Summary
Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.
Abstract
Los arrecifes de coral están amenazados debido a factores de estrés antropogénicos. La respuesta biológica del coral a estos factores estresantes puede ocurrir a nivel celular, pero los mecanismos no se entienden bien. Para investigar la respuesta coralina a los factores estresantes, necesitamos herramientas para analizar las respuestas celulares. En particular, necesitamos herramientas que faciliten la aplicación de ensayos funcionales para comprender mejor cómo reaccionan las poblaciones celulares al estrés. En el estudio actual, utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y separar diferentes poblaciones celulares en corales pedregosos. Este protocolo incluye: (1) la separación de los tejidos corales del esqueleto, (2) la creación de una suspensión de una sola célula, (3) el etiquetado de las células de coral utilizando varios marcadores para la citometría de flujo, y (4) gating y estrategias de clasificación celular. Este método permitirá a los investigadores trabajar en corales a nivel celular para análisis, ensayos funcionales y estudios de expresión génica de diferentes poblaciones celulares.
Introduction
Los arrecifes de coral son uno de los ecosistemas más importantes de la Tierra. Facilitan la biodiversidad proporcionando hábitats críticos para los peces y los invertebrados y son cruciales para sostener las comunidades antropogénicas proporcionando alimentos y medios de vida económicos a través del turismo1. Como el constructor clave de los arrecifes de coral, el animal de coral (Phylum: Cnidaria) también ayuda a las comunidades costeras mediante la creación de grandes marcos de carbonato de calcio que mitigan los daños causados por las olas y las tormentas2.
Los corales como adultos son animales sésiles que albergan una amplia gama de socios endosímbióticos, incluyendo virus, arqueas, bacterias, protistas, hongos, y más notablemente, miembros de la familia de dinoflagelados de algas Symbiodiniaceae3. Los cambios en el medio ambiente pueden causar desequilibrios en esta comunidad, a menudo dando lugar a brotes de enfermedades y blanqueo de corales en los que las Simbióticas Symbiodiniaceae son expulsadas de la colonia de coral, eliminando así la principal fuente de nutrición para el coral. Ambos escenarios a menudo causan la muerte del huésped de coral4,5,6. Los efectos de los factores estresantes inducidos por antropogénicos, como el rápido cambio climático, están acelerando los eventos masivos de muerte de coral, lo que conduce a un declive global de los arrecifes de coral7.
Recientemente, se han desarrollado muchos métodos diferentes para ayudar a mitigar la pérdida de arrecifes de coral. Estos métodos incluyen la desplantación de corales en arrecifes existentes, el cruce genético utilizando genotipos térmicamente tolerantes, y la manipulación celular de las comunidades microbianas y simbióticas alojadas dentro del coral8,,9. A pesar de estos esfuerzos, mucho sigue siendo desconocido sobre la diversidad de células de coral y la función celular10,11,12,13. Una comprensión profunda de la diversidad del tipo de células de coral y la función celular es necesaria para entender cómo el organismo coralino se comporta bajo condiciones normativas y estresantes. Los esfuerzos para maximizar la restauración y la eficiencia de la preservación se beneficiarán de una mejor comprensión de cómo se acoplan la diversidad celular y la función génica.
Los trabajos previos sobre diversidad y función celular se han centrado principalmente en estudios histológicos y muestreo de ARN de tejido entero14,15,16,17. Para obtener más detalles sobre la función de tipo celular específico en los corales, es necesario que existan métodos para el aislamiento de poblaciones específicas de células coralinas vivas. Esto se ha hecho con éxito en organismos modelo noclónicos mediante la tecnología de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)18. FACS utiliza una combinación de láseres sintonizados con diferentes longitudes de onda para medir diferentes propiedades celulares endógenas a nivel de celda única, como el tamaño relativo de la célula, la granularidad celular y la autofluorescencia. Además, las células pueden estar marcadas por compuestos con etiqueta fluorescente para medir las propiedades específicas deseadas18,19.
Hasta ahora, la aplicación de la citometría de flujo a las células de coral ha sido principalmente para el análisis de Symbiodiniaceae simbióticas y otras poblaciones bacterianas mediante la utilización de su fuerte autofluorescencia natural20,,21,22. FACS también se ha utilizado para estimar el tamaño del genoma del coral mediante el uso de señal marcador de ADN fluorescente en comparación con las células del organismo modelo de referencia23,24. La aplicación eficiente de FACS proporciona tres herramientas distintas que son útiles para los estudios de biología celular: 1) descripción morfológica y funcional de células individuales; 2) identificación, separación y aislamiento de poblaciones celulares específicas para estudios posteriores; y 3) el análisis de ensayos funcionales a nivel de célula única.
El desarrollo y aplicación de varios marcadores fluorescentes exógenos para el estudio de las células de coral sigue siendo casi inexplorado. Tales marcadores pueden incluir proteínas etiquetadas, sustratos etiquetados para enzimas o respuestas fluorescentes a otros compuestos. Estos marcadores se pueden utilizar para identificar tipos de celdas que tienen propiedades únicas, como resaltar celdas que producen cantidades variables de una característica de compartimiento celular específica, como los lisosomas. Un ejemplo adicional es el uso de perlas con etiqueta fluorescente para identificar funcionalmente las células competentes para la fagocitosis, o el engullimiento de un patógeno objetivo25. Las poblaciones de células activas en las respuestas de inmunidad pueden ser fácilmente identificadas por el FACS después del engullimiento de estas cuentas aplicadas exógenamente. Mientras que los métodos histológicos tradicionales requieren tejido preservado y muchas horas para aproximar el porcentaje de células positivas para el engullimiento de las cuentas, un ensayo funcional basado en FACS para el engullido patógeno se puede realizar relativamente rápidamente en células vivas aisladas. Además de estudiar las respuestas específicas de las células al estrés, esta tecnología tiene el potencial de aclarar la expresión específica del gen e iluminar la historia evolutiva y de desarrollo de tipos celulares totalmente únicos de los cnidarios, como calicoblastos y cnidocitos.
Recientemente, realizamos un cribado intensivo de más de 30 marcadores celulares que resultó en identificar 24 que son capaces de etiquetar células de coral, 16 de las cuales son útiles para distinguir poblaciones únicas18,convirtiéndolas en grupos de diferenciación (CD). Aquí describimos el proceso de aislamiento de células de coral en Pocillopora damicornis de la eliminación de células del esqueleto de carbonato de calcio hasta la identificación y aislamiento de poblaciones celulares específicas con FACS (Figura 1).
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Protocol
1. Disociación de tejidos del esqueleto de coral a través de aerógrafo y compresor
NOTA: Realice pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes.
- Montar el kit de aerógrafo conectando el compresor de aire, la manguera y el aerógrafo (Figura 2). Ajuste el manómetro entre 276 x 483 kPa.
NOTA: El compresor y la manguera de aire recomendados para este estudio se preestablecieron a una presión máxima de 393 kPa. El uso fuera de este rango de 276-483 kPa puede resultar en la eliminación celular inadecuada del esqueleto o la ruptura de las membranas celulares. Este rango puede diferir para cada especie y puede requerir una prueba de viabilidad. Se puede realizar una prueba de viabilidad con un subconjunto de la mezcla celular con un hemociclomekilido simple y un ensayo de exclusión de tinte de 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), visualizado en un microscopio compuesto. - Preparar 100 ml de medios de tinción celular en un autoclavado, recipiente de vidrio estéril añadiendo 33 ml de solución salina tamponada 10x fosfato (PBS; sin calcio y magnesio) a una concentración final de 3,3x, 2 ml de suero de ternera fetal (FCS; calor inactivado a 56 oC durante 30 min) a 2% del volumen total, y 2 ml de búfer HEPES de 1 M a una concentración final de 20 mM. A continuación, respete a 100 ml con agua estéril.
NOTA: La concentración de 3,3 pbS se eligió para imitar la salinidad del agua de mar, como se demuestra en Rosental et al.18. Esta concentración debe ajustarse para que las especies que se encuentran en otros ambientes imiten su salinidad. - Transfiera 10 ml de medios de tinción celular a una botella de aerógrafo (etiquetada "F" en la Figura 2)y conecte la tapa del adaptador para el conector del aerógrafo.
NOTA: Los fragmentos más grandes y las especies con capas de tejido más gruesas pueden requerir más medios para la extracción adecuada de tejido. - Para las especies de coral ramificadas que se muestran aquí, utilice un cortador de huesos para cortar o cortar un fragmento de coral de aproximadamente 3 x 5 cm de longitud o 4 cm2 de área.
NOTA: El fragmento debe estar libre de macroalgas y otros organismos multicelulares porque estos no pueden ser eliminados de la muestra aguas abajo y contaminarán la muestra durante los procesos de análisis y clasificación de FACS. Un fragmento de 1 cm de P. damicornis da aproximadamente 2 x 10 x 106 células después de filtrar, tinción y lavado. - Coloque el fragmento de coral dentro de una bolsa de plástico y utilice el aerógrafo para rociar los medios de tinción celular sobre el coral (Figura 2). Continúe este proceso hasta que la mayor parte del esqueleto quede expuesto. Retire el esqueleto restante de la bolsa de colección.
2. Disociación de células del tejido coral ánsúnico
NOTA: Realice todos los pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes.
- Filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 40 m en un tubo centrífugo de 50 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
NOTA: Diferentes tamaños de malla de colador celular pueden ser más apropiados para diferentes especies. Sin embargo, tamaños más grandes pueden resultar en una disociación inadecuada del tejido debido al paso de escombros y grumos celulares.- Para muestras con capas de moco más gruesas, utilice el émbolo esterilizado de una jeringa de plástico de 1 ml y muele suavemente contra el filtro para romper los grumos y ayudar a las células a pasar a través del colador. Enjuague el colador y el émbolo con medios de tinción celular en el tubo centrífugo.
- Pele el gestion de las células por centrifugación a 4oC a 450 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medios de tinción celular.
3. Mancha de células
NOTA: Realice todos los pasos sobre hielo y proteja las manos con guantes. Las manchas que aparecen en este protocolo son para fines de representación. Las manchas alternativas requerirán diferentes concentraciones y tiempos de incubación.
- Transfiera 500 l de células resuspendidas a un tubo de fondo redondo de 5 ml y reserve como muestra de control. No añada manchas a esta alícuota.
- A la suspensión celular restante, añada 0,42 l de tinte de viabilidad DAPI de 12 mM(Tabla de materiales),1 l de una tinción de oxígeno reactivo (ROS) de 5 m (Tablade materiales)y 0,1 l de mancha de lisosomas de 0,2 M(Tabla de materiales). Pipetear bien para mezclar e incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad para evitar el fotoblanquetado.
NOTA: DAPI se utiliza en este ejemplo para trabajar como una mancha de ADN y tinte de viabilidad para el gating diferencial de células muertas en la máquina FACS. Esto supone que DAPI penetra en las células moribundas debido a la integridad de la membrana. La mancha ROS emite luz en el rango de 520 nm (verde), mientras que el marcador lisosomal emite luz a aproximadamente 668 nm (rojo). - Pellet 500 l de las células manchadas por centrifugación a 4 oC a 450 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 500 s de medios de tinción celular. Transfiera a un nuevo tubo de fondo redondo de 5 ml y guárdelo en hielo.
4. Inicio de FACS
NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro debido a las diferencias en los láseres y canales. Para este protocolo, se utilizó un citometro con láseres de longitud de onda 405, 488, 535 y 640 nm. Los filtros que aparecen en este protocolo son para fines de representación. Las manchas celulares alternativas pueden requerir un conjunto diferente de filtros y láseres.
- Comience a crear una nueva plantilla de proyecto en el software clasificador y elija el panel láser. Para la combinación representada de manchas y fluorescencia natural, seleccione los cuatro láseres (405, 488, 535 y 640 nm).
- Seleccione los filtros adecuados para cada color esperado representado en el experimento.
- Para detectar la emisión DAPI y ayudar en la separación de células vivas y muertas, utilice un filtro con un paso de banda (BP) de 450/50 (rango de 425 a 475 nm) como un filtro DAPI, Hoeschst o Pacific Blue.
- Para la detección de la luz emitida por la señal ROS verde, utilice un filtro con una presión BP de 530/30 (rango de longitud de onda de 515-545 nm) como un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) o proteína fluorescente verde (GFP). Este filtro medirá la concentración de ROS en cada célula.
- Agregue un filtro adicional con una presión arterial de 670/30 (rango de 655 x 685 nm) como un filtro de aloficocian (APC) para la detección de la emisión de manchas lisosomales.
NOTA: El canal APC permitirá la medición de la actividad fagocítica. Este canal también detectará la autofluorescencia generada por el coral de algas simbióticas de la familia Symbiodiniaceae. Sin embargo, esta señal se puede separar utilizando un canal adicional que tenga una longitud de onda más larga que el filtro APC. - Incluya un filtro que tenga una presión arterial de 780/60 (rango de 750-810 nm), como la fitoerytrina más utilizada, filtro de cianina (APC-Cy7), que detecta la emisión de autofluorescencia de color rojo lejano de Symbiodiniaceae y ayuda en el aislamiento de las células aposymbióticas.
5. Configuración de gating FACS
NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición junto con el citómetro.
- En la pantalla experimental del proyecto del software de citometría, cree una gráfica de dispersión y seleccione la dispersión hacia delante (FCS) como la métrica para el eje X y la dispersión lateral (SSC) para el eje Y.
NOTA: FCS se correlaciona con el tamaño de la célula y SSC se correlaciona con la granularidad. Esto permitirá la eliminación de la mayoría de los desechos, ya que la mayoría será de menor tamaño que las células intactas. - Establezca los ejes en escalas logarítmicas o biexponenciales, ya que los tamaños de celda y la granularidad pueden variar en varios órdenes de magnitud(Figura 3A),particularmente en corales.
6. Análisis FACS y aislamiento celular
NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición acoplado.
- Coloque el control (es decir, el subconjunto de células no manchada) en la cámara de muestra del citómetro e inicie el proceso de lectura. Cuando el equipo comienza a recibir datos de cada celda o evento, los puntos comenzarán a aparecer en el gráfico de dispersión. Para eliminar los restos que queden en las cámaras del citometro de experimentos anteriores, permita que pasen aproximadamente 30 s antes de iniciar el análisis.
- En la gráfica de dispersión, ajuste la tensión del tubo fotomultiplicador (PMT) para centrar los puntos.
NOTA: La tensión PMT se utiliza para amplificar la intensidad de la señal de los fotones que se miden; si el voltaje PMT es demasiado débil, se leerán menos celdas, y si el voltaje PMT es demasiado fuerte, las celdas se medirán cerca del valor máximo y diferentes tipos de celdas serán indistinguibles entre sí. Una tensión PMT adecuada garantiza que los eventos distinguibles independientemente poblarán la gráfica de dispersión. La separación de eventos es más fácil de visualizar mediante la proyección de escalas logarítmicas o biexponenciales en las gráficas de dispersión FSC y SSC. - Comience a grabar los eventos. Para conservar el ejemplo, detenga la adquisición de datos después de que se hayan leído aproximadamente 15.000 eventos. En la mayoría de los casos, esto será adecuado para visualizar los patrones generales de población celular. Registre más eventos si analiza y aísla poblaciones celulares pequeñas y especializadas.
- En el primer gráfico de FSC y SSC, cree una selección, o puerta, de las celdas alrededor de la marca 102 y superior en el eje X FSC. Cualquier cosa por debajo de este umbral es probable que los desechos celulares. Dibuje puertas rectangulares, que es una opción regular en programas de software de citometría de flujo y buena para poblaciones celulares claras y distintas. Para las poblaciones de celdas que toman una forma más irregular en las gráficas de dispersión, utilice una opción de medición poligonal.
NOTA: Un límite mínimo de 102 en la dispersión hacia adelante debe seleccionar para las células de coral más pequeñas, pero puede permitir la contaminación de los desechos. Para enmendar esto, aumente el límite inferior de la gating para ser más conservador. - Cree un nuevo gráfico de dispersión que exprese el filtro DAPI en el eje X y el filtro APC-Cy7 en el eje Y. Para ello, seleccione la puerta para las celdas intactas creadas en el paso 6.4, haga clic con el botón derecho y seleccione la opción para crear un nuevo gráfico de dispersión. Ajuste los ejes a escalas logarítmicas o biexponenciales.
NOTA: Los pasos necesarios para crear una nueva gráfica pueden variar con diferentes programas de software. - Ahora retire la muestra de control de la cámara del citometro y sustitúyala con las células manchadas. Permita que pasen 30 s antes de iniciar el análisis y registrar los datos. Registre aproximadamente 15.000 celdas antes de hacer una pausa.
NOTA: Las poblaciones distintas en el extremo superior de la escala APC-Cy7 son aquellas con alta autofluorescencia roja de Symbiodiniaceae. No se necesita ninguna mancha para visualizar estas roturas de población, y también se pueden ver en la grabación de muestra de control (Figura 3C). Seleccione para las poblaciones solo de coral, las más bajas en el eje Y, para una mayor diferenciación. - Cree una nueva gráfica de dispersión de las células aposintomáticas para visualizar las concentraciones de ROS (filtro FITC) y las celdas positivas a lisosomas (filtro APC), utilizando de nuevo escalas logarítmicas o biexponenciales.
NOTA: Si hay varias poblaciones celulares distintas que son aposímbióticas, cada una se puede distinguir aún más en su propia gráfica de dispersión (Figura 3C,D). - Compare el grupo de muestras manchado con el subconjunto no detenido del control mediante la primera grabación de la muestra de control o reinsertando y volviendo a ejecutar el grupo de control. Puerta de los eventos que son exclusivos del grupo de muestra manchado.
7. Clasificación y recogida de FACS
NOTA: Los pasos pueden variar según la marca y el modelo del citómetro y el programa de adquisición junto con el citómetro.
- Con una selección de células elegidas para recoger, coloque los tubos de microcentrífuga (que contienen 250-500 l de medios de cultivo celular o tampón de lysis basado en el número de células recogidas y el método de almacenamiento) en la cámara de recolección del citometro.
NOTA: El citómetro de flujo representado es capaz de clasificar cuatro poblaciones diferentes a la vez, y la máquina se puede configurar para contener una variedad de dispositivos de recolección, incluyendo varios tubos de centrífuga y 96 placas de pozo. - Una vez que el citómetro comienza a leer la muestra y ha pasado una cantidad adecuada de tiempo para eliminar los escombros, comience a clasificar las poblaciones deseadas y recoja entre 20.000 células hasta varios millones.
- Para más de 500.000 celdas, ajuste el volumen de medios de cultivo de celdas o búfer de lysis y el volumen del dispositivo de recopilación.
- Para estudios in vitro, almacene las células en hielo hasta que se coloquen en una incubadora o en un entorno esterilizado.
- Para estudios moleculares, inicie inmediatamente el proceso de aislamiento de ADN/ARN/proteína o congele el flash y guárdelo a -80 oC hasta la extracción.
- Cada vez que se utiliza una nueva mancha, especie o clasificador, realice una comprobación de pureza de la población de interés clasificando al menos 20.000 células de interés en 500 oL de medios de tinción, luego vuelva a analizar las celdas ordenadas y confirme que las celdas se están leyendo dentro de la puerta utilizada para ordenar inicialmente (Figura 4).
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Representative Results
En general, este protocolo es útil porque facilita la identificación y recolección de poblaciones de células de coral vivas que se pueden utilizar para análisis funcionales. El flujo de trabajo comenzó con la separación mecánica de los tejidos corales del esqueleto de carbonato de calcio subyacente (Figura 1). Este es uno de los pasos iniciales más importantes porque una técnica inadecuada resulta en una alta mortalidad celular y puede crear grandes cantidades de escombros. No se recomienda la separación enzimática porque puede resultar en un aumento del cizallamiento tisular y una alta mortalidad celular. La separación mecánica con un aerógrafo reduce estos desafíos(Figura 2),reduciendo la mortalidad celular media al 10 % (datos no mostrados). Después de la separación mecánica mediada por el aerógrafo de los tejidos del esqueleto, la suspensión resultante se filtró a una suspensión celular por filtración a través de un colador celular. La suspensión celular fue entonces manchada con ADN (DAPI), ROS, y marcadores de lisosoma y leído por el citómetro FACS. A continuación, se desarrolló una estrategia de medición para aislar poblaciones celulares específicas en función de los marcadores celulares que se utilizan. Las poblaciones de células cerradas se clasificaron en tubos de recogida (Figura 1).
Al analizar muestras en el citómetro FACS, se tomaron varios pasos para eliminar los desechos y las células muertas de la muestra. Las células de Symbiodiniaceae podrían eliminarse selectivamente si se desea debido a su autofluorescencia. En primer lugar, los desechos y otras partículas no celulares que no compartían la misma forma o granularidad que las células de coral se eliminaron de los análisis mediante la creación de una selección de gating en la dispersión hacia delante (tamaño) y lateral (granularidad) (Figura 3A). A continuación, se excluyeron las células muertas comparando la suspensión de células de control no manchadas con la muestra manchada de DAPI y el canal rojo lejano, luego despetrando las células positivas para la tinción DAPI alta en la muestra manchada (Figura 3B, población celular P6). Paralelamente, las células que alojaban symbiodiniáceas autofluorescentes fueron eliminadas al enfrentarse a células con una señal alta en el canal rojo lejano(Figura 3B,APC-Cy7). Después de este proceso iterativo de gating, las células restantes para los análisis representan las poblaciones intactas de células de coral vivas que carecen de Symbiodiniaceae.
Estas células podrían clasificarse en diferentes subpoblaciones celulares comparando las muestras de control y manchadas mediante la adición de manchas exógenas para características como la actividad ROS y/o el contenido de lisosomas (Figura 3C). Por ejemplo, el examen de los datos sobre los filtros de tinción de ROS y lisosoma reveló cuatro subpoblaciones distintas de las células de coral. Una población celular tenía una señal relativamente baja para el contenido lisosomal (filtro APC) y las otras tres tenían señal alta en el contenido lisosomal y un rango de actividad ROS (filtro FITC) (Figura 3C). Cada una de estas subpoblaciones se puede ordenar individualmente para el análisis posterior, o analizarse y analizarse más detalladamente en subpoblaciones más discretas por la intersección de tamaño, granularidad, autofluorescencia y/o contenido de ADN. En este estudio, el ADN, la actividad ROS y el contenido lisosomal se utilizaron para identificar amplias características de las células de coral. Es importante destacar que este protocolo general se puede adaptar a una gama de marcadores fluorescentes, así como sondas de anticuerpos específicas que se pueden utilizar conjuntamente para el aislamiento de poblaciones celulares especializadas de interés como las células madre.
Figura 1: El flujo de trabajo general del proceso de clasificación de células de coral. El protocolo destacado permite la eliminación de células de coral del esqueleto para la tinción, que luego se ejecutan a través del citómetro FACS, medido, analizado y aislado en poblaciones celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eliminación de tejido y células del esqueleto de coral. El compresor de aire (A) fuerza el aire y los medios de tinción celular (F) fuera del aerógrafo (E) y trabaja para destruir el tejido del esqueleto de coral (C) y crea una suspensión celular en la bolsa (D). La presión máxima del aire es controlada por el manómetro (B) en el compresor de aire (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Selección de gating de células de coral vivas. (A) Las células vivas se aislaron de los escombros utilizando un valor mínimo de dispersión hacia delante de 102. (B) El filtro APC-Cy7 se utilizó para identificar la autofluorescencia roja, separando efectivamente las células alojadas en simbiontes, mientras que DAPI se utilizó para identificar células altamente positivas para la tinción del ADN. Los altamente positivos para DAPI eran indicativos de células muertas y moribundas. (C,D) Se utilizaron marcadores adicionales para la actividad de ROS y el contenido de lisosomas para diferenciar aún más las diferentes poblaciones de células de coral. Todos los datos se volvió a analizar más tarde en FlowJo (v10) para generar estos gráficos. La etiqueta de población insertada y el porcentaje corresponde a las fotos microscópicas tomadas de cada población ordenada (E). Los porcentajes mostrados en cada trazado son del total de celdas dentro de esa gráfica. Barra de escala inferior derecha a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comprobación de pureza de las células asociadas a Symbiodiniaceae autofluorescentes. (A) Se ordenaron las celdas positivas para la fluorescencia en el filtro APC-Cy7 de la muestra de control no vidrida. (B) Este grupo clasificado de células se volvió a ejecutar en el citómetro y se volvió a analizar en las mismas condiciones, mostrando una pureza del 94%. La dispersión hacia delante (eje X, FSC) se utilizó para el eje de anclaje, pero es intercambiable con cualquiera de los otros parámetros. El mismo proceso se puede realizar en muestras manchadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo fue adaptado de Rosental et al.18 y desarrollado para la identificación y aislamiento de células P. damicornis. La metodología se centra en el proceso de filtrado de muestras para eliminar desechos, células no viables y células alojadas en Symbiodiniaceae a través del examen de factores intrínsecos celulares, incluyendo el tamaño relativo de la célula, la granularidad relativa de las células, la autofluorescencia celular y la presencia de membranas celulares intactas. Estas técnicas se pueden aplicar a otras especies de coral. Sin embargo, las estrategias de medición de FACS pueden variar debido a las diferencias específicas de la especie en las características de la población celular.
La utilidad de FACS para entender la salud del coral radica en su capacidad de utilizar diversos factores intrínsecos celulares para identificar y aislar diferencialmente las células. Además, este protocolo describe el uso adicional de tinción celular exógena para diferenciar las células de coral en función de la viabilidad, la concentración reactiva de especies de oxígeno y el contenido de lisosomas. De los más de 30 marcadores comerciales que antes se probaron en Rosental et al.18, 24 células P. damicornis, de los cuales 16 produjeron señal diferencial, grupos de diferenciación que permitirían la selección de subpoblaciones celulares.
Uno de los pasos críticos de este protocolo es la eliminación y filtrado adecuados de tejidos para garantizar que los grumos de tejido se disocucicen y no bloqueen el flujo laminar del citómetro de flujo. El ajuste adecuado de la tensión PMT es crucial para la detección y el análisis precisos de eventos de detección de células independientes. En comparación con el trabajo anterior18, el proceso de aislamiento de células de coral del esqueleto subyacente a través de la interrupción mecánica del aerógrafo mejora significativamente los métodos tradicionales de raspado al reducir los desechos y maximizar la viabilidad celular (90%, Figura 2 y Figura 3A), mejorando así los análisis posteriores mediante la reducción de falsos positivos debido al ruido.
La metodología descrita en este documento facilita la separación de las poblaciones de células de coral a través de la selección diferencial en una intersección de características morfológicas y funcionales a un nivel que antes no era posible. Con el desarrollo de metodologías FACS para células de coral, ahora es posible seleccionar subpoblaciones celulares específicas para la creación de cultivos celulares definidos, así como para sondear perfiles transcriptómicos y epigenéticos asociados con subpoblaciones celulares específicas. La aplicación de esta información de escala fina proporcionará información sobre el tipo de célula, el comportamiento y la función, y puede revelar características asociadas con la evolución de tipos de células específicas de cnidarian como calicoblastos y cnidocitos. Además, la aplicación de la tecnología FACS al desarrollo de ensayos de estrés mejorados y biomarcadores puede resultar útil para la protección de los arrecifes de coral gravemente amenazados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
NTK desea reconocer los Premios de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de la Universidad de Miami por financiar esta investigación. BR desea agradecer a Alex y Ann Lauterbach por financiar el Laboratorio de Inmunología Comparativa y Evolutiva. El trabajo de la BR fue apoyado por los números de la Fundación Israel Science (ISF): 1416/19 y 2841/19, y HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nos gustaría dar las gracias a Zhanna Kozhekbaeva y Mike Connelly por la asistencia técnica. También nos gustaría agradecer al Recurso Compartido de Citometría de Flujo de la Universidad de Miami, Miller School of Medicine en el Sylvester Comprehensive Cancer Center por el acceso al citometro FACS y a Shannon Saigh por apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
