Summary
وتخلق الشعاب المرجانية نظما إيكولوجية للتنوع البيولوجي هامة لكل من البشر والكائنات البحرية. ومع ذلك، ما زلنا لا نفهم الإمكانات الكاملة ووظيفة العديد من الخلايا المرجانية. هنا، نقدم بروتوكولاً تم تطويره لعزل ووسم وفصل مجموعات الخلايا المرجانية الحجرية.
Abstract
الشعاب المرجانية مهددة بسبب الضغوطات البشرية المنشأ. قد تحدث الاستجابة البيولوجية للشعاب المرجانية لهذه الضغوطات على المستوى الخلوي ، ولكن الآليات غير مفهومة بشكل جيد. للتحقيق في استجابة المرجان للضغوط، نحتاج إلى أدوات لتحليل الاستجابات الخلوية. على وجه الخصوص، نحن بحاجة إلى الأدوات التي تسهل تطبيق المقالات الوظيفية لفهم أفضل لكيفية تفاعل مجموعات الخلايا مع الإجهاد. في الدراسة الحالية، نستخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين (FACS) لعزل وفصل مجموعات الخلايا المختلفة في الشعاب المرجانية الحجرية. يتضمن هذا البروتوكول: (1) فصل أنسجة المرجان عن الهيكل العظمي، (2) إنشاء تعليق خلية واحدة، (3) وضع علامات على الخلايا المرجانية باستخدام علامات مختلفة للقياس الخلوي للتدفق، و(4) استراتيجيات الجاتوز وفرز الخلايا. ستمكن هذه الطريقة الباحثين من العمل على الشعاب المرجانية على المستوى الخلوي للتحليل والمقالات الوظيفية ودراسات التعبير الجيني لمجموعات الخلايا المختلفة.
Introduction
الشعاب المرجانية هي واحدة من أهم النظم الإيكولوجية على وجه الأرض. وهي تيسر التنوع البيولوجي من خلال توفير موائل حيوية للأسماك واللافقاريات، وهي حاسمة لاستدامة المجتمعات البشرية المنشأ عن طريق توفير الغذاء وسبل العيش الاقتصادية من خلال السياحة1. كباني رئيسي للشعاب المرجانية، والحيوان المرجاني (فيلوم: Cnidaria) يساعد أيضا المجتمعات الساحلية من خلال إنشاء أطر كربونات الكالسيوم الكبيرة التي تخفف من الأضرار الناجمة عن الموجة والعواصف2.
الشعاب المرجانية كبالغين هي الحيوانات sessile التي تستضيف مجموعة واسعة من الشركاء الإندوسيفي، بما في ذلك الفيروسات، archaea، البكتيريا، البروتيين، الفطريات، وأبرزها، أعضاء الأسرة اللادغالي dinoflagellate سيمبيدياسي3. يمكن أن تسبب التغيرات في البيئة اختلالات في هذا المجتمع، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى تفشي الأمراض وتبييض المرجان حيث يتم طرد السيمبيدياسية التكافلية من مستعمرة المرجان، وبالتالي القضاء على المصدر الرئيسي للتغذية للشعاب المرجانية. كل من هذه السيناريوهات غالبا ما يسبب وفاة المضيف المرجان4,5,6. وتؤدي آثار الضغوط اتّسبة من صنع الإنسان، مثل التغير المناخي السريع، إلى تسريع أحداث موت المرجان الجماعي، مما يؤدي إلى انخفاض عالمي في عدد الشعاب المرجانية7.
وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من الطرق المختلفة للمساعدة في التخفيف من فقدان الشعاب المرجانية. وتشمل هذه الأساليب زراعة الشعاب المرجانية على الشعاب المرجانية القائمة، والعبور الجيني باستخدام الأنماط الجينية المتسامحة حراريا، والتلاعب الخلوي بالمجتمعات الميكروبية والتكافلية المستضافة داخل المرجان8،,9. على الرغم من هذه الجهود، لا يزال الكثير غير معروف حول تنوع الخلايا المرجانية وظيفة الخلية10،11،12،13. من الضروري فهم شامل لتنوع نوع الخلايا المرجانية ووظيفة الخلية لفهم كيفية تعامل الكائن المرجاني في ظل ظروف معيارية ومرهقة. وستستفيد الجهود الرامية إلى تحقيق أقصى قدر من الكفاءة في الترميم والحفظ من تعزيز فهم كيفية اقتران تنوع الخلايا ووظيفة الجينات.
وقد ركز العمل السابق على تنوع الخلايا ووظيفتها في المقام الأول على الدراسات النسيجية والأنسجة الكاملة الحمض النووي الريبي أخذ العينات14،15،16،17. للحصول على مزيد من التفاصيل حول وظيفة نوع خلية محددة في الشعاب المرجانية ، يجب أن تكون هناك طرق لعزل مجموعات محددة من خلايا المرجان الحية. وقد تم ذلك بنجاح في الكائنات الحية النموذج غير الكلاسيكي عن طريق فرز الخلايا المنشطة فلورسينس (FACS) تدفق تكنولوجيا القياس الخلوي18. يستخدم FACS مزيجًا من الليزر الذي يتم ضبطه على أطوال موجية مختلفة لقياس الخصائص الخلوية الذاتية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة مثل حجم الخلية النسبية وحبيبات الخلية والفلورسب. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم وضع علامة على الخلايا بواسطة مركبات تحمل علامة فلورية لقياس خصائص محددة ومطلوبة18،19.
حتى الآن، وتطبيق تدفق قياس الخلايا الخلايا المرجانية كان أساسا لتحليل سيمبيانياسيا تكافلي وغيرها من السكان البكتيرية من خلال الاستفادة من الفلور الفلورالطبيعية القوية20،21،22. كما استُخدم نظام مراقبة الشعاب المرجانية لتقدير حجم الجينوم المرجاني باستخدام إشارة علامة الحمض النووي الفلورية مقارنة بخلايا الكائنات الحية النموذجية المرجعية23،,24. ويوفر التطبيق الفعال للنظام الميداني للخلايا الدقيقة ثلاث أدوات متميزة مفيدة لدراسات بيولوجيا الخلايا: 1) الوصف المورفولوجي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) الوصف الوظيفي والوظيفي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة؛ (2) وصف وظيفي وعملي للخلايا المفردة 2) تحديد وفصل وعزل مجموعات خلايا محددة لدراسات المصب؛ و 3) تحليل المقالات الوظيفية على مستوى الخلية الواحدة.
ولا يزال تطوير وتطبيق مختلف العلامات الفلورية الخارجية لدراسة الخلايا المرجانية غير مستكشفتقريبا. قد تتضمن هذه العلامات البروتينات الموسومة، أو ركائز الموسومة للإنزيمات، أو استجابات الفلورسنت للمركبات الأخرى. يمكن استخدام هذه العلامات لتحديد أنواع الخلايا التي لها خصائص فريدة، مثل تمييز الخلايا التي تنتج كميات مختلفة من ميزة مقصورة خلوية محددة، مثل الليسوسوماس. مثال إضافي هو استخدام الخرز المسمى الفلورسنت لتحديد وظيفيا الخلايا المختصة لبلع، أو ابتلاع مسببات الأمراض المستهدفة25. ويمكن بسهولة تحديد مجموعات الخلايا النشطة في استجابات المناعة من قبل FACS بعد ابتلاع هذه الخرز المطبقة خارجيًا. في حين تتطلب الطرق النسيجية التقليدية الأنسجة المحفوظة وساعات عديدة لتقريب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لابتلاع النحل ، يمكن إجراء فحص وظيفي قائم على FACS لابتلاع مسببات الأمراض بسرعة نسبية على الخلايا الحية المعزولة. بالإضافة إلى دراسة الاستجابات الخاصة بالخلايا للإجهاد ، فإن هذه التكنولوجيا لديها القدرة على توضيح التعبير الخاص بالجينات وإلقاء الضوء على التاريخ التطوري والتنموي لأنواع الخلايا الفريدة تمامًا للcnidarians ، مثل الكاليكوبلاس والخلايا العصبية.
في الآونة الأخيرة، قمنا بإجراء فحص مكثف لأكثر من 30 علامة خلوية أسفرت عن تحديد 24 علامة قادرة على وضع علامات على الخلايا المرجانية، 16 منها مفيدة للتمييز بين السكان الفريدين18،مما يجعلها مجموعات من التمايز (CD). هنا نحن وصف عملية عزل الخلايا المرجانية في البوتشيبوروا داميكورنيس من إزالة الخلايا من الهيكل العظمي كربونات الكالسيوم إلى تحديد وعزل مجموعات خلايا محددة مع FACS(الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تفكيك الأنسجة من الهيكل العظمي المرجاني عن طريق البخاخة والضاغط
ملاحظة: تنفيذ الخطوات على الجليد وحماية اليدين مع قفازات.
- تجميع عدة البخاخة عن طريق ربط ضاغط الهواء، خرطوم، والبخاخة(الشكل 2). تعيين مقياس الضغط بين 276-483 كيلو باسكال.
ملاحظة: الضاغط الموصى به وخرطوم الهواء المستخدمة في هذه الدراسة كان مسبقا إلى أقصى ضغط من 393 كيلو باسكال. استخدام خارج هذا النطاق 276-483 كيلو باسكال قد يؤدي إما إزالة الخلايا غير كافية من الهيكل العظمي أو تمزق أغشية الخلية. قد يختلف هذا النطاق لكل نوع وقد يتطلب اختبار قابلية البقاء. ويمكن إجراء اختبار قابلية البقاء مع مجموعة فرعية من الطين الخلية مع مقياس الهيموكيستومتر بسيطة و4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) فحص استبعاد الصبغة, تصور على المجهر المركب. - إعداد 100 مل من الوسائط تلطيخ الخلية في autoclaved، حاوية زجاجية معقمة بإضافة 33 مل من محلول سالين معزل الفوسفات 10x (PBS؛ بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) إلى تركيز نهائي قدره 3.3x، 2 مل من مصل عجل الجنين (FCS؛ الحرارة المعطلة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) إلى 2٪ من الحجم الإجمالي، و2 مل من 1 M HEPES المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي من 20 MM. ثم أعلى قبالة في 100 مل مع الماء المعقم.
ملاحظة: تم اختيار تركيز PBS 3.3x لمحاكاة ملوحة مياه البحر، كما هو موضح في Rosental وآخرون18. وينبغي تعديل هذا التركيز لمراعاة الأنواع الموجودة في بيئات أخرى لمحاكاة ملوحة هذه الأنواع. - نقل 10 مل من الوسائط تلطيخ الخلية إلى زجاجة البخاخة (المسمى "F" في الشكل 2)وإرفاق غطاء محول لموصل البخاخة.
ملاحظة: قد تتطلب الشظايا والأنواع الأكبر مع طبقات الأنسجة الأكثر سمكًا المزيد من الوسائط لإزالة الأنسجة الكافية. - بالنسبة للأنواع المرجانية المتفرعة المثبتة هنا، استخدم قاطع العظام لقص أو قطع جزء من المرجان بطول 3-5 سم تقريبًا أو 4 سم2 في المنطقة.
ملاحظة: يجب أن يكون الجزء واضحًا من الطحالب الماكرووغيرها من الكائنات متعددة الخلايا لأنه قد لا تتم إزالتها من العينة إلى المصب وسوف تلوث العينة أثناء عمليات تحليل وفرز FACS. جزء 1 سم من P. damicornis يعطي ما يقرب من 2-10 × 106 خلايا بعد التصفية وتلطيخ والغسيل. - ضع الجزء المرجاني داخل كيس تجميع بلاستيكي واستخدم البخاخة لرش الوسائط تلطيخ الخلية على المرجان(الشكل 2). مواصلة هذه العملية حتى يتم كشف معظم الهيكل العظمي. قم بإزالة الهيكل العظمي المتبقي من حقيبة التجميع.
2- انفصال الخلايا عن الأنسجة المرجانية
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد وحماية اليدين مع قفازات.
- تصفية الطين الخلية من خلال مصفاة خلية النايلون 40 ميكرومتر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: قد تكون أحجام شبكة مصفاة الخلايا المختلفة أكثر ملاءمة للأنواع المختلفة. ومع ذلك، قد تؤدي أحجام أكبر إلى عدم كفاية انفصال الأنسجة بسبب مرور الحطام وكتل الخلايا.- للعينات ذات طبقات المخاط السميكة، استخدم المكبس المعقم من حقنة بلاستيكية 1 مل وطحنبلطف ضد مرشح لتفريق كتل ومساعدة الخلايا تمر من خلال مصفاة. شطف مصفاة والمكبس مع خلية تلطيخ وسائل الإعلام في أنبوب الطرد المركزي.
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية في 450 × ز لمدة 5 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط تلطيخ الخلية.
3. تلطيخ الخلية
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد وحماية اليدين مع قفازات. البقع الواردة في هذا البروتوكول هي لأغراض التمثيل. البقع البديلة سوف تتطلب تركيزات مختلفة وأوقات الحضانة.
- نقل 500 ميكرولتر من الخلايا التي أعيد تعليقها إلى أنبوب مستدير من أسفل 5 مل وتوضع جانباً كعينة تحكم. لا تضيف وصمة عار إلى هذا aliquot.
- إلى تعليق الخلية المتبقية ، أضف 0.42 ميكرولتر من 12 مل DAPI صبغة الجدوى(جدول المواد)، 1 ميكرولتر من 5 ميكرومتر أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) وصمة عار(جدول المواد)، و 0.1 ميكرولتر من 0.2 ميكرومتر وصمة عار ليسوسوم(جدول المواد). مابيت جيدا لخلط واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام لمنع التبييض الضوئي.
ملاحظة: يستخدم DAPI في هذا المثال للعمل كصبغة الحمض النووي وصبغة الجدوى لجاتينغ التفاضلية للخلايا الميتة على جهاز FACS. وهذا يفترض أن DAPI يخترق الخلايا التي تُدفّت بسبب سلامة الغشاء. تنبعث من وصمة عار ROS الضوء في نطاق 520 نانومتر (أخضر)، في حين تنبعث من علامة الليسوسومي ة الضوء بسرعة 668 نانومتر (أحمر). - بيليه 500 ميكرولتر من الخلايا الملطخة عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية في 450 × ز لمدة 5 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من وسائط تلطيخ الخلايا. نقل إلى أنبوب جديد 5 مل مستديرة القاع وتخزينها على الجليد.
4. بدء تشغيل FACS
ملاحظة: قد تختلف الخطوات وفقا لطراز والنموذج من مقياس الخلايا بسبب الاختلافات في الليزر والقنوات. لهذا البروتوكول، تم استخدام مقياس للخلايا مع 405 و 488 و 535 و 640 نانومتر ليزر الطول الموجي. الفلاتر الواردة في هذا البروتوكول هي لأغراض التمثيل. قد تتطلب بقع الخلايا البديلة مجموعة مختلفة من الفلاتر وأشعة الليزر.
- ابدأ في إنشاء قالب مشروع جديد على برنامج الفرز واختر لوحة الليزر. للحصول على مزيج يمثل من البقع والفلورسين الطبيعي، حدد جميع أشعة الليزر الأربعة (405، 488، 535، و 640 نانومتر).
- حدد عوامل التصفية المناسبة لكل لون متوقع مُمثل في التجربة.
- للكشف عن انبعاثات DAPI والمساعدات في فصل الخلايا الحية والميتة، استخدم فلترمع ممر (BP) من 450/50 (نطاق 425-475 نانومتر) مثل مرشح DAPI أو Hoeschst أو Blue Pacific.
- للكشف عن الضوء المنبعث من إشارة ROS الخضراء، استخدم فلتر مع BP من 530/30 (نطاق الطول الموجي من 515-545 نانومتر) مثل مرشح متساوي الوثيوسيات الفلورية (FITC) أو مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP). هذا المرشح سوف يقيس تركيز ROS في كل خلية.
- أضف فلترًا إضافيًا مع BP من 670/30 (نطاق 655-685 نانومتر) مثل فلتر الوفيكوسيانين (APC) للكشف عن انبعاثات البقع الليسوسومية.
ملاحظة: ستسمح قناة APC بقياس النشاط البلعوم. هذه القناة سوف تكشف أيضا عن الفلورات الناتجة عن الطحالب التكافلية المرجانية من سيمبينياسيالأسرة. يمكن فصل هذه الإشارة باستخدام قناة إضافية لها طول موجي أطول من مرشح APC. - وتشمل مرشح يحتوي على BP من 780/60 (750-810 نانومتر النطاق)، مثل phycoerythrin الأكثر استخداما، مرشح السيمنين (APC-Cy7)، الذي يكشف عن انبعاث الفلور الحمراء البعيدة من سيمبيدينياسيوويساعد في عزلة الخلايا أبوسيمبية.
5. إعداد الجاتينغ FACS
ملاحظة: قد تختلف الخطوات وفقا ً لطراز مقياس الخلايا وبرنامج الاستحواذ إلى جانب مقياس الخلايا.
- على الشاشة التجريبية للمشروع من برنامج القياس الخلوي، قم بإنشاء مخطط مبعثر وحدد مبعثر ًا إلى الأمام (FCS) كمقياس للمحور X وتشتت الجانب (SSC) للمحور Y.
ملاحظة: يرتبط FCS مع حجم الخلية ويرتبط SSC مع التفاصيل. وهذا سيسمح لإزالة معظم الحطام، لأن معظمها سيكون أصغر في الحجم من الخلايا السليمة. - تعيين المحاور إلى إما لوغاريتمي أو المقاييس ثنائية الأسي، كما أحجام الخلايا والحبيبية قد تختلف من قبل عدة أوامر من الحجم(الشكل 3A)،لا سيما في الشعاب المرجانية.
6 - تحليل القوات المسلحة الكونغولية وعزل الخلايا
ملاحظة: قد تختلف الخطوات وفقاً لجعل ونموذج مقياس الخلايا وبرنامج الاستحواذ المقترن.
- ضع عنصر التحكم (أي المجموعة الفرعية للخلية غير الملطخة) في غرفة العينة للمقياس الخلوي وابدأ عملية القراءة. عندما يبدأ الكمبيوتر في تلقي البيانات من كل خلية أو حدث، ستبدأ النقاط في الظهور على المخطط المبعثر. لإزالة أي حطام اليسار في غرف مقياس الخلايا من التجارب السابقة، والسماح ما يقرب من 30 ق لتمرير قبل البدء في التحليل.
- في المؤامرة مبعثر، وضبط أنبوب photomultiplier (PMT) الجهد من أجل مركز النقاط.
ملاحظة: يتم استخدام الجهد PMT لتضخيم قوة إشارة الفوتوان التي يجري قياسها; إذا كان الجهد PMT ضعيفة جدا، سيتم قراءة عدد أقل من الخلايا، وإذا كان الجهد PMT قوية جدا، سيتم قياس الخلايا بالقرب من القيمة القصوى وأنواع مختلفة من الخلايا لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. يضمن الجهد الكافي PMT أن الأحداث التي يمكن تمييزها بشكل مستقل سوف تملأ المؤامرة مبعثر. فصل الحدث هو أسهل لتصور من خلال إسقاط لوغاريتمي أو المقاييس ثنائية الأسي على FSC وSSC المؤامرات مبعثر. - ابدأ بتسجيل الأحداث. للحفاظ على العينة، أوقف الحصول على البيانات مؤقتًا بعد قراءة ما يقرب من 15,000 حدث. وفي معظم الحالات، سيكون ذلك كافيا لتصور الأنماط السكانية الإجمالية للخلايا. تسجيل المزيد من الأحداث إذا تحليل وعزل مجموعات الخلايا الصغيرة المتخصصة.
- على الرسم البياني الأول من FSC و SSC، قم بإنشاء تحديد، أو بوابة، للخلايا حول علامة 102 وأعلى على محور X FSC. أي شيء تحت هذه العتبة هو من المرجح الحطام الخلوي. رسم البوابات مستطيلة، وهو خيار منتظم على تدفق برامج القياس الخلوي وجيدة لواضحة، مجموعات متميزة من الخلايا. بالنسبة لتجمعات الخلايا التي تأخذ شكلًا غير منتظم أكثر على المؤامرات المتناثرة، استخدم خيار الجاتين متعدد الأضلاع.
ملاحظة: يجب أن يختار الحد الأدنى من قطع 102 على التشتت الأمامي لأصغر الخلايا المرجانية ولكن قد يسمح تلوث الحطام. لتعديل هذا ، وزيادة الحد الأدنى من gating لتكون أكثر تحفظا. - إنشاء مخطط مبعثر جديد يعبر عن عامل تصفية DAPI على المحور X وعامل تصفية APC-Cy7 على المحور Y. للقيام بذلك، حدد البوابة للخلايا السليمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.4، انقر بزر الماوس الأيمن، وحدد الخيار لإنشاء مخطط مبعثر جديد. ضبط المحاور إما إلى اللوغاريتمي أو المقاييس ثنائية الأسي.
ملاحظة: الخطوات المطلوبة لإنشاء مؤامرة جديدة قد تختلف مع برامج برامج مختلفة. - الآن إزالة عينة التحكم من غرفة مقياس الخلايا واستبدال مع الخلايا الملطخة. السماح 30 s لتمرير قبل البدء في التحليل وتسجيل البيانات. سجل ما يقرب من 15000 خلية قبل التوقف.
ملاحظة: السكان (السكان) متميزة على الطرف الأعلى من مقياس APC-Cy7 هي تلك التي مع الفلور الحمراء العالية من سيمبيانياسي. لا توجد حاجة إلى وصمة عار لتصور هذه فواصل السكان، ويمكن أيضا أن ينظر إليها على تسجيل عينة التحكم(الشكل 3C). حدد للمجموعات السكانية للشعاب المرجانية فقط، تلك الأقل على المحور Y، لمزيد من التمايز. - إنشاء مؤامرة مبعثر جديد من الخلايا أبوسيمبيوتك لتصور تركيزات ROS (مرشح FITC) والخلايا الإيجابية إلى الليسوسومات (مرشح APC)، مرة أخرى باستخدام اللوغاريتمي أو المقاييس ثنائية الأسي.
ملاحظة: إذا كان هناك العديد من مجموعات الخلايا المتميزة التي هي aposymbiotic، يمكن تمييز كل واحد في مؤامرة مبعثر الخاصة بها(الشكل 3C، D). - قارن مجموعة العينة الملطخة بعنصر التحكم، وهي مجموعة فرعية غير ملطخة إما باستخدام التسجيل الأول لعينة التحكم أو إعادة إدراج مجموعة التحكم وإعادة تشغيلها. بوابة الأحداث التي هي فريدة من نوعها لمجموعة عينة ملطخة.
7 - فرز وجمع القوات المسلحة الكونغولية
ملاحظة: قد تختلف الخطوات وفقا ً لطراز مقياس الخلايا وبرنامج الاستحواذ إلى جانب مقياس الخلايا.
- مع مجموعة مختارة من الخلايا التي تم اختيارها لجمع، ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (التي تحتوي على 250-500 ميكرولتر من وسائط ثقافة الخلايا أو المخزن المؤقت للخلايا استنادًا إلى عدد الخلايا التي تم جمعها وطريقة تخزينها) في غرفة جمع مقياس الخلايا.
ملاحظة: مقياس التدفق الخلوي الممثل قادر على فرز أربع مجموعات سكانية مختلفة في كل مرة، ويمكن تكوين الجهاز لعقد مجموعة متنوعة من أجهزة التجميع، بما في ذلك أنابيب الطرد المركزي المختلفة و 96 لوحة بئر. - مرة واحدة في عداد الخلايا يبدأ في قراءة العينة وكمية مناسبة من الوقت قد مرت لطرد الحطام، والبدء في فرز السكان المطلوب وجمع في أي مكان من 20،000 الخلايا إلى عدة ملايين.
- لأكثر من 500,000 خلية، قم بضبط حجم وسائط ثقافة الخلايا أو المخزن المؤقت للتحلي، وحجم جهاز المجموعة.
- للدراسات في المختبر، قم بتخزين الخلايا على الجليد حتى توضع في حاضنة أو بيئة معقمة.
- للدراسات الجزيئية، إما البدء فورا في عملية عزل الحمض النووي / الحمض النووي / البروتين أو تجميد فلاش وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخراج.
- في كل مرة يتم فيها استخدام بقعة جديدة أو أنواع أو فرز ، قم بإجراء فحص النقاء على السكان المهمين عن طريق فرز ما لا يقل عن 20000 خلية ذات أهمية إلى 500 ميكرولتر من وسائط تلطيخ ، ثم إعادة تحليل الخلايا المصنفة والتأكد من أن الخلايا تتم قراءتها داخل البوابة المستخدمة في البداية للفرز(الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وعموما، فإن هذا البروتوكول مفيد لأنه ييسر تحديد وجمع مجموعات الخلايا المرجانية الحية التي يمكن استخدامها في التحليلات الوظيفية. بدأ سير العمل مع الفصل الميكانيكي للأنسجة المرجانية من الهيكل العظمي كربونات الكالسيوم الأساسي(الشكل 1). هذه هي واحدة من أهم الخطوات الأولية لأن تقنية غير سليمة يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات في الخلايا ويمكن أن تخلق كميات كبيرة من الحطام. لا ينصح الفصل الأنزيمي لأنه يمكن أن يؤدي إلى زيادة القص الأنسجة وارتفاع معدل وفيات الخلايا. الفصل الميكانيكي باستخدام البخاخة يقلل من هذه التحديات(الشكل 2)، والحد من متوسط وفيات الخلايا إلى ~ 10 ٪ (البيانات غير مبين). بعد فصل الأنسجة الميكانيكية بوساطة البخاخة من الهيكل العظمي ، تمت تصفية الطين الناتج إلى تعليق الخلية عن طريق الترشيح من خلال مصفاة الخلية. ثم تم تلطيخ تعليق الخلية مع الحمض النووي (DAPI) ، ROS ، وعلامات الليسوسوم وقراءتها من قبل مقياس الخلايا FACS. ثم وضعت استراتيجية للجاتينغ لعزل مجموعات خلايا محددة على أساس علامات الخلية المستخدمة. ثم تم فرز مجموعات الخلايا المسورة إلى أنابيب جمع(الشكل 1).
وعند تحليل العينات على مقياس الخلايا في القوات الجوية الكونغولية، اتخذت عدة خطوات لإزالة الأنقاض والخلايا الميتة من العينة. يمكن إزالة خلايا التكافل بشكل انتقائي إذا رغبت في ذلك بسبب الفلورات. أولاً، تمت إزالة الحطام والجسيمات الأخرى غير الخلوية التي لم تشترك في نفس الشكل أو الحبيبية مثل الخلايا المرجانية من التحليلات عن طريق إنشاء اختيار الجاتينغ على الأمام (الحجم) والجانب (التفاصيل) مبعثر(الشكل 3A). بعد ذلك ، تم استبعاد الخلايا الميتة من خلال مقارنة تعليق خلية التحكم غير الملطخة بالعينة الملطخة بـ DAPI والقناة الحمراء البعيدة ، ثم إيقاف الخلايا الإيجابية لتلطيخ DAPI العالي في العينة الملطخة(الشكل 3B، تعداد الخلايا P6). في موازاة ذلك، تمت إزالة الخلايا التي تستضيف الخلايا التي تستضيف الفلورسنت السيمبيدانياسيا عن طريق الجاتينغ ضد الخلايا مع إشارة عالية في القناة الحمراء البعيدة(الشكل 3B،APC-Cy7). بعد هذه العملية الجاتينغ المتكررة، تمثل الخلايا المتبقية للتحليلات مجموعات الخلايا المرجانية الحية السليمة التي تفتقر إلى السيمبيدياسيا.
ويمكن بعد ذلك تصنيف هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا عن طريق مقارنة عينات التحكم والعينات الملطخة عن طريق إضافة بقع خارجية لميزات مثل نشاط ROS و / أو المحتوى الليسوسوم(الشكل 3C). على سبيل المثال، كشف فحص البيانات على مرشحات تلطيخ الخلايا المرجانية من ROS وlysosome عن أربع مجموعات فرعية متميزة. كان لدى إحدى الخلايا إشارة منخفضة نسبيًا للمحتوى الليسوسومي (مرشح APC) وكان الثلاثة الآخرون لديهم إشارة عالية في المحتوى الليسوسومي ومجموعة من نشاط ROS (مرشح FITC)(الشكل 3C). يمكن فرز كل من هذه الفئات السكانية الفرعية بشكل فردي لتحليل المصب ، أو مزيد من التحليل وتحليلها في مجموعات فرعية أكثر سرية من خلال تقاطع الحجم ، والحبيبية ، والفلور ، و / أو محتوى الحمض النووي. في هذه الدراسة، تم استخدام الحمض النووي، ونشاط ROS، والمحتوى الليسوسومي لتحديد الخصائص العريضة للخلايا المرجانية. والأهم من ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول العام مع مجموعة من علامات الفلورسنت وكذلك تحقيقات الأجسام المضادة المحددة التي يمكن استخدامها بالتزامن لعزل مجموعات الخلايا المتخصصة ذات الأهمية مثل الخلايا الجذعية.
الشكل 1: سير العمل العام لعملية فرز الخلايا المرجانية. يتيح البروتوكول المميز إزالة خلايا الشعاب المرجانية من الهيكل العظمي للتلطيخ ، والتي يتم تشغيلها بعد ذلك من خلال مقياس الخلايا FACS ، وقياسها ، وتحليلها ، وعزلها إلى مجموعات الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إزالة الأنسجة والخلايا من الهيكل العظمي المرجاني. ضاغط الهواء(A)قوات الهواء وخلية تلطيخ وسائل الإعلام(F)من البخاخة(E)ويعمل على تفجير الأنسجة قبالة الهيكل العظمي المرجاني(C)ويخلق ملاط الخلية في الحقيبة(D). يتم التحكم في الحد الأقصى لضغط الهواء بواسطة مقياس الضغط(B)على ضاغط الهواء(A). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختيار الجاتينغ لخلايا المرجان الحية. (أ)عزلت الخلايا الحية من الحطام باستخدام قيمة مبعثرة أمامية أدنى قدرها 102. (ب)تم استخدام مرشح APC-Cy7 لتحديد الفلور الحمراء ، وفصل فعال من الخلايا المستضافة التكافلية ، في حين تم استخدام DAPI لتحديد الخلايا الإيجابية للغاية لتلطيخ الحمض النووي. تلك إيجابية للغاية بالنسبة للDAPI كانت مؤشرا على الخلايا الميتة والقاتلة. (C،D) واستخدمت علامات إضافية لنشاط ROS ومحتوى الليسوسوم لزيادة التمييز بين مجموعات الخلايا المرجانية المختلفة. تم إعادة تحليل كافة البيانات لاحقًا على FlowJo (v10) لإنشاء هذه الرسوم البيانية. التسمية السكانية المدرجة والنسبة المئوية تتوافق مع الصور المجهرية التي تم التقاطها من كل مجموعة من السكان(E). النسب المئوية الموضحة في كل قطعة هي من إجمالي الخلايا داخل تلك المؤامرة. أسفل شريط مقياس اليمين = 20 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فحص نقاء الخلايا التكافلية الفلورية المرتبطة بها. (أ)تم فرز الخلايا الإيجابية للفلورسينس على مرشح APC-Cy7 من عينة التحكم غير الملطخة. (ب)ثم أعيد تشغيل هذه المجموعة من الخلايا المصنفة على مقياس الخلايا وإعادة تحليلها في ظل نفس الظروف، مما يدل على نقاء 94٪. تم استخدام التشتت إلى الأمام (المحور X، FSC) لمحور الربط، ولكنه قابل للتبديل مع أي من المعلمات الأخرى. ويمكن تنفيذ نفس العملية على عينات ملطخة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تكييف هذا البروتوكول من Rosental et al.18 وتم تطويره لتحديد وعزل خلايا P. damicornis. وتركز المنهجية على عملية تصفية العينات لإزالة الحطام والخلايا غير القابلة للحياة والخلايا المستضافة من قبل السيمبيدياسية من خلال فحص العوامل الجوهرية للخلية، بما في ذلك حجم الخلية النسبي، وحبيبات الخلايا النسبية، وفلور الخلايا الذاتية، ووجود أغشية خلوية سليمة. ويمكن تطبيق هذه التقنيات على الأنواع المرجانية الأخرى. ومع ذلك، قد تختلف استراتيجيات الجات FACS بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع في خصائص مجموعة الخلايا.
وتكمن فائدة نظام مراقبة الشعاب المرجانية في فهم صحة المرجان في قدرته على استخدام عوامل جوهرية متنوعة للخلايا لتحديد الخلايا وعزلها على نحو متفاوت. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول الاستخدام الإضافي للتلطيخ الخلوي الخارجي للتمييز بين الخلايا المرجانية على أساس قابلية البقاء ، وتركيز أنواع الأكسجين التفاعلية ، والمحتوى الليسوسوم. ومن بين العلامات التجارية الثلاثين التي كانت تختبر سابقاً في روزنتال وآخرون18،فإن 24 خلية تحمل اسم P. damicornis، منها 16 علامة أنتجت إشارة تفاضلية، وهي مجموعات من التمايز تسمح باختيار المجموعات الفرعية للخلايا.
واحدة من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هو إزالة الأنسجة السليمة والتصفية لضمان أن يتم فصل كتل الأنسجة وعدم منع تدفق اللاميمتر التدفق. التعديل السليم للجهد PMT أمر بالغ الأهمية للكشف الدقيق وتحليل أحداث الكشف عن الخلايا المستقلة. بالمقارنة مع العمل السابق18، فإن عملية عزل الخلايا المرجانية من الهيكل العظمي الأساسي عبر البخاخة الميكانيكية تعطل يحسن بشكل كبير على طرق الكشط التقليدية عن طريق الحد من الحطام وتعظيم صلاحية الخلية (~ 90 ٪، الشكل 2 والشكل 3A)،وبالتالي تحسين التحليلات اللاحقة عن طريق الحد من ايجابيات كاذبة بسبب الضوضاء.
وتيسر المنهجية الموصوفة في هذه الورقة الفصل بين مجموعات الخلايا المرجانية من خلال الاختيار التفاضلي على تقاطع بين الخصائص المورفولوجية والوظيفية على مستوى لم يكن ممكنا من قبل. ومع وضع منهجيات FACS للخلايا المرجانية، أصبح من الممكن الآن اختيار مجموعات فرعية محددة من الخلايا لإنشاء ثقافات خلايا محددة، وكذلك للتحقق من الملامح اللاجينية واللاجينية المرتبطة بمجموعات فرعية محددة من الخلايا. تطبيق هذه المعلومات على نطاق رفيع سوف توفر نظرة ثاقبة في نوع الخلية، والسلوك، ووظيفة، ويمكن أن تكشف عن الخصائص المرتبطة تطور أنواع الخلايا cnidarian محددة مثل الكاليكوبلاس والخلايا cnidocytes. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المفيد تطبيق تكنولوجيا نظام مراقبة الشعاب المرجانية لتطوير مُساعدات الإجهاد والمؤشرات الحيوية في حماية الشعاب المرجانية المهددة بشدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وتود NTK أن تعترف بجوائز جامعة ميامي للأبحاث في العلوم الطبيعية والهندسة لتمويلها هذا البحث. BR تود أن تشكر أليكس وآن لاوترباخ لتمويل مختبر المناعة المقارنة والتطورية. تم دعم عمل BR من قبل أرقام مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF): 1416/19 و 2841/19، ومنحة أبحاث HFSP، RGY0085/2019. ونود أن نشكر زانا كوزهيكباييفا ومايك كونيلي على المساعدة التقنية. ونود أيضا أن نشكر جامعة ميامي، وكلية ميلر للطب تدفق الموارد المشتركة في مركز سيلفستر الشامل للسرطان للوصول إلى مقياس الخلايا FACS وشانون صايغ للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
