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Cancer Research

डाइमिथाइलबेंज [ए] एंथ्रेसीन और 12-ओ-टेट्रेडकैनोइल फोर्बोल-13-एसीटेट (DMBA-टीपीए) का उपयोग करके रासायनिक-प्रेरित त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60445
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,2, 1
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

दो चरण त्वचा कार्सिनोजेनेसिस दो सामयिक रूप से लागू रसायनों से प्रेरित होता है। एक म्यूटाजेन 7,12-डाइमेथिलबेंज [ए]एंथ्रेसीन) एपिडर्मल कोशिकाओं में उत्परिवर्तन का कारण बनता है और सामान्य विकास उत्तेजक 12-ओ-टेट्रेडकैनोइल फोर्बोल-13-एसीटेट के निरंतर अनुप्रयोग त्वचा पेपिलोमा गठन को तेज करता है।

Abstract

कैंसर सबसे विनाशकारी मानव रोगों में से एक है। प्रयोगात्मक कैंसर मॉडल ट्यूमर प्रगति को बढ़ावा देने में विभिन्न सेल प्रकार और जीन के जटिल परस्पर क्रिया में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए और विभिन्न चिकित्सीय दृष्टिकोण की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक भड़काऊ कैंसर मॉडल में से एक DMBA-TPA दो चरण त्वचा कैंसर कारक मॉडल है । ट्यूमर गठन दो अलग-अलग रसायनों, 7,12-डाइमिथाइलबेंज [ए]एंथ्रेसीन (DMBA) और 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (टीपीए) के सामयिक आवेदन द्वारा इस मॉडल में प्रेरित किया जाता है, जो एक साथ त्वचा में पेपिलोमा गठन का कारण बनता है। चूंकि प्राथमिक परिणाम त्वचा में पेपिलोमा गठन है, मॉडल ट्यूमर दीक्षा (ट्यूमर मुक्त अस्तित्व) और ट्यूमर प्रगति (दृश्यमान ट्यूमर की संख्या और आकार) दोनों को संबोधित करने का एक आदर्श, विश्वसनीय और प्रजनन योग्य तरीका है। DMBA-टीपीए उपचार के प्रभाव एक भड़काऊ तंत्र के माध्यम से प्रेषित होते हैं, जो इस मॉडल को ट्यूमर गठन में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है। हालांकि, यह मॉडल त्वचा और अन्य सतहों तक सीमित है जहां रसायनों को लागू किया जा सकता है। मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए इस लेख में एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।

Introduction

कैंसर दुनिया में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है। इसलिए, रोग की बेहतर समझ प्राप्त करने के साथ-साथ संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए विश्वसनीय प्रयोगात्मक रोग मॉडल विकसित करने की मांग की गई है। त्वचा कैंसर के विकास का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक में से एक रासायनिक रूप से प्रेरित दो-चरण त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल1,2है। मॉडल प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और एंजियोजेनेसिस जैसी विशिष्ट घटनाओं के अलावा ट्यूमर दीक्षा, पदोन्नति और प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है।

दो चरण त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल का उपयोग करने के लिए, चूहों की पीठ की त्वचा को दो अलग-अलग रसायनों के साथ इलाज किया जाता है जो एक साथ ट्यूमर गठन को प्रेरित करते हैं। मॉडल को म्यूटाजेन, DMBA की कम खुराक के साथ शुरू किया जाता है, जिसके बाद ट्यूमर प्रमोटर, टीपीए3 (चित्रा 1)के लिए लंबे समय तक एक्सपोजर होता है। डीएमबीए एपिडरमल कोशिकाओं और प्राथमिक केराटिनोसाइट स्टेम सेल4,5,6,7के डीएनए के साथ सहसंयोजक एडक्ट्स बनाकर डीएनए को बेतरतीब ढंग से म्यूट करता है । इनमें से कुछ यादृच्छिक उत्परिवर्तन एक प्रोटो-ऑन्कोजीन में होते हैं, जैसे कि Hras1 (Kras और Nras में उत्परिवर्तन भी पता लगाया जाता है) और प्रोटो-ऑन्कोजीन का ऑन्कोजीन में रूपांतरण उचित उत्तेजनाओं के तहत ट्यूमर गठन को चलाता है। टीपीए, बदले में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया ट्यूमर विकास को बढ़ावा देने एजेंट है । इसका आणविक लक्ष्य प्रोटीन किनाज सी (पीकेसी)8है । टीपीए भी Wnt/-catenin संकेत है कि मॉडल9में ट्यूमर गठन के लिए महत्वपूर्ण है सक्रिय करता है । को बढ़ावा देने वाले एजेंट के लिए दोहराया और लंबे समय तक जोखिम बढ़ाया सेल संकेत, विकास कारकों के उत्पादन में वृद्धि, और एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया है, जो डीएनए संश्लेषण और इलाज त्वचा में भड़काऊ सेल घुसपैठ के कारण स्पष्ट कर रहे है की ओर जाता है ।

DMBA-टीपीए मॉडल में प्रमुख भड़काऊ मध्यस्थों की पहचान10की गई है । इंटरल्यूकिन-17ए (आईएल-17ए) को DMBA-टीपीए मॉडल11,12में विशेष रूप से ट्यूमरीजेनिक माना जाता है। यह इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) के साथ तालमेल में काम करता है और मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल भर्ती13,14में भाग लेता है । इसके अलावा डीएमबीए-टीपीए मॉडल मेंसीडी4+ टी सेल और न्यूट्रोफिल को ट्यूमरीजेनिक दिखाया गया है। अंत में, मैक्रोफेज मॉडल15,16,17में ट्यूमरजेनेसिस को भी बढ़ावा दे सकता है।

पदोन्नति चरण के दौरान, उत्परिवर्तित कोशिकाओं के कोशिका प्रसार को बढ़ाया जाता है और एपिडर्मिस की निरंतर हाइपरप्लासिया1बनाए रखी जाती है। इससे त्वचा में 10-20 सप्ताह में पेपिलोमा विकास होता है, जिसके बाद पेपिलोमा घातक ट्यूमर, स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी)2में परिवर्तित होना शुरू हो जाता है। हालांकि, पेपिलोमा का 10% से भी कम द्रोह करने के लिए प्रगति करता है, हालांकि यह प्रतिशत चूहों2,18की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है। दशकों से यह ज्ञात नहीं था कि ट्यूमर में शुरू में किस प्रकार की कोशिकाओं को द्रोह की ओर ले जाया गया था, भले ही कुछ अध्ययनों ने सौम्य पेपिलोमास19,20की तुलना में घातक ट्यूमर में स्पष्ट रूप से अलग विशेषताओं की सूचना दी थी। हालांकि, हाल के अध्ययनों से DMBA-टीपीए मॉडल21में ट्यूमर गठन की क्लोनल उत्पत्ति पर हमारी समझ बहुत बढ़ गईहै। 22. 23. यह प्रदर्शन किया गया था कि दोनों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एपिथेलियल कोशिकाओं और बाल कूप स्टेम कोशिकाओं ट्यूमर गठन22में योगदान . स्टेज-विशिष्ट वंश ट्रेसिंग अध्ययनों का अनावरण किया गया है कि सौम्य पेपिलोमा मोनोक्लोनल मूल के हैं, लेकिन वे21,23नए एपिथेलियल सेल आबादी की भर्ती करते हैं। हालांकि, केवल एक सेल क्लोन कार्सिनोजेनेसिस के लिए एक ड्राइवर के रूप में कार्य करता है; यह एक Hras म्यूटेशन23शामिल हैं . कार्सिनोमा गठन की प्रगति क्लोनल स्वीप23से जुड़ी हुई है ।

कार्सिनोजन DMBA पेपिलोमा गठन शुरू करता है और टीपीए ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देता है। इसलिए, टीपीए उपचार अवधि से पहले प्रयोग में व्यवधान डालकर ट्यूमर दीक्षा का प्रचार से अलग से अध्ययन किया जा सकता है। के रूप में ट्यूमर प्रगति साप्ताहिक अध्ययन किया है यह अध्ययन के दौरान विस्तृत ट्यूमर विकास विश्लेषण के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है । क्योंकि ट्यूमर बाहरी रसायनों से उत्पन्न होते हैं, अंकुरित में एक ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन अनावश्यक है। इस प्रकार, ट्यूमरजीनिस पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि (जैसे, नॉकआउट/ट्रांसजीन बनाम जंगली प्रकार) के प्रभावों का अध्ययन करना सीधा2है । संक्षेप में, DMBA/टीपीए त्वचा कैंसर मॉडल ट्यूमर प्रगति में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के साथ ही ट्यूमर दीक्षा और संवर्धन कदम स्वतंत्र रूप से या परस्पर निर्भर के मूल्यांकन के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी दृष्टिकोण है ।

Figure 1
चित्रा 1: DMBA-टीपीए प्रेरित त्वचा कैंसरजन्य मॉडल रूपरेखा। कार्सिनोजन DMBA मॉडल के दीक्षा चरण में डीएनए म्यूटेशन को प्रेरित करने के लिए सामयिक रूप से लागू किया जाता है। विकास को बढ़ावा देने वाले एजेंट टीपीए को पदोन्नति चरण के दौरान सेल प्रसार को बढ़ाने के लिए एक सप्ताह में 2x प्रशासित किया जाता है, जिससे त्वचा में पेपिलोमा का विकास होता है। जानवरों की बलि के बाद papilloma प्रतिक्रिया एक पठार तक पहुंचता है, आमतौर पर सप्ताह के भीतर 15-20, चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है । पेपिलोमा का एक छोटा सा अनुपात 20-50 सप्ताह के भीतर एससीसी में और विकसित हो सकता है। दीक्षा और प्रारंभिक पदोन्नति चरण में प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, नमूने एकत्र किए जा सकते हैं (उदाहरण के लिए, दूसरे टीपीए आवेदन के तुरंत बाद)। उपचार के 19 सप्ताह के बाद C57BL/6 माउस त्वचा पर पेपिलोमास के एक प्रतिनिधि तस्वीर और हेमैटोक्सिलिन और eosin दाग पार अनुभाग दिखाया जाता है । स्केल बार = 0.1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को फिनलैंड की नेशनल एनिमल एथिक्स कमेटी (प्रोटोकॉल संख्या ESAVI/23659/2018) ने मंजूरी दे दी है।

1. प्रायोगिक पशु, अभिकर्मक, और उपकरण

  1. उम्र और सेक्स से मेल खाने वाले चूहों का इस्तेमाल करें। उम्र के 7-9 सप्ताह में अध्ययन शुरू करें, क्योंकि अधिकांश चूहों में त्वचा उस उम्र2के आसपास टेलोजेन (आराम चरण) में होती है।
  2. अध्ययन के दौरान जानवरों के व्यवहार का निरीक्षण करें और यदि वे लड़ते हैं, जो अक्सर पुरुषों के साथ होता है, तो उन्हें अलग से घर दें। झगड़े त्वचा में कटौती का कारण बन सकते हैं, जो ट्यूमर गठन को बढ़ावा देते हैं। महिला चूहों को उनके कम आक्रामक व्यवहार के कारण पसंद किया जाता है। विशिष्ट प्रायोगिक समूह का आकार प्रति समूह24,25,26,27में 8-20 जानवरों के बीच होता है ।
    नोट:पहले के अध्ययनों में देखे गए जैविक विचरण के आधार पर बिजली की गणना पर्याप्त रूप से बड़े समूह आकार का चयन करने में मदद करती है। इस लेख में उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किए जाने वाले उपभेदों में बाल्ब/सी और C57BL/6 शामिल हैं । हालांकि, सेंकार और एफवीबी जैसे कई अन्य माउस उपभेदों का उपयोग DMBA-टीपीए-मॉडल के साथ-साथ विस्टार और स्प्राग-डावले चूहों2,28,29के साथ किया गया है। अध्ययन शुरू करने से पहले पशु कार्य की राष्ट्रीय या स्थानीय समिति से लाइसेंस की आवश्यकता होती है । सामान्य कल्याण विचारों के अलावा, मॉडल-विशिष्ट एंडपॉइंट आमतौर पर स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) और त्वचा का संक्रमण होता है। एसीटोन में ट्यूमरिजेनिक रसायनों के आवेदन के बाद खुजली के कारण त्वचा में खरोंच विशिष्ट है लेकिन अन्यथा जानवरों को असुविधा के कोई संकेत नहीं दिखाना चाहिए। नियमित रूप से वजन (उदाहरण के लिए, 2x एक महीने) जानवरों के कल्याण का मूल्यांकन करने में मदद करता है ।
  3. एसिटोन में पतला दोनों DMBA और टीपीए का उपयोग करें। DMBA की कार्य एकाग्रता 250 ग्राम/एल है। एक जानवर के लिए एक खुराक एसीटोन के 200 माइक्रोन में डीएमबीए का 50 μg है। टीपीए की स्टॉक कंसंट्रेशन 125 ग्राम/एल और ट्रीटमेंट कंसंट्रेशन 25 जी/एल है। एक जानवर के लिए एक टीपीए खुराक एसीटोन के 200 माइक्रोन में 5 μg है।
    सावधानी:DMBA हानिकारक है अगर निगल लिया और कैंसर का कारण हो सकता है । एसीटोन तेजी से वाष्पित होता है और ज्वलनशील होता है। इससे आंखों में चक्कर आ सकते हैं और परेशान हो सकते हैं। एक श्वास मुखौटा का प्रयोग करें और/या एक वैक्यूम प्रवाह के तहत काम करते हैं । इनमें से किसी भी रसायन को संभालने के बाद दस्ताने बदलें। व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरे चूहों के आवास के दौरान रसायनों के प्रसार को रोकते हैं। आवेदन के बाद, DMBA को संभालने और खतरनाक कचरे के रूप में निपटान के लिए इस्तेमाल किया पिपेट युक्तियों इकट्ठा।
    नोट:DMBA प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। पतला टीपीए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जाता है, अधिमानतः प्रकाश से संरक्षित होता है।
  4. निम्नलिखित उपकरणों की खरीद करें: एक पैमाने, फर के लिए एक साधारण शेवर, एक साधारण शासक, एक डिजिटल कैमरा, एक नोटपैड और एक कलम या पेपिलोमास, एक साँस संज्ञाहरण प्रणाली या एक माउस निरोधक रिकॉर्डिंग के लिए एक कंप्यूटर पीछे की चोटी पर एक खोलने के साथ, और चूहों के त्याग के लिए एक कार्बन डाइऑक्साइड नार्कोसिस प्रणाली।

2. स्किन पैपिलोमा इंडक्शन एंड प्रमोशन

  1. पीछे की त्वचा को शेव करें और जानवर का वजन करें। बाद में जरूरत पड़ने पर त्वचा को शेव करें लेकिन केमिकल एक्सपोजर के समय नहीं।
    नोट:पेपिलोमास के आसपास शेविंग करते समय सावधान रहें और त्वचा पर कोई कटौती करने से बचें। किसी भी संभावित वजन घटाने की सूचना देने के लिए हर 2 सप्ताह में प्रत्येक जानवर का वजन करें।
  2. फर शेविंग के बाद एक पिपेट 48 एच का उपयोग करके मुंडा क्षेत्र पर एसीटोन के 200 माइक्रोन में डीएमबीए के 50 μg लागू करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रकाश साँस लेना संज्ञाहरण या माउस निरोधक का उपयोग करके जानवर को नियंत्रित करें।
  3. 7 दिनों के बाद, पहली टीपीए खुराक दें। एक सप्ताह में एक पिपेट 2x, अधिमानतः सोमवार और गुरुवार या मंगलवार और शुक्रवार के साथ एकेटोन के 200 μL में टीपीए के 5 μg लागू करें।
  4. गिनती, रिकॉर्ड, और तस्वीर papillomas हर हफ्ते। व्यास में 1 मिमी से अधिक एक स्पष्ट द्रव्यमान एक पेपिलोमा माना जाता है यदि यह 1 सप्ताह से अधिक समय तक रहता है। एक नक्शे पर प्रत्येक व्यक्ति पेपिलोमा चिह्नित करें और हर हफ्ते इसके आकार की सूची दें। डिजिटल तस्वीरों को स्टोर करें।

3. पशु बलि और नमूना संग्रह

  1. ट्यूमर प्रतिक्रिया एक पठार तक पहुंचने तक उपचार जारी रखें। आम तौर पर, इस्तेमाल किए गए माउस तनाव के आधार पर दीक्षा के 10-20 सप्ताह बाद पेपिलोमा बोझ बढ़ने की उम्मीद है। पठार 15-20 हफ्तों में होने की उम्मीद है। पेपिलोमा का एक छोटा सा अनुपात (3% से कम%) 20-50 सप्ताह2के भीतर एससीसी में विकसित कर सकते हैं ।
  2. पिछले टीपीए आवेदन के बाद जानवरों 24 घंटे का बलिदान। सर्वाइकल अव्यवस्था या किसी अन्य उपयुक्त विधि के साथ कार्बन डाइऑक्साइड नार्कोसिस का उपयोग करें।
  3. शोध के प्रश्न के आधार पर, जानवरों से30, 31उचित नमूना सामग्री इकट्ठा करें।
    1. उदाहरण के लिए, बलिदान से पहले रक्त के नमूने लें और प्लाज्मा को अलग करें।
    2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला (जैसे, हेमैटोक्सीलिन और इओसिन, प्रसार या भड़काऊ कोशिकाओं) के लिए त्वचा के टुकड़े काटें।
    3. जीन अभिव्यक्ति के लिए पेपिलोमा ऊतक या गैर-पेपिलोमा (इलाज) त्वचा के साथ त्वचा के टुकड़ों को इकट्ठा करने के लिए बायोप्सी घूंसे का उपयोग करें (जैसे, क्यूपीसीआर) और/या प्रोटीन विश्लेषण (जैसे, पश्चिमी दाग या एलिसा)।
    4. यदि प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का अधिक विस्तृत विश्लेषण वांछित है तो प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए तिल्ली और त्वचा-निकासी लिम्फ नोड्स का एक टुकड़ा एकत्र करें। आप आगे के विश्लेषण ों के लिए एपिडर्मल और डर्मल परतें भी अलग कर सकते हैं।

4. आंकड़े

  1. पैपिलोमा-मुक्त समय का एक काप्लान-मेयर सर्वाइवल वक्र ड्रा करें और अस्तित्व के लिए मैनटेल-कॉक्स लॉग-रैंक परीक्षण का उपयोग करें। प्रति सप्ताह पेपिलोमास की संख्या का एक रैखिक वक्र ड्रा करें। क्योंकि यह डेटा गिनती है, एक nonlinear प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करें। जरूरत पड़ने पर किसी सांख्यिकीविद् से सलाह लें।

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Representative Results

मुख्य परिणाम उपचार या जीनोटाइप समूहों के बीच अस्तित्व (यानी, पेपिलोमा मुक्त) समय है। माध्यमिक परिणाम प्रत्येक समूह में प्रति सप्ताह पेपिलोमास की संख्या है(चित्रा 2)। अपेक्षित परिणाम पेपिलोमा खाली समय में और प्रयोगात्मक (दो या अधिक) समूहों के बीच पेपिलोमा की संख्या में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर हैं। उस चरण में समूहों के बीच मतभेदों का विचार प्राप्त करने के लिए प्रचार (टीपीए) चरण के दौरान पेपिलोमा की संख्या गिनने और एक वक्र आकर्षित करने की सिफारिश की जाती है। प्रयोग को बहुत जल्दी समाप्त करने से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर छिपा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: DMBA-टीपीए प्रेरित त्वचा कैंसरजन्य मॉडल के मुख्य परिणाम। माउस त्वचा और दो मुख्य परिणामों पर पेपिलोमा की प्रतिनिधि छवियां। डेटा को चार अलग-अलग प्रयोगों से जोड़ा गया था। नोट: Balb/C और C57BL/6 चूहों के साथ प्रयोग अलग से किया गया । (क) पेपिलोमा खाली समय का अस्तित्व कथानक । धराशायी लाइन = Balb/c और ठोस लाइन = C57BL/6 । (ख) प्रति माउस पेपिलोमास की औसत संख्या । धराशायी लाइन = Balb/c और ठोस लाइन = C57BL/6 । त्रुटि सलाखों = (C) DMBA उपचार के बाद 11 सप्ताह में papillomas के साथ एक Balb/c माउस । (D) DMBA उपचार के बाद 11 सप्ताह में पेपिलोमास के साथ एक C57BL/6 माउस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हिस्टोलॉजी, एमआरएनए, और सेलुलर और प्रोटीन विश्लेषण मनाया मतभेदों अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए आयोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण पेपिलोमा की संरचना, त्वचा की आकृति विज्ञान (एपिडर्मल और डर्मल मोटाई), विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं (प्रसार, एपोप्टोसिस, एंजियोजेनेसिस), या प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ32 (चित्रा 3)का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं। त्वचा अत्याधुनिक छवि विश्लेषण प्रणालियों30,31,32,33द्वारा रूपात्मक और आईएचसी मापदंडों के विश्वसनीय परिमाणीकरण के लिए आदर्श है। (पेपिलोमा) त्वचा के नमूनों से जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति आसानी से मानक तरीकों के साथ अध्ययन किया जा सकता है30। फ्लो साइटोमेट्री तिल्ली और त्वचा-निकासी लिम्फ नोड्स की विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण है, जैसा कि पहले30वर्णित था। विश्लेषणात्मक तरीकों का चुनाव शोध प्रश्न पर निर्भर करता है और प्रयोग शुरू करने से पहले इस पर विचार करने की आवश्यकता है।

Figure 3
चित्रा 3: DMBA-टीपीए मॉडल में भड़काऊ सेल घुसपैठ का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। DMBA-टीपीए मॉडल में पीएफए-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड त्वचा से प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल क्रॉस सेक्शन। त्वचा वर्गों एक मैक्रोफेज मार्कर F4/80 (भूरे रंग) के साथ दाग थे । स्केल बार = 200 माइक्रोन।(A)सामान्य, अनुपचारित त्वचा में केवल कुछ F4/80 सकारात्मक मैक्रोफेज देखे गए। (ख)दूसरे टीपीए प्रशासन के बाद 2 सप्ताह और ३६ घंटे में कैंसर को बढ़ावा देने के प्रारंभिक चरण में डर्मिस में मैक्रोफेज घुसपैठ स्पष्ट थी । इसके अलावा, एपिडर्मल हाइपरप्रसार को 2 सप्ताह में देखा गया था, जैसा कि एपिडर्मिस के मोटा होने से दिखाया गया है। (ग)19 सप्ताह में गैर-पेपिलोमा त्वचा ने अभी भी मैक्रोफेज की उल्लेखनीय घुसपैठ दिखाई है । (डी)डम्बा-टीपीए इलाज जानवरों के डर्मिस में पेपिलोमास के तहत मैक्रोफेज का एक मजबूत संचय देखा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

DMBA-टीपीए प्रेरित त्वचा कैंसर सबसे अधिक इस्तेमाल किया कैंसर मॉडल में से एक है क्योंकि यह अत्यधिक प्रजनन योग्य है और दीक्षा से द्रोह के लिए ट्यूमर प्रगति के बारे में जानकारी प्रदान करता है । प्रमुख परिणाम उपाय, पेपिलोमा गठन, आसानी से और मज़बूती से मात्रात्मक है। मॉडल दोनों ट्यूमर दीक्षा (ट्यूमर मुक्त अस्तित्व) और प्रगति (ट्यूमर संख्या और आकार) एक साथ पते । मॉडल विभिन्न यौगिकों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जैसे संभावित चिकित्सा विज्ञान, और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों में ट्यूमर प्रगति पर व्यक्तिगत जीन के प्रभाव। किसी भी तनाव के लिए मॉडल लागू करते समय, यह सलाह दी जाती है कि मौजूदा साहित्य का अध्ययन कैसे तनाव मॉडल में प्रतिक्रिया (जैसे, पता लगाने के लिए कितनी जल्दी पहले papillomas दिखाई देगा) के एक विचार को प्राप्त करने के लिए सलाह दी जाती है । आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करते समय, जंगली प्रकार के लिटरमेट्स के उपयोग की हमेशा सिफारिश की जाती है। संभावित अतिरिक्त नियंत्रणों का उपयोग, जैसे कि या तो DMBA या टीपीए या दोनों एसीटोन द्वारा प्रतिस्थापित करना, अत्यधिक बहस का मुद्दा है, क्योंकि यह ज्ञात है कि या तो DMBA या टीपीए को हटाने या उनके प्रशासन के आदेश को उलटना पेपिलोमा विकास34को शामिल करने की संभावना नहीं है। जब ट्यूमर दीक्षा का अध्ययन करना आवश्यक है (यानी, अकेले DMBA के प्रशासन द्वारा), यह DMBA खुराक के बाद जानवरों का त्याग करके प्राप्त किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक या नॉकआउट सेटिंग में किसी व्यक्तिगत जीन के प्रभाव का अध्ययन करते समय, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और जंगली प्रकार के उपभेदों30,31के बीच ट्यूमर गठन से पहले मौजूद संभावित मतभेदों का पता लगाने के लिए अनुपचारित जानवरों से नमूने लेने की सिफारिश की जाती है।

हालांकि DMBA-टीपीए मॉडल अपेक्षाकृत तकनीकी रूप से आचरण करने के लिए सरल है, सटीक समय सफलता के लिए आवश्यक है । डीएमबीए का आवेदन और टीपीए का नियमित अनुप्रयोग ट्यूमर विकास34दोनों के लिए महत्वपूर्ण है। सभी डेटा इकट्ठा करने के लिए पेपिलोमा की एक सावधान साप्ताहिक परीक्षा आवश्यक है। यह ध्यान देने की आवश्यकता है कि कुछ उपचार या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के कारण पेपिलोमास बढ़ सकता है और बाद में सिकुड़ सकता है या30भी गायब हो सकता है । कभी-कभी, अन्य गैर-कैंसर घाव और एससीसी उत्पन्न होते हैं। इस मामले में, घाव की हिस्टोलॉजिकल जांच की सिफारिश की जाती है। एक और महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि टीपीए एकमात्र ट्यूमर प्रमोटर है। त्वचा का आघात साइटोकिन्स के उत्पादन को प्रेरित करता है जो ट्यूमर को बढ़ावा देने2,34को प्रभावित कर सकता है । इस प्रकार, शेविंग के दौरान त्वचा के आयट्रोनिक घायल होने से बचने की आवश्यकता होती है, और आक्रामक, लड़ने वाले चूहों को अलग से रखा जाना चाहिए। लड़ाई के अलावा पशु कल्याण के अन्य पहलू भी महत्वपूर्ण हैं । वजन घटाने, सुस्त और पेचीदा फर, और उदासीन व्यवहार असुविधा के संकेत हैं। बेचैनी न केवल एक नैतिक मुद्दा है, क्योंकि नकारात्मक ऊर्जा संतुलन ट्यूमर विकास34को रोकता है।

DMBA-टीपीए मॉडल कई संशोधनों के लिए एक अवसर प्रदान करता है। क्योंकि कुछ उपभेदों को दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील माना जाता है, एक सावधानीपूर्वक चयन प्रयोग को शेड्यूल करने और टीपीए आवेदन18, 35की राशि और आवृत्ति को समायोजित करनेमेंसक्षम बनाता है। मॉडल मुख्य रूप से त्वचा ट्यूमर के विकास के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पथ के लिए स्थानीय आवेदन एक विकल्प36है। इसके अलावा, मॉडल के एक संशोधित संस्करण श्वासनली37में ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। क्योंकि ट्यूमर विकास को DMBA और टीपीए अनुप्रयोगों के साथ विनियमित किया जा सकता है, मॉडल आहार और सर्कैडियन लय38जैसे पर्यावरणीय पहलुओं को संशोधित करने के बाद परिणामों का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। ट्यूमर दीक्षा (DMBA) और संवर्धन (टीपीए) को अलग करके, मॉडल स्वतंत्र रूप से उन दो प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है । उदाहरण के लिए, DMBA उपचार के बाद चूहों का त्याग उपचार के तंत्र या ट्यूमर दीक्षा2,34में रुचि के जीन के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है। ट्यूमर दीक्षा और संवर्धन में शुरुआती घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, जानवरों को शुरुआती समय बिंदु पर बलिदान किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दूसरे टीपीए प्रशासन (उदाहरण के लिए 3 घंटे, 12 एच, 36 एच, या 48 घंटे के बाद)30,31के बाद नमूने एकत्र किए जा सकते हैं। यह भी देखने लायक है कि शास्त्रीय DMBA-TPA दो चरण कार्सिनोजेनेसिस मॉडल विभिन्न रसायनों का उपयोग करके या "तीसरे" रसायन का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है। इनकी समीक्षा हाबिल एट अल2द्वारा की जाती है ।

DMBA-टीपीए मॉडल दशकों के लिए विभिन्न प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है34. इसका उपयोग विभिन्न चिकित्सीय24,25,26 और जीन31,32,39,40 के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है , लेकिन पोषण27, सर्कैडियन लय38और नैदानिक उपकरणों के विकास के लिएभी। त्वचा से ट्यूमर के रूप में, मॉडलप्रगति 21के विभिन्न चरणों में ट्यूमर ऊतक के नमूने इकट्ठा करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। नए कीमोसेटिव एजेंटया इम्यूनोमोडुलेटर शुरू करते समय, पहले इस बारे में डेटा इकट्ठा करने की सलाह दी जाती है कि पिछले अध्ययनों में DMBA-टीपीए मॉडल में तनाव कैसे प्रतिक्रिया हुई है। यदि उपलब्ध नहीं है, तो संभावित चिकित्सीय एजेंट के बिना एक पूर्वअध्ययन के समय और पेपिलोमा की संख्या के साथ-साथ इन मापदंडों में भिन्नता निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। प्रकाशित अध्ययनों से मौजूदा डेटा परीक्षण यौगिक24,27की खुराक निर्धारित करने में भी मदद कर सकता है, लेकिन यदि अनुपलब्ध है, तो परीक्षण किए गए यौगिक के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करके एजेंट की खुराक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है25,26का अध्ययन किया।

मानव ट्यूमर उत्पत्ति के लिए सूजन आवश्यक है, क्योंकि यह ट्यूमर प्रगति के सभी चरणों में शामिल है: दीक्षा, पदोन्नति, और द्रोह42,43में रूपांतरण। रासायनिक रूप से प्रेरित त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल एक सूजन संचालित कार्सिनोजेनेसिस मॉडल है। समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन प्रतिक्रिया और इलाज त्वचा के लिए भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ मॉडल के प्रारंभिक चरण में पहले से ही स्पष्ट हैं। पहली घुसपैठ कोशिकाएं न्यूट्रोफिल हैं, जिसके बाद मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं आदि का संचय30,31होता है। ये कोशिकाएं त्वचा में एक भड़काऊ माइक्रोएनवायरमेंट बनाती हैं, और भड़काऊ और एपिडर्मल कोशिकाओं के बीच एक क्रॉस टॉक शुरू की जाती है, जिससे साइटोकिन्स, केमोकिन्स और प्रोस्टाग्लैंडिन का उत्पादन होता है जो स्थानीय रूप से ट्यूमर दीक्षा और विकास को चलाते हैं। चूंकि DMBA-टीपीए मॉडल एक सूजन-चालित मॉडल है, इसमें नैदानिक कैंसर के कुछ अन्य पहलुओं को शामिल नहीं किया गया है। यद्यपि यह ज्ञात है कि एससीसी अंततः DMBA-टीपीए मॉडल में मेटाटैसिस का कारण बन सकता है, केवल पेपिलोमा का एक छोटा सा हिस्सा एससीसी2,23में विकसित होता है। नतीजतन, मेटास्टासिस DMBA-टीपीए मॉडल में एक दुर्लभ विशेषता है, हालांकि सीडी-1 या सेनकार जैसे कुछ संवेदनशील आउटब्रीड स्टॉक्स में मेटास्टासिस44विकसित होने की संभावना बढ़ सकती है। एससीसी की उपस्थिति को अक्सर पशु कल्याण का मुद्दा माना जाता है और इस प्रकार एक अंत बिंदु मापदंड। इसलिए, मॉडल में मेटाटैसिस के अस्तित्व के बावजूद, प्रत्यारोपण या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल जैसे कुछ अन्य मॉडल मेटाटैसिस45का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं। मॉडल की एक और सीमा यह है कि रसायनों को लागू करने के लिए सतह की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, एक विशिष्ट आंतरिक अंग में कैंसर की प्रगति का अध्ययन मॉडल के दायरे से बाहर है।

एक और आम त्वचा कैंसर मॉडल यूवी विकिरण मॉडल46है. मॉडल DMBA-टीपीए मॉडल के बराबर है क्योंकि इन दो मॉडलों में से न तो कैंसर का कारण बनने के लिए सेल प्रत्यारोपण या आनुवंशिक संशोधन की जरूरत है । मॉडलों के बीच बुनियादी अंतर यह है कि यूवी विकिरण मॉडल आक्रामक एसएससी गठन को प्रेरित करता है, जबकि DMBA-टीपीए मॉडल में ट्यूमर परिणाम आम तौर पर सौम्य पेपिलोमा होता है। यदि यूवी विकिरण रासायनिक कैंसरजनकों के अनुप्रयोग के साथ या माउस उपभेदों में आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ जोड़ा जाता है जो तनाव को कैंसर के विकास के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है, यहां तक कि मेलानोमा गठन भी हो सकता है। यूवी विकिरण मॉडल में सबसे आम उत्परिवर्तन p53 जीन, मनुष्यों में एक महत्वपूर्ण ट्यूमर दमन जीन४६को निष्क्रिय करते हैं, जबकि DMBA-टीपीए मॉडल में सबसे आम उत्परिवर्तन Hras-जीन23को सक्रिय करते हैं । यूवी विकिरण भी इम्यूनोसप्रेसिंग46,47का कारण बनता है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली के पहलुओं का अध्ययन करते समय एक भ्रामक कारक हो सकता है। हालांकि ये दोनों मॉडल कॉम्बिनेशन में भी काम करते हैं। यूवी विकिरण का उपयोग डीएमबीए के साथ या टीपीए46के साथ एक शुरुआती एजेंट के रूप में एक प्रोजेक्ट्रेट एजेंट के रूप में किया जा सकता है।

एक उचित सवाल यह है कि क्या DMBA-टीपीए मॉडल मानव कैंसर की नकल करता है । पेपिलोमा का एक छोटा सा अनुपात एससीसी में विकसित होता है। फिर भी, मानव एससीसी का प्रेमसंचल चरण ऐक्टिव केराटोसिस है, और यह मॉडल में देखे गए पेपिलोमा गठन से अलग है। फिर भी, मॉडल के समान पेपिलोमा गठन का पता वेमुराफेनिब के साथ मेलानोमा के लिए इलाज किए गए मानव व्यक्तियों में पाया जाता है। इससे पता चलता है कि डीएमबीए-टीपीए मॉडल में कार्सिनोजेनेसिस के लिए आवश्यक एचआरएएस-उत्परिवर्तित स्टेम सेल भी मानव त्वचा34पर मौजूद हैं। इसके अलावा, यह बताया गया है कि 2-deoxy-2-[18 एफ]-फ्लोरो-डी-ग्लूकोज(18एफ-एफडीजी) पेपिलोमास और माइक्रोइनवेसिव एससीसी का तेज आसपास की त्वचा की तुलना में अधिक है, लेकिन पूरी तरह से आक्रामक एससीसी में उतना अधिक नहीं है, जो प्रेमघातक चरणों की समानता को दर्शाती है41। यदि विषाक्तता मूल्यांकन के लिए DMBA-टीपीए मॉडल का उपयोग कर, एक याद रखना चाहिए कि जोखिम की पुनरावृत्ति ट्यूमर पदोंनति३४पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है । कम से कम कुछ आणविक तंत्र मॉडल और मानव त्वचा के लिए आम हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को फिनलैंड अकादमी (अनुदान 25013080481 और 25013142041 (I.J.), 286377 और 295814 (मप्र), 287907 (जे.जे.), Päivikki और सकरी सोहलबर्ग फाउंडेशन (एम.पी., द्वारा वित्त पोषित किया गया था, टीजे), फिनिश मेडिकल फाउंडेशन (टीपी), प्रतिस्पर्धी राज्य अनुसंधान टैम्परे विश्वविद्यालय अस्पताल के विशेषज्ञ उत्तरदायित्व क्षेत्र का वित्तपोषण (अनुदान 9V049 और 9X044 (मप्र), 9X011 और 9V010 (T.J.)), फिमलाब प्रयोगशालाओं के विशेषज्ञ उत्तरदायित्व क्षेत्र के प्रतिस्पर्धी राज्य अनुसंधान वित्तपोषण (अनुदान X51409 (I.J.)), Tays समर्थन फाउंडेशन (I.J., M.P., J.J.), टैम्परे तपेदिक फाउंडेशन (I.J., M.P., J.J.), फिनिश कल्चरल फाउंडेशन (M.V.), पाउलो फाउंडेशन (T.P.), फिनलैंड के कैंसर सोसायटी (M.P.), और एमिल Aaltonen फाउंडेशन (T.P.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill Starlab S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill Starlab S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Sigma D3254-100MG Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone Sigma 1000141011 Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g Piramal Critical Care Limited Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis Albert Kerlb GmbH GT421 For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter ZeoSys GmbH For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm Staples Business Advantage 60383 For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red VetTech Solutions Ltd AN045AR For sacrifice
Mekasoft Mekalasi 23008 Table cover
Mice (Balb/c JRj) Janvier labs Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj) Janvier labs Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera Panasonic
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Enzo BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G KERN & SOHN GmbH PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing VetTech Solutions Ltd AN044BX For sacrifice
RNAlater Qiagen 76104 For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul Sartorius LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul Sartorius LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Induction Box Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer Scintica instrumentation inc. For anesthesia

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डाइमिथाइलबेंज [ए] एंथ्रेसीन और 12-ओ-टेट्रेडकैनोइल फोर्बोल-13-एसीटेट (DMBA-टीपीए) का उपयोग करके रासायनिक-प्रेरित त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल
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Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. H. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).

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