Summary
산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
산호초는 인위적 스트레스로 인해 위협을 받고 있습니다. 이러한 스트레스에 산호의 생물학적 반응은 세포 수준에서 발생할 수 있습니다,하지만 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다. 스트레스에 산호 응답을 조사 하려면, 우리는 세포 응답을 분석 하기 위한 도구가 필요. 특히, 우리는 세포 집단이 스트레스에 반응하는 방법을 더 잘 이해하기 위하여 기능적인 측정법의 응용을 촉진하는 공구가 필요합니다. 현재 연구에서는, 우리는 돌산호에 있는 다른 세포 인구를 격리하고 분리하기 위하여 형광 활성화 세포 선별 (FACS)를 이용합니다. 이 프로토콜은 다음을 포함한다: (1) 골격으로부터 산호 조직의 분리, (2) 단일 세포 현탁액의 생성, (3) 유세포 측정을 위한 다양한 마커를 사용하여 산호 세포를 표지하는 것, 및 (4) 게이팅 및 세포 선별 전략. 이 방법은 연구원이 분석, 기능 분석 및 다른 세포 집단의 유전자 발현 연구를 위한 세포 수준에서 산호에 작동하도록 가능하게 할 것입니다.
Introduction
산호초는 지구상에서 가장 중요한 생태계 중 하나입니다. 그들은 물고기와 무척추 동물에 대한 중요한 서식지를 제공함으로써 생물 다양성을 촉진하고 관광1을통해 음식과 경제적 생계를 제공함으로써 인류 공동체를 유지하는 데 중요합니다. 산호초의 주요 빌더인 산호동물(Phylum: Cnidaria)은 파도와 폭풍 피해를 완화하는 대형 탄산칼슘 프레임워크를 만들어 해안 지역사회를 돕습니다2.
산호는 성인으로서 바이러스, 고고학, 박테리아, 프로티스트, 곰팡이, 그리고 특히 조류 디노플라젤레이트 패밀리 심비오디니아과3의구성원을 포함하는 다양한 내분비파트너를 호스트하는 세실 동물이다. 환경의 변화는 종종 질병 발발과 공생 Symbiodiniaceae따라서 산호 식민지에서 추방되는 산호 표백으로 이어지는이 지역 사회에서 불균형을 일으킬 수 있습니다, 따라서 산호에 대한 영양의 주요 소스를 제거. 이 두 가지 시나리오는 종종산호 호스트4,5,,6의죽음을 일으킵니다. 급속한 기후 변화와 같은 인위적인 유발 스트레스의 영향은 대량 산호 사멸 사건을 가속화하여 산호초의 세계적인 쇠퇴로 이어지고 있습니다7.
최근에는 산호초 손실을 완화하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 기존 산호초에 산호의 식재, 열 내성 유전형을 사용하여 유전 횡단, 산호 내에서 호스팅 미생물 및 공생 지역 사회의 세포조작을포함8,9. 이러한 노력에도 불구하고, 산호세포의 다양성과세포기능(10,,11,,12,,13)에대해서는 아직 알려지지 않은 것들이 많다. 산호 세포 유형 다양성과 세포 기능에 대한 철저한 이해는 산호 유기체가 규범적이고 스트레스가 많은 조건에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 필요합니다. 복원 및 보존 효율성을 극대화하기 위한 노력은 세포 다양성과 유전자 기능이 결합되는 방식에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 것입니다.
세포 다양성 및 기능에 대한 이전 연구는 주로 조직학 연구 및 전체 조직 RNA 샘플링14,,15,,16,,17에초점을 맞추고 있다. 산호의 특정 세포 유형 기능에 대한 자세한 내용을 얻으려면, 살아있는 산호 세포의 특정 인구의 격리를위한 방법이 있을 필요가있다. 이는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 유세포 분석 기술18에의해 비고전적 모델 유기체에서 성공적으로 수행되었다. FACS는 상대적인 세포 크기, 세포 세분성 및 자동 형광과 같은 단일 세포 수준에서 다른 내인성 세포 특성을 측정하기 위해 다양한 파장으로 조정된 레이저의 조합을 이용합니다. 부가적으로, 세포는 특정, 원하는 특성 을 측정하기 위해 형광 표지 화합물에 의해 표시 될 수있다18,,19.
지금까지 산호세포에 대한 유세포분석의 적용은 주로 그들의 강하고 자연적인자가형광(20,,21,,22)을이용하여 공생공생과 및 기타 세균 집단의 분석을 위한 것이되었다. FACS는 또한 참조 모델 유기체 세포23,,24에비해 형광 DNA 마커 신호를 사용하여 산호 게놈 크기를 추정하는 데 사용되어 왔다. FACS의 효율적인 응용 프로그램은 세포 생물학 연구에 유용한 세 가지 뚜렷한 도구를 제공합니다 : 1) 단일 세포의 형태학적 및 기능적 설명; 2) 다운스트림 연구를 위한 특정 세포 집단의 식별, 분리 및 격리; 및 3) 단일 세포 수준에서 기능성 분석의 분석.
산호 세포의 연구를위한 다양한 외인성 형광 마커의 개발 및 적용은 거의 탐험되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 마커는 태그가 지정된 단백질, 효소에 대한 태그가 지정된 기질, 또는 다른 화합물에 대한 형광 반응을 포함할 수 있다. 이 마커는 리소좀같이 특정 세포 구획 특징의 다양한 양을 생성하는 세포를 강조하는 것과 같은 독특한 특성이 있는 세포 모형을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. 추가적인 예는 형광표지된 비드를 사용하여 식세포증또는 표적병원균(25)의침형성에 유능한 세포를 기능적으로 식별한다. 면역 반응에서 활성 세포의 집단은 외인성 적용 비드의 침몰 후 FACS에 의해 쉽게 식별 될 수있다. 전통적인 조직학적 방법은 비드 침윤에 대해 양성 세포의 백분율을 근사하기 위해 보존 된 조직과 많은 시간을 필요로하지만, 병원체 침윤에 대한 FACS 기반 기능 분석법은 고립 된 살아있는 세포에서 상대적으로 빠르게 수행 될 수 있습니다. 이 기술은 스트레스에 대한 세포 특이적 반응을 연구하는 것 외에도 유전자 특이적 발현을 명확히 하고 칼리코블라스트 및 자각세포와 같은 세포체에 완전히 고유한 세포 유형의 진화 및 발달 역사를 조명할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
최근에는 30개 이상의 세포 마커를 집중적으로 선별하여 산호 세포에 라벨을 붙일 수 있는 24개의 세포를 식별했으며, 그 중 16개는 고유 집단18을구별하는 데 유용하며, 이를 차별화(CD)의 클러스터로 만들었습니다. 여기에서 우리는 POCILlopora damicornis에 있는 산호 세포 격리의 프로세스를 FACS를 가진 특정 세포 인구의 확인 그리고 격리에 탄산칼슘 골격에서 세포를 제거하기에서 기술합니다(그림 1).
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Protocol
1. 에어 브러시와 압축기를 통해 산호 골격에서 조직의 해리
참고 : 얼음에 단계를 수행하고 장갑으로 손을 보호합니다.
- 에어 컴프레서, 호스 및 에어브러시를 연결하여 에어브러시 키트를 조립합니다(그림2). 압력 게이지를 276-483 kPa 사이로 설정합니다.
참고: 이 연구에 사용된 권장 압축기 및 공기 호스는 최대 압력 393kPa로 미리 설정되었습니다. 이 276-483 kPa 범위 의 외부 사용은 세포막의 골격 또는 파열에서 부적당한 세포 제거 귀착될 수 있습니다. 이 범위는 각 종에 따라 다를 수 있으며 생존 시험이 필요할 수 있습니다. 생존시험은 간단한 혈세포계와 4′,6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI) 염료 배제 분석법을 사용하여, 화합물 현미경상에서 가시화된 세포 슬러리의 서브세트로 수행될 수 있다. - 오토클레이브에 100 mL의 세포 염색 매체를 준비, 멸균 유리 용기는 10x 인산완충식염수(PBS; 칼슘 및 마그네슘 없음)의 33 mL를 최종 농도3.3배, 태아 송아지 혈청 2 mL(FCS; 30분 동안 56°C에서 불활성화된 열)을 총 부피의 2% 내지, 1 M HEPES의 2 mL의 최종 농도에 2 mL를 첨가하여 mPES의 최종 농도를 2m완충으로 하였다. 그런 다음 멸균 수로 100 mL에서 위로.
참고 : 3.3 x PBS 농도는 Rosental et al.18에서입증 된 바와 같이 해수의 살린도를 모방하도록 선택되었습니다. 이 농도는 그들의 살을 모방하기 위하여 그밖 환경에서 찾아낸 종을 위해 조정될 필요가 있습니다. - 셀 염색 매체 10mL를 에어브러시 병으로 옮기고(그림 2의"F"라고 표시)하고 에어브러시 커넥터의 어댑터 뚜껑을 부착합니다.
참고: 두꺼운 조직 층을 가진 더 큰 파편 및 종은 적당한 조직 제거를 위해 더 많은 매체를 요구할 수 있습니다. - 여기에서 시연된 분기 산호 종의 경우, 뼈 커터를 사용하여 산호 조각을 약 3−5cm 길이 또는 4cm2 면적에 잘라냅니다.
참고 : 이러한 샘플 다운 스트림에서 제거되지 않을 수 있으며 FACS 분석 및 선별 과정에서 샘플을 오염시킬 수 있기 때문에 단편은 macroalgae 및 기타 다세포 유기체의 명확해야합니다. P. 다미코니스의 1cm 조각은 여과, 염색 및 세척 후 약 2-10 x 106 세포를 제공합니다. - 산호 조각을 비닐 수집 백 안에 넣고 에어브러시를 사용하여 셀 염색 매체를 산호에 뿌린다(그림2). 대부분의 골격이 노출될 때까지 이 프로세스를 계속합니다. 컬렉션 가방에서 나머지 골격을 제거합니다.
2. 산호 조직에서 세포의 해리
참고 : 얼음에 모든 단계를 수행하고 장갑으로 손을 보호합니다.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 50 mL 원심 분리튜브로 40 μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 세포 슬러리를 필터링합니다.
참고: 다른 세포 스트레이너 메쉬 크기는 다른 종에 더 적합할 수 있습니다. 그러나, 더 큰 크기는 파편과 세포 덩어리의 통행 때문에 부적당한 조직 해리 귀착될 수 있습니다.- 두꺼운 점액 층이있는 표본의 경우 1 mL 플라스틱 주사기의 멸균 플런저를 사용하여 필터에 대해 부드럽게 갈아서 덩어리를 부수고 세포가 여과기를 통과하도록 돕습니다. 스트레이너와 플런저를 세포 염색 매체로 원심분리기 튜브에 헹구십시오.
- 펠렛 세포를 4°C에서 450 x g에서 5분 동안 5분 동안 펠트. 상류를 제거하고 세포 염색 매체의 1 mL에서 세포를 다시 중단한다.
3. 세포 염색
참고 : 얼음에 모든 단계를 수행하고 장갑으로 손을 보호합니다. 이 프로토콜에 등장하는 얼룩은 표현목적으로 사용됩니다. 대체 얼룩은 다른 농도와 배양 시간을 필요로합니다.
- 500 μL의 재부유 세포를 5 mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 대조군 샘플로 따로 둡니다. 이 알리쿼트에 얼룩을 추가하지 마십시오.
- 나머지 세포 현탁액에, 12 mM DAPI 생존 성 염료의 0.42 μL을 추가(재료의 표),1 μL 의 5 μM 반응성 산소 종 (ROS) 얼룩(재료의 표),0.2 μM 리소좀 얼룩의 0.1 μL(재료의 표). 파이펫잘 혼합하고 광 표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 배양.
참고: DAPI는 FACS 기계상에서 죽은 세포의 차동 게이팅에 대한 DNA 얼룩 및 생존 성 염료로서 작동하기 위해 이 예에서 사용된다. 이것은 DAPI가 막 무결성 때문에 죽어가는 세포를 관통한다고 가정합니다. ROS 얼룩은 520 nm 범위(녹색)에서 빛을 방출하고 리소좀 마커는 약 668nm(빨간색)에서 빛을 방출합니다. - 펠렛 500 μL은 4°C에서 450 x g에서 450 x g에서 원심분리하여 5분 동안 상구체를 제거하고 500 μL의 세포 염색 매체에서 펠릿을 재중단시켰다. 새로운 5 mL 라운드 바닥 튜브로 옮기고 얼음에 보관하십시오.
4. FACS 시작
참고 : 단계는 레이저와 채널의 차이로 인해 세포계의 확인 및 모델에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 405, 488, 535 및 640 nm 파장 레이저를 가진 세포계가 사용되었다. 이 프로토콜에 등장하는 필터는 표현을 위한 것입니다. 대체 세포 얼룩은 필터 및 레이저의 다른 세트를 요구할 수 있습니다.
- 선별기 소프트웨어에 새 프로젝트 템플릿 만들기를 시작하고 레이저 패널을 선택합니다. 얼룩과 자연 형광의 표현 조합을 위해 네 개의 레이저 (405, 488, 535 및 640 nm)를 모두 선택하십시오.
- 실험에 표시되는 각 예상 색상에 적합한 필터를 선택합니다.
- DAPI 방출을 감지하고 라이브 셀과 죽은 셀의 분리를 돕기 위해 DAPI, Hoeschst 또는 Pacific Blue 필터와 같은 450/50(425−475 nm 범위)의 대역통과(BP)가 있는 필터를 사용합니다.
- 녹색 ROS 신호에서 방출되는 빛을 감지하기 위해 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 필터와 같은 BP 530/30(파장 범위 515-545 nm)을 가진 필터를 사용하십시오. 이 필터는 각 세포에서 ROS의 농도를 측정합니다.
- 리소좀 얼룩 방출을 검출하기 위한 알로피코시아닌(APC) 필터와 같은 670/30(655-685 nm 범위)의 BP를 가진 추가 필터를 추가합니다.
참고 : APC 채널은 식세포 활성의 측정을 허용합니다. 이 채널은 또한 가족 공생 조류로부터 산호 공생 조류에 의해 생성된 자가형광을 검출한다. 그러나 이 신호는 APC 필터보다 파장이 긴 추가 채널을 사용하여 분리할 수 있습니다. - 가장 일반적으로 사용되는 phycoerythrin, 시아닌 필터 (APC-Cy7)와 같은 780/60 (750-810 nm 범위)의 BP를 가지는 필터를 포함, 이는 심비오 디네아세아과에서 원붉은 자가 형광의 방출을 감지하고 세포 세포의 격리에 에이즈.
5. FACS 게이팅 설정
참고: 단계는 세포계 및 세포계와 결합된 수집 프로그램의 확인 및 모델에 따라 달라질 수 있습니다.
- 세포분석 소프트웨어의 프로젝트 실험 화면에서 산점도를 작성하고 Y축에 대한 X축 및 측면 산란(SSC)에 대한 메트릭으로 앞으로 산란(FCS)을 선택합니다.
참고: FCS는 셀의 크기와 상관 관계가 있으며 SSC는 세분성과 상관관계가 있습니다. 이것은 대부분의 파편을 제거 할 수 있습니다, 대부분의 그대로 세포보다 크기가 작을 것입니다. - 셀 크기와 세분성은 특히 산호에서 여러순서(그림 3A)에따라 달라질 수 있으므로 축을 로그개학 또는 비xponential 비늘로 설정합니다.
6. FACS 분석 및 세포 격리
참고: 단계는 세포계 및 결합 된 수집 프로그램의 확인 및 모델에 따라 다를 수 있습니다.
- 세포계의 샘플 챔버에 대조군(즉, 얼룩지지 않은 세포 서브셋)을 놓고 판독 과정을 시작합니다. 컴퓨터가 각 셀 또는 이벤트에서 데이터를 받기 시작하면 점들이 분산형 플롯에 나타나기 시작합니다. 이전 실험에서 세포계 챔버에 남아있는 파편을 지우려면 분석을 시작하기 전에 약 30s가 통과하도록 하십시오.
- 산란플롯에서 점의 중심을 조정하기 위해 광증배기 튜브(PMT) 전압을 조정합니다.
참고: PMT 전압은 측정중인 광자의 신호 강도를 증폭하는 데 사용됩니다. PMT 전압이 너무 약하면 셀을 더 적게 읽을 수 있으며 PMT 전압이 너무 강하면 셀이 최대값에 가깝게 측정되고 다른 셀 유형이 서로 구별되지 않습니다. 적절한 PMT 전압을 통해 독립적으로 구별가능한 이벤트가 산란플롯을 채울 수 있습니다. FSC 및 SSC 산점도에 로그 또는 비xponential 스케일을 투사하여 이벤트 분리를 쉽게 시각화할 수 있습니다. - 이벤트 기록을 시작합니다. 샘플을 보존하려면 약 15,000개의 이벤트를 읽은 후 데이터 수집을 일시 중지합니다. 대부분의 경우에, 이것은 전반적인 세포 집단 패턴을 구상하기 위하여 적당할 것입니다. 작고 전문화된 세포 집단을 분석하고 격리하는 경우 더 많은 이벤트를 기록합니다.
- FSC 및 SSC의 첫 번째 그래프에서 FSC X축에서 102 마크 및 더 높은 셀의 선택 또는 게이트를 만듭니다. 이 임계값 이하의 모든 것은 세포 파편일 가능성이 높습니다. 직사각형 게이트를 그립니다, 이는 유세포 분석 소프트웨어 프로그램에 대한 일반 옵션이며 명확하고 뚜렷한 세포 집단에 적합합니다. 산란플롯에서 더 불규칙한 모양을 취하는 셀 모집단의 경우 다각형 게이팅 옵션을 사용합니다.
참고: 전방 산란에 102의 최소 차단은 가장 작은 산호 세포에 대해 선택해야하지만 파편의 오염을 허용 할 수 있습니다. 이를 수정하려면 게이팅의 하한을 더 보수적으로 늘립니다. - X축의 DAPI 필터와 Y축의 APC-Cy7 필터를 표현하는 새 분산형 플롯을 작성합니다. 이렇게 하려면 6.4단계에서 작성된 손상되지 않은 셀의 게이트를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 새 분산형 플롯을 작성하는 옵션을 선택합니다. 축을 로그 개학 또는 비xponential 비늘로 조정합니다.
참고: 새 플롯을 만드는 데 필요한 단계는 소프트웨어 프로그램에 따라 다를 수 있습니다. - 이제 세포계 챔버에서 제어 샘플을 제거하고 염색 된 세포로 교체하십시오. 분석을 시작하고 데이터를 기록하기 전에 30s를 통과할 수 있습니다. 일시 중지하기 전에 약 15,000개의 셀을 기록합니다.
참고 : APC-Cy7 척도의 높은 끝에 있는 뚜렷한 인구는 심비오디니아과에서 높은 빨간색 자가 형광을 가진 사람들입니다. 이러한 모집단 나누기를 시각화하기 위해 얼룩이 필요하지 않으며, 또한 대조군 샘플기록(그림 3C)에서도볼 수 있다. 산호 전용 인구, Y축에서 낮은 개체를 선택하여 추가 분화를 선택합니다. - ROS 농도(FITC 필터)와 리소좀(APC 필터)에 양성 세포를 시각화하기 위해 배분 적 세포의 새로운 산란플롯을 생성하고 로그고유 또는 비xponential 스케일을 다시 활용합니다.
참고: 포심생물인 여러 개의 뚜렷한 세포 집단이 있는 경우, 각 세포집단은 자체 분산형 플롯에서 더 구별될 수있다(그림 3C,D). - 대조군 샘플의 첫 번째 기록을 사용하거나 대조군을 다시 삽입하고 다시 실행하여 얼룩이 진 샘플 그룹을 대조군, 얼룩이 없는 하위 집합과 비교합니다. 스테인드 샘플 그룹에 고유한 이벤트를 게이트합니다.
7. FACS 정렬 및 수집
참고: 단계는 세포계 및 세포계와 결합된 수집 프로그램의 확인 및 모델에 따라 달라질 수 있습니다.
- 수집하도록 선택된 셀의 선택과 함께, 세포 분양 튜브(수집된 세포 수 및 저장 방법에 따라 세포 배양 배지 또는 포해 완충액 250-500 μL 함유)를 세포계 수집 챔버에 놓습니다.
참고 : 표현 된 유량 세포계는 한 번에 4 개의 다른 모집단을 분류 할 수 있으며, 기계는 다양한 원심 분리튜브 및 96 웰 플레이트를 포함한 다양한 수집 장치를 보유하도록 구성 할 수 있습니다. - 세포계가 샘플을 읽기 시작하고 적절한 시간이 경과하면 원하는 인구를 정렬하고 20,000 셀에서 수백만 세포로 수집하십시오.
- 500,000개 이상의 셀의 경우, 세포 배양 배지 또는 용해 버퍼의 부피, 및 수집 장치의 부피를 조정한다.
- 시험관 내 연구의 경우, 인큐베이터 또는 멸균 된 환경에 놓일 때까지 얼음에 세포를 저장하십시오.
- 분자 연구의 경우, 즉시 DNA/RNA/단백질 분리 과정을 시작하거나 플래시 동결을 시작하여 추출될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 새로운 얼룩, 종 또는 선별기가 사용될 때마다, 적어도 20,000개의 관심 있는 세포를 염색 매체의 500 μL로 분류하고, 분류된 세포를 다시 분석하고 세포가 처음에 분류하는 데 사용되는 게이트 내에서 판독되고 있는지 확인함으로써 관심 있는 집단에 대한 순도 검사를 수행한다(그림4).
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Representative Results
전반적으로, 이 프로토콜은 기능적 분석에 사용될 수 있는 살아있는 산호 세포 집단의 식별 및 수집을 용이하게 하기 때문에 유용합니다. 워크플로우는 산호 조직을 탄산칼슘 골격에서 기계적으로 분리하는 것으로시작되었습니다(그림 1). 이것은 부적당한 기술이 높은 세포 사망을 초래하고 많은 양의 파편을 만들 수 있기 때문에 가장 중요한 초기 단계 중 하나입니다. 효소 분리는 증가된 조직 전단 및 높은 세포 사망을 초래할 수 있기 때문에 조언되지 않습니다. 에어브러시를 사용한 기계적 분리는 이러한 과제를 감소시킵니다(그림2),평균 세포 사망률을 ~10%로 감소시킵니다(데이터는 표시되지 않음). 에어브러시 매개 된 골격으로부터 조직의 기계적 분리에 이어, 생성된 슬러리는 세포 스트레이너를 통해 여과하여 세포 현탁액으로 여과되었다. 세포 현탁액을 DNA(DAPI), ROS, 및 리소좀 마커로 염색하고 FACS 세포계에 의해 판독하였다. 게이팅 전략은 그 때 이용되는 세포 마커에 근거를 둔 특정 세포 인구를 격리하기 위해 개발되었습니다. 그런 다음 게이트된 셀 모집단을 수집 튜브로 분류했습니다(그림1).
FACS 세포계에서 샘플을 분석할 때 샘플에서 이물질과 죽은 세포를 제거하기 위해 몇 가지 단계를 수행했습니다. 공생체과세포는 자가형광으로 인해 원하는 경우 선택적으로 제거할 수 있다. 먼저, 산호세포와 동일한 형상 또는 세분성을 공유하지 않은 파편 및 기타 비세포 입자는 전방(size) 및 측(세분성) 산란에 게이팅 선택을 생성하여 분석으로부터 제거하였다(도3A). 다음으로, 죽은 세포는 얼룩이 없는 대조군 세포 현탁액을 DAPI 염색 샘플 및 원적 채널과 비교하여 배제한 다음, 염색된 샘플에서 높은 DAPI 염색을 위한 양성 세포를 게이팅(도3B,세포 집단 P6)으로 배아하였다. 병렬로, 자가형광 공생과를 호스팅하는 세포는 원적 채널에서 높은 신호를 가진 세포에 대하여 게이팅함으로써 제거하였다(그림3B,APC-Cy7). 이 반복적인 게이팅 과정 후에, 분석을 위한 나머지 세포는 Symbiodiniaceae가 결여된 그대로 살아있는 산호 세포 인구를 나타냅니다.
이들 세포는 ROS 활성 및/또는 리소좀 함량과 같은 특징에 대한 외인성 얼룩을 첨가하여 대조군 및 염색된 샘플을 비교하여 상이한 세포 하위 집단으로 분류될 수있다(그림 3C). 예를 들면, ROS- 및 리소좀 염색 필터에 데이터를 검토하는 것은 산호 세포의 4개의 명백한 하위 집단을 밝혔습니다. 하나의 세포 집단은 리소좀 함량(APC 필터)에 대해 상대적으로 낮은 신호를 가졌고, 다른 3개는 리소좀 함량 및 ROS 활성 범위(FITC 필터)에서 높은 신호를가졌다(그림 3C). 이러한 각 하위 모집단은 다운스트림 분석을 위해 개별적으로 정렬하거나 크기, 세분성, 자가형광 및/또는 DNA 함량의 교차점에 의해 더 개별적인 하위 모집단으로 추가분석 및 구문 분석할 수 있습니다. 본 연구에서는, DNA, ROS 활성 및 리소좀 함량이 산호 세포의 광범위한 특성을 식별하는 데 사용되었다. 중요한 것은, 이러한 일반 프로토콜은 줄기 세포와 같은 관심 있는 특수 세포 집단의 격리를 위해 함께 사용될 수 있는 특이적 항체 프로브뿐만 아니라 다양한 형광 마커에 적응될 수 있다.
그림 1: 산호 세포 선별 과정의 일반적인 워크플로우. 추천된 프로토콜은 염색을 위한 골격에서 산호 세포의 제거를 가능하게 합니다, 그 때 FACS 세포계를 통해실행되고, 측정되고, 분석되고, 세포 집단으로 격리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 산호 골격에서 조직과 세포의 제거. 공기 압축기(A)는에어 브러시(E)에서공기 및 세포 염색 매체(F)를강제로 꺼내 산호 골격(C)에서조직을 폭발시키고 가방(D)에세포 슬러리를 만듭니다. 최대 공기 압력은 공기압축기(A)의압력 게이지(B)에 의해 제어됩니다.B 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 살아있는 산호 세포의 게이팅 선택. (a)살아있는 세포는 최소 정방향 산란값 102를사용하여 이물질로부터 분리하였다. (B)APC-Cy7 필터는 적색 자가형광을 식별하여 공생-호스팅 세포를 효과적으로 분리하는 데 사용되었으며, DAPI는 DNA 염색에 대해 매우 양성세포를 식별하는 데 사용되었다. DAPI에 대한 매우 긍정적 인 사람들은 죽은 세포와 죽어가는 세포를 나타냈다. (C,D) ROS 활동 및 리소좀 함량에 대한 추가 마커는 다른 산호 세포 집단을 더욱 분화하는 데 사용되었습니다. 모든 데이터는 나중에 이러한 그래프를 생성하기 위해 FlowJo (v10)에서 다시 분석되었습니다. 삽입된 모집단 레이블과 백분율은 각 정렬된 모집단(E)에서E찍은 현미경 사진에 해당합니다. 각 플롯에 표시된 백분율은 해당 플롯 내의 총 셀입니다. 오른쪽 아래 축척 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 자가형광 공생체과 관련 세포의 순도 검사. (a)얼룩지지 않은 대조군 샘플로부터 APC-Cy7 필터상에서 형광에 대해 양성 세포를 분류하였다. (B)이 분류된 세포 군을 세포계에서 재실행하고 동일한 조건하에서 재분석하여 94% 순도를 나타냈다. 정방향 산란(X축, FSC)은 앵커링 축에 사용되었지만 다른 매개변수와 교환할 수 있습니다. 스테인드 샘플에서도 동일한 공정을 수행할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 Rosental 외18에서 적응하고 P. 다미코니스 세포의 식별 및 격리를 위해 개발되었다. 이 방법론은 상대적인 세포 크기, 상대세포 세분성, 세포 자가형광 및 손상되지 않은 세포막의 존재를 포함한 세포 본질적 인자를 검사를 통해 파편, 생존 불가능한 세포 및 Symbiodiniaceae 호스팅 세포를 제거하기 위해 샘플을 필터링하는 과정에 중점을 둡니다. 이러한 기술은 다른 산호 종에 적용 할 수 있습니다. 그러나, FACS 게이팅 전략은 세포 집단 특성에 있는 종 특정 다름 때문에 변화할 수 있습니다.
산호 건강을 이해하기위한 FACS의 유용성은 세포를 차별화하고 격리하기 위해 다양한 세포 본질적 인 인자를 사용하는 능력에 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 생존가능성, 반응성 산소 종 농도 및 리소좀 함량에 기초하여 산호 세포를 분화하기 위해 외인성 세포 염색의 추가 사용을 설명합니다. 이전에 Rosental et al.18에서시험된 30개 이상의 상업적 마커 중 24개가 P. damicornis 세포를 표시했으며, 그 중 16개는 차등 신호, 세포 하위 집단의 선택을 허용하는 분화 군집을 생성하였다.
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 조직 덩어리가 해리되고 유세포계의 층류 흐름을 차단하지 않도록 적절한 조직 제거 및 필터링입니다. PMT 전압의 적절한 조정은 독립적인 셀 검출 이벤트를 정확하게 감지하고 분석하는 데 매우 중요합니다. 전작18과비교하면, 에어브러시 기계적 파괴를 통해 근본적인 골격으로부터 산호세포를 분리하는 과정은 이물질을 줄이고 세포 생존력을 극대화함으로써 전통적인 스크래핑 방법을 크게 개선한다(~90%, 도 2 및 도 3A),소음으로 인한 거짓 긍정을 줄임으로써 후속 분석이 개선됩니다.
이 백서에 기술된 방법론은 이전에는 불가능했던 수준에서 형태학적 및 기능적 특성의 교차점에 대한 차등 선택을 통해 산호 세포 집단의 분리를 용이하게 합니다. 산호 세포에 대한 FACS 방법론의 개발과 함께, 정의 된 세포 배양의 생성을위한 특정 세포 하위 집단을 선택할 수 있습니다, 뿐만 아니라 특정 세포 하위 집단과 관련된 전사체 및 후생 유전학 프로파일을 프로빙. 이 정밀한 규모의 정보의 응용은 세포 모형, 행동 및 기능에 통찰력을 제공하고, calicoblasts 및 cnidocytes와 같은 cnidarian 특정 세포 모형의 진화와 관련되었던 특성을 제시할 수 있습니다. 또한, 개선 된 스트레스 검안제 및 바이오 마커의 개발에 FACS 기술의 응용 프로그램은 심각하게 위협 산호초의 보호에 유용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
NTK는이 연구에 자금을 조달하기위한 자연 과학 및 공학 마이애미 연구 상 대학을 인정하고 싶습니다. BR은 비교 및 진화 면역학 실험실에 자금을 지원한 알렉스와 앤 라우터바흐에게 감사를 표하고 싶습니다. BR의 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF) 번호에 의해 지원되었다: 1416/19 및 2841/19, HFSP 연구 보조금, RGY0085/2019. 우리는 기술 지원을 위한 잔나 코제바에바와 마이크 코넬리에게 감사드립니다. 우리는 또한 마이애미 대학, 의학의 밀러 학교의 흐름 세포 분석 공유 자원 에 FACS 세포계에 대한 액세스 및 기술 지원을 섀넌 Saigh에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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