Summary
Mercanlar hem insanlar hem de deniz canlıları için önemli olan biyoçeşitlilik ekosistemleri oluştururlar. Ancak, hala tam potansiyel ve birçok mercan hücrelerinin fonksiyonu anlamıyorum. Burada, taşlı mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu, etiketlemi ve ayrılması için geliştirilmiş bir protokol salıyoruz.
Abstract
Mercan resifleri antropojenik stres nedeniyle tehdit altındadır. Bu streslere mercan biyolojik tepki hücresel düzeyde oluşabilir, ancak mekanizmaları iyi anlaşılamamıştır. Mercanların strese karşı tepkisini araştırmak için hücresel tepkileri analiz etmek için araçlara ihtiyacımız var. Özellikle, hücre popülasyonlarının strese nasıl tepki verdiğini daha iyi anlamak için fonksiyonel tahlillerin uygulanmasını kolaylaştıran araçlara ihtiyacımız vardır. Mevcut çalışmada, taşlı mercanlarda farklı hücre popülasyonlarını izole etmek ve ayırmak için floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Bu protokol şunları içerir: (1) mercan dokularının iskeletten ayrılması, (2) tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulması, (3) mercan hücrelerinin akış sitometrisi için çeşitli belirteçler kullanarak etiketleme sitometrisi ve (4) gating ve hücre sıralama stratejileri. Bu yöntem, araştırmacıların farklı hücre popülasyonlarının analizi, fonksiyonel tahlilleri ve gen ekspresyonu çalışmaları için hücresel düzeyde mercanlar üzerinde çalışmalarına olanak sağlayacaktır.
Introduction
Mercan resifleri dünya üzerindeki en önemli ekosistemlerden biridir. Onlar balık ve omurgasızlar için kritik habitatlar sağlayarak biyolojik çeşitliliği kolaylaştırmak veturizm1 ile gıda ve ekonomik geçim sağlayarak antropojenik toplulukların sürdürülmesi için çok önemlidir. Mercan resifleri anahtar oluşturucu olarak, mercan hayvan (Phylum: Cnidaria) da dalga ve fırtına hasarı azaltmak büyük kalsiyum karbonat çerçeveleri oluşturarak kıyı toplulukları yardımcı olur2.
Yetişkinler gibi Mercanlar virüsler, arkeler, bakteriler, protistler, mantarlar ve en önemlisi, algal dinoflagellate aile Symbiodiniaceae3üyeleri de dahil olmak üzere endosimbiyotik ortakları, geniş bir yelpazede ev sahipliği sessile hayvanlardır. Çevredeki değişiklikler bu toplumda dengesizliklere neden olabilir, genellikle hastalık salgınları ve simbiyotik Simbiyodiniaceae mercan kolonisinden atılır mercan ağartma yol açan, böylece mercan için beslenme önemli kaynağı ortadan kaldırarak. Bu senaryoların her ikisi de genellikle mercan konak4,5,6ölüme neden olur. Antropojenik kaynaklı stres etkileri, hızlı iklim değişikliği gibi, mercan resifleri küresel bir düşüşe yol açan, kitle mercan ölüm olayları hızlandırıyor7.
Son zamanlarda, birçok farklı yöntemler mercan resifi kaybını azaltmak için geliştirilmiştir. Bu yöntemler mevcut resifleri mercan outplanting dahil, termal toleranslı genotipler kullanarak genetik geçiş, ve mikrobiyal ve simbiyotik toplulukların hücresel manipülasyon mercan içinde barındırılan8,9. Bu çabalara rağmen, çok mercan hücre çeşitliliği ve hücre fonksiyonu10,11,,12,13hakkında bilinmemektedir . Mercan hücre tipi çeşitliliği ve hücre fonksiyonu nun tam olarak anlaşılması, mercan organizmasının normatif ve stresli koşullar altında nasıl çalıştığını anlamak için gereklidir. Restorasyon ve koruma verimliliğini en üst düzeye çıkarma çabaları, hücre çeşitliliği ve gen fonksiyonunun nasıl birleştiğinin daha iyi anlaşılmasından yararlanacaktır.
Hücre çeşitliliği ve fonksiyonu üzerinde önceki çalışma öncelikle histolojik çalışmalar ve tam doku RNA örnekleme14, 15,15,16,17odaklanmıştır. Mercanlarda belirli hücre tipi fonksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı elde etmek için, canlı mercan hücrelerinin belirli popülasyonlarının izolasyonu için yöntemler olması gerekir. Bu floresan-aktive hücre sıralama (FACS) akış sitometri teknolojisi18ile klasik olmayan model organizmalarda başarıyla yapılmıştır. FACS, göreli hücre boyutu, hücre tanecikliliği ve otofloresans gibi tek hücre düzeyinde farklı endojen hücresel özellikleri ölçmek için değişen dalga boylarına ayarlanmış lazerlerin bir kombinasyonunu kullanır. Ayrıca, hücreler belirli ölçmek için floresan etiketli bileşikler ile işaretlenmiş olabilir, istenen özellikleri18,19.
Şimdiye kadar, mercan hücrelerine akış sitometri uygulaması esas olarak güçlü, doğal otofloresan20,,21,22kullanarak simbiyotik Simbiyodiniaceae ve diğer bakteri popülasyonlarının analizi için olmuştur. FACS ayrıca referans model organizma hücreleri23,24karşılaştırıldığında floresan DNA marker sinyali kullanarak mercan genom boyutunu tahmin etmek için kullanılmıştır. FACS'ın etkin uygulaması hücre biyolojisi çalışmaları için yararlı olan üç farklı araç sağlar: 1) tek hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel tanımı; 2) kimlik, ayırma ve downstream çalışmalar için belirli hücre popülasyonlarının izolasyon; ve 3) tek hücre düzeyinde fonksiyonel tahlillerin analizi.
Mercan hücrelerinin incelenmesi için çeşitli eksojen floresan belirteçlerin geliştirilmesi ve uygulanması neredeyse keşfedilmemiş kalır. Bu tür belirteçler etiketli proteinler, enzimler için etiketli substratlar veya diğer bileşiklere floresan yanıtları içerebilir. Bu işaretler, belirli bir hücresel bölmesi özelliğinin farklı miktarlarda üretilmesi gibi benzersiz özelliklere sahip hücre türlerini tanımlamak için kullanılabilir. Buna ek bir örnek, fagositöz için yetkin hücreleri işlevsel olarak tanımlamak için floresan etiketli boncukların kullanılması veya hedeflenen bir patojenin yutulmasıdır 25. Bağışıklık yanıtlarında aktif olan hücre popülasyonları, bu eksojen olarak uygulanan boncukların yutulmasından sonra FACS tarafından kolayca tespit edilebilir. Geleneksel histolojik yöntemler korunmuş doku ve boncuk yutma için pozitif hücrelerin yüzdesini yaklaşık saatlerce gerektirirken, patojen yutma için facs tabanlı fonksiyonel test izole canlı hücreler üzerinde nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Strese karşı hücreye özgü tepkileri incelemenin yanı sıra, bu teknoloji genlere özgü ifadeyi açıklığa kavuşturma ve kalikoblastlar ve cnidositler gibi cnidarianlara tamamen özgü hücre tiplerinin evrimsel ve gelişimsel tarihini aydınlatma potansiyeline sahiptir.
Son zamanlarda, mercan hücrelerini etiketleme yeteneğine sahip 24 tanımlanması ile sonuçlanan 30'dan fazla hücresel belirteçleri yoğun bir tarama yapıldı, 16 tanesi benzersiz popülasyonları ayırt etmek için yararlıdır18, onları farklılaşma kümeleri yapma (CD). Burada, Pocillopora damicornis'teki mercan hücre izolasyonunun kalsiyum karbonat iskeletinden hücrelerin çıkarılmasından belirli hücre popülasyonlarının FACS ile tanımlanması ve izole edilmesine kadar olan süreci açıklıyoruz (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hava fırçası ve kompresör ile mercan iskeletinden dokuların dissosiyatasyonu
NOT: Buz üzerinde adımlar atın ve eldivenile ellerinizi koruyun.
- Hava kompresörü, hortum ve airbrush(Şekil 2)bağlayarak airbrush kiti monte edin. Basınç ölçeri 276−483 kPa arasında ayarlayın.
NOT: Bu çalışmada kullanılan önerilen kompresör ve hava hortumu maksimum 393 kPa basınca önceden ayarlanmıştı. Bu 276-483 kPa aralığının dışında kullanılması ya iskeletten yetersiz hücre çıkarılmasına veya hücre zarlarının yırtılmasına neden olabilir. Bu aralık her tür için farklılık gösterebilir ve bir canlılık testi gerektirebilir. Basit bir hemositometre ve 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) boya dışlama testi ile hücre bulamacının bir alt kümesi ile canlılık testi yapılabilir, bileşik mikroskop üzerinde görselleştirilmiş. - 100 mL hücre boyama ortamını otoklavda hazırlayın, 3.3x son konsantrasyonuna 10x fosfat tamponlu salin (PBS; kalsiyum ve magnezyum olmadan) 33 mL, fetal buzağı serumunun 2 mL 'si (FCS; 30 dk için 56 °C'de inaktive ısı) ilave edilerek toplam hacmin %2'sine ve 2 mL 1 MHEPES tamponunun 20 mM'lik son konsantrasyona ilave edilerek steril cam konteyner. Daha sonra steril su ile 100 mL'de üzerini kapatın.
NOT: Rosental ve ark.18'degösterildiği gibi, 3.3x PBS konsantrasyonu deniz suyunun tuzluluk unu taklit etmek için seçilmiştir. Bu konsantrasyon, tuzluluklarını taklit etmek için diğer ortamlarda bulunan türler için ayarlanmalıdır. - 10 mL hücre boyama ortamını bir airbrush şişesine (Şekil 2'de"F" olarak etiketlenmiş) aktarın ve airbrush konektörü için adaptör kapağını takın.
NOT: Daha kalın doku tabakalarına sahip daha büyük parçalar ve türler yeterli doku alınması için daha fazla ortam gerektirebilir. - Burada gösterilen dallanma mercan türleri için, yaklaşık 3−5 cm uzunluğunda veya 4 cm2 alanda bir mercan parçasını kesmek veya kesmek için bir kemik kesici kullanın.
NOT: Parça makroalgve diğer çok hücreli organizmalardan arındırılmalıdır, çünkü bunlar örnekten aşağı doğru çıkarılmayabilir ve FACS analizi ve sıralama işlemleri sırasında numuneyi kirletecektir. P. damicornis bir 1 cm parçası filtreleme, boyama ve yıkama sonra yaklaşık 2−10 x 106 hücreleri verir. - Mercan parçasını plastik bir toplama torbasının içine yerleştirin ve hücre boyama ortamını mercanın üzerine püskürtmek için hava fırçasını kullanın(Şekil 2). İskeletin çoğu açığa çıkana kadar bu işleme devam edin. Kalan iskeleti toplama çantasından çıkarın.
2. Mercan dokusundan hücrelerin dissociation
NOT: Buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirin ve eldiven ile ellerinizi koruyun.
- Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre bulamacını 40 m'lik naylon hücresüzden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
NOT: Farklı hücresüz kafes boyutları farklı türler için daha uygun olabilir. Ancak, büyük boyutlarda yetersiz doku dissosyasyonu enkaz ve hücre kümelerinin geçişi nedeniyle neden olabilir.- Kalın mukus tabakalarına sahip numuneler için, 1 mL plastik şırınganın sterilize edilmiş pistonlu kısmını kullanın ve kümeleri kırmak ve hücrelerin süzgeçten geçmesine yardımcı olmak için filtreye hafifçe eziyet edin. Süzgeve pistonu hücre boyama ortamıyla santrifüj tüpüne durulayın.
- 4 °C'de 4 °C'de 450 x g'de 5 dk.
3. Hücre boyama
NOT: Buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirin ve eldiven ile ellerinizi koruyun. Bu protokolde yer alan lekeler temsil amaçlıdır. Alternatif lekeler farklı konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri gerektirir.
- 500 μL'lik yeniden askıda kalmış hücreleri 5 mL'lik yuvarlak alt tüpe aktarın ve kontrol numunesi olarak bir kenara koyun. Bu aliquot leke eklemeyin.
- Kalan hücre süspansiyonuna 0,42 μL 12 mM DAPI canlılık boyası(Malzeme Tablosu),1 μL 5 μM reaktif oksijen türleri (ROS) lekesi(Malzeme Tablosu)ve 0,1 μL 0,2 μL lizozom leke(Malzeme Tablosu)ekleyin. Pipet iyi karıştırmak ve fotobeyazrlama önlemek için karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
NOT: DAPI bu örnekte, FACS makinesindeki ölü hücrelerin diferansiyel gating için DNA lekesi ve canlılık boyası olarak çalışmak için kullanılır. Bu DAPI membran bütünlüğü nedeniyle ölmekte olan hücrelere nüfuz varsayar. ROS lekesi 520 nm aralığında (yeşil) ışık yayarken, lisozomal marker yaklaşık 668 nm (kırmızı) ışık yayar. - 4 °C'de 4 °C'de 5 dk. g Yeni bir 5 mL yuvarlak alt tüp ve buz üzerinde depolamak aktarın.
4. FACS başlangıç
NOT: Adımlar lazerler ve kanallardaki farklılıklara bağlı olarak sitometrenin matvesaline göre değişiklik gösterebilir. Bu protokol için 405, 488, 535 ve 640 nm dalga boyuna lazeriçeren bir sitometre kullanıldı. Bu protokolde yer alan filtreler temsil amaçlıdır. Alternatif hücre lekeleri filtre ve lazerler farklı bir dizi gerektirebilir.
- Sıralayıcı yazılımında yeni bir proje şablonu oluşturmaya başlayın ve lazer panelini seçin. Lekeler ve doğal floresan kombinasyonu için dört lazeri (405, 488, 535 ve 640 nm) seçin.
- Denemede temsil edilen beklenen her renk için uygun filtreleri seçin.
- Canlı ve ölü hücrelerin ayrılmasında DAPI emisyonve yardımını saptamak için, DAPI, Hoeschst veya Pasifik Mavisi filtre gibi 450/50 (425−475 nm aralığında) bandpass (BP) içeren bir filtre kullanın.
- Yeşil ROS sinyali tarafından yayılan ışığın tespiti için, floresan izotoyokiyanat (FITC) veya yeşil floresan protein (GFP) filtresi gibi 530/30 (dalga boyu aralığı 515-545 nm) bp'li bir filtre kullanın. Bu filtre her hücredeki ROS konsantrasyonu ölçecektir.
- Lysozomal leke emisyonunun saptanması için allofikomisin (APC) filtresi gibi 670/30 (655−685 nm aralığında) BP'li ek bir filtre ekleyin.
NOT: APC kanalı fagositik aktivitenin ölçülmesine olanak sağlayacaktır. Bu kanal aynı zamanda simbiyodiniaceae ailesinden mercan simbiyotik algler tarafından oluşturulan otofloresans tespit edecektir. Ancak bu sinyal, APC filtresinden daha uzun dalga boyuna sahip ek bir kanal kullanılarak ayrılabilir. - 780/60 (750-810 nm aralığı) bp olan bir filtre dahil, en yaygın olarak kullanılan phycoerythrin gibi, siyanür filtresi (APC-Cy7), Symbiodiniaceae uzak kırmızı otofloresan semisyonu algılar ve apooardisyal hücrelerin izolasyonyardımcıolur.
5. FACS gating kurulumu
NOT: Adımlar sitometrenin ve satın alma programının sitometreile birleştiğinde yapılan ve modele göre değişiklik gösterebilir.
- Sitometri yazılımının proje deneysel ekranında, bir dağılım çizimi oluşturun ve Y ekseni için X ekseni ve yan dağılım (SSC) için metrik olarak ileri dağılım (FCS) seçin.
NOT: FCS hücrenin boyutu ile ilişkilidir ve SSC parçalılık ile ilişkilidir. Bu en enkaz kaldırılması için izin verecektir, çoğu bozulmamış hücrelere göre boyutu daha küçük olacak gibi. - Hücre boyutları ve taneciklilik, özellikle mercanlarda çeşitli büyüklük sıralarınagöreAdeğişebileceğinden eksenleri logaritmik veya biüstential ölçeklere ayarlayın.
6. FACS analizi ve hücre izolasyonu
NOT: Adımlar sitometrenin ve birleştirilmiş satın alma programının molası ve modeline göre değişiklik gösterebilir.
- Denetimi (örneğin, lekelenmemiş hücre alt kümesi) sitometrenin örnek odasına yerleştirin ve okuma işlemini başlatın. Bilgisayar her hücreden veya olaydan veri almaya başladığında, dağılım çiziminde noktalar görünmeye başlar. Önceki deneylerden sitometre odalarında kalan enkazı temizlemek için, analize başlamadan önce yaklaşık 30 s geçmesine izin verin.
- Dağılım çiziminde, noktaları ortalamak için fotoçarpan tüpü (PMT) gerilimini ayarlayın.
NOT: PMT gerilimi ölçülen fotonların sinyal mukavemetini yükseltmek için kullanılır; PMT gerilimi çok zayıfsa, daha az hücre okunur ve PMT gerilimi çok güçlüyse, hücreler maksimum değere yakın ölçülür ve farklı hücre türleri birbirinden ayırt edilemez olur. Yeterli bir PMT gerilimi, bağımsız olarak ayırt edilebilir olayların dağılım çizimini doldurmasını sağlar. Olay ayrımı, Logaritmik veya biexponential ölçekleri FSC ve SSC dağılım çizimlerine yansıtarak görselleştirmek daha kolaydır. - Olayları kaydetmeye başlayın. Örneği korumak için, yaklaşık 15.000 olay okunduktan sonra veri toplamayı duraklatın. Çoğu durumda, bu genel hücre popülasyon uyplarını görselleştirmek için yeterli olacaktır. Küçük, özel hücre popülasyonlarını analiz edip yalıtıyorsanız daha fazla olay kaydedin.
- FSC ve SSC'nin ilk grafiğinde, FSC X ekseninde 102 işareti ve üzeri hücrelerin bir seçim veya kapı oluşturun. Bu eşiğin altındaki her şey muhtemelen hücresel enkaz. Akış sitometri yazılım programlarında düzenli bir seçenek olan ve açık, farklı hücre popülasyonları için iyi dikdörtgen kapılar çizin. Dağılım çizimlerinde daha düzensiz bir şekil alan hücre popülasyonları için çokgen bir gating seçeneği kullanın.
NOT: En küçük mercan hücreleri için ön dağılımda en az 102 kesit seçilmelidir, ancak enkazın kirlenmesine izin verebilir. Bunu değiştirmek için, daha muhafazakar olmak için gating alt sınırını artırmak. - X ekseninde DAPI filtresini ve Y ekseninde APC-Cy7 filtresini ifade eden yeni bir dağılım çizimi oluşturun. Bunu yapmak için, adım 6.4'te oluşturulan bozulmamış hücreler için geçidi seçin, sağ tıklatın ve yeni bir dağılım çizimi oluşturma seçeneğini seçin. Eksenleri logaritmik veya biüstel ölçeklere ayarlayın.
NOT: Yeni bir çizim oluşturmak için gereken adımlar farklı yazılım programlarına göre değişebilir. - Şimdi sitometre odasından kontrol örneğini çıkarın ve lekeli hücrelerle değiştirin. Analize başlamadan ve verileri kaydetmeden önce 30'ların geçmesine izin verin. Duraklamadan önce yaklaşık 15.000 hücre kaydedin.
NOT: APC-Cy7 ölçeğinin üst ucundaki belirgin popülasyon(lar), Symbiodiniaceae'den gelen yüksek kırmızı otofloresansa sahip olanlardır. Bu popülasyon kırıklarını görselleştirmek için leke ye gerek yoktur ve bunlar kontrol numunesi kaydında da görülebilir (Şekil 3C). Daha fazla farklılaşma için yalnızca mercan popülasyonları olan Y ekseninde daha düşük popülasyonlar için seçin. - Yine logaritmik veya bikonential ölçekler kullanarak, ROS konsantrasyonları (FITC filtresi) ve lizozom (APC filtresi) pozitif hücreleri görselleştirmek için aposimotik hücrelerin yeni bir dağılım arsa oluşturun.
NOT: Aposimbiyotik birden fazla hücre popülasyonu varsa, her biri kendi dağılım çiziminde daha da ayırt edilebilir (Şekil 3C,D). - Lekeli örnek grubunu, kontrol örneğinin ilk kaydını kullanarak veya kontrol grubunu yeniden ekleyerek ve yeniden çalıştırarak, lekesiz alt kümeyle karşılaştırın. Lekeli örnek grubuna özgü olayları kapıla.
7. FACS sıralama ve toplama
NOT: Adımlar sitometrenin ve satın alma programının sitometreile birleştiğinde yapılan ve modele göre değişiklik gösterebilir.
- Toplamak için seçilen hücre seçimi yle, mikrosantrifüj tüpleri (toplanan hücre sayısına ve depolama yöntemine göre 250−500 μL hücre kültürü ortamı veya lysis tamponu içeren) sitometre toplama odasına yerleştirin.
NOT: Temsil edilen akış sitometresi aynı anda dört farklı popülasyonu sıralama yeteneğine sahiptir ve makine çeşitli santrifüj tüpleri ve 96 kuyu plakası da dahil olmak üzere çeşitli toplama aygıtlarını tutacak şekilde yapılandırılabilir. - Sitometre numuneyi okumaya başladığında ve enkazları temizlemek için uygun bir süre geçtikten sonra, istenilen popülasyonları sıralamaya başlayın ve 20.000 hücreden birkaç milyona kadar her yerde toplayın.
- 500.000'den fazla hücre için hücre kültürü ortamının veya lysis arabelleği hacmini ve toplama aygıtının hacmini ayarlayın.
- In vitro çalışmalar için, bir kuvöz veya sterilbir ortama yerleştirilenkadar buz üzerinde hücreleri depolar.
- Moleküler çalışmalar için, ya hemen DNA/RNA/protein izolasyon işlemine başlayın ya da flaş dondurma ve ekstraksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
- Her yeni leke, tür veya ayıklayıcı kullanıldığında, en az 20.000 ilgi hücresini 500 μL boyama ortamına ayırarak, daha sonra sıralanmış hücreleri yeniden analiz ederek ve hücrelerin başlangıçta sıralamak için kullanılan kapı içinde okunduğunu doğrulayarak, ilgi popülasyonu üzerinde saflık kontrolü gerçekleştirin (Şekil 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel olarak, bu protokol, fonksiyonel analizler için kullanılabilecek canlı mercan hücresi popülasyonlarının tanımlanmasını ve toplanmasını kolaylaştırdığı için yararlıdır. İş akışı, mercan dokularının altta yatan kalsiyum karbonat iskeletinden mekanik olarak ayrılması ile başlamıştır (Şekil 1). Bu en önemli ilk adımlardan biridir, çünkü yanlış teknik yüksek hücre mortalitesi ile sonuçlanır ve büyük miktarda enkaz oluşturabilir. Enzimatik ayırma tavsiye edilmez çünkü doku kırpma ve yüksek hücre mortalitesi ile sonuçlanabilir. Bir hava fırçası kullanılarak mekanik ayırma bu zorlukları azaltır(Şekil 2),ortalama hücre mortalitesini ~10%'e düşürür (veriler gösterilmez). Hava fırçası aracılı mekanik dokuların iskeletten ayrılmasının ardından elde edilen bulamaç, bir hücre süzgecinden geçirilerek hücre süspansiyonuna filtre edildi. Hücre süspansiyonu daha sonra DNA (DAPI), ROS ve lizozom belirteçleri ile lekelendi ve FACS sitometresi tarafından okundu. Daha sonra kullanılan hücre belirteçlerine göre belirli hücre popülasyonlarını izole etmek için bir gating stratejisi geliştirilmiştir. Geçitli hücre popülasyonları daha sonra toplama tüpleri olarak sıralandı (Şekil 1).
FACS sitometresindeki numuneler analiz edilirken, numunedeki enkaz ve ölü hücreleri temizlemek için birkaç adım atıldı. Symbiodiniaceae hücreleri seçici olarak istenirse onların otofloresans nedeniyle kaldırılabilir. İlk olarak, mercan hücreleri yle aynı şekil veya tanecikliliği paylaşmayan enkaz ve diğer hücre dışı parçacıklar, ileri (boyut) ve yan (granüler) dağılımda bir gating seçimi oluşturarak analizlerden çıkarıldı (Şekil 3A). Daha sonra, ölü hücreler DAPI-lekeli örnek ve uzak kırmızı kanal karşı lekesiz kontrol hücresi süspansiyon karşılaştırArak dışlandı, daha sonra lekeli örnekte yüksek DAPI boyama için pozitif hücreleri gating(Şekil 3B, hücre popülasyonu P6). Buna paralel olarak, otofloresan Symbiodiniaceae barındıran hücreler uzak kırmızı kanalda yüksek sinyal ile hücrelere karşı gating tarafından kaldırıldı(Şekil 3B, APC-Cy7). Bu yinelemeli gating işleminden sonra, analizler için kalan hücreler Symbiodiniaceae eksikliği bozulmamış canlı mercan hücre popülasyonları temsil eder.
Bu hücreler daha sonra ROS aktivitesi ve/veya lizozom içeriği gibi özellikler için ekzojen lekeler eklenerek kontrol ve lekeli örnekleri karşılaştırarak farklı hücre alt popülasyonlarına sınıflandırılabilirler(Şekil 3C). Örneğin, ROS ve lizozom boyama filtrelerinde elde edilen veriler inceleyerek mercan hücrelerinin dört farklı alt popülasyonu ortaya çıkar. Bir hücre popülasyonunun lysozomal içeriği (APC filtresi) için nispeten düşük sinyali, diğer üçünde ise lysosomal içerikte yüksek sinyal ve çeşitli ROS aktivitesi (FITC filtresi) vardı (Şekil 3C). Bu alt popülasyonların her biri, alt akış analizi için ayrı ayrı sıralanabilir veya boyut, taneciklilik, otofloresanve/veya DNA içeriğinin kesiştiği şekilde daha fazla ayrıayrı alt popülasyona ayrıştırılabilir. Bu çalışmada mercan hücrelerinin geniş özelliklerini belirlemek için DNA, ROS aktivitesi ve izozomal içerik kullanılmıştır. Daha da önemlisi, bu genel protokol bir dizi floresan belirteçlere ve kök hücreler gibi özel leşmiş hücre popülasyonlarının izole edilmesinde birlikte kullanılabilecek spesifik antikor problarına uyarlanabilir.
Şekil 1: Mercan hücresi sıralama işleminin genel iş akışı. Özellikli protokol, mercan hücrelerinin daha sonra FACS sitometresinden geçirilip, ölçülen, analiz edilen ve hücre popülasyonlarına izole edilen boyama için iskeletten çıkarılmasını sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mercan iskeletinden doku ve hücrelerin çıkarılması. Hava kompresörü(A)hava ve hücre boyama ortamını(F)hava fırçasının dışına (E)zorlar ve mercan iskeletindeki(C)dokuya patlamaya çalışır ve torbada bir hücre bulamacı oluşturur(D). Maksimum hava basıncı, hava kompresörüüzerindeki basınç göstergesi(B)ile kontrol edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Canlı mercan hücrelerinin gating seçimi. (A) Canlı hücreler enkazdan en az 102'likbir ileri dağılım değeri kullanılarak izole edilmiştir. (B) APC-Cy7 filtresi kırmızı otofloresans tanımlamak için kullanılan, etkili simbiyoz barındırılan hücreleri ayıran, DAPI DNA boyama için son derece pozitif hücreleri tanımlamak için kullanılırken. DAPI için son derece pozitif olanlar ölü ve ölmekte olan hücrelerin göstergesiydi. (C,D) Farklı mercan hücresi popülasyonlarını daha da ayırt etmek için ROS aktivitesi ve izomöz içerik için ek belirteçler kullanılmıştır. Tüm veriler daha sonra flowJo (v10) üzerinde bu grafikleri oluşturmak için yeniden analiz edildi. Eklenen popülasyon etiketi ve yüzdesi, sıralanmış her popülasyonun(E)çekilen mikroskobik fotoğraflarına karşılık gelir. Her çizimde gösterilen yüzdeler, bu çizimdeki toplam hücrelerdir. Sağ alt ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Otofloresan Simbiyodiaceae ilişkili hücrelerin saflık kontrolü. (A) Lekesiz kontrol örneğinden APC-Cy7 filtresinde floresan pozitif hücreler sıralandı. (B) Bu sıralanmış hücre grubu daha sonra sitometrede yeniden çalıştırıldı ve %94 saflık göstererek aynı koşullar altında yeniden analiz edildi. İleri dağılım (X ekseni, FSC) bağlantı ekseni için kullanılmıştır, ancak diğer parametrelerden herhangi biriyle değiştirilebilir. Aynı işlem lekeli numuneler üzerinde de yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol Rosental ve ark.18'den uyarlanmış ve P. damicornis hücrelerinin tanımlanması ve izole edilmesi için geliştirilmiştir. Metodoloji enkaz kaldırmak için örnekleri filtreleme sürecine odaklanır, cansız hücreler, ve Simbiyodiniaceae barındırılan hücreleri hücre içsel faktörlerin incelenmesi yoluyla, göreceli hücre büyüklüğü de dahil olmak üzere, göreceli hücre granüleritliği, hücre otofloresans, ve bozulmamış hücre zarlarının varlığı. Bu teknikler diğer mercan türlerine uygulanabilir. Ancak, FACS gating stratejileri hücre popülasyonu karakteristiklerinde türe özgü farklılıklara bağlı olarak değişebilir.
Mercan sağlığını anlamak için FACS yarar farklı tanımlamak ve hücreleri izole etmek için çeşitli hücre içsel faktörleri kullanmak için yeteneğini yatıyor. Ayrıca, bu protokol mercan hücrelerini canlılığa, reaktif oksijen türlerinin konsantrasyonuna ve lizom içeriğine göre ayırt etmek için ek olarak ek hücresel boyama kullanımını açıklamaktadır. Daha önce Rosental ve ark.18,24 etiketli P. damicornis hücreleri, 16 farklı sinyal üretilen 30 + ticari belirteçleri, hücre alt popülasyonlarının seçimi için izin verecek diferansiyel kümeleri.
Bu protokolün kritik adımlarından biri, doku kümelerinin ayrıştırılmasını ve akış sitometresinin laminar akışını engellememesini sağlamak için uygun doku çıkarılması ve filtrelemedir. PMT geriliminin doğru ayarlanması, bağımsız hücre algılama olaylarının doğru tespiti ve analizi için çok önemlidir. Önceki çalışma ile karşılaştırıldığında18, airbrush mekanik bozulma yoluyla altta yatan iskelet mercan hücre izolasyon süreci önemli ölçüde enkaz azaltarak ve hücre canlılığını maksimize ederek geleneksel kazıma yöntemleri üzerine geliştirir (~ 90%, Şekil 2 ve Şekil 3A), böylece gürültü nedeniyle yanlış pozitif azaltarak sonraki analizleri geliştirmek.
Bu yazıda açıklanan metodoloji, daha önce mümkün olmayan bir düzeyde morfolojik ve fonksiyonel özelliklerin kesiştiği diferansiyel seçilim yoluyla mercan hücresi popülasyonlarının ayrılmasını kolaylaştırıyor. Mercan hücreleri için FACS metodolojilerinin geliştirilmesi ile, tanımlanan hücre kültürlerinin oluşturulması için belirli hücre alt popülasyonlarının yanı sıra belirli hücre alt popülasyonları ile ilişkili transkripsiyon ve epigenetik profillerin araştırılması için de belirli hücre alt popülasyonlarını seçmek mümkündür. Bu ince ölçekli bilgilerin uygulanması hücre tipi, davranış ve fonksiyon hakkında bilgi sağlayacak ve kalikoblastlar ve cnidositler gibi cnidarian spesifik hücre türlerinin evrimi ile ilişkili özellikleri ortaya çıkarabilir. Ayrıca, geliştirilmiş stres tahlilleri ve biyobelirteçleri geliştirilmesi için FACS teknolojisinin uygulanması ciddi tehdit mercan resifleri korunması için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
NTK, Bu araştırmayı finanse etmek için Miami Üniversitesi Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Ödülleri'ni kabul etmek istiyorum. BR, Alex ve Ann Lauterbach'a Karşılaştırmalı ve Evrimsel İmmünoloji Laboratuvarı'nı finanse ettiği için teşekkür etmek istiyorum. BR'nin çalışmaları İsrail Bilim Vakfı (ISF) numaraları: 1416/19 ve 2841/19 ve HFSP Research Grant, RGY0085/2019 tarafından desteklenmiştir. Zhanna Kozhekbaeva ve Mike Connelly'e teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Miami Üniversitesi, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nde FACS sitometre erişim ve Shannon Saigh teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
