Summary
Koraller skapar biologisk mångfald ekosystem viktiga för både människor och marina organismer. Men vi förstår fortfarande inte den fulla potentialen och funktionen hos många korallceller. Här presenterar vi ett protokoll som utvecklats för isolering, märkning och separation av steniga korallcellpopulationer.
Abstract
Korallrev hotas på grund av antropogena stressfaktorer. Den biologiska reaktionen av korall till dessa stressfaktorer kan uppstå på cellnivå, men mekanismerna är inte väl förstådda. För att undersöka korall svar på stressfaktorer, vi behöver verktyg för att analysera cellulära svar. Framför allt behöver vi verktyg som underlättar tillämpningen av funktionella analyser för att bättre förstå hur cellpopulationer reagerar på stress. I den aktuella studien använder vi fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera och separera olika cellpopulationer i steniga koraller. Detta protokoll innehåller: (1) separation av korallvävnader från skelettet, (2) skapandet av en enda cell suspension, (3) märkning korallcellerna med hjälp av olika markörer för flöde cytometri, och (4) gating och cell sortering strategier. Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att arbeta med koraller på cellnivå för analys, funktionella analyser och genuttrycksstudier av olika cellpopulationer.
Introduction
Korallrev är ett av de viktigaste ekosystemen på jorden. De underlättar den biologiska mångfalden genom att tillhandahålla kritiska livsmiljöer för fisk och ryggradslösa djur och är avgörande för att upprätthålla antropogena samhällen genom att tillhandahålla livsmedel och ekonomisk försörjning genom turism1. Som den viktigaste byggaren av korallrev, korall djur (Phylum: Cnidaria) hjälper också kustsamhällen genom att skapa stora kalciumkarbonat ramar som mildrar våg och storm skador2.
Koraller som vuxna är sessile djur som är värd för ett brett spektrum av endosymbiotiska partner, inklusive virus, arkéer, bakterier, protister, svampar, och framför allt, medlemmar av den alg dinoflagellate familjen Symbiodiniaceae3. Förändringar i miljön kan orsaka obalanser i detta samhälle, ofta leder till sjukdomsutbrott och korall blekning där symbiotiska Symbiodiniaceae utvisas från korallkolonin, vilket eliminerar den viktigaste näringskällan för korall. Båda dessa scenarier orsakar ofta död korall värd4,5,6. Effekter av antropogena-inducerad stressfaktorer, såsom snabba klimatförändringar, accelererar massa korall död händelser, vilket leder till en global nedgång av korallrev7.
På senare tid har många olika metoder utvecklats för att lindra korallrev förlust. Dessa metoder inkluderarutplantering av koraller på befintliga rev, genetisk korsning med termiskt toleranta genotyper, och cellulär manipulation av mikrobiella och symbiotiska samhällen värd inom korall8,9. Trots dessa ansträngningar, mycket är fortfarande okänt om korallcell mångfald och cellfunktion10,11,12,13. En grundlig förståelse av korall cell typ mångfald och cellfunktion är nödvändigt att förstå hur korallorganismen beter sig under normativa och stressiga förhållanden. Arbetet med att maximera restaurerings- och bevarandeeffektiviteten kommer att gynnas av en ökad förståelse för hur cellmångfald och genfunktion kopplas ihop.
Tidigare arbete med cellmångfald och cellfunktion har främst fokuserat på histologiska studier och RNA-provtagning i helavävnaden 14,,15,,16,17. För att få mer detaljer om specifika celltyp funktion i koraller, det måste finnas metoder för isolering av specifika populationer av levande korallceller. Detta har gjorts framgångsrikt i icke-klassificerade modellorganismer med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) flödescytometriteknik18. FACS använder en kombination av lasrar inställda på varierande våglängder för att mäta olika endogena cellulära egenskaper på encellig nivå som relativ cellstorlek, cellgranularitet och autofluorescens. Dessutom kan cellerna markeras med fluorescerande märkta föreningar för att mäta specifika, önskade egenskaper18,19.
Hittills har tillämpningen av flödescytometri till korallceller främst varit för analys av symbiotiska Symbiodiniaceae och andra bakteriepopulationer genom att utnyttja deras starka, naturliga autofluorescens20,21,22. FACS har också använts för att uppskatta korallgenomstorlek med hjälp av fluorescerande DNA-markörsignal jämfört med referensmodellorganismcellerna23,24. Effektiv tillämpning av FACS ger tre distinkta verktyg som är användbara för cellbiologi studier: 1) morfologiska och funktionell beskrivning av enskilda celler; 2) Identifiering, separation och isolering av specifika cellpopulationer för studier nedströms; och 3) analys av funktionella analyser på encellig nivå.
Utveckling och tillämpning av olika exogena fluorescerande markörer för studier av korallceller är fortfarande nästan outforskade. Sådana markörer kan innehålla taggade proteiner, taggade substrat för enzymer, eller fluorescerande svar på andra föreningar. Dessa markörer kan användas för att identifiera celltyper som har unika egenskaper, till exempel markera celler som producerar varierande mängder av en specifik cellulär fackfunktion, till exempel lysosomer. Ett ytterligare exempel är användningen av fluorescerande märkta pärlor för att funktionellt identifiera celler som är behöriga för fagocytos, eller uppslukandet av en riktad patogen25. Populationer av celler som är aktiva i immunitet svar kan lätt identifieras av FACS efter uppslukande av dessa exogent tillämpas pärlor. Medan traditionella histologiska metoder kräver bevarad vävnad och många timmar att approximera andelen celler positiva för pärla uppslukande, en FACS-baserad funktionell analys för patogen engulfment kan utföras relativt snabbt på isolerade levande celler. Förutom att studera cellspecifika reaktioner på stress har denna teknik potential att klargöra genspecifika uttryck och belysa celltypernas evolutionära och utvecklingsmässiga historia som är helt unik för cnidarianer, såsom calicoblaster och cnidocyter.
Nyligen utförde vi en intensiv screening av över 30 cellulära markörer som resulterade i att identifiera 24 som kan märka korallceller, varav 16 är användbara för att skilja unika populationer18, vilket gör dem kluster av differentiering (CD). Här beskriver vi processen för korallcell isolering i Pocillopora damicornis från att ta bort celler från kalciumkarbonat skelett till identifiering och isolering av specifika cellpopulationer med FACS (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissociation av vävnader från korallskelett via airbrush och kompressor
OBS: Utför steg på is och skydda händerna med handskar.
- Montera airbrushsatsen genom att ansluta luftkompressorn, slangen och airbrushn (figur 2). Ställ in tryckmätaren mellan 276−483 kPa.
OBS: Den rekommenderade kompressorn och luftslangen som användes för denna studie var förinställd till ett maximalt tryck på 393 kPa. Användning utanför detta 276-483 kPa-intervall kan resultera i antingen otillräcklig cellborttagning från skelettet eller bristning av cellmembranen. Detta intervall kan variera för varje art och kan kräva ett lönsamhetstest. En lönsamhet test kan utföras med en delmängd av cellen slam med en enkel hemocytometer och en 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) färgämne uteslutning analys, visualiseras på en sammansatt mikroskop. - Förbered 100 ml cellfärgningsmedel i en autoklaverad, steril glasbehållare genom att tillsätta 33 ml 10x fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS; utan kalcium och magnesium) till en slutlig koncentration av 3,3 x, 2 ml fetala kalvserum (FCS; värme inaktiverad vid 56 °C i 30 min) till 2% av den totala volymen och 2 ml 1 M HEPES-buffert till en slutlig koncentration på 20 mM. Sedan toppa på 100 ml med sterilt vatten.
OBS: 3,3 x PBS-koncentrationen valdes för att efterlikna salthalten i havsvatten, vilket framgår av Rosental m.fl.18. Denna koncentration måste justeras för arter som finns i andra miljöer för att efterlikna deras salthalt. - Överför 10 ml cellfärgningsmedel till en airbrushflaska (märkt "F" i figur 2) och fäst adapterlocket för airbrushkontakten.
OBS: Större fragment och arter med tjockare vävnadsskikt kan kräva mer media för adekvat vävnadsborttagning. - För förgrening korallarter visas här, använd en benskärare för att klippa eller skära en korall fragment ca 3−5 cm i längd eller 4 cm2 i området.
OBS: Fragmentet måste vara fritt från makroalger och andra flercelliga organismer eftersom dessa inte får avlägsnas från provet nedströms och kommer att förorena provet under FACS-analys- och sorteringsprocesserna. Ett 1 cm fragment av P. damicornis ger cirka 2−10 x 106 celler efter filtrering, färgning och tvättning. - Placera korallfragmentet i en plastsamlingspåse och använd airbrushen för att spraya cellfärgningsmediet på korallen (figur 2). Fortsätt denna process tills de flesta av skelettet är exponerad. Ta bort det återstående skelettet från uppsamlingspåsen.
2. Dissociation av celler från korallvävnad
OBS: Utför alla steg på is och skydda händerna med handskar.
- Filtrera cellens slam genom en 40 μm nyloncellssil i ett 50 ml centrifugrör för att erhålla en enda cellfjädring.
OBS: Olika maskstorlekar i cellsilen kan vara lämpligare för olika arter. Större storlekar kan dock resultera i otillräcklig vävnad dissociation på grund av passage av skräp och cell klumpar.- För prover med tjockare slemlager, använd den steriliserade kolven på en 1 ml plastspruta och slipa försiktigt den mot filtret för att bryta upp klumpar och hjälpa cellerna att passera genom silen. Skölj silen och kolven med cellfärgningsmedia i centrifugröret.
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 4 °C vid 450 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspend cellerna i 1 ml cellfärgningsmedia.
3. Cellfärgning
OBS: Utför alla steg på is och skydda händerna med handskar. Fläckar som presenteras i detta protokoll är för representation. Alternativa fläckar kommer att kräva olika koncentrationer och inkubationstider.
- Överför 500 μL återsuspenderade celler till ett 5 ml rundbottensrör och ställ åt sidan som ett kontrollprov. Lägg inte fläcken till denna alikvot.
- Tillsätt 0,42 μL 12 m M DAPI-livsduglighetsfärg (Tabell över material),1 μL reaktiv syreart (ROS)(Tabell över material)och 0,1 μl av 0,2 μM lysoombets(Tabell över material). Pipett väl att blanda och inkubera på is i 30 min i mörkret för att förhindra fotoblekning.
OBS: DAPI används i detta exempel för att fungera som en DNA-fläck och livsduglighetsfärg för differentiell gating av döda celler på FACS-maskinen. Detta förutsätter att DAPI tränger in i döende celler på grund av membranintegritet. ROS-fläcken avger ljus i intervallet 520 nm (grön), medan den lysosomal markören avger ljus vid ca 668 nm (röd). - Pellet 500 μL av de färgade cellerna genom centrifugering vid 4 °C vid 450 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspend pelleten i 500 μL cellfärgningsmedia. Överför till ett nytt 5 ml rundbottensrör och förvara på is.
4. FACS start
OBS: Stegen kan variera beroende på cytometerns märke och modell på grund av skillnader i lasrar och kanaler. För detta protokoll, en cytometer med 405, 488, 535 och 640 nm våglängd lasrar användes. Filter som visas i det här protokollet är för representation. Alternativa cellfläckar kan kräva en annan uppsättning filter och lasrar.
- Börja skapa en ny projektmall på sorteringsprogrammet och välj laserpanelen. För den representerade kombinationen av fläckar och naturlig fluorescens, välj alla fyra lasrar (405, 488, 535 och 640 nm).
- Välj lämpliga filter för varje förväntad färg som representeras i experimentet.
- För att upptäcka DAPI-utsläpp och stöd vid separation av levande och döda celler, använd ett filter med ett bandpass (BP) på 450/50 (425−475 nm intervall) såsom ett DAPI, Hoeschst eller Pacific Blue-filter.
- För detektion av ljus som avges av den gröna ROS-signalen, använd ett filter med ett BP på 530/30 (våglängdsområde på 515-545 nm) såsom ett fluoresceinisothiocyanatfilter (FITC) eller grönt fluorescerande proteinfilter (GFP). Detta filter mäter koncentrationen av ROS i varje cell.
- Tillsätt ytterligare ett filter med ett BP på 670/30 (655−685 nm-intervall) såsom ett allofykocyaninfilter (APC) för detektion av detlysosomal fläckutsläpp.
APC-kanalen gör det möjligt att mäta fagocytisk aktivitet. Denna kanal kommer också att upptäcka autofluorescens som genereras av korall symbiotiska alger från familjen Symbiodiniaceae. Denna signal kan dock separeras med hjälp av en extra kanal som har en längre våglängd än APC-filtret. - Inkludera ett filter som har en BP på 780/60 (750-810 nm-intervall), såsom den vanligaste fykoerythrin, cyaninfilter (APC-Cy7), som detekterar utsläpp av vidstrött autofluorescens från Symbiodiniaceae och stöd i isolering av aposymbiotiska celler.
5. FACS gating setup 5.
OBS: Stegen kan variera beroende på märke och modell av cytometern och förvärvsprogrammet tillsammans med cytometern.
- På projektets experimentella skärm av cytometriprogrammet skapar du en punktdiagram och väljer punkt framåt (FCS) som mått för X-axeln och sidospis (SSC) för Y-axeln.
OBS: FCS korrelerar med storleken på cellen och SSC korrelerar med granularitet. Detta kommer att möjliggöra avlägsnande av de flesta skräp, eftersom de flesta kommer att vara mindre i storlek än intakta celler. - Ställ in axlarna på antingen logaritmiska eller biexponential skalor, eftersom cellstorlekar och granularitet kan variera med flera storleksordningar (figur 3A), särskilt i koraller.
6. FACS-analys och cellisolering
OBS: Stegen kan variera beroende på cytometerns märke och modell och det kopplade förvärvsprogrammet.
- Placera kontrollen (dvs. den ofläckade cellundergruppen) i cytometerns provkammare och starta avläsningsprocessen. När datorn börjar ta emot data från varje cell eller händelse börjar punkter visas i punktdiagrammet. För att rensa eventuellt skräp som finns kvar i cytometerkamrarna från tidigare experiment, låt cirka 30 s passera innan analysen påbörjas.
- I spridningsdiagrammet justerar du fotomultiplierrörets (PMT) spänning för att centrera punkterna.
OBS: PMT-spänningen används för att förstärka signalstyrkan hos fotoner som mäts. Om PMT-spänningen är för svag kommer färre celler att läsas, och om PMT-spänningen är för stark, kommer cellerna att mätas nära maximalt värde och olika celltyper kommer att vara omöjliga att skilja från varandra. En lämplig PMT-spänning säkerställer att självständigt urskiljbara händelser kommer att fylla spridningsområdet. Händelseseparation är lättare att visualisera genom att projicera logaritmiska eller biponenta skalar på FSC- och SSC-spridningsdiagram. - Börja spela in händelserna. Om du vill spara i exemplet pausar du datainsamlingen efter att cirka 15 000 händelser har lästs. I de flesta fall kommer detta att vara tillräckligt för att visualisera den totala cellpopulationen mönster. Spela in fler händelser om du analyserar och isolerar små, specialiserade cellpopulationer.
- På det första diagrammet fsc och SSC skapar du en markering, eller grind, av cellerna runt 102-markeringen och högre upp på FSC X-axeln. Allt under denna tröskel är sannolikt cellulära skräp. Rita rektangulära grindar, vilket är ett vanligt alternativ på flöde cytometri program och bra för tydliga, distinkta cell populationer. För cellpopulationer som tar en mer oregelbunden form på scatter-tomterna använder du ett polygonalt gating-alternativ.
OBS: En minsta cutoff på 102 på den främre scatter bör välja för de minsta korallceller men kan tillåta kontaminering av skräp. För att ändra detta, öka den nedre gränsen för gating att vara mer konservativ. - Skapa en ny spridningsdiagram som uttrycker DAPI-filtret på X-axeln och APC-Cy7-filtret på Y-axeln. Det gör du genom att markera porten för intakta celler som skapats i steg 6.4, högerklicka och välj alternativet för att skapa ett nytt spridningsdiagram. Justera axlarna till antingen logaritmiska eller biexponenta skalor.
De steg som behövs för att skapa en ny tomt kan variera med olika program. - Ta nu bort kontrollprovet från cytometerkammaren och ersätt med de färgade cellerna. Låt 30 s passera innan analysen påbörjas och data. Spela in cirka 15 000 celler innan du pausar.
OBS: Den distinkta populationen (s) på den övre delen av APC-Cy7 skalan är de med hög röd autofluorescens från Symbiodiniaceae. Ingen fläck behövs för att visualisera dessa populationspauser, och de kan också visas på kontrollprovet inspelning (figur 3C). Välj för korall-bara populationer, de lägre på Y-axeln, för ytterligare differentiering. - Skapa en ny spridningstomt av de aposymbiotiska cellerna för att visualisera ROS-koncentrationerna (FITC-filtret) och cellerna positiva till lysosomer (APC-filter), återigen med logaritmiska eller biexponenta skalor.
OBS: Om det finns flera olika cellpopulationer som är aposymbiotiska, kan var och en ytterligare särskiljas i sin egen spridningstlott (figur 3C,D). - Jämför den färgade provgruppen mot kontrollen, ofläckad delmängd genom att antingen använda den första registreringen av kontrollprovet eller sätta tillbaka och köra om kontrollgruppen. Gate de händelser som är unika för den färgade provgruppen.
7. FACS sortering och insamling
OBS: Stegen kan variera beroende på märke och modell av cytometern och förvärvsprogrammet tillsammans med cytometern.
- Med ett urval av celler valda att samla in, placera mikrocentrifugrör (innehållande 250−500 μl cellodlingsmedia eller lysbuffert baserat på antal celler som samlats in och lagringsmetod) i cytometersamlingskammaren.
OBS: Den representerade flödescytometern kan sortera fyra olika populationer åt gången, och maskinen kan konfigureras för att rymma en mängd olika insamlingsanordningar, inklusive olika centrifugrör och 96 brunnsplattor. - När cytometern börjar läsa provet och en lämplig tid har gått för att spola ut skräp, börja sortera de önskade populationerna och samla in allt från 20.000 celler till flera miljoner.
- För mer än 500 000 celler justerar du volymen av cellodlingsmedia eller lysbuffert och volymen på insamlingsenheten.
- För in vitro-studier, förvara celler på is tills de placeras i en inkubator eller steriliserad miljö.
- För molekylära studier, antingen omedelbart starta DNA/ RNA/ protein isoleringsprocessen eller blixt frysa och lagra på -80 °C tills extraktion.
- Varje gång en ny fläck, art eller sorterare används, utföra en renhetskontroll av populationen av intresse genom att sortera minst 20.000 celler av intresse i 500 μL färgningsmedia, sedan åter analysera de sorterade cellerna och bekräftar att cellerna läss in i porten som används för att initialt sortera (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammantaget är detta protokoll användbart eftersom det underlättar identifiering och insamling av levande korallcellpopulationer som kan användas för funktionella analyser. Arbetsflödet började med mekanisk separation av korallvävnader från det underliggande kalciumkarbonatskelettet (figur 1). Detta är en av de viktigaste inledande stegen eftersom felaktig teknik resulterar i hög celldödlighet och kan skapa stora mängder skräp. Enzymatisk separation rekommenderas inte eftersom det kan resultera i ökad vävnadsskjurning och hög celldödlighet. Mekanisk separation med hjälp av en airbrush minskar dessa utmaningar (figur 2), vilket minskar den genomsnittliga celldödligheten till ~10% (data visas inte). Efter airbrush-medierad mekanisk separation av vävnader från skelettet, var den resulterande slam filtreras till en cell suspension genom filtrering genom en cell sil. Cellen suspension var sedan färgas med DNA (DAPI), ROS, och lysoso markörer och läsas av FACS cytometer. En gating strategi utvecklades sedan för att isolera specifika cell populationer baserat på cell markörer som används. Gated cell populationer sorterades sedan i insamlingsrör (figur 1).
Vid analys av prover på FACS-cytometern vidtogs flera steg för att avlägsna skräp och döda celler från provet. Symbiodiniaceae celler kan selektivt avlägsnas om så önskas på grund av att deras autofluorescens. För det första avlägsnades skräp och andra ickecellulära partiklar som inte hade samma form eller granularitet som korallceller från analyser genom att skapa ett gating-urval på punkt främre (storlek) och sidan (granularitet)(figur 3A). Därefter uteslöts döda celler genom att jämföra den ofläckade kontrollcellsupphängningen mot DAPI-färgade prov och vidströda kanaler, och sedan gating ut de positiva cellerna för hög DAPI-färgning i det färgade provet (figur 3B, cellpopulation P6). Parallellt togs celler som var värd för autofluorescent Symbiodiniaceae bort genom att gating mot celler med en hög signal i den rödröda kanalen (Figur 3B, APC-Cy7). Efter denna iterativa gating process, de återstående cellerna för analyser representerar intakt levande korall cell populationer saknar Symbiodiniaceae.
Dessa celler kan sedan delas in i olika cellsubpopulationer genom att jämföra kontroll- och färgade prover genom att lägga till exogena fläckar för egenskaper som ROS-aktivitet och/eller lysoominnehåll (figur 3C). Till exempel, undersöka data på ROS- och lysosome-färgning filter visade fyra olika subpopulationer av korallceller. En cellpopulation hade en relativt låg signal för lysosomalt innehåll (APC-filter) och de andra tre hade hög signal i det lysomala innehållet och en rad ROS-aktivitet (FITC-filter) (figur 3C). Var och en av dessa subpopulationer kan sorteras individuellt för nedströmsanalys, eller ytterligare analyseras och tolkas i mer diskreta subpopulationer genom skärningspunkten mellan storlek, granularitet, autofluorescens och / eller DNA-innehåll. I denna studie användes DNA, ROS-aktivitet och lysosomal innehåll för att identifiera breda egenskaper hos korallceller. Viktigt, detta allmänna protokoll kan anpassas till en rad fluorescerande markörer samt specifika antikroppar sonder som kan användas tillsammans för isolering av specialiserade cell populationer av intresse såsom stamceller.
Figur 1: Det allmänna arbetsflödet för korallcellsorteringsprocessen. Det presenterade protokollet gör det möjligt att avlägsna korallceller från skelettet för färgning, som sedan körs genom FACS cytometer, mätt, analyseras och isoleras i cellpopulationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Borttagning av vävnad och celler från korallskelettet. Luftkompressorn (A) tvingar luft och cellfärgningsmedia (F) ut ur airbrush (E) och arbetar för att spränga vävnaden från korallskelettet(C) och skapar en cell slam i påsen (D). Det maximala lufttrycket styrs av tryckmätaren(B) på luftkompressorn (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gating urval av levande korallceller. (A)Levande celler isolerades från skräp med ett minsta punktvärde framåt på 102. (B)APC-Cy7-filtret användes för att identifiera röd autofluorescens, vilket effektivt separerade ut de symbiont-värdda cellerna, medan DAPI användes för att identifiera celler som var mycket positiva för DNA-färgning. De mycket positiva för DAPI var ett tecken på döda och döende celler. (C,D) Ytterligare markörer för ROS-aktivitet och lysöom innehåll användes för att ytterligare skilja olika korallcellpopulationer. Alla data omanalyserades senare på FlowJo (v10) för att generera dessa diagram. Den infogade populationsetiketten och procenten motsvarar de mikroskopiska bilder som tagits av varje sorterad population (E). De procentsatser som visas i varje område är av de totala cellerna i det området. Nedre högra skalan = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Renhetskontroll av de autofluorescent Symbiodiniaceae-associerade cellerna. aA) Celler som är positiva för fluorescens på filtret APC-Cy7 från det ofläckade kontrollprovet sorterades. (B) Denna sorterade grupp av celler kördes sedan på cytometern och analyserades på samma villkor, vilket visar 94 % renhet. Framåtspit (X-axeln, FSC) användes för förankringsaxeln, men är utbytbar med någon av de andra parametrarna. Samma process kan utföras på färgade prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll anpassades från Rosental et al.18 och utvecklades för identifiering och isolering av P. damicornis celler. Metoden fokuserar på processen att filtrera prover för att ta bort skräp, nonviable celler, och Symbiodiniaceae-hosted celler genom undersökning av cell inneboende faktorer, inklusive relativ cellstorlek, relativ cell granularitet, cell autofluorescens, och förekomsten av intakta cellulära membran. Dessa tekniker kan tillämpas på andra korallarter. FACS-strategier kan dock variera på grund av artspecifika skillnader i cellpopulationens egenskaper.
Nyttan av FACS för att förstå korall hälsa ligger i dess förmåga att använda olika cell inneboende faktorer för att differentiellt identifiera och isolera celler. Vidare beskriver detta protokoll ytterligare användning av exogen cellulär färgning för att skilja korallceller baserat på livsduglighet, reaktiv syrearthalt och lysosominnehåll. Av de 30 + kommersiella markörer som tidigare testades i Rosental et al.18, 24 märkta P. damicornis celler, varav 16 producerade differentialsignal, kluster av differentiering som skulle möjliggöra val av cell subpopulationer.
En av de kritiska stegen i detta protokoll är korrekt vävnadsborttagning och filtrering för att säkerställa att vävnadsklumpar separeras och inte blockerar flödescytometerns laminära flöde. Korrekt justering av PMT-spänningen är avgörande för korrekt detektering och analys av oberoende celldetekteringshändelser. Jämfört med tidigare arbete18, processen för korallcell isolering från det underliggande skelettet via airbrush mekaniska störningar avsevärt förbättrar traditionella skrapning metoder genom att minska skräp och maximera cellens livskraft (~ 90%, Figur 2 och figur 3A), vilket förbättrar efterföljande analyser genom att minska falska positiva på grund av buller.
Den metod som beskrivs i detta dokument underlättar separation av korallcellpopulationer genom differentiellt urval i en skärningspunkt mellan morfologiska och funktionella egenskaper på en nivå som inte tidigare var möjlig. Med utvecklingen av FACS-metoder för korallceller är det nu möjligt att välja specifika cellsubpopulationer för att skapa definierade cellkulturer, samt för att undersöka transkriptomiska och epigenetiska profiler associerade med specifika cellsubpopulationer. Tillämpningen av denna finskaliga information kommer att ge insikt i celltyp, beteende och funktion, och kan avslöja egenskaper som är associerade med utvecklingen av cnidarian-specifika celltyper såsom calicoblasts och cnidocytes. Dessutom kan tillämpningen av FACS-teknik för att utveckla förbättrade stressanalyser och biomarkörer vara användbara för att skydda allvarligt hotade korallrev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
NTK vill erkänna University of Miami Research Awards i naturvetenskap och teknik för att finansiera denna forskning. BR vill tacka Alex och Ann Lauterbach för finansieringen av komparativa och evolutionära immunologi laboratory. Arbetet i BR stöddes av Israel Science Foundation (ISF) nummer: 1416/19 och 2841/19, och HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vill tacka Zhanna Kozhekbaeva och Mike Connelly för tekniskt bistånd. Vi vill också tacka University of Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource vid Sylvester Comprehensive Cancer Center för tillgång till FACS cytometer och Shannon Saigh för teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
