瘤生长,后来收缩,甚至消失30。有时,其他非癌性病变和SCC出现。在这种情况下,建议对病变进行组织学检查。另一个关键步骤是确保TPA是唯一的肿瘤运动。皮肤创伤诱导细胞因子的产生,可能影响肿瘤促进2,34。因此,剃须期间皮肤的致病性伤害需要避免,而且攻击性的,战斗的小鼠必须分开安置。除了战斗,动物福利的其他方面也很重要。减肥,沉闷和纠结的毛皮,和冷漠的行为是不适的迹象。不适不仅是一个伦理问题,因为负能量平衡抑制肿瘤生长34。

DMBA-TPA 模型提供了许多修改的机会。由于一些菌株已知比其他菌株更敏感,仔细的选择可以安排实验和调整TPA应用18,35的数量和频率。该模型主要用于发展皮肤肿瘤,但局部应用于胃肠道是一个选项36。此外,该模型的修改版本已用于研究气管37的肿瘤发育。由于肿瘤的发展可以通过DMBA和TPA应用来调节,该模型能够研究改变饮食和昼夜节律38等环境因素后的结果。通过分离肿瘤启动 (DMBA) 和升级 (TPA), 该模型能够独立研究这两个过程。例如,在DMBA治疗后牺牲小鼠,允许研究治疗机制或肿瘤启动2,34中感兴趣的基因的效果。为了研究肿瘤的启动和提升的早期事件,动物可以在早期点被牺牲。例如,样品可以在第二次 TPA 给给后不久收集(例如 3 小时、12 小时、36 小时或 48 小时后)3031。还值得注意的是,传统的DMBA-TPA两阶段致癌模型可以通过使用不同的化学品或使用"第三"化学物加以修改。这些由Abel等人2审查。

DMBA-TPA模型已经用于不同的目的几十年34。它被用于研究不同疗法24、25、26和基因31、32、39、40的影响,同时也用于研究营养27、昼夜节律38和诊断工具41的开发。当肿瘤从皮肤形成时,该模型提供了一个独特的机会,收集肿瘤组织样本在进展21的不同阶段。在引入新的化学预防剂或免疫调节剂时,建议首先收集有关该菌株在DMBA-TPA模型中在先前研究中的反应的数据。如果没有,建议在没有潜在治疗剂的前期研究,以确定辣椒的时间和数量,以及这些参数的差异。来自已发表的研究的现有数据也可能有助于确定被测试化合物24,27的剂量,但如果不可用,使用被测化合物的连续稀释能够评估所研究的制剂25,26的剂量反应。

炎症对于人类肿瘤的产生至关重要,因为它涉及肿瘤进展的所有阶段:启动、促进和转化为恶性肿瘤42,43。化学诱导的皮肤致癌模型是一种炎症驱动的致癌模型。亲炎细胞因子反应和炎症细胞渗透到治疗的皮肤已经很明显,在模型的早期阶段。第一个渗透细胞是嗜中性粒细胞,其次是巨噬细胞、T细胞等的积累30,31。这些细胞在皮肤中产生炎症微环境,并启动炎症细胞和表皮细胞之间的交叉对话,导致细胞因子、化学因子和前列腺素的产生,从而推动肿瘤局部的启动和生长。由于DMBA-TPA模型是一个炎症驱动的模型,它不包括临床癌症的一些其他方面。虽然众所周知,SCC最终可能导致转移在DMBA-TPA模型,只有一小部分的辣椒发育成SCC2,23。因此,转移是DMBA-TPA模型中的一个罕见特征,尽管一些敏感的杂交种群,如CD-1或SENCAR,可能增加发生转移的可能性44。SCC 的出现通常被认为是一个动物福利问题,因此是一个终点标准。因此,尽管模型中存在转移,但其他一些模型,如移植或基因工程模型更适合研究转移45。该模型的另一个限制是,它需要一个表面来应用化学品。因此,研究特定内脏器官的癌症进展是模型范围之内的。

另一种常见的皮肤癌模型是紫外线辐射模型46。该模型与DMBA-TPA模型相当,因为这两种模型都不需要细胞移植或基因改造才能导致癌症。模型之间的根本区别是,紫外线辐射模型诱导积极的SSC形成,而DMBA-TPA模型中的肿瘤结果通常是良性的皮粉。如果紫外线辐射与化学致癌物的应用或具有遗传背景的小鼠菌株相结合,使该菌株易受癌症发展的影响,甚至黑色素瘤的形成也发生。紫外线辐射模型中最常见的突变使p53基因失去活性,p53基因是人类中一个关键的肿瘤抑制基因46,而DMBA-TPA模型中最常见的突变激活了Hras基因23。紫外线辐射也引起免疫抑制46,47,这可能是一个混淆因素,在研究免疫系统的各个方面。但是,这两种模型也同时工作。紫外线辐射可用作DMBA的促进剂,或作为TPA46的起始剂。

一个合理的问题是DMBA-TPA模型是否模仿人类癌症。一小部分的辣椒病发展到SCC。然而,人类SCC的恶性前阶段是行为性角质病,它不同于模型中看到的皮球瘤形成。尽管如此,在用韦穆拉芬尼治疗黑色素瘤的人类个体中,仍检测到与模型相似的皮粉虫形成。这表明,在DMBA-TPA模型中对致癌至关重要的Hras突变干细胞也存在于人类皮肤上34。此外,据报道,2-脱氧-2-18F+-氟-D-葡萄糖(18F-FDG)的吸肌瘤和微创SCC的摄入量高于周围皮肤,但不如完全侵入性的SCC,反映了前恶性阶段41的相似性。如果使用DMBA-TPA模型进行毒性评价,必须记住,重复暴露对肿瘤的促进有很大的影响34。至少一些分子机制是模型和人类皮肤共有的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由芬兰学院(赠款25013080481和25013142041(I.J.),286377和295814(M.P.),287907(T.J.),Pöivikki和Sakari Sohlberg基金会(M.P., T.J.),芬兰医学基金会,竞争国家研究坦佩雷大学医院专家责任区(拨款9V049和9X044(M.P.),9X0111和9V010(T.J.),Fimlab实验室专家责任区竞争性国家研究经费(授予X51409(I.J.),泰斯支持基金会(I.J.、M.P.、T.J.)、坦佩雷结核病基金会(I.J.、M.P.、T.J.)、芬兰文化基金会、保罗基金会、芬兰癌症协会(M.P.)和埃米尔·阿尔托宁基金会(T.P.)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill Starlab S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill Starlab S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Sigma D3254-100MG Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone Sigma 1000141011 Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g Piramal Critical Care Limited Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis Albert Kerlb GmbH GT421 For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter ZeoSys GmbH For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm Staples Business Advantage 60383 For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red VetTech Solutions Ltd AN045AR For sacrifice
Mekasoft Mekalasi 23008 Table cover
Mice (Balb/c JRj) Janvier labs Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj) Janvier labs Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera Panasonic
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Enzo BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G KERN & SOHN GmbH PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing VetTech Solutions Ltd AN044BX For sacrifice
RNAlater Qiagen 76104 For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul Sartorius LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul Sartorius LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Induction Box Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer Scintica instrumentation inc. For anesthesia

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癌症研究, 问题 154, 皮肤癌, 化学致癌物, 诱变, 运动, DMBA-TPA, 心电图, 血管生成, 炎症, 肿瘤, 增殖
使用二甲基苯甲酸酯和12-O-Tetradecanyl Phorbol-13-醋酸酯(DMBA-TPA)的化学诱导皮肤致癌模型
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