Summary
Två-stegs hud cancerogenesen induceras av två topikalt applicerade kemikalier. En mutagen 7, 12-dimetylbenz [a] antracen) orsakar mutationer i epidermala celler och en kontinuerlig tillämpning av allmän tillväxt stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat accelererar hudpapillom formation.
Abstract
Cancer är en av de mest förödande mänskliga sjukdomarna. Experimentella cancer modeller är viktiga för att få insikt i det komplexa samspelet mellan olika celltyper och gener för att främja tumörprogression och för att tillhandahålla en plattform för att testa effekten av olika terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella inflammatoriska cancer modeller är DMBA-TPA två-stegs hud carcinogenes modell. Tumör bildning induceras i denna modell av topikal applicering av två olika kemikalier, 7, 12-dimetylbenz [a] antracen (DMBA) och 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), som tillsammans orsakar papillom bildas i huden. Eftersom det primära resultatet är papillom bildning i huden, modellen är en idealisk, pålitlig, och reproducerbara sätt att ta itu med både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och tumör progression (antal och storlek av synliga tumörer). Effekterna av DMBA-TPA-behandling överförs via en inflammatorisk mekanism, vilket gör denna modell särskilt lämplig för att studera immunsystemets roll i tumör bildning. Denna modell är dock begränsad till huden och andra ytor där kemikalierna kan appliceras på. Ett detaljerat protokoll finns i den här artikeln för att använda modellen med lyckat resultat.
Introduction
Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen. Därför finns det en efterfrågan att utveckla pålitliga experimentella sjukdomsmodeller för att få en bättre förståelse av sjukdomen samt att utforska potentiella terapeutiska metoder. En av de mest använda experimentella in vivo-modellerna för att studera hudcancer utveckling är den kemiskt inducerade tvåstegs hud cancerogenesen Model1,2. Modellen ger ett verktyg för att studera tumör initiering, befordran, och progression utöver specifika händelser såsom immun cell infiltration och angiogenes.
För att använda två-stegs hud carcinogenes modell, ryggen huden på möss behandlas med två olika kemikalier som tillsammans inducera tumör bildning. Modellen inleds med en låg dos av mutagen, DMBA, följt av långvarig exponering för tumörpromotorn, TPA3 (figur 1). Dmba muterar DNA slumpmässigt genom att bilda kovalenta addukter med DNA från epidermala celler och primära keratinocyter stamceller4,5,6,7. Några av dessa slumpmässiga mutationer äger rum i en proto-Onkogene, såsom Hras1 (mutationer i kras och de nationella regleringsmyndigheterna upptäcks också) och omvandlingen av proto-onkogener till onkogener driver tumörbildningen under rätt stimuli. TPA, i sin tur, är den mest använda tumörtillväxt främjande agent. Dess molekylära mål är proteinkinas C (PKC)8. TPA aktiverar också WNT/β-catenin signalering som är avgörande för tumör bildning i modell9. Upprepad och långvarig exponering för att främja agenten leder till förbättrad cellsignalering, ökad produktion av tillväxtfaktorer, och en lokal inflammatorisk reaktion, som är uppenbara på grund av ökad DNA-syntes och inflammatorisk cell infiltration i den behandlade huden.
De viktigaste inflammatoriska mediatorerna i DMBA-TPA-modellen har identifierats10. Interleukin-17a (Il-17a) är känd för att vara särskilt tumorigen i dmba-TPA-modellen11,12. Det fungerar i samverkan med interleukin 6 (IL-6) och deltar i makrofagen och neutrofila rekrytering13,14. Dessutom, CD4+ T-celler och neutrofiler har visat sig vara tumörframkallande i dmba-TPA-modellen. Slutligen kan makrofager också främja uppkomst i modellen15,16,17.
Under främjande fasen, cell spridningen av muterade celler förstärks och en ihållande hyperplasi i epidermis upprätthålls1. Detta leder till papillom utveckling i huden i 10 – 20 veckor, varefter papillom börjar konvertera till maligna tumörer, skivepitelcancer cell karcinom (SCCS)2. Emellertid, mindre än 10% av papillom framsteg till malignitet, även om denna procentsats beror också på den genetiska bakgrunden av möss2,18. I årtionden var det inte känt vilken typ av celler var initialt muterade i tumörer som leder till malignitet, även om vissa studier hade rapporterat klart distinkta funktioner i maligna tumörer jämfört med benign papillom19,20. Emellertid, nyare studier har kraftigt ökat vår förståelse för det klonala ursprunget av tumör bildning i DMBA-TPA modell21. 22. 23. det visades att både benmärg-härledda epitelceller och hårfollikelstamceller bidrar till tumörbildningen22. Stage-specifika härstamning studier har avslöjat att godartade papillom är av monoklonal ursprung, men de rekrytera nya epitelceller populationer21,23. Men endast en av cell klonerna fungerar som en drivkraft för carcinogenes; den innehåller en HRAS-mutation23. Progressionen till carcinom bildas är förknippad med en klon svep23.
Cancerframkallande dmba initierar papillom bildandet och TPA främjar tumörtillväxt. Därför, tumören initiering kan studeras separat från befordran genom att avbryta experimentet innan TPA behandlingsperioden. Som tumörprogression studeras veckovis det erbjuder en stor möjlighet för detaljerad tumörtillväxt analys under hela studien. Eftersom tumörerna genereras av externa kemikalier, är en onkogen mutation i köns cells onödigt. Således, studera effekterna av en genetisk bakgrund (t. ex. knockout/Transgene vs Wild typ) på uppkomst är enkel2. Sammanfattningsvis är DMBA/TPA hudcancer modell en särskilt användbar metod för att studera rollen av immunförsvaret i tumörprogression samt för utvärderingen av tumör initiering och främjande steg självständigt eller beroende.
Figur 1: DMBA-TPA-inducerad hud carcinogenes modell kontur. Det carcinogena DMBA appliceras lokalt för att inducera DNA-mutationer i inledningsskedet av modellen. Den tillväxtbefrämjande agent TPA administreras 2x en vecka för att öka cellproliferation under främjande fasen, vilket leder till utvecklingen av papillom i huden. Djur offras efter papillom svar når en platå, vanligtvis inom veckor 15 – 20, beroende på den genetiska bakgrunden av möss. En liten del av papillom kan vidareutvecklas till SCCs inom 20 – 50 veckor. För att studera tidiga händelser i inledningen och tidig befordran fas, prover kan samlas in (t. ex., strax efter den andra TPA ansökan). Ett representativt fotografi och hematoxylin och eosin färgade tvärsnitt av papillom på en C57BL/6 mus hud efter 19 veckors behandling visas. Scale bar = 0,1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det protokoll som beskrivs här har godkänts av Finlands nationella djur Etiknämnd (protokollnummer ESAVI/23659/2018).
1. försöksdjur, reagens och utrustning
- Använd ålder och kön matchade möss. Starta studien vid 7 – 9 veckors ålder, eftersom huden i de flesta möss är i telogen (vilofasen) runt den åldern2.
- Observera beteendet hos djuren under studien och om de slåss, som ofta händer med hanar, hus dem separat. Slagsmål kan orsaka nedskärningar i huden, som främjar tumör bildning. Kvinnliga möss är att föredra på grund av deras mindre aggressiva beteende. Den typiska experimentella gruppstorleken varierar mellan 8 – 20 djur per grupp24,25,26,27.
Anmärkning: effektberäkningar baserade på den biologiska variationen som setts i tidigare studier hjälper till att välja en tillräckligt stor gruppstorlek. De stammar som används som exempel i denna artikel är Balb/c och C57BL/6. Men många andra mus stammar som sencar och fvb har använts med dmba-TPA-modellen, liksom Wistar och Sprague-Dawley rats2,28,29. En licens från den nationella eller lokala kommittén för djur arbete behövs innan studien inleds. Förutom allmänna välfärds överväganden är de modellspecifika ändpunkterna vanligtvis skivepitelcancer (SCC) och en infektion i huden. Repor i huden på grund av klåda efter applicering av de tumorigena kemikalierna i aceton är typiskt men annars djuren bör inte visa några tecken på obehag. Vägning regelbundet (t. ex. 2x en månad) hjälper till att utvärdera djurens välfärd. - Använd DMBA och TPA, båda utspädda i aceton. Den arbetande koncentrationen av DMBA är 250 g/L. En dos för ett djur är 50 μg DMBA i 200 μL aceton. Beståndets koncentration av TPA är 125 g/L och behandlings koncentrationen 25 g/L. En TPA-dos för ett djur är 5 μg i 200 μL aceton.
Försiktighet: dmba är skadligt vid förtäring och kan orsaka cancer. Aceton avdunstar snabbt och är brandfarlig. Det kan orsaka yrsel och irritera ögonen. Använd en andningsmask och/eller arbeta under ett vakuumflöde. Byt handskar efter hantering av någon av dessa kemikalier. Individuellt ventilerade burar förhindra spridningen av kemikalierna under huset av mössen. Efter applicering, samla pipettspetsarna som används för hantering av DMBA och kassera som farligt avfall.
Anmärkning: dmba måste skyddas mot ljus. Den utspädda TPA förvaras i-20 ° c, företrädesvis skyddad från ljus. - Anskaffa följande utrustning: en skala, en vanlig rakapparat för päls, pipetter och tips av lämplig storlek, en vanlig linjal, en digitalkamera, ett anteckningsblock och en penna eller en dator för registrering av papillom, ett inhalerat anestesisystem eller en mus med en öppning på bak toppen, och ett koldioxid narkos system för att offra möss.
2. hudpapillom induktion och befordran
- Raka ryggen huden och väg djuret. Senare, raka huden när det behövs men inte vid tidpunkten för den kemiska exponeringen.
Obs: var försiktig när du rakar runt papillom och undvika att göra några nedskärningar på huden. Väg varje djur var 2 veckor att märka någon potentiell viktminskning. - Applicera 50 μg DMBA i 200 μL aceton lokalt på det rakade området med hjälp av en pipett 48 h efter rakning av pälsen. Om det behövs, begränsa djuret med hjälp av lätt inhalationsanestesi eller en mus.
- Efter 7 dagar, ge den första TPA-dosen. Applicera 5 μg TPA i 200 μL aceton topiskt med pipett 2x en vecka, företrädesvis måndag och torsdag eller tisdag och fredag.
- Räkna, spela in och fotografera papillom varje vecka. En påtaglig massa som är större än 1 mm i diameter anses vara en papillom om den stannar längre än 1 vecka. Markera varje enskild papillom på en karta och lista dess storlek varje vecka. Lagra digitala fotografier.
3. djuroffer och provinsamling
- Fortsätt behandlingen tills tumörresponsen når en platå. Generellt, papillom bördan väntas öka 10 – 20 veckor efter inledandet, beroende på vilken mus stam som används. Platån väntas i 15 – 20 veckor. En liten del av papillom (under 3%) kan utvecklas till SCCs inom 20 – 50 veckor2.
- Offra djuren 24 h efter den sista TPA ansökan. Använd koldioxid narkos med cervikal dislokation eller annan lämplig metod.
- Beroende på forskningsfråga, samla lämpligt provmaterial från djuren30,31.
- Ta till exempel blodprov före uppoffring och separera plasman.
- Skär bitar av huden för immunohistokemi (IHC) färgning (t. ex., hematoxylin och eosin, prolifererande eller inflammatoriska celler).
- Använd biopsi stansar för att samla in hud bitar med antingen papillom vävnad eller icke-papillom (behandlad) hud för genuttryck (t. ex., qPCR) och/eller protein analyser (t. ex., Western blot eller ELISA).
- Samla en bit av mjälten och hud-dränerande lymfkörtlar för flödescytometri analys om mer detaljerad analys av immunceller populationer önskas. Du kan också separera epidermal och dermal lager för ytterligare analyser.
4. statistik
- Rita en Kaplan-Meier överlevnads kurva av papillom-fri tid och använda mantel-Cox log-rank test för överlevnad. Rita en linjär kurva av antalet papillom per vecka. Eftersom det här är räknardata använder du en icke-linjär regressionsmodell. Konsultera en statistiker om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det huvudsakliga resultatet är överlevnad (dvs, papillom fri) tid mellan behandling eller genotyp grupper. Det sekundära utfallet är antalet papillom per vecka i varje grupp (figur 2). De förväntade resultaten är en statistiskt signifikant skillnad i papillom ledig tid och i antalet papillom mellan experimentella (två eller flera) grupper. Det rekommenderas att räkna antalet papillom och rita en kurva under befordran (TPA) fas för att få en uppfattning om skillnaderna mellan grupperna i det skedet. Om du avslutar experimentet för tidigt kan det dölja en statistiskt signifikant skillnad.
Figur 2: de viktigaste resultaten av den DMBA-TPA-inducerad hud carcinogenes modell. Representativa bilder av papillom på mus huden och de två viktigaste resultaten. Data kombinerades från fyra separata experiment. Experiment med Balb/C och C57BL/6-möss utfördes separat. A ) en överlevnadsplan för papillom fri tid. Streckad linje = Balb/c och heldragen linje = C57BL/6. (B) Genomsnittligt antal papillom per mus. Streckad linje = Balb/c och heldragen linje = C57BL/6. Felstaplar = SEM. (c) en Balb/C-mus med papillom vid 11 veckor efter dmba-behandling. D) en C57BL/6-mus med papillom 11 veckor efter behandling med dmba. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Histologi, mRNA, och cellulära och proteinanalys kan utföras för att utforska mekanismerna bakom de observerade skillnaderna. Till exempel, histologiska analyser är lämpliga för att studera strukturen av papillom, morfologi i huden (epidermal och dermal tjocklek), olika biologiska processer (proliferation, apoptos, angiogenes), eller infiltration av immunceller32 (figur 3). Huden är idealisk för tillförlitlig kvantifiering av morfologiska och IHC-parametrar genom State-of-Art bildanalys system30,31,32,33. Gen-och proteinuttryck från (papillom) hudprover kan lätt studeras med standardmetoder30. Flödescytometri är ett användbart verktyg för analys av olika immun cells populationer av mjälte och hud-dränerande lymfkörtlar, som tidigare beskrivits30. Valet av analysmetoder beror på forskningsfrågan och måste övervägas innan experimentet inleds.
Figur 3: histologisk analys av inflammatorisk cell infiltration i DMBA-TPA-modellen. Representativa histologiska tvärsnitt från PFA-fast paraffin-inbäddade hud i DMBA-TPA-modellen. Hudpartier färgas med en makrofag markör F4/80 (brun). Skalstreck = 200 μm. (a) endast några få F4/80 positiva makrofager sågs i normal, obehandlad hud. (B) makrofaginfiltration i dermis var uppenbar i det tidiga skedet av cancer befordran, vid 2 veckor och 36 h efter den andra TPA-administrationen. Också, epidermal hyperproliferation sågs vid 2 veckor, som framgår av förtjockning av epidermis. (C) icke-papillom hud vid 19 veckor visade fortfarande en anmärkningsvärd infiltration av makrofager. Den stark ackumulering av makrofager sågs under papillom i dermis hos de dmba-TPA-behandlade djuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DMBA-TPA-inducerad hudcancer är en av de mest använda cancer modeller eftersom det är mycket reproducerbara och ger information om tumör progression från initiering till malignitet. Den viktigaste resultatmåttet, papillom formation, är lätt och tillförlitligt kvantitativ. Modellen behandlar både tumör initiering (tumör-fri överlevnad) och progression (tumör nummer och storlekar) samtidigt. Modellen lämpar sig för att studera olika föreningar, såsom potentiella Therapeutics, och effekterna av enskilda gener på tumörprogression hos genetiskt modifierade djur. Vid tillämpning av modellen för en viss stam, är det tillrådligt att studera den befintliga litteraturen för att uppnå en uppfattning om hur stammen reagerar i modellen (t. ex. att ta reda på hur snabbt den första papillom kommer att visas). När du använder genetiskt modifierade möss, användning av vilda typ littermates rekommenderas alltid. Användningen av potentiella ytterligare kontroller, såsom att ersätta antingen DMBA eller TPA eller båda av aceton, är mycket diskutabel, eftersom det är känt att ta bort antingen DMBA eller TPA eller invertera deras administration order är högst osannolikt att resultera i induktion av papillom tillväxt34. När det är viktigt att studera tumör initiering (dvs., genom administrering av DMBA ensam), det kan uppnås genom att offra djuren efter DMBA-dosen. När man studerar effekten av en enskild gen i en transgen eller knockout inställning, är det rekommenderat att ta prover från obehandlade djur för att upptäcka eventuella skillnader som kan finnas innan tumör bildning mellan genetiskt modifierade och vilda typ stammar30,31.
Även om DMBA-TPA-modellen är relativt enkel att genomföra tekniskt, är exakt timing avgörande för framgång. Tillämpningen av DMBA och regelbunden tillämpning av TPA är båda avgörande för tumörutveckling34. En noggrann veckovis undersökning av papillom är viktigt att samla in alla data. Det måste noteras att vissa behandlingar eller genetiska bakgrunder kan orsaka papillom att växa och senare krympa eller ens försvinna30. Ibland, andra noncancerous lesioner och SCCs uppstår. I detta fall rekommenderas Histologisk undersökning av lesionen. Ett annat kritiskt steg är att se till att TPA är den enda tumör promotor. Hud trauma inducerar produktionen av cytokiner som kan påverka tumör befordran2,34. Således måste den iatrogena skadade huden under rakning undvikas, och aggressiva, kämpar möss ska inhysas separat. Förutom striderna är även andra aspekter av djurens välbefinnande viktiga. Viktminskning, tråkig och trassliga päls, och apatiska beteende är tecken på obehag. Obehaget är inte bara en etisk fråga, eftersom negativ energibalans hämmar tumörtillväxt34.
DMBA-TPA-modellen ger möjlighet till många modifieringar. Eftersom vissa stammar är kända för att vara känsligare än andra, gör ett noggrant val schemaläggning experimentet och justera mängden och frekvensen av TPA ansökan18,35. Modellen används främst för att utveckla hudtumörer, men lokal applicering till mag-tarmkanalen är ett alternativ36. Dessutom har en modifierad version av modellen använts för att studera tumörutveckling i luftstrupen37. Eftersom tumörutveckling kan regleras med DMBA och TPA applikationer, modellen gör det möjligt att studera resultaten efter ändring av miljöaspekter såsom diet och dygnsrytm38. Genom att separera tumör initiering (DMBA) och befordran (TPA), modellen gör det möjligt att studera dessa två processer självständigt. Till exempel, offra möss efter dmba behandling tillstånd att studera mekanismen för behandling eller effekten av en gen av intresse i tumör initiering2,34. För att studera de tidiga händelserna i tumören initiering och befordran, djur kan offras vid en tidig tidpunkt. Exempel: prover kan samlas in kort efter den andra TPA-administrationen (t. ex. 3 h, 12 h, 36 h eller 48 h efter)30,31. Det är också värt att notera att den klassiska DMBA-TPA två-stegs carcinogenesen modellen kan ändras med hjälp av olika kemikalier eller genom att använda "tredje" kemikalie. Dessa granskas av Abel et al2.
DMBA-TPA-modellen har använts i årtionden för olika ändamål34. Det har använts för att studera effekterna av olika Therapeutics24,25,26 och gener31,32,39,40 men också för att studera Nutrition27, dygnsrytmen38, och utvecklingen av diagnostiska verktyg41. Eftersom tumörerna bildas från huden, ger modellen en unik möjlighet att samla tumörvävnadsprover vid olika stadier av progressionen21. När nya kemopreventiva medel eller immunmodulerande läkemedel införs, är det tillrådligt att först samla in data om hur stammen har reagerat i DMBA-TPA-modellen i tidigare studier. Om det inte finns, rekommenderas en förstudie utan det potentiella terapeutiska medlet för att bestämma tidpunkten och antalet papillom samt variansen i dessa parametrar. Befintliga data från publicerade studier kan också bidra till att bestämma doseringen av den testade substansen24,27, men om den inte är tillgänglig, med hjälp av en seriell utspädning av den testade substansen gör det möjligt att utvärdera dosresponsen av agenten studerade25,26.
Inflammation är viktigt för mänsklig tumorigenes, eftersom det är involverat i alla faser av tumör progression: inledandet, befordran, och omvandlingen till malignitet42,43. Den kemiskt inducerade hud carcinogenes modellen är en inflammation-driven carcinogenes modell. Pro-inflammatorisk cytokinrespons och infiltration av inflammatoriska celler till den behandlade huden är redan uppenbara i den tidiga fasen av modellen. De första infiltrerande cellerna är neutrofiler, följt av ackumulering av makrofager, T-celler, etc.30,31. Dessa celler skapar en inflammatorisk mikromiljö i huden, och ett kors samtal mellan inflammatoriska och epidermal celler initieras, vilket leder till produktion av cytokiner, chemokiner och prostaglandiner som driver tumör initiering och tillväxt lokalt. Eftersom DMBA-TPA-modellen är en inflammationsstyrd modell, innehåller den inte några andra aspekter av klinisk cancer. Även om det är känt att SCCS så småningom kan orsaka metastaser i dmba-TPA-modellen, endast en liten del av papillom utvecklas till SCCS2,23. Följaktligen, metastaser är ett sällsynt inslag i DMBA-TPA-modellen, även om vissa känsliga utavlade bestånd såsom CD-1 eller SENCAR kan ha en ökad sannolikhet för att utveckla metastaser44. Utseendet på SCC anses ofta vara en djurskydds fråga och därmed ett Endpoint kriterium. Därför, trots förekomsten av metastaser i modellen, några andra modeller såsom transplantation eller genetiskt modifierade modeller är mer lämpade för att studera metastaser45. En annan begränsning av modellen är att det kräver en yta för att tillämpa kemikalierna. Således är att studera cancer progression i ett specifikt inre organ ur tillämpningsområdet för modellen.
En annan vanlig hudcancer modell är UV-strålningen modell46. Modellen är jämförbar med DMBA-TPA-modellen eftersom ingen av dessa två modeller behöver celltransplantation eller genetisk modifiering för att orsaka cancer. Den grundläggande skillnaden mellan modellerna är att UV-strålningen modellen inducerar aggressiv SSC formation, medan tumör resultatet i DMBA-TPA-modellen är i allmänhet godartad papillom. Om UV-strålning kombineras med tillämpning av kemiska carcinogener eller i mus stammar med en genetisk bakgrund som gör stammen mottagliga för cancerutveckling, även melanom bildas kan äga rum. De vanligaste mutationerna i UV-strålningsmodellen inaktiverar p53-genen, en avgörande tumör suppressor-gen hos människor46, medan de vanligaste mutationerna i DMBA-TPA-modellen aktiverar HRAS-genen23. UV-strålningen orsakar också immunsuppression46,47, som kan vara en confounding faktor när man studerar aspekter av immunförsvaret. Men dessa två modeller fungerar också i kombination. UV-strålning kan användas som ett befrämjande medel med DMBA eller som initierande medel med TPA46.
En rimlig fråga är om DMBA-TPA-modellen härmar mänsklig cancer. En liten andel av papillom utvecklas till SCCs. Icke desto mindre, det premaligna stadiet av humant SCC är aktinisk keratos, och det skiljer sig från papillom bildandet ses i modellen. Fortfarande, papillom formation liknar modellen detekteras hos människor som behandlats för melanom med vemurafenib. Detta tyder på att de HRAS-muterade stamceller som är nödvändiga för carcinogenes i DMBA-TPA-modellen finns också på mänsklig hud34. Dessutom rapporteras det att upptaget av 2-deoxy-2-[18f]-fluoro-D-glukos (18f-FDG) papillom och mikroinvasiv SCCS är högre än i den omgivande huden men inte lika hög som i en helt invasiv SCC, vilket återspeglar likheten mellan premaligna stadier41. Om du använder DMBA-TPA-modellen för toxicitet utvärdering, måste man komma ihåg att upprepning av exponeringen har en stor effekt på tumörfrämjande34. Åtminstone några av de molekylära mekanismerna är gemensamma för modellen och mänsklig hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (bidrag 25013080481 och 25013142041 (I.J.), 286377 och 295814 (M.P.), 287907 (tj)), Päivikki och Sakari Sohlberg Foundation (M.P., tj), finska Medical Foundation (T.P.), den konkurrensutsatta statliga forskningen Finansiering av expert ansvarsområdet vid Tammerfors universitetssjukhus (Grant 9V049 och 9X044 (M.P.), 9X011 och 9V010 (tj)), den konkurrensutsatta statliga forskningsfinansieringen av expert ansvarsområdet i Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., tj), Tampere tuberculosis Foundation (I.J., M.P., tj), Finlands Kulturstiftelse (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) och stiftelsen Emil Aaltonen (T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
![Kemisk-inducerad hud carcinogenes modell med Dimetylbenz [a] antracen och 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetat (DMBA-TPA)](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/60445.jpg)
