Summary
Koraller skaber biodiverse økosystemer, der er vigtige for både mennesker og marine organismer. Men vi forstår stadig ikke det fulde potentiale og funktion af mange koraller celler. Her præsenterer vi en protokol udviklet til isolering, mærkning og adskillelse af stenede koraller cellepopulationer.
Abstract
Koralrev er truet på grund af menneskeskabte stressfaktorer. Den biologiske reaktion af koraller til disse stressfaktorer kan forekomme på et cellulært niveau, men mekanismerne er ikke godt forstået. For at undersøge koraller svar på stressfaktorer, vi har brug for værktøjer til at analysere cellulære reaktioner. Vi har især brug for værktøjer, der letter anvendelsen af funktionelle analyser for bedre at forstå, hvordan cellepopulationer reagerer på stress. I den aktuelle undersøgelse bruger vi fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at isolere og adskille forskellige cellepopulationer i stenede koraller. Denne protokol omfatter: (1) adskillelse af koraller væv fra skelettet, (2) oprettelse af en enkelt celle suspension, (3) mærkning af koraller celler ved hjælp af forskellige markører for flow cytomettri, og (4) gating og celle sortering strategier. Denne metode vil gøre det muligt for forskere at arbejde på koraller på celleniveau til analyse, funktionelle analyser og genekspressionsundersøgelser af forskellige cellepopulationer.
Introduction
Koralrev er et af de vigtigste økosystemer på Jorden. De fremmer biodiversiteten ved at tilvejebringe kritiske levesteder for fisk og hvirvelløse dyr og er afgørende for at opretholde menneskeskabte samfund ved at give fødevarer og økonomiske levebrød gennem turisme1. Som den vigtigste bygherre af koralrev, koral dyr (Phylum: Cnidaria) også støtte kystsamfund ved at skabe store calciumcarbonat rammer, der afbøder bølge og storm skader2.
Koraller som voksne er sessile dyr, der er vært for en bred vifte af endosymbiotiske partnere, herunder virus, archaea, bakterier, protister, svampe, og især medlemmer af alge dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3. Ændringer i miljøet kan forårsage ubalancer i dette samfund, ofte fører til sygdomsudbrud og koral blegning, hvor symbiotiske Symbiodiniaceae er bortvist fra koraller koloni, og dermed fjerne den vigtigste kilde til ernæring for koraller. Begge disse scenarier ofte forårsage død af koraller vært4,5,6. Virkningerne af menneskeskabte-induceret stressfaktorer, såsom hurtige klimaændringer, accelererer masse koraller død begivenheder, hvilket fører til en global nedgang i koralrev7.
For nylig er mange forskellige metoder blevet udvikletfor at hjælpe med at afbøde koralrev tab. Disse metoder omfatterudplantning af koraller på eksisterende rev, genetisk passage ved hjælp af termisk tolerante genotyper, og cellulære manipulation af mikrobielle og symbiotiske samfund vært inden for koraller8,9. På trods af disse bestræbelser er meget stadig ukendt om koraller celle mangfoldighed og cellefunktion10,11,12,13. En grundig forståelse af koraller celle type mangfoldighed og cellefunktion er nødvendig for at forstå, hvordan koraller organismen opfører sig under normative og stressende forhold. Bestræbelserne på at maksimere restaurering og konservering effektivitet vil drage fordel af en øget forståelse af, hvordan celle mangfoldighed og genfunktion er koblet.
Tidligere arbejde med cellediversitet og -funktion har primært fokuseret på histologiske undersøgelser og RNA-prøvetagning af hele væv14,15,16,17. For at få flere detaljer om specifikke celletype funktion i koraller, der skal være metoder til isolering af specifikke populationer af levende koraller celler. Dette er blevet gjort med succes i ikke-klassificerede modelorganismer ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) cytometriteknologi18. FACS udnytter en kombination af lasere tunet til varierende bølgelængder til at måle forskellige endogene cellulære egenskaber på enkeltcelleniveau såsom relativ cellestørrelse, cellegranularitet og autofluorescens. Derudover kan cellerne være markeret med fluorescerende mærkede forbindelser til at måle specifikke, ønskede egenskaber18,19.
Hidtil har anvendelsen af flow cytometri til koraller celler hovedsagelig været til analyse af symbiotiske Symbiodiniaceae og andre bakterielle populationer ved at udnytte deres stærke, naturlige autofluorescens20,21,22. FACS er også blevet brugt til at anslå koralgenomsstørrelsen ved hjælp af fluorescerende DNA-markørsignal sammenlignet med referencemodelorganismecellerne23,24. Effektiv anvendelse af FACS giver tre forskellige værktøjer, der er nyttige for cellebiologi undersøgelser: 1) morfologiske og funktionelle beskrivelse af enkelte celler; 2) identifikation, adskillelse og isolering af specifikke cellepopulationer i nedstrømsundersøgelser og 3) analyse af funktionelle analyser på enkeltcelleniveau.
Udviklingen og anvendelsen af forskellige udefrakommende fluorescerende markører for studiet af koraller celler er næsten uudforsket. Sådanne markører kan omfatte mærkede proteiner, mærkede substrater for enzymer eller fluorescerende reaktioner på andre forbindelser. Disse markører kan bruges til at identificere celletyper, der har unikke egenskaber, f.eks. Et yderligere eksempel er brugen af fluorescerende mærkede perler til funktionelt at identificere celler, der er kompetente for fagocytose, eller opslugelse af et målrettet patogen25. Populationer af celler, der er aktive i immunitetsresponser, kan let identificeres af FACS efter opslugelse af disse eksogent anvendte perler. Mens traditionelle histologiske metoder kræver konserveret væv og mange timer til at tilnærme procentdelen af celler positiv for perle opslugelse, en FACS-baseret funktionel analyse for patogen opslugelse kan udføres relativt hurtigt på isolerede levende celler. Ud over at studere cellespecifikke reaktioner på stress, har denne teknologi potentiale til at afklare gen-specifikke udtryk og belyse den evolutionære og udviklingsmæssige historie celletyper helt unik for cnidarians, såsom calicoblasts og cnidocytes.
For nylig udførte vi en intensiv screening af over 30 cellulære markører, der resulterede i at identificere 24, der er i stand til at mærke koraller celler, hvoraf 16 er nyttige for at skelne unikke populationer18, hvilket gør dem klynger af differentiering (CD). Her beskriver vi processen med koralcelleisolation i Pocillopora damicornis fra at fjerne celler fra calciumcarbonatskelettet til identifikation og isolering af specifikke cellepopulationer med FACS (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissociation af væv fra koral skelet via airbrush og kompressor
BEMÆRK: Udfør trin på isen og beskyt hænderne med handsker.
- Saml airbrush kit ved at tilslutte luftkompressor, slange og airbrush (Figur 2). Indstil trykmåleren mellem 276−483 kPa.
BEMÆRK: Den anbefalede kompressor og luftslange, der blev anvendt til denne undersøgelse, blev indstillet til et maksimalt tryk på 393 kPa. Brug uden for dette 276-483 kPa-område kan resultere i enten utilstrækkelig fjernelse af celler fra skelettet eller brud på cellemembranerne. Dette interval kan variere for hver art og kan kræve en rentabilitetstest. En levedygtighedstest kan udføres med en delmængde af cellegylle med et simpelt hemocytometer og en 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvestof udelukkelse assay, visualiseret på en sammensat mikroskop. - Forbered 100 ml cellefarvningsmedier i en autoklateret, steril glasbeholder ved at tilsætte 33 ml 10x fosfatbufferet saltvand (PBS; uden calcium og magnesium) til en endelig koncentration på 3,3 x, 2 ml føtal kalveserum (FCS; varmeinaktiveret ved 56 °C i 30 min) til 2% af det samlede volumen og 2 ml 1 M HEPES buffer til en endelig koncentration på 20 mM. Derefter top off ved 100 ml med sterilt vand.
BEMÆRK: 3,3 x PBS-koncentrationen blev valgt til at efterligne saltholdigheden af havvand, som påvist i Rosental et al.18. Denne koncentration skal justeres for arter, der findes i andre miljøer for at efterligne deres saltholdighed. - Overfør 10 ml cellefarvningsmedier til en airbrush-flaske (mærket "F" i figur 2), og fastgør adapterlåget til airbrush-stikket.
BEMÆRK: Større fragmenter og arter med tykkere vævslag kan kræve flere medier for tilstrækkelig vævsfjernelse. - For de forgrenede koraller arter demonstreret her, bruge en knogle cutter til at klippe eller skære en koral fragment ca 3−5 cm i længden eller 4 cm2 i området.
BEMÆRK: Fragmentet skal være fri for makroalger og andre flercellede organismer, da disse ikke må fjernes fra prøven nedstrøms og vil forurene prøven under FACS-analyse- og sorteringsprocesserne. Et 1 cm fragment af P. damicornis giver ca. 2−10 x 106 celler efter filtrering, farvning og vask. - Placer koralfragmentet i en plastopsamlingspose og brug airbrush til at sprøjte cellefarvningsmediet på korallerne (Figur 2). Fortsæt denne proces, indtil det meste af skelettet er udsat. Fjern det resterende skelet fra opsamlingsposen.
2. Dissociation af celler fra koralvæv
BEMÆRK: Udfør alle trin på isen og beskyt hænderne med handsker.
- Cellegylden filtreres gennem en 40 μm nyloncellesien i et centrifugerør på 50 ml for at opnå en enkelt cellesuspension.
BEMÆRK: Forskellige celle si maskestørrelser kan være mere hensigtsmæssigt for forskellige arter. Større størrelser kan dog resultere i utilstrækkelig vævsafkobling på grund af passage af snavs og celleklumper.- For prøver med tykkere slim lag, bruge steriliseret stemplet af en 1 ml plast sprøjte og forsigtigt male det mod filteret for at bryde op klumper og hjælpe cellerne passere gennem sien. Skyl sien og stemplet med cellefarvningsmedier ind i centrifugerøret.
- Træd cellerne ved centrifugering ved 4 °C ved 450 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og opslæmm cellerne i 1 ml cellefarvningsmedier.
3. Celle farvning
BEMÆRK: Udfør alle trin på isen og beskyt hænderne med handsker. Pletter i denne protokol er til repræsentationsformål. Alternative pletter vil kræve forskellige koncentrationer og inkubationstider.
- 500 μL resuspenderede celler overføres til et 5 ml rundt bundrør og udtages som kontrolprøve. Tilsæt ikke pletter til denne aliquot.
- Til den resterende cellesuspension tilsættes 0,42 μL 12 mM DAPI-rentabilitetsfarvestof (Tabel over Materialer), 1 μL 5 μM reaktiv iltart (ROS)(Tabel over materialer) og 0,1 μL μL 0,2 μM lysosomplet(Tabel over Materialer). Pipette godt at blande og inkubere på is i 30 min i mørke for at forhindre fotobleaching.
BEMÆRK: DAPI bruges i dette eksempel til at arbejde som dna-plet og levedygtighedsfarvestof til differentialning af døde celler på FACS-maskinen. Dette forudsætter, at DAPI trænger døende celler på grund af membran integritet. ROS-pletten udsender lys i 520 nm-området (grøn), mens lysosommalmarkøren udsender lys ved ca. 668 nm (rød). - Pellet 500 μL af de farvede celler ved centrifugering ved 4 °C ved 450 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og opslæt pelleten i 500 μL cellefarvningsmidler. Overfør til en ny 5 ml runde bund rør og opbevares på is.
4. FACS start
BEMÆRK: Trinene kan variere alt efter cytometerets mærke og model på grund af forskelle i lasere og kanaler. Til denne protokol blev der anvendt et cytometer med lasere med 405, 488, 535 og 640 nm bølgelængde. Filtre i denne protokol er til repræsentationsformål. Alternative cellepletter kan kræve et andet sæt filtre og lasere.
- Begynd at oprette en ny projektskabelon på sorteringssoftwaren, og vælg laserpanelet. For den repræsenterede kombination af pletter og naturlig fluorescens skal du vælge alle fire lasere (405, 488, 535 og 640 nm).
- Vælg de relevante filtre for hver forventet farve, der er repræsenteret i eksperimentet.
- Hvis du vil opdage DAPI-emissionen og -støtten ved adskillelse af levende og døde celler, skal du bruge et filter med et båndpas (BP) på 450/50 (425−475 nm-filter), f.eks.
- Til påvisning af lys, der udsendes af det grønne ROS-signal, skal du bruge et filter med et BP på 530/30 (bølgelængdeområde på 515-545 nm), såsom et fluorescein isothiocyanat (FITC) eller grønt fluorescerende protein (GFP). Dette filter vil måle koncentrationen af ROS i hver celle.
- Tilføj et ekstra filter med et BP på 670/30 (655−685 nm rækkevidde), såsom et allophycocyanin (APC) filter til påvisning af lysosole plet emission.
BEMÆRK: APC-kanalen vil gøre det muligt at måle fagocytisk aktivitet. Denne kanal vil også opdage autofluorescens genereret af koraller symbiotiske alger fra familien Symbiodiniaceae. Dette signal kan dog adskilles ved hjælp af en ekstra kanal, der har en længere bølgelængde end APC-filteret. - Medtag et filter, der har en BP på 780/60 (750-810 nm rækkevidde), såsom de mest almindeligt anvendte phycoerythrin, cyanin filter (APC-Cy7), som registrerer emissionen af langt røde autofluorescens fra Symbiodiniaceae og hjælpemidler i isolation af aposymbiotiske celler.
5. Opsætning af FACS gating
BEMÆRK: Trin kan variere alt efter cytometerets mærke og model og anskaffelsesprogrammet kombineret med cytometeret.
- På projektets eksperimentelle skærm af cytometrisoftwaren skal du oprette et scatter plot og vælge fremad scatter (FCS) som metrikværdi for X-aksen og sidespredningen (SSC) for Y-aksen.
BEMÆRK: FCS korrelerer med størrelsen af cellen og SSC korrelerer med granularitet. Dette vil give mulighed for fjernelse af de fleste vragrester, da de fleste vil være mindre i størrelse end intakte celler. - Sæt akserne til enten logaritmiske eller biekstrentielle skalaer, da cellestørrelser og granularitet kan variere med flere størrelsesordener (figur 3A), især hos koraller.
6. FACS-analyse og celleisolation
BEMÆRK: Trin kan variere afhængigt af cytometerets mærke og model og det koblede anskaffelsesprogram.
- Anbring kontrolelementet (dvs. den ikke-inddækkede cellemængde) i cytometerets prøvekammer, og aflæsningsprocessen påbegyndes. Når computeren begynder at modtage data fra hver celle eller hændelse, begynder prikkerne at blive vist på punktdiagramblottet. For at fjerne eventuelt snavs, der er tilbage i cytometerkamrene, fra tidligere forsøg, skal der gå ca. 30 s, før analysen påbegyndes.
- I scatter plot, justere photomultiplier tube (PMT) spænding for at centrere punkterne.
BEMÆRK: PMT-spændingen bruges til at forstærke signalstyrken af de fotoner, der måles. Hvis PMT-spændingen er for svag, vil færre celler blive læst, og hvis PMT-spændingen er for stærk, vil cellerne blive målt nær maksimumværdi, og forskellige celletyper vil ikke kunne skelnes fra hinanden. En passende PMT spænding sikrer, at uafhængigt skelnes begivenheder vil befolke scatter plot. Hændelsesseparation er lettere at visualisere ved at projicere logaritmiske eller biekponentielle skalaer på FSC- og SSC-punktområder. - Begynd at optage begivenhederne. Hvis du vil bevare eksemplet, skal du sætte dataindsamlingen på pause, når ca. 15.000 hændelser er blevet læst. I de fleste tilfælde vil dette være tilstrækkeligt til at visualisere de samlede cellepopulationmønstre. Optag flere hændelser, hvis du analyserer og isolerer små, specialiserede cellepopulationer.
- På den første graf over FSC og SSC skal du oprette en markering eller en port af cellerne omkring 102-mærket og højere på FSC X-aksen. Alt under denne grænse er sandsynligvis cellulære vragrester. Tegn rektangulære porte, som er en regelmæssig mulighed på flow cytometri softwareprogrammer og godt for klare, forskellige cellepopulationer. For cellepopulationer, der tager en mere uregelmæssig form på scatter plots, skal du bruge en polygonal gating mulighed.
BEMÆRK: En minimumsafskæring på 102 på den forreste spredning bør vælge for de mindste koralceller, men kan tillade forurening af snavs. For at ændre dette, øge den nedre grænse for gating at være mere konservativ. - Opret et nyt punktdiagram, der udtrykker DAPI-filteret på X-aksen og APC-Cy7-filteret på Y-aksen. Det kan du gøre ved at markere porten til intakte celler, der er oprettet i trin 6.4, højreklikke og vælge indstillingen for at oprette et nyt punktdiagram. Juster akserne til enten logaritmiske eller bieksponentielle skalaer.
BEMÆRK: De trin, der er nødvendige for at oprette et nyt plot, kan variere med forskellige softwareprogrammer. - Fjern nu kontrolprøven fra cytometerkammeret og udskift den med de farvede celler. Lad 30 s passere, før analysen påbegyndes og dataene optages. Optag ca. 15.000 celler, før du sætter dem på pause.
BEMÆRK: Den eller de forskellige populationer i den højere ende af APC-Cy7-skalaen er populationer med højrød autofluorescens fra Symbiodiniaceae. Ingen plet er nødvendig for at visualisere disse population pauser, og de kan også ses på kontrol prøve optagelse (Figur 3C). Vælg for koraller-only befolkninger, dem lavere på Y-aksen, for yderligere differentiering. - Opret en ny scatter plot af aposymbiotic celler til at visualisere ROS koncentrationer (FITC filter) og cellerne positive for lysosomer (APC filter), igen ved hjælp af logaritmiske eller biexponential skalaer.
BEMÆRK: Hvis der er flere forskellige cellepopulationer, der er aposymbiotiske, kan hver enkelt skelnes yderligere i sit eget scatter plot (Figur 3C,D). - Sammenlign den farvede prøvegruppe med kontrolelementet, undergruppen, der ikke er tilbagelagt, ved enten at bruge den første registrering af kontrolprøven eller ved at genindsætte og køre kontrolgruppen igen. Gate de begivenheder, der er unikke for den farvede prøve gruppe.
7. FACS-sortering og -indsamling
BEMÆRK: Trin kan variere alt efter cytometerets mærke og model og anskaffelsesprogrammet kombineret med cytometeret.
- Med et udvalg af celler, der er valgt til at indsamle, anbringes mikrocentrifugerør (indeholdende 250−500 μL cellekulturmedier eller lysisbuffer baseret på antal indsamlede celler og opbevaringsmetode) i cytometeropsamlingskammeret.
BEMÆRK: Det repræsenterede flowcytometer er i stand til at sortere fire forskellige populationer ad gangen, og maskinen kan konfigureres til at rumme en række opsamlingsanordninger, herunder forskellige centrifugerør og 96 brøndplader. - Når cytometeret begynder at aflæse prøven, og der er gået en passende tid til at skylle snavs ud, skal du begynde at sortere de ønskede populationer og indsamle alt fra 20.000 celler til flere millioner.
- For mere end 500.000 celler skal du justere mængden af cellekulturmedier eller lysisbuffer og samlingens enheds volumen.
- For in vitro undersøgelser, gemme celler på is, indtil placeret i en inkubator eller steriliseret miljø.
- I forbindelse med molekylære undersøgelser skal DNA/RNA/proteinisolationsprocessen straks påbegyndes, eller der skal fryses af blitz og opbevares ved -80 °C indtil ekstraktionen.
- Hver gang der anvendes en ny plet, art eller sorteringsenhed, skal du foretage en renhedskontrol af populationen af interesse ved at sortere mindst 20.000 celler af interesse i 500 μL farvningsmedier, derefter genanalysere de sorterede celler og bekræfte, at cellerne læses inden for den port, der anvendes til i første omgang at sortere (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlet set er denne protokol nyttig, fordi den letter identifikation og indsamling af levende koraller cellepopulationer, der kan bruges til funktionelle analyser. Arbejdsprocessen startede med den mekaniske adskillelse af koralvæv fra det underliggende calciumcarbonatskelet (Figur 1). Dette er en af de vigtigste indledende skridt, fordi forkert teknik resulterer i høj celledødelighed og kan skabe store mængder af snavs. Enzymatisk separation tilrådes ikke, fordi det kan resultere i øget vævsklipning og høj celledødelighed. Mekanisk adskillelse ved hjælp af en airbrush reducerer disse udfordringer (figur 2), hvilket reducerer den gennemsnitlige celledødelighed til ~ 10% (data ikke vist). Efter airbrush-medieret mekanisk adskillelse af væv fra skelettet, den resulterende gylle blev filtreret til en celle suspension ved filtrering gennem en celle si. Cellesuspensionen blev derefter plettet med DNA (DAPI), ROS og lysosommarkører og læst af FACS cytometeret. Der blev derefter udviklet en gatingstrategi til at isolere bestemte cellepopulationer baseret på de cellemarkører, der anvendes. Gated cellepopulationer blev derefter sorteret i opsamlingsrør (Figur 1).
Ved analyse af prøver på FACS-cytometeret blev der taget flere skridt til at fjerne snavs og døde celler fra prøven. Symbiodiniaceae celler kunne fjernes selektivt, hvis det ønskes på grund af deres autofluorescens. For det første blev snavs og andre ikke-cellulære partikler, der ikke havde samme form eller granularitet som koralceller, fjernet fra analyserne ved at skabe en gating-markering på det forreste (størrelse) og side (granularitet)(Figur 3A). Dernæst blev døde celler udelukket ved at sammenligne den ikke-indtagne kontrolcellesuspension med DAPI-plettet prøve og langt-rød kanal, hvorefter de positive celler ud for høj DAPI-farvning i den farvede prøve (Figur 3B, cellepopulation P6). Parallelt hermed blev celler, der var vært for autofluorescerende Symbiodiniaceae, fjernet ved at gating mod celler med et højt signal i den langt røde kanal (Figur 3B, APC-Cy7). Efter denne iterative gating proces, de resterende celler til analyser repræsenterer intakt levende koraller cellepopulationer mangler Symbiodiniaceae.
Disse celler kan derefter klassificeres i forskellige celleunderpopulationer ved at sammenligne kontrol- og farvede prøver ved at tilføje udefrakommende pletter for funktioner som ROS-aktivitet og/eller lysosomindhold (figur 3C). For eksempel afslørede en undersøgelse af data om ROS- og lysosom-farvning filtre fire forskellige delpopulationer af koraller celler. En cellepopulation havde et relativt lavt signal for lysosomalt indhold (APC-filter), og de tre andre havde et højt signal i lysosomalindholdet og en række ROS-aktiviteter (FITC-filter) (Figur 3C). Hver af disse delpopulationer kan sorteres individuelt til downstream-analyse eller analyseres yderligere og analyseres i mere diskrete delpopulationer efter skæringspunktet mellem størrelse, granularitet, autofluorescens og/eller DNA-indhold. I denne undersøgelse blev DNA, ROS aktivitet, og lysosomal indhold bruges til at identificere brede karakteristika af koraller celler. Det er vigtigt, at denne generelle protokol kan tilpasses en række fluorescerende markører samt specifikke antistofsonder, der kan bruges sammen til isolering af specialiserede cellepopulationer af interesse såsom stamceller.
Figur 1: Den generelle arbejdsgang for koralcellesorteringsprocessen. Den fremhævede protokol gør det muligt at fjerne koraller celler fra skelettet til farvning, som derefter løber gennem FACS cytometer, målt, analyseret, og isoleret i cellepopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fjernelse af væv og celler fra koralskelettet. Luftkompressoren (A) tvinger luft- og cellefarvningsmedier (F) ud af airbrush (E) og arbejder på at sprænge vævet af koralskelettet (C) og skaber en cellegylle i posen (D). Det maksimale lufttryk styres af trykmåleren (B) på luftkompressoren (A). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gating udvælgelse af levende koraller celler. (A) Levende celler blev isoleret fra affald ved hjælp af en mindste fremadgående spredningsværdi på 102. (B) APC-Cy7-filteret blev brugt til at identificere rød autofluorescens, hvilket effektivt adskilte de symbiont-hostede celler, mens DAPI blev brugt til at identificere celler, der var meget positive til DNA-farvning. De meget positive for DAPI var tegn på døde og døende celler. ( C,D) Yderligere markører for ROS aktivitet og lysosom indhold blev brugt til yderligere at differentiere forskellige koraller cellepopulationer. Alle data blev senere reanalyseret på FlowJo (v10) for at generere disse grafer. Den indsatte befolkningsetiket og procent svarer til de mikroskopiske billeder, der er taget af hver sorteret population (E). De procenter, der vises i hvert område, er af de samlede celler i det pågældende område. Nederste højre skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Renhedskontrol af de autofluorescerende Symbiodiniaceae-associerede celler. (A) Celler, der er positive for fluorescens på APC-Cy7-filteret fra den ikke-indtagne kontrolprøve, blev sorteret. (B) Denne sorterede gruppe af celler blev derefter genkørt på cytometeret og reanalyseret under de samme betingelser, hvilket viser 94% renhed. Fremadgående scatter (X-akse, FSC) blev brugt til forankringsaksen, men kan erstattes med nogen af de andre parametre. Den samme proces kan udføres på farvede prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol blev tilpasset fra Rosental et al.18 og udviklet til identifikation og isolering af P. damicornis celler. Metoden fokuserer på processen med filtrering af prøver for at fjerne snavs, ikke-levedygtige celler og Symbiodiniaceae-hostede celler gennem undersøgelse af celle iboende faktorer, herunder relativ cellestørrelse, relativ celle granularitet, celle autofluorescens, og tilstedeværelsen af intakte cellulære membraner. Disse teknikker kan anvendes på andre koraller arter. FACS gating-strategier kan dog variere på grund af artsspecifikke forskelle i cellepopulationkarakteristika.
Nytten af FACS til forståelse koral sundhed ligger i dens evne til at bruge forskellige celle iboende faktorer til differentieret at identificere og isolere celler. Endvidere beskriver denne protokol den yderligere brug af udefrakommende cellulære farvning til at differentiere koraller celler baseret på levedygtighed, reaktiv ilt arter koncentration, og lysosom indhold. Af de 30+ kommercielle markører, der tidligere blev testet i Rosental et al.18, 24 mærket P. damicornis celler, hvoraf 16 produceret differentialsignal, klynger af differentiering, der ville give mulighed for udvælgelse af celle underpopulationer.
Et af de kritiske trin i denne protokol er korrekt væv fjernelse og filtrering for at sikre, at væv klumper er dissocieret og ikke blokere laminar strømmen af flow cytometer. Korrekt justering af PMT-spændingen er afgørende for nøjagtig detektion og analyse af uafhængige celledetektionshændelser. Sammenlignet med tidligere arbejde18forbedrer processen med koralcelleisolation fra det underliggende skelet via airbrush mekaniske forstyrrelser betydeligt på traditionelle skrabningsmetoder ved at reducere snavs og maksimere celleoverkommeligheden (~90%, figur 2 og figur 3A), hvilket forbedrer efterfølgende analyser ved at reducere falske positiver på grund af støj.
Den metode, der er beskrevet i dette dokument, letter adskillelsen af koraller cellepopulationer gennem differential udvælgelse på et skæringspunkt af morfologiske og funktionelle egenskaber på et niveau, der ikke tidligere er muligt. Med udviklingen af FACS-metoder for koralceller er det nu muligt at vælge specifikke celleunderpopulationer til oprettelse af definerede cellekulturer samt til sondering af transskriptiske og epigenetiske profiler, der er forbundet med specifikke celleunderpopulationer. Anvendelsen af denne fine-skala oplysninger vil give indsigt i celletype, adfærd og funktion, og kan afsløre egenskaber forbundet med udviklingen af cnidarian-specifikke celletyper såsom calicoblasts og cnidocytter. Desuden kan anvendelsen af FACS-teknologi til udvikling af forbedrede stressanalyser og biomarkører vise sig nyttig til beskyttelse af stærkt truede koralrev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
NTK vil gerne anerkende University of Miami Research Awards i Naturvidenskab og Teknik for at finansiere denne forskning. BR vil gerne takke Alex og Ann Lauterbach for at have finansieret det komparative og evolutionære immunologilaboratorium. Br's arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (ISF) numre: 1416/19 og 2841/19, og HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vil gerne takke Zhanna Kozhekbaeva og Mike Connelly for teknisk bistand. Vi vil også gerne takke University of Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource på Sylvester Comprehensive Cancer Center for adgang til FACS cytometer og Shannon Saigh for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
