Summary
A carcinogênese de pele em dois estágios é induzida por dois produtos químicos aplicados topicamente. Um mutagen 7,12-dimetilbenz [a] antracaneno) provoca mutações nas células epidérmicas e uma aplicação contínua do estimulador de crescimento geral 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato acelera a formação de papiloma da pele.
Abstract
O câncer é uma das doenças humanas mais devastadoras. Modelos experimentais de câncer são importantes para obter informações sobre a complexa interação de diferentes tipos de células e genes na promoção da progressão do tumor e fornecer uma plataforma para testar a eficácia de diferentes abordagens terapêuticas. Um dos modelos experimentais mais utilizados de câncer inflamatório experimental é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios DMBA-TPA. A formação tumoral é induzida neste modelo pela aplicação tópica de dois produtos químicos diferentes, 7,12-dimetilbenz[a]antracaneno (DMBA) e phorbol-13-acetato de 12-O-tetradecanoyl (TPA), que juntos causam formação de papiloma na pele. Como o resultado primário é a formação do papiloma na pele, o modelo é uma maneira ideal, confiável e reproduzível de abordar tanto a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão do tumor (número e tamanho de tumores visíveis). Os efeitos do tratamento DMBA-TPA são transmitidos através de um mecanismo inflamatório, o que torna este modelo especialmente adequado para estudar o papel do sistema imunológico na formação de tumores. No entanto, este modelo é restrito à pele e outras superfícies onde os produtos químicos podem ser aplicados. Um protocolo detalhado é fornecido neste artigo para usar o modelo com sucesso.
Introduction
O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Portanto, há uma demanda para desenvolver modelos de doenças experimentais confiáveis para obter uma melhor compreensão da doença, bem como para explorar possíveis abordagens terapêuticas. Um dos modelos in vivo experimentais mais comumente usados para estudar o desenvolvimento do câncer de pele é o modelo de carcinogênese de pele de dois estágios quimicamente induzido1,2. O modelo fornece uma ferramenta para estudar a iniciação, a promoção e a progressão do tumor além dos eventos específicos tais como a infiltração da pilha imune e o angiogenesis.
Para usar o modelo de carcinogênese de pele em dois estágios, a pele traseira de camundongos é tratada com dois produtos químicos diferentes que, juntos, induzem a formação do tumor. O modelo é iniciado com uma dose baixa do mutagen, DMBA, seguido pela exposição prolongada ao promotor do tumor, TPA3 (Figura 1). DMBA muta DNA aleatoriamente, formando adutores covalentes com o DNA de células epidérmicas e células-tronco teatinócitos primários4,5,6,7. Algumas dessas mutações aleatórias ocorrem em um proto-oncogene, como Hras1 (mutações em Kras e Nras também são detectadas) e a conversão de proto-oncogenes para oncogenes impulsiona a formação tumoral estímulos adequados. O TPA, por sua vez, é o agente de promoção do crescimento tumoral mais utilizado. Seu alvo molecular é proteína kinase C (PKC)8. O TPA também ativa a sinalização wnt/β-catenina que é crucial para a formação de tumores no modelo9. A exposição repetida e prolongada ao agente promotor leva a uma sinalização celular aprimorada, aumento da produção de fatores de crescimento e uma reação inflamatória local, que são evidentes devido ao aumento da síntese de DNA e infiltração de células inflamatórias na pele tratada.
Os principais mediadores inflamatórios no modelo DMBA-TPA foram identificados10. Interleukin-17A (IL-17A) é conhecido por ser particularmente tumorigenic no modelo DMBA-TPA11,12. Trabalha em sinergia com interleucina 6 (IL-6) e participa do recrutamento de macrófagos e neutrófilos13,14. Além disso, as células TCD4 + e neutrófilos têm se mostrado tumorigenic no modelo DMBA-TPA. Finalmente, macrófagos também podem promover tumorigênese no modelo15,16,17.
Durante a fase de promoção, a proliferação celular das células mutadas é reforçada e uma hiperplasia sustentada da epiderme é mantida1. Isso leva ao desenvolvimento do papiloma na pele em 10-20 semanas, após o que os papilomas começam a se converter em tumores malignos, carcinomas de células escamosas (SCCs)2. No entanto, menos de 10% dos papilomas progridem para a malignidade, embora essa porcentagem também dependa do fundo genético dos camundongos2,18. Durante décadas não se sabia que tipo de células foram inicialmente mutadas nos tumores que levaram à malignidade, embora alguns estudos tenham relatado características claramente distintas nos tumores malignos quando comparados aos papilomas benignos19,20. No entanto, estudos recentes têm aumentado muito a nossa compreensão sobre a origem clonal da formação tumoral no modelo DMBA-TPA21. 22. 23.Demonstrou-se que ambas as células epiteliais derivadas da medula óssea e as células-tronco do folículo piloso contribuem para a formação tumoral22. Estudos de rastreamento de linhagem específicos de palco revelaram que os papilomas benignos são de origem monoclonal, mas recrutam novas populações de células epiteliais21,23. No entanto, apenas um dos clones celulares funciona como motorista de carcinogênese; ele contém uma mutação Hras23. A progressão para a formação de carcinoma está associada a uma varredura clonal23.
O DMBA cancerígeno inicia a formação do papiloma e a TPA promove o crescimento tumoral. Assim, a iniciação do tumor pode ser estudada separadamente da promoção interrompendo o experimento antes do período de tratamento do TPA. Como a progressão do tumor é estudada semanalmente, oferece uma grande oportunidade para a análise detalhada do crescimento do tumor ao longo do estudo. Porque os tumores são gerados por produtos químicos externos, uma mutação oncogenic na linha germinal é desnecessária. Assim, estudar os efeitos de um fundo genético (por exemplo, nocaute /transgene vs. tipo selvagem) sobre tumorigênese é simples2. Em suma, o modelo de câncer de pele DMBA/TPA é uma abordagem particularmente útil para estudar o papel do sistema imunológico na progressão do tumor, bem como para a avaliação dos passos de iniciação e promoção do tumor de forma independente ou interdependente.
Figura 1: Esboço do modelo de carcinogênese de pele induzida por DMBA-TPA. O DMBA cancerígeno é aplicado topicamente para induzir mutações no DNA na fase de iniciação do modelo. O agente promotor de crescimento TPA é administrado 2x por semana para aumentar a proliferação celular durante a fase de promoção, levando ao desenvolvimento de papilomas na pele. Os animais são sacrificados após a resposta do papiloma atingir um platô, geralmente dentro das semanas 15-20, dependendo do fundo genético dos ratos. Uma pequena proporção dos papilomas pode se desenvolver ainda mais em SCCs dentro de 20-50 semanas. Para estudar os primeiros eventos na fase de iniciação e promoção precoce, as amostras podem ser coletadas (por exemplo, logo após a segunda aplicação de TPA). Uma fotografia representativa e hematoxilina e eosina manchada seção transversal de papilomas em uma pele de rato C57BL/6 após 19 semanas de tratamento são mostrados. Barra de escala = 0,1 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/23659/2018).
1. Animais experimentais, reagentes e equipamentos
- Use idade e camundongos com sexo. Comece o estudo em 7-9 semanas de idade, porque a pele na maioria dos ratos está em telogênio (a fase de descanso) em torno dessa idade2.
- Observe o comportamento dos animais durante o estudo e se eles lutam, o que muitas vezes acontece com os machos, abrigá-los separadamente. As lutas podem causar cortes na pele, que promovem a formação do tumor. Os ratos fêmeas são preferidos devido a seu comportamento menos agressivo. O tamanho típico do grupo experimental varia entre 8-20 animais por grupo24,25,26,27.
NOTA:Cálculos de energia com base na variação biológica observada em estudos anteriores ajudam a escolher um tamanho de grupo suficientemente grande. As cepas utilizadas como exemplos neste artigo incluem Balb/c e C57BL/6. No entanto, muitas outras cepas de camundongos, como SENCAR e FVB têm sido usadas com o modelo DMBA-TPA, bem como os ratos Wistar e Sprague-Dawley2,28,29. É necessária uma licença do comité nacional ou local do trabalho animal antes do início do estudo. Além de considerações gerais de bem-estar, os desfechos específicos do modelo são tipicamente carcinoma de células escamosas (CCS) e uma infecção da pele. Arranhões na pele devido à coceira após a aplicação dos produtos químicos tumorigenic na acetona é típico, mas caso contrário, os animais não devem mostrar sinais de desconforto. Pesando regularmente (por exemplo, 2x por mês) ajuda a avaliar o bem-estar dos animais. - Use o DMBA e o TPA, ambos diluídos em acetona. A concentração de trabalho do DMBA é de 250 g/L. Uma dose para um animal é de 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona. A concentração de tpa é de 125 g/l e a concentração de tratamento 25 g/L. Uma dose de TPA para um animal é de 5 μg em 200 μL de acetona.
CUIDADO:DMBA é prejudicial se engolido e pode causar câncer. Acetona evapora rapidamente e é inflamável. Pode causar tonturas e irritar os olhos. Use uma máscara de respiração e/ou trabalhe um fluxo de vácuo. Troque luvas depois de manusear qualquer um desses produtos químicos. As gaiolas individualmente ventiladas impedem a propagação dos produtos químicos durante a carcaça dos ratos. Após a aplicação, recolher as pontas pipette usado para lidar com o DMBA e dispor como resíduos perigosos.
NOTA:O DMBA deve ser protegido da luz. O TPA diluído é armazenado em -20 °C, protegido preferencialmente da luz. - Procure o seguinte equipamento: uma escala, uma máquina de barbear comum para a pele, pipetas e pontas de tamanho apropriado, uma régua comum, uma câmera digital, um bloco de notas e uma caneta ou um computador para gravar os papilomas, um sistema de anestesia inalada ou um contidor do mouse com uma abertura no topo de trás, e um sistema de narcose de dióxido de carbono para sacrificar ratos.
2. Indução e Promoção do Papiloma da Pele
- Raspe a pele traseira e pese o animal. Mais tarde, raspar a pele sempre que necessário, mas não no momento da exposição química.
NOTA:Tenha cuidado ao fazer a barba ao redor dos papilomas e evitar fazer qualquer corte na pele. Pese cada animal a cada 2 semanas para notar qualquer perda de peso potencial. - Aplique 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona topicamente na área raspada usando uma pipeta 48 h após raspar a pele. Se necessário, contenha o animal usando anestesia de inalação de luz ou um contidor de camundongos.
- Após 7 dias, dê a primeira dose de TPA. Aplique 5 μg de TPA em 200 μL de acetona topicamente com uma pipeta 2x por semana, de preferência segunda e quinta-feira ou terça-feira e sexta-feira.
- Conte, registre e fotografe os papomas todas as semanas. Uma massa palpável superior a 1 mm de diâmetro é considerada um papiloma se permanecer mais de 1 semana. Marque cada papiloma individual em um mapa e liste seu tamanho a cada semana. Armazenar fotografias digitais.
3. Sacrifício animal e coleção da amostra
- Continue o tratamento até que a resposta do tumor atinja um platô. Geralmente, espera-se que a carga do papiloma aumente de 10 a 20 semanas após a iniciação, dependendo da cepa do camundongo usada. O planalto é esperado em 15-20 semanas. Uma pequena proporção dos papilomas (menos de 3%) pode evoluir para SCCs dentro de 20-50 semanas2.
- Sacrifique os animais 24 h após a última aplicação tpa. Use narcose de dióxido de carbono com luxação cervical ou outro método adequado.
- Dependendo da questão da pesquisa, recolher material amostral adequado dos animais30,31.
- Por exemplo, recolher amostras de sangue antes do sacrifício e separar o plasma.
- Corte pedaços da pele para a coloração de imunohistoquímica (IHC) (por exemplo, hematoxilina e eosina, proliferando ou inflamatórias).
- Use socos de biópsia para coletar pedaços de pele com tecido de papiloma ou pele não papiloma (tratada) para expressão gênica (por exemplo, qPCR) e/ou análises de proteínas (por exemplo, mancha ocidental ou ELISA).
- Colete um pedaço dos gânglios linfáticos de drenagem do baço e da pele para análise de citometria de fluxo se for desejada uma análise mais detalhada das populações de células imunes. Você também pode separar camadas epidérmicas e dérmicas para análises adicionais.
4. Estatísticas
- Desenhe uma curva de sobrevivência Kaplan-Meier do tempo livre de papiloma e use o teste de log-rank Mantel-Cox para a sobrevivência. Desenhe uma curva linear do número de papilomas por semana. Como se trata de dados de contagem, use um modelo de regressão não linear. Consulte um estatístico, se necessário.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O principal resultado é o tempo de sobrevivência (ou seja, livre de papiloma) entre o tratamento ou os grupos genótipo. O resultado secundário é o número de papilomas por semana em cada grupo(Figura 2). Os resultados esperados são uma diferença estatisticamente significativa no tempo livre do papiloma e no número de papiillomas entre os grupos experimentais (dois ou mais). Recomenda-se contar o número de papilomas e desenhar uma curva durante a fase de promoção (TPA) para ter uma idéia das diferenças entre os grupos nessa fase. Terminar o experimento muito cedo pode esconder uma diferença estatisticamente significativa.
Figura 2: Os principais resultados do modelo de carcinogênese da pele induzida pelo DMBA-TPA. Imagens representativas de papilomas na pele do rato e os dois principais resultados. Os dados foram combinados de quatro experimentos separados. NOTA: Experimentos com ratos Balb/C e C57BL/6 foram feitos separadamente. (A) Um lote da sobrevivência do tempo livre do papiloma. Linha tracejada = Balb/c e linha sólida = C57BL/6. (B) O número médio de papilomas por mouse. Linha tracejada = Balb/c e linha sólida = C57BL/6. Barras de erro = SEM. (C) Um rato Balb/c com papillomas às 11 semanas após o tratamento de DMBA. (D) Um rato C57BL/6 com papillomas às 11 semanas após o tratamento de DMBA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Histologia, mRNA e análise celular e proteica podem ser conduzidas para explorar os mecanismos subjacentes às diferenças observadas. Por exemplo, as análises histológicas são adequadas para o estudo da estrutura dos papilomas, morfologia da pele (espessura epidérmica e dérmica), diferentes processos biológicos (proliferação, apoptose, angiogênese) ou a infiltração de células imunes32 (Figura 3). A pele é ideal para quantificação confiável de parâmetros morfológicos e IHC por sistemas de análise de imagem de última geração30,31,32,33. Expressões de genes e proteínas das amostras de pele (papiloma) podem ser facilmente estudadas com métodos padrão30. O fluxo de citometria é uma ferramenta útil para a análise de diferentes populações de células imunes dos gânglios linfáticos de drenagem da pele e da pele, como descrito anteriormente30. A escolha dos métodos analíticos depende da questão da pesquisa e precisa ser considerada antes de iniciar o experimento.
Figura 3: Análise histológica da infiltração de células inflamatórias no modelo DMBA-TPA. Seções transversais histológicas representativas da pele fixa da parafina-encaixada PFA no modelo De DMBA-TPA. As seções da pele foram manchadas com um marcador f4/80 do macrófago (marrom). Barras de escala = 200 μm. (A)Apenas alguns macrófagos positivos F4/80 foram vistos na pele normal e não tratada. (B) A infiltração de macrófagos na derme ficou evidente no estágio inicial da promoção do câncer, às 2 semanas e 36 h após a segunda administração do TPA. Além disso, a hiperproliferação epidérmica foi observada às 2 semanas, como mostrado pelo espessamento da epiderme. (C) A pele não papiloma em 19 semanas ainda mostrou uma notável infiltração de macrófagos. (D)Um forte acúmulo de macrófagos foi visto papilomas na derme dos animais tratados com DMBA-TPA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O câncer de pele induzido pelo DMBA-TPA é um dos modelos de câncer mais usados porque é altamente reproduzível e fornece informações sobre a progressão do tumor da iniciação à malignidade. A medida-chave do resultado, a formação do papiloma, é facilmente e confiável quantitativa. O modelo aborda a iniciação tumoral (sobrevivência livre de tumores) quanto a progressão (números e tamanhos tumorais) simultaneamente. O modelo é adequado para estudar diferentes compostos, como potenciais terapêuticas, e os efeitos de genes individuais na progressão do tumor em animais geneticamente modificados. Ao aplicar o modelo para qualquer cepa, é aconselhável estudar a literatura existente para alcançar uma idéia de como a cepa reage no modelo (por exemplo, para descobrir a rapidez com que os primeiros papilomas aparecerão). Ao usar ratos geneticamente modificados, o uso de littermates tipo selvagem é sempre recomendado. O uso de potenciais controles adicionais, como a substituição de DMBA ou TPA ou ambos por acetona, é altamente discutível, porque se sabe que a remoção de DMBA ou TPA ou a inversão de sua ordem de administração é altamente improvável de resultar na indução do crescimento do papiloma34. Quando é essencial estudar a iniciação tumoral (ou seja, apenas pela administração do DMBA), pode ser alcançado sacrificando os animais após a dose de DMBA. Ao estudar o efeito de um gene individual em um ambiente transgênico ou nocaute, recomenda-se a coleta de amostras de animais não tratados para detectar possíveis diferenças que possam existir antes da formação tumoral entre cepas do tipo geneticamente modificadoe selvagem30,31.
Embora o modelo DMBA-TPA seja relativamente simples de conduzir tecnicamente, o tempo preciso é essencial para o sucesso. A aplicação do DMBA e a aplicação regular do TPA são cruciais para o desenvolvimento do tumor34. Um exame semanal cuidadoso dos papilomas é essencial para coletar todos os dados. É preciso notar que certos tratamentos ou origens genéticas podem causar papilomas a crescer e mais tarde encolher ou mesmo desaparecer30. Às vezes, outras lesões não cancerosas e SCCs surgem. Neste caso, recomenda-se o exame histológico da lesão. Outro passo crítico é garantir que a TPA seja o único promotor tumoral. Trauma de pele induz a produção de citocinas que podem afetar a promoçãodotumor2,34. Assim, o ferimento iagênico da pele durante o barbear precisa ser evitado, e agressivo, ratos de combate devem ser alojados separadamente. Além da luta, outros aspectos do bem-estar animal também são importantes. Perda de peso, pele sem brilho e emaranhado, e comportamento apático são sinais de desconforto. O desconforto não é apenas uma questão ética, porque o balanço energético negativo inibe o crescimento do tumor34.
O modelo DMBA-TPA oferece uma oportunidade para muitas modificações. Como algumas cepas são conhecidas por serem mais sensíveis do que outras, uma seleção cuidadosa permite agendar o experimento e ajustar a quantidade e a frequência do aplicativo TPA18,35. O modelo é usado principalmente para o desenvolvimento de tumores de pele, mas a aplicação local para o trato gastrointestinal é uma opção36. Além disso, uma versão modificada do modelo tem sido usada para estudar o desenvolvimento do tumor na traqueia37. Como o desenvolvimento do tumor pode ser regulado com aplicações de DMBA e TPA, o modelo permite estudar os resultados após modificar aspectos ambientais, como dieta e ritmo circadiano38. Ao separar a iniciação tumoral (DMBA) e a promoção (TPA), o modelo permite estudar esses dois processos de forma independente. Por exemplo, sacrificar os camundongos após o tratamento de DMBA permite estudar o mecanismo do tratamento ou o efeito de um gene de interesse na iniciação tumoral2,34. Para estudar os primeiros eventos na iniciação e promoção do tumor, os animais podem ser sacrificados em um ponto de início. Por exemplo, as amostras podem ser coletadas logo após a segunda administração do TPA (por exemplo, 3 h, 12 h, 36 h, ou 48 h depois)30,31. Também vale a pena notar que o modelo clássico de carcinogênese de duas etapas DMBA-TPA pode ser modificado usando diferentes produtos químicos ou usando o "terceiro" produto químico. Estes são revisados por Abel et al2.
O modelo DMBA-TPA tem sido usado há décadas para diferentes fins34. Tem sido utilizado para estudar os efeitos de diferentes terapêuticas24,25,26 e genes31,32,39,40, mas também para estudar nutrição27,o ritmo circadiano38,e o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico41. Como os tumores se formam a partir da pele, o modelo oferece uma oportunidade única para coletar amostras de tecido tumoral em diferentes estágios da progressão21. Ao introduzir novos agentes quimiopreventivos ou imunomoduladores, é aconselhável primeiro coletar dados sobre como a cepa reagiu no modelo DMBA-TPA em estudos anteriores. Se não estiver disponível, um preestudodor sem o potencial agente terapêutico é recomendado para determinar o tempo e o número de papilomas, bem como a variação nesses parâmetros. Os dados existentes de estudos publicados também podem ajudar a determinar a dosagem do composto testado24,27,mas se não estiverem disponíveis, o uso de uma diluição em série do composto testado permite avaliar a resposta da dose do agente estudado25,26.
A inflamação é essencial para a tumorigênese humana, pois está envolvida em todas as fases da progressão do tumor: a iniciação, a promoção e a conversão à malignidade42,43. O modelo quimicamente induzido da carcinogênese da pele é um modelo inflamado da carcinogênese. A resposta pró-inflamatória da citocina e a infiltração de células inflamatórias na pele tratada já são evidentes na fase inicial do modelo. As primeiras células infiltradas são neutrófilos, seguidos pelo acúmulo de macrófagos, células T, etc.30,31. Estas células criam um microambiente inflamatório na pele, e uma conversa cruzada entre células inflamatórias e epidérmicas é iniciada, levando à produção de citocinas, quimiocinas e prostaglandinas que impulsionam a iniciação e crescimento do tumor localmente. Como o modelo DMBA-TPA é um modelo orientado para inflamação, ele não inclui alguns outros aspectos do câncer clínico. Embora se saiba que os SCCs eventualmente podem causar metástase no modelo DMBA-TPA, apenas uma pequena porção de papilomas se desenvolvem em SCCs2,23. Consequentemente, a metástase é uma característica rara no modelo DMBA-TPA, embora alguns estoques sensíveis de raça superada, como CD-1 ou SENCAR, possam ter uma maior probabilidade de desenvolver metástase44. O aparecimento de CCS é muitas vezes considerado uma questão de bem-estar animal e, portanto, um critério de ponto final. Portanto, apesar da existência de metástase no modelo, alguns outros modelos, como transplante ou modelos geneticamente modificados, são mais adequados para o estudo da metástase45. Outra limitação do modelo é que ele requer uma superfície para aplicar os produtos químicos. Assim, estudar a progressão do câncer em um órgão interno específico está fora do escopo do modelo.
Outro modelo comum de câncer de pele é o modelo de radiação UV46. O modelo é comparável ao modelo DMBA-TPA porque nenhum desses dois modelos precisa de transplante celular ou modificação genética para causar câncer. A diferença fundamental entre os modelos é que o modelo de radiação UV induz a formação agressiva do SSC, enquanto o resultado do tumor no modelo DMBA-TPA é geralmente papilomas benignos. Se a radiação UV é combinada com a aplicação de agentes cancerígenos químicos ou em cepas de camundongos com um fundo genético que torna a cepa suscetível para o desenvolvimento do câncer, até mesmo a formação de melanoma pode ocorrer. As mutações mais comuns no modelo de radiação UV inativam o gene p53, um gene supressor de tumor crucial em humanos46,enquanto as mutações mais comuns no modelo DMBA-TPA ativam o geneHras-gene 23. A radiação UV também causa imunossupressão46,47, o que pode ser um fator de confusão ao estudar os aspectos do sistema imunológico. No entanto, esses dois modelos também funcionam em combinação. A radiação UV pode ser usada como um agente promotor com DMBA ou como um agente iniciador com TPA46.
Uma pergunta razoável é se o modelo DMBA-TPA imita o câncer humano. Uma pequena proporção de papilomas se desenvolve para SCCs. No entanto, o estágio pré-maligno do CCS humano é a queratose actínica, e difere da formação do papiloma visto no modelo. Ainda assim, a formação de papiloma semelhante ao modelo é detectada em indivíduos humanos tratados para melanoma com vemurafenib. Isso sugere que as células-tronco mutadas por Hras que são essenciais para a carcinogênese no modelo DMBA-TPA também existem na pele humana34. Além disso, relata-se que a captação de 2-deoxy-2-[18F]-fluoro-D-glicose(18F-FDG) papilomas e SCCs microinvasivos é maior do que na pele circundante, mas não tão alta quanto em um CCS totalmente invasivo, refletindo a semelhança dos estágios pré-malignos41. Se o uso do modelo DMBA-TPA para avaliação de toxicidade, deve-se lembrar que a repetição da exposição tem um grande efeito sobre a promoção do tumor34. Pelo menos alguns dos mecanismos moleculares são comuns ao modelo e à pele humana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia (subvenções 25013080481 e 25013142041 (I.J.), 286377 e 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki e Fundação Sakari Sohlberg (Pm,, T.J.), Fundação Médica Finlandesa (T.P.), A Pesquisa Estatal Competitiva Financiamento da Área de Responsabilidade Especializada do Hospital Universitário de Tampere (concessão 9V049 e 9X044 (M.P.), 9X011 e 9V010 (T.J.)), O Financiamento De Investigação Estatal Competitivo da Área de Responsabilidade Especializada dos Laboratórios Fimlab (subvenção X51409 (I.J.)), Tays Fundação de Apoio (I.J., M.P., T.J.), Fundação Tampere Tuberculosis (I.J., M.P., T.J.), a Fundação Cultural Finlandesa (M.V.), a Fundação Paulo (T.P.), a Sociedade de Câncer da Finlândia (M.P.) e a Fundação Emil Aaltonen (T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
![Modelo de carcinogênese cutânea induzida por produtos químicos usando dimetilbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetato (DMBA-TPA)](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/60445.jpg)
