Summary
Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.
Abstract
Koraalriffen worden bedreigd als gevolg van antropogene stressoren. De biologische reactie van koraal op deze stressoren kan op cellulair niveau optreden, maar de mechanismen zijn niet goed begrepen. Om de reactie van koraal op stressoren te onderzoeken, hebben we tools nodig voor het analyseren van cellulaire reacties. We hebben met name instrumenten nodig die de toepassing van functionele tests vergemakkelijken om beter te begrijpen hoe celpopulaties reageren op stress. In de huidige studie gebruiken we fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS) om verschillende celpopulaties in steenachtige koralen te isoleren en te scheiden. Dit protocol omvat: (1) de scheiding van koraalweefsels van het skelet, (2) het creëren van een eencellige suspensie, (3) het labelen van de koraalcellen met behulp van verschillende markers voor stroomcytometrie, en (4) gating en celsorling strategieën. Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om te werken aan koralen op cellulair niveau voor analyse, functionele testen, en genexpressie studies van verschillende celpopulaties.
Introduction
Koraalriffen zijn een van de belangrijkste ecosystemen op aarde. Ze vergemakkelijken de biodiversiteit door het verstrekken van kritieke habitats voor vissen en ongewervelde dieren en zijn van cruciaal belang voor het behoud van antropogene gemeenschappen door het verstrekken van voedsel en economisch levensonderhoud door middel van toerisme1. Als de belangrijkste bouwer van koraalriffen, het koraal dier (Phylum: Cnidaria) helpt ook kustgemeenschappen door het creëren van grote calcium carbonaat kaders die golf en storm schade te verzachten2.
Koralen als volwassenen zijn sessile dieren die een breed scala van endosymbiotische partners, waaronder virussen, archaea, bacteriën, protisten, schimmels, en vooral, leden van de algen dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3host . Veranderingen in het milieu kunnen leiden tot onevenwichtigheden in deze gemeenschap, vaak leidt tot ziekte-uitbraken en koraal bleken waarin de symbiotische Symbiodiniaceae worden verdreven uit de koraalkolonie, waardoor de belangrijkste bron van voeding voor het koraal wordt geëlimineerd. Beide scenario's veroorzaken vaak de dood van de koraalgastheer4,5,6. Effecten van antropogene geïnduceerde stressoren, zoals snelle klimaatverandering, versnellen de massa koraalsterfte, wat leidt tot een wereldwijde achteruitgang van koraalriffen7.
Onlangs zijn er veel verschillende methoden ontwikkeld om het verlies van koraalriffen te helpen beperken. Deze methoden omvattenoutplanting van koralen op bestaande riffen, genetische kruising met behulp van thermisch tolerante genotypen, en cellulaire manipulatie van de microbiële en symbiotische gemeenschappen gehost binnen het koraal8,9. Ondanks deze inspanningen blijft er veel onbekend over koraalceldiversiteit en celfunctie10,11,12,13. Een grondig begrip van koraalceltypediversiteit en celfunctie is noodzakelijk om te begrijpen hoe het koraalorganisme zich gedraagt onder normatieve en stressvolle omstandigheden. Inspanningen om de efficiëntie van herstel en behoud te maximaliseren, zullen profiteren van een beter begrip van de manier waarop celdiversiteit en genfunctie worden gekoppeld.
Eerdere werkzaamheden over celdiversiteit en -functie waren voornamelijk gericht op histologische studies en RNA-bemonstering met volledig weefsel14,15,16,17. Om meer details te verkrijgen over de specifieke celtypefunctie in koralen, moeten er methoden zijn voor de isolatie van specifieke populaties van levende koraalcellen. Dit is met succes gedaan in niet-klassische modelorganismen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS) flow cytomemetrietechnologie18. FACS maakt gebruik van een combinatie van lasers afgestemd op verschillende golflengten om verschillende endogene cellulaire eigenschappen te meten op het niveau van één cel, zoals relatieve celgrootte, cel granulariteit en autofluorescentie. Bovendien kunnen de cellen worden gemarkeerd door fluorescerende stoffen om specifieke, gewenste eigenschappen18,19te meten .
Tot nu toe is de toepassing van stromingscytometrie op koraalcellen voornamelijk bedoeld geweest voor de analyse van symbiotische Symbiodiniaceae en andere bacteriële populaties door gebruik te maken van hun sterke, natuurlijke autofluorescentie20,21,22. FACS is ook gebruikt om de grootte van het koraalgenoom te schatten door fluorescerend DNA-markersignaal te gebruiken in vergelijking met referentiemodelorganismecellen23,24. De efficiënte toepassing van FACS biedt drie verschillende instrumenten die nuttig zijn voor celbiologiestudies: 1) morfologische en functionele beschrijving van enkele cellen; 2) identificatie, scheiding en isolatie van specifieke celpopulaties voor downstreamstudies; en 3) de analyse van functionele testen op het niveau van één cel.
De ontwikkeling en toepassing van verschillende exogene fluorescerende markers voor de studie van koraalcellen blijft bijna onontgonnen. Dergelijke markers kunnen bestaan uit gelabelde eiwitten, gelabelde substraten voor enzymen of fluorescerende reacties op andere verbindingen. Deze markeringen kunnen worden gebruikt om celtypen te identificeren die unieke eigenschappen hebben, zoals het markeren van cellen die verschillende hoeveelheden van een specifieke cellulaire compartimentfunctie produceren, zoals lysosomen. Een bijkomend voorbeeld is het gebruik van fluorescerend gelabelde kralen om cellen die bevoegd zijn voor fagocytose of het overspoelen van een gerichte ziekteverwekker25functioneel te identificeren. Populaties van cellen die actief zijn in immuniteitsreacties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door FACS na het overspoelen van deze exogene toegepaste kralen. Terwijl traditionele histologische methoden bewaard weefsel en vele uren nodig hebben om het percentage cellen positief te benaderen voor bead engulfment, kan een op FACS gebaseerde functionele test voor pathogene engulfment relatief snel worden uitgevoerd op geïsoleerde levende cellen. Naast het bestuderen van celspecifieke reacties op stress, heeft deze technologie het potentieel om genspecifieke expressie te verduidelijken en de evolutionaire en ontwikkelingsgeschiedenis van celtypen te verlichten die volledig uniek zijn voor cnidarians, zoals calicoblasten en cnidocyten.
Onlangs hebben we een intensieve screening uitgevoerd van meer dan 30 cellulaire markers die resulteerden in het identificeren van 24 die in staat zijn om koraalcellen te labelen, waarvan er 16 nuttig zijn voor het onderscheiden van uniekepopulaties 18, waardoor ze clusters van differentiatie (CD) zijn. Hier beschrijven we het proces van koraalcelisolatie in Pocillopora damicornis van het verwijderen van cellen uit het calciumcarbonaatskelet tot de identificatie en isolatie van specifieke celpopulaties met FACS (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissociatie van weefsels van koraalskelet via airbrush en compressor
LET OP: Voer stappen uit op ijs en bescherm handen met handschoenen.
- Monteer de airbrushkit door de luchtcompressor, slang en airbrush aan te sluiten(figuur 2). Stel de drukmeter in op 276−483 kPa.
LET OP: De aanbevolen compressor en luchtslang die voor dit onderzoek werd gebruikt, was ingesteld op een maximale druk van 393 kPa. Gebruik buiten dit 276-483 kPa-bereik kan leiden tot onvoldoende celverwijdering uit het skelet of breuk van de celmembranen. Dit bereik kan per soort verschillen en kan een levensvatbaarheidstest vereisen. Een levensvatbaarheid test kan worden uitgevoerd met een subset van de cel drijfmest met een eenvoudige hemocytometer en een 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleurstof uitsluiting test, gevisualiseerd op een samengestelde microscoop. - Bereid 100 mL van cel vlekken media in een autoclaved, steriele glascontainer door toevoeging van 33 mL 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zonder calcium en magnesium) aan een eindconcentratie van 3,3x, 2 mL foetaal kalfsserum (FCS; warmte geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min) tot 2% van het totale volume en 2 mL van 1 M HEPES buffer tot een eindconcentratie van 20 mM. Sluit vervolgens af op 100 mL met steriel water.
OPMERKING: De 3,3x PBS-concentratie werd gekozen om het zoutgehalte van zeewater na te bootsen, zoals aangetoond in Rosental et al.18. Deze concentratie moet worden aangepast voor soorten die in andere omgevingen worden aangetroffen om hun zoutgehalte na te bootsen. - Breng 10 mL celvlekkende media over op een airbrushfles (gelabeld "F" in figuur 2)en bevestig het adapterdeksel voor de airbrushconnector.
OPMERKING: Grotere fragmenten en soorten met dikkere weefsellagen kunnen meer media nodig hebben voor een adequate weefselverwijdering. - Voor de vertakkende koraalsoorten die hier worden gedemonstreerd, gebruikt u een botsnijder om een koraalfragment van ongeveer 3−5 cm lang of 4 cm2 in het gebied te knippen of te snijden.
OPMERKING: Het fragment moet vrij zijn van macroalgen en andere meercellige organismen, omdat deze niet stroomafwaarts uit het monster mogen worden verwijderd en het monster tijdens de FACS-analyse- en sorteerprocessen kunnen besmetten. Een fragment van 1 cm van P. damicornis geeft ongeveer 2−10 x 106 cellen na het filteren, vlekken en wassen. - Plaats het koraalfragment in een plastic opvangzak en gebruik de airbrush om de celkleuringsmedia op het koraal te spuiten(figuur 2). Zet dit proces voort totdat het grootste deel van het skelet is blootgesteld. Haal het resterende skelet uit de opvangzak.
2. Dissociatie van cellen uit koraalweefsel
LET OP: Voer alle stappen op ijs uit en bescherm handen met handschoenen.
- Filtreer de celdrijfmest door een nylon celzeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 mL om een enkele celopening te verkrijgen.
OPMERKING: Verschillende mazen van de celzeef kunnen geschikter zijn voor verschillende soorten. Echter, grotere maten kunnen resulteren in onvoldoende weefsel dissociatie als gevolg van de passage van puin en celklonen.- Voor exemplaren met dikkere slijmlagen, gebruik maken van de gesteriliseerde zuiger van een 1 mL plastic spuit en zachtjes malen tegen het filter te breken klonten en helpen de cellen door de zeef. Spoel de zeef en zuiger met celvlekken in de centrifugebuis.
- Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 4 °C bij 450 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant en zet de cellen opnieuw op in 1 mL celkleuringsmedia.
3. Celvlekken
LET OP: Voer alle stappen op ijs uit en bescherm handen met handschoenen. Vlekken in dit protocol zijn voor representatiedoeleinden. Alternatieve vlekken vereisen verschillende concentraties en incubatietijden.
- Breng 500 μL geresuspendeerde cellen over naar een 5 mL ronde bodembuis en zet apart als controlemonster. Voeg geen vlek toe aan dit aliquot.
- Voeg aan de resterende celsuspensie 0,42 μL van 12 mM DAPI-leefstof(Tabel van materialen),1 μL van 5 μM reactieve zuurstofsoorten (ROS) vlek(Tabel van materialen)toe en 0,1 μL van 0,2 μM lyssomnige vlek(Tabel van materialen). Pipette goed te mengen en uitbroeden op ijs voor 30 minuten in het donker om te voorkomen dat fotobleaching.
OPMERKING: DAPI wordt in dit voorbeeld gebruikt om te werken als een DNA-vlek en levensvatbaarheid kleurstof voor de differentiële gating van dode cellen op de FACS machine. Dit veronderstelt dat DAPI stervende cellen doordringt toe te schrijven aan membraanintegriteit. De ROS-vlek straalt licht uit in het bereik van 520 nm (groen), terwijl de lysosomale markering licht uitzendt op ongeveer 668 nm (rood). - Pellet 500 μL van de gekleurde cellen door centrifugatie bij 4 °C bij 450 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant en zet de pellet opnieuw op in 500 μL celkleuringsmedia. Ga over op een nieuwe 5 mL ronde bodembuis en bewaar op ijs.
4. FACS opstarten
LET OP: De stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer als gevolg van verschillen in de lasers en kanalen. Voor dit protocol werd een cytometer met 405, 488, 535 en 640 nm golflengtelasers gebruikt. Filters in dit protocol zijn bedoeld voor representatiedoeleinden. Alternatieve celvlekken vereisen mogelijk een andere set filters en lasers.
- Begin met het maken van een nieuwe projectsjabloon op de sorteerdersoftware en kies het laserpaneel. Voor de vertegenwoordigde combinatie van vlekken en natuurlijke fluorescentie, selecteert u alle vier de lasers (405, 488, 535 en 640 nm).
- Selecteer de juiste filters voor elke verwachte kleur die in het experiment wordt weergegeven.
- Gebruik een filter met een bandpass (BP) van 450/50 (425-475 nm bereik) zoals een DAPI, Hoeschst of Pacific Blue-filter om de DAPI-emissie en hulp bij de scheiding van levende en dode cellen op te sporen.
- Voor de detectie van licht dat door het groene ROS-signaal wordt uitgezonden, gebruikt u een filter met een BP van 530/30 (golflengtebereik van 515-545 nm), zoals een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of groen fluorescerend eiwit (GFP) filter. Dit filter meet de concentratie van ROS in elke cel.
- Voeg een extra filter toe met een BP van 670/30 (655−685 nm bereik) zoals een allophycocyanine (APC) filter voor de detectie van de lysosomale vlek emissie.
OPMERKING: Het APC-kanaal maakt het mogelijk om fagocytische activiteit te meten. Dit kanaal detecteert ook de autofluorescentie gegenereerd door de koraal symbiotische algen uit de familie Symbiodiniaceae. Dit signaal kan worden gescheiden met behulp van een extra kanaal dat een langere golflengte dan de APC-filter heeft, echter. - Neem een filter op met een BP van 780/60 (750-810 nm bereik), zoals de meest gebruikte fycoerythrin, cyaninefilter (APC-Cy7), die de emissie van verrode autofluorescentie van Symbiodiniaceae detecteert en helpt bij de isolatie van aposymbiotische cellen.
5. FACS gating setup
OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het acquisitieprogramma in combinatie met de cytometer.
- Maak op het experimentele projectscherm van de cytometriesoftware een spreidingsplot en selecteer forward scatter (FCS) als de statistiek voor de X-as en zijverstrooiing (SSC) voor de Y-as.
OPMERKING: FCS correleert met de grootte van de cel en SSC correleert met granulariteit. Dit zal zorgen voor de verwijdering van de meeste puin, zoals de meeste kleiner zal zijn in omvang dan intacte cellen. - Stel de assen in op logaritmische of biexponentiële schalen, omdat celgroottes en granulariteit kunnen variëren met verschillende ordes van grootte(figuur 3A), met name in koralen.
6. FACS-analyse en celisolatie
OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het gekoppelde acquisitieprogramma.
- Plaats het besturingselement (d.w.z. de niet-gekleurde celsubset) in de monsterkamer van de cytometer en start het leesproces. Wanneer de computer gegevens van elke cel of gebeurtenis begint te ontvangen, worden er stippen weergegeven op de spreidingsplot. Om alle puin links in de cytometer kamers van eerdere experimenten duidelijk, laat ongeveer 30 s te passeren voordat u begint met de analyse.
- Pas in het strooiperceel de fotomultiplierbuis (PMT) spanning aan om de punten te centreren.
OPMERKING: De PMT-spanning wordt gebruikt om de signaalsterkte van fotonen die worden gemeten te versterken; als de PMT-spanning te zwak is, worden er minder cellen gelezen en als de PMT-spanning te sterk is, worden cellen gemeten in de buurt van de maximale waarde en zijn verschillende celtypen niet van elkaar te onderscheiden. Een adequate PMT-spanning zorgt ervoor dat onafhankelijk te onderscheiden gebeurtenissen het strooiperceel zullen vullen. Gebeurtenisscheiding is gemakkelijker te visualiseren door logaritmische of biexponentiële schalen te projecteren op FSC- en SSC-spreidingspercelen. - Begin met het opnemen van de gebeurtenissen. Om het voorbeeld te behouden, pauzeert u de gegevensverwerving nadat ongeveer 15.000 gebeurtenissen zijn gelezen. In de meeste gevallen zal dit voldoende zijn om de totale celpopulatiepatronen te visualiseren. Nota meer gebeurtenissen als het analyseren en isoleren van kleine, gespecialiseerde celpopulaties.
- Maak op de eerste grafiek van FSC en SSC een selectie of poort van de cellen rond de 102-markering en hoger op de FSC X-as. Alles onder deze drempel is waarschijnlijk cellulaire puin. Teken rechthoekige poorten, dat is een regelmatige optie op flow cytometry software programma's en goed voor duidelijke, duidelijke cel populaties. Voor celpopulaties die een onregelmatigere vorm hebben op de spreidingspercelen, gebruikt u een veelhoekige gatingoptie.
OPMERKING: Een minimale cutoff van 102 op de voorwaartse spreiding moet selecteren voor de kleinste koraalcellen, maar kan verontreiniging van puin mogelijk maken. Om dit te wijzigen, verhoog de ondergrens van de gating om conservatiever te zijn. - Maak een nieuwe spreidingsplot die het DAPI-filter op de X-as en het APC-Cy7-filter op de Y-as uitdrukt. Selecteer hiervoor de poort voor intacte cellen die in stap 6.4 zijn gemaakt, klik met de rechtermuisknop en selecteer de optie om een nieuwe spreidingsplot te maken. Pas de assen aan op logaritmische of biexponentiële schalen.
OPMERKING: De stappen die nodig zijn om een nieuw plot te maken, kunnen variëren met verschillende softwareprogramma's. - Verwijder nu het controlemonster uit de cytometerkamer en vervang deze door de gekleurde cellen. Laat 30 s passeren voordat u begint met de analyse en het opnemen van de gegevens. Neem ongeveer 15.000 cellen op voordat ze worden onderbroken.
OPMERKING: De verschillende populatie(s) aan de hogere kant van de APC-Cy7 schaal zijn die met hoge rode autofluorescentie van Symbiodiniaceae. Er is geen vlek nodig om deze populatieonderbrekingen te visualiseren, en ze kunnen ook worden bekeken op de controlemonsteropname(figuur 3C). Selecteer voor de koraal-only populaties, die lager op de Y-as, voor verdere differentiatie. - Maak een nieuwe spreidingsplot van de aposymbiotische cellen om de ROS-concentraties (FITC-filter) en de cellen positief voor lysosomen (APC-filter) te visualiseren, opnieuw met behulp van logaritmische of biexponentiële schalen.
OPMERKING: Als er meerdere verschillende celpopulaties zijn die aposymbiotisch zijn, kan elk een andere afbeelding van het gebied(figuur 3C,D)verder worden onderscheiden. - Vergelijk de gekleurde monstergroep met de besturingselement, niet-bevlekte subset door de eerste opname van het besturingselementmonster te gebruiken of de controlegroep opnieuw in te brengen en opnieuw uit te voeren. Bek maak de gebeurtenissen die uniek zijn voor de gekleurde steekproefgroep.
7. FACS sortering en inzameling
OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het acquisitieprogramma in combinatie met de cytometer.
- Plaats microcentrifugebuizen (met 250-500 μL celkweekmedia of lysisbuffer op basis van het aantal verzamelde cellen en de opslagmethode) in de cytometer-verzamelkamer.
OPMERKING: De vertegenwoordigde stroomcytometer is in staat om vier verschillende populaties tegelijk te sorteren en de machine kan worden geconfigureerd om een verscheidenheid aan inzamelapparaten te bevatten, waaronder verschillende centrifugebuizen en 96 putplaten. - Zodra de cytometer begint te lezen van het monster en een passende hoeveelheid tijd is verstreken om te spoelen puin, beginnen met het sorteren van de gewenste populaties en overal te verzamelen van 20.000 cellen tot enkele miljoenen.
- Pas voor meer dan 500.000 cellen het volume van celkweekmedia of lysisbuffer en het volume van het verzamelapparaat aan.
- Voor in vitro studies, bewaar cellen op ijs totdat geplaatst in een incubator of gesteriliseerde omgeving.
- Voor moleculaire studies, onmiddellijk beginnen met het DNA / RNA / eiwit isolatie proces of flash bevriezen en op te slaan op -80 °C tot extractie.
- Elke keer dat een nieuwe vlek, soort of sorteerder wordt gebruikt, voert u een zuiverheidscontrole uit op de populatie van belang door ten minste 20.000 cellen van belang te sorteren in 500 μL kleuringsmedia, vervolgens de gesorteerde cellen opnieuw te analyseren en te bevestigen dat de cellen worden gelezen binnen de poort die wordt gebruikt om in eerste instantie te sorteren (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Over het algemeen is dit protocol nuttig omdat het de identificatie en verzameling van levende koraalcelpopulaties vergemakkelijkt die kunnen worden gebruikt voor functionele analyses. De workflow begon met de mechanische scheiding van koraalweefsels van het onderliggende calciumcarbonaatskelet(figuur 1). Dit is een van de belangrijkste eerste stappen, omdat onjuiste techniek resulteert in een hoge celsterfte en kan leiden tot grote hoeveelheden puin. Enzymatische scheiding wordt niet geadviseerd omdat het kan leiden tot verhoogde weefselschuif en hoge celsterfte. Mechanische scheiding met behulp van een airbrush vermindert deze uitdagingen (Figuur 2), het verminderen van de gemiddelde celsterfte tot ~ 10% (gegevens niet getoond). Na airbrush-gemedieerde mechanische scheiding van weefsels van het skelet, werd de resulterende drijfmest gefilterd op een cel suspensie door filtratie door middel van een celzeef. De celsuspensie werd vervolgens bevlekt met DNA (DAPI), ROS en lyssome markers en gelezen door de FACS cytometer. Vervolgens werd een gating strategie ontwikkeld voor het isoleren van specifieke celpopulaties op basis van de celmarkers die worden gebruikt. Gated celpopulaties werden vervolgens gesorteerd in opvangbuizen (figuur 1).
Bij het analyseren van monsters op de FACS cytometer werden verschillende stappen genomen om puin en dode cellen uit het monster te verwijderen. Symbiodiniaceae cellen kunnen selectief worden verwijderd indien gewenst als gevolg van hun autofluorescentie. Ten eerste werden puin en andere niet-cellulaire deeltjes die niet dezelfde vorm of granulariteit hebben als koraalcellen uit analyses verwijderd door een gatingselectie te maken op de voorwaartse (grootte) en zijkant (granulariteit)(figuur 3A). Vervolgens werden dode cellen uitgesloten door de niet-bevlekte controlecelsuspensie te vergelijken met dapi-gekleurd monster en ver-rood kanaal, en vervolgens de positieve cellen voor hoge DAPI-kleuring in het gekleurde monster te verwijderen(figuur 3B, celpopulatie P6). Tegelijkertijd werden cellen die autofluorescente Symbiodiniaceae hosten verwijderd door tegen cellen met een hoog signaal in het ver-rode kanaal te vechten(figuur 3B, APC-Cy7). Na dit iteratieve gatingproces vertegenwoordigen de resterende cellen voor analyses de intacte levende koraalcelpopulaties die Symbiodiniaceae missen.
Deze cellen kunnen vervolgens worden ingedeeld in verschillende celsubpopulaties door de controle- en gekleurde monsters te vergelijken door exogene vlekken toe te voegen voor functies zoals ROS-activiteit en/of lysosoomgehalte(figuur 3C). Zo bleek uit het onderzoek van de gegevens over de ROS- en lysosoom-vlekkende filters vier verschillende subpopulaties van koraalcellen. De ene celpopulatie had een relatief laag signaal voor lysosomale inhoud (APC-filter) en de andere drie hadden een hoog signaal in het lysosomale gehalte en een reeks ROS-activiteit (FITC-filter)(figuur 3C). Elk van deze subpopulaties kan individueel worden gesorteerd voor downstream-analyse, of verder worden geanalyseerd en ontleed in meer discrete subpopulaties door het snijpunt van grootte, granulariteit, autofluorescentie, en / of DNA-inhoud. In deze studie werden DNA, ROS-activiteit en lysosomale inhoud gebruikt om brede kenmerken van koraalcellen te identificeren. Belangrijk is dat dit algemene protocol kan worden aangepast aan een reeks fluorescerende markers en specifieke antilichaamsondes die kunnen worden gebruikt in combinatie voor de isolatie van gespecialiseerde celpopulaties van belang, zoals stamcellen.
Figuur 1: De algemene workflow van het koraalcelsorteerproces. Het aanbevolen protocol maakt het mogelijk om koralencellen uit het skelet te verwijderen voor vlekken, die vervolgens door de FACS-cytometer worden uitgevoerd, gemeten, geanalyseerd en geïsoleerd in celpopulaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Verwijdering van weefsel en cellen uit het koraalskelet. De luchtcompressor (A) dwingt lucht- en celvlekkende media(F)uit de airbrush(E)en werkt om het weefsel van het koraalskelet(C)te blazen en creëert een celdrijfmest in de zak(D). De maximale luchtdruk wordt geregeld door de drukmeter(B)op de luchtcompressor(A). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Gating selectie van levende koraalcellen. (A) Levende cellen werden geïsoleerd van puin met een minimale voorwaartse spreidingswaarde van 102. (B) Het APC-Cy7-filter werd gebruikt om rode autofluorescentie te identificeren, waarbij de door symbiont gehoste cellen effectief werden gescheiden, terwijl DAPI werd gebruikt om cellen te identificeren die zeer positief zijn voor DNA-vlekken. Die zeer positief voor DAPI waren indicatief voor dode en stervende cellen. CC,D) Extra markers voor ROS-activiteit en lysosoomgehalte werden gebruikt om verschillende koraalcelpopulaties verder te differentiëren. Alle gegevens werden later opnieuw geanalyseerd op FlowJo (v10) om deze grafieken te genereren. Het ingevoegde bevolkingslabel en percentage komt overeen met de microscopische foto's genomen van elke gesorteerde populatie(E). De percentages die in elk plot worden weergegeven, zijn van de totale cellen binnen dat perceel. Rechteronderbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Zuiverheidscontrole van de aan autofluorescente Symbiodiniaceae geassocieerde cellen. (A) Cellen die positief zijn voor fluorescentie op het APC-Cy7-filter uit het niet-bevlekte controlemonster werden gesorteerd. (B) Deze gesorteerde groep cellen werd vervolgens opnieuw uitgevoerd op de cytometer en opnieuw geanalyseerd onder dezelfde omstandigheden, met een zuiverheid van 94%. Voorwaartse spreiding (X-as, FSC) werd gebruikt voor de verankeringsas, maar is uitwisselbaar met een van de andere parameters. Hetzelfde proces kan worden uitgevoerd op gekleurde monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol werd aangepast van Rosental et al.18 en ontwikkeld voor de identificatie en isolatie van P. damicornis cellen. De methodologie richt zich op het proces van filteren monsters om puin te verwijderen, niet-levensvatbare cellen, en Symbiodiniaceae gehoste cellen door het onderzoek van cel intrinsieke factoren, met inbegrip van relatieve celgrootte, relatieve cel granulariteit, cel autofluorescentie, en de aanwezigheid van intacte cellulaire membranen. Deze technieken kunnen worden toegepast op andere koraalsoorten. FACS gatingstrategieën kunnen echter variëren als gevolg van soortenspecifieke verschillen in celpopulatiekenmerken.
Het nut van FACS voor het begrijpen van koraal gezondheid ligt in haar vermogen om diverse cel intrinsieke factoren te gebruiken om cellen te differentieel identificeren en isoleren. Verder beschrijft dit protocol het extra gebruik van exogene cellulaire vlekken om koraalcellen te onderscheiden op basis van levensvatbaarheid, reactieve zuurstofsoortenconcentratie en lysomavol gehalte. Van de meer dan 30 commerciële merkers die voorheen in Rosental et al.18werden getest, 24 gelabelde P. damicorniscellen, waarvan er 16 differentieel signaal produceerden, differentiatieclusters die de selectie van celsubpopulaties mogelijk zouden maken.
Een van de kritieke stappen van dit protocol is een goede weefselverwijdering en filtering om ervoor te zorgen dat weefselklonten worden gescheiden en niet blokkeren de laminaire stroom van de stroom cytometer. Een goede afstelling van de PMT-spanning is cruciaal voor de nauwkeurige detectie en analyse van onafhankelijke celdetectiegebeurtenissen. In vergelijking met eerdere werkzaamheden18, verbetert het proces van koraalcelisolatie van het onderliggende skelet via airbrush mechanische verstoring aanzienlijk bij traditionele schrapmethoden door het verminderen van puin en het maximaliseren van de levensvatbaarheid van de cel (~ 90%, figuur 2 en figuur 3A),waardoor latere analyses worden verbeterd door het verminderen van valse positieven als gevolg van lawaai.
De in dit document beschreven methodologie vergemakkelijkt de scheiding van koraalcelpopulaties door differentiële selectie op een kruising van morfologische en functionele kenmerken op een niveau dat voorheen niet mogelijk was. Met de ontwikkeling van FACS-methodologieën voor koraalcellen is het nu mogelijk om specifieke celonderpopulaties te selecteren voor het creëren van gedefinieerde celculturen, evenals voor indringende transcriptie- en epigenetische profielen die verband houden met specifieke celonderpopulaties. De toepassing van deze informatie op fijne schaal geeft inzicht in het celtype, het gedrag en de functie en kan kenmerken onthullen die verband houden met de evolutie van cnidarisch-specifieke celtypen zoals calicoblasten en cnidocyten. Bovendien kan de toepassing van FACS-technologie op de ontwikkeling van verbeterde stresstesten en biomarkers nuttig zijn voor de bescherming van ernstig bedreigde koraalriffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
NTK wil de University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering erkennen voor de financiering van dit onderzoek. BR wil Alex en Ann Lauterbach bedanken voor de financiering van het Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Het werk van BR werd ondersteund door Israel Science Foundation (ISF) nummers: 1416/19 en 2841/19, en HFSP Research Grant, RGY0085/2019. We willen Zhanna Kozhekbaeva en Mike Connelly bedanken voor de technische bijstand. We willen ook de Universiteit van Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource bedanken in het Sylvester Comprehensive Cancer Center voor toegang tot de FACS cytometer en aan Shannon Saigh voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
