Summary
האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.
Abstract
שוניות אלמוגים נמצאות תחת איום. עקב אנתרופוגניים שתוקפים התגובה הביולוגית של האלמוג לאותם לחצים עלולה להתרחש ברמה התאית, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. כדי לחקור את תגובת האלמוגים לתוקפים, אנו זקוקים לכלים לניתוח תגובות סלולריות. במיוחד, אנחנו צריכים כלים המאפשרים את היישום של מוסר פונקציונלי להבין טוב יותר כיצד אוכלוסיות תאים מגיבים ללחץ. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים במיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) כדי לבודד ולהפריד אוכלוסיות תאים שונות באלמוגים אבן. פרוטוקול זה כולל: (1) הפרדת רקמות האלמוגים מן השלד, (2) היצירה של השעיית תא יחיד, (3) תיוג התאים האלמוגים באמצעות סמנים שונים עבור הזרמת cy, ו (4) מיון ואסטרטגיות המיון תאים. שיטה זו תאפשר לחוקרים לעבוד על אלמוגים ברמה התאית לניתוח, משפט פונקציונלי, ולימודי גנים של אוכלוסיות תאים שונות.
Introduction
שוניות אלמוגים הן אחת. האקולוגיות החשובות בעולם הם מאפשרים ביולוגי על ידי מתן בתי גידול קריטיים לדגים וחסרי חוליות והם חיוניים לקיום קהילות אנתרופוגניים על ידי מתן מזון ופרנסה כלכלית באמצעות התיירות1. כמו בונה המפתח של שוניות אלמוגים, בעלי חיים אלמוג (Phylum: Cנדבך) גם מסייע לקהילות החוף על ידי יצירת מסגרות סידן פחמתי גדול ההקלת הנזק גל וסערה2.
אלמוגים כמו מבוגרים הם בעלי חיים sessile המארחים מגוון רחב של שותפים אנדוסימביוזה, כולל וירוסים, ארכאונים, חיידקים, protists פטריות, ובעיקר, חברים של פריחת אצות dinoflagellate משפחה Symbiodiniaceae3. שינויים בסביבה יכולים לגרום לחוסר איזון בקהילה זו, המובילה לעתים קרובות להתפרצויות של מחלות והלבנת אלמוגים שבה מגורשים הSymbiodiniaceae הסימביוטיים ממושבת האלמוגים, ובכך מבטלים את המקור העיקרי של תזונה לאלמוגים. שני תרחישים אלה לעתים קרובות לגרום למוות של מארח האלמוג4,5,6. השפעות אנתרופוגניים המושרה, כגון שינוי האקלים המהיר, הם האצת אירועי מוות של קורל המוני, המוביל לירידה גלובלית של שוניות האלמוגים7.
לאחרונה, הרבה שיטות שונות פיתחנו לסייע בהפחתת אובדן שונית האלמוגים. שיטות אלה כולל שתילת אלמוגים על שוניות קיימות, מעבר גנטי באמצעות גנוטיפים עמידים בפני חום, ותפעול הסלולר של החיידקים וקהילות סימביוטי אירח בתוך האלמוג8,9. למרות המאמצים הללו, הרבה נשאר לא ידוע על הגיוון תא אלמוגים ותפקוד התא10,11,12,13. הבנה יסודית של סוג תא אלמוגים מגוון ותפקוד התא הוא הכרחי כדי להבין כיצד האורגניזם האלמוג מתנהג בתנאים נורמטיביים ומלחיצים. המאמצים כדי למקסם את יעילות השיקום והשימור ייהנו מהבנה משופרת של איך תאים גיוון ותפקוד גנטי מצמידים.
העבודה הקודמת על תא גיוון ותפקוד התמקד בעיקר במחקרים היסטלוגיים ו-RNA רקמות שלמות בדגימה14,15,16,17. כדי לקבל פרטים רבים יותר על פונקציית סוג תא מסוימת באלמוגים, יש להיות שיטות לבידוד של אוכלוסיות מסוימות של תאי אלמוגים חיים. זה נעשה בהצלחה באורגניזמים שאינם קלאסיים מודל באמצעות מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) זרם cy, לנסות הטכנולוגיה18. FACS מנצל שילוב של לייזרים מכוונים אורכי גל משתנים כדי למדוד תכונות הסלולר שונים ברמת תא בודד כגון גודל התא היחסי, צפיפות התא, ו-פלואורסצנטית אוטומטי. בנוסף, התאים עשויים להיות מסומנים על-ידי התרכובות המסומנות באמצעות פלואורוסקופים כדי למדוד מאפיינים ספציפיים ורצויים18,19.
עד כה, היישום של הזרמת cy, לתאי אלמוגים הייתה בעיקר לניתוח של שיתופי Symbiodiniaceae ואוכלוסיות בקטריאלי אחרות על ידי ניצול חזק, טבעי שלהם האוטוקטנטית20,21,22. Facs יש גם שימש כדי להעריך את גודל הגנום אלמוג באמצעות אות ה-DNA הפלורסנט סמן לעומתהתייחסות מודלאורגניזם תאים23,24. היישום היעיל של FACS מספק שלושה כלים ברורים השימושיים עבור לימודי ביולוגיה של התא: 1) תיאור מורפולוגיים ופונקציונלי של תאים בודדים; 2) זיהוי, הפרדה ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עבור לימודי במורד הזרם; ו-3) ניתוח ההסכמה הפונקציונלית במפלס התא הבודד.
פיתוח ויישום של סמני פלורסנט שונים לחקר התאים האלמוגים נשאר כמעט נחקרו. סמנים כאלה עשויים לכלול חלבונים מתויגים, מתויג מצעים עבור אנזימים, או תגובות פלורסנט לתרכובות אחרות. ניתן להשתמש בסמנים אלה כדי לזהות סוגי תאים בעלי מאפיינים ייחודיים, כגון הדגשת תאים המייצרים כמויות שונות של תכונה מסוימת של תא תאי, כמו ליסוזומים. דוגמה נוספת היא השימוש בחרוזים בעלי תוויות פלואורוסקופים כדי לזהות מבחינה פונקציונלית תאים המוסמכים עבור phagocyציטוזה, או הבשלה של הפתוגן ממוקד25. אוכלוסיות של תאים הפעילים בתגובות חסינות ניתן לזהות בקלות על ידי FACS לאחר שתבלע את החרוזים האלה להחיל באופן שלאחר. בעוד שיטות היסטולוגית מסורתיות דורשות רקמה שנשמרה ושעות רבות כדי לקירוב אחוז התאים חיובי עבור חרוז השחב, מבוסס FACS מבוססי פונקציונליות תפקודית עבור הפתוגן שתבלע ניתן לבצע במהירות יחסית על תאים חיים מבודדים. בנוסף ללימוד תגובות התאים הספציפיים ללחץ, טכנולוגיה זו יש פוטנציאל להבהיר ביטוי גנטי ספציפי ולהאיר את ההיסטוריה ההתפתחותית של סוגי תאים ייחודיים לחלוטין לקטענים, כגון calicoblasts חזיק ו cnidocציטים.
לאחרונה, ביצעו הקרנה אינטנסיבית של מעל 30 סמנים סלולריים שגרמו לזיהוי 24 כי הם מסוגלים לתייג תאים אלמוג, 16 מהם שימושיים להבחנה בין אוכלוסיות ייחודיות18, מה שהופך אותם אשכולות של בידול (CD). כאן אנו מתארים את התהליך של בידוד תא אלמוגים ב Pocillopora damicornis מהסרת תאים משלד סידן פחמתי לזיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות עם facs (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דיסוציאציה של רקמות משלד אלמוג דרך airbrush ו מדחס
הערה: בצע צעדים על הקרח והגן על הידיים עם כפפות.
- להרכיב את ערכת airbrush על ידי חיבור מדחס אוויר, צינור, מברשת אוויר (איור 2). הפעילו את מד הלחץ בין 276 ל-483 kPa.
הערה: המדחס וצינור האוויר המומלצים המשמשים למחקר זה הוגדר מראש ללחץ מרבי של 393 kPa. השימוש מחוץ לטווח זה 276-483 kPa עלול לגרום להסרת תאים לא מספקת משלד או מקרע של קרום התא. טווח זה עשוי להיות שונה עבור כל מינים והוא עשוי לדרוש בדיקת כדאיות. בדיקת הכדאיות ניתן לבצע עם קבוצת משנה של העישון התא עם הומוציטוטומטר פשוט ו 4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI) שיטת הדרה, דמיינו על מיקרוסקופ מורכב. - להכין 100 mL של תא צביעת המדיה באוטוקלבד, מכולה מזכוכית סטרילית על ידי הוספת 33 mL של מלוחים 10x פוספט באגירה (PBS; ללא סידן ומגנזיום) לריכוז הסופי של 3.3 x, 2 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS; החום מופעל ב 56 ° c עבור 30 דקות) כדי 2% של נפח סה כ, ו 2 מ ' 1 מאגר HEPES לריכוז הסופי ואז למעלה ב 100 mL עם מים סטריליים.
הערה: ההתרכזות של 3.3 x PBS נבחרה לחקות את המליחות של מי הים, כפי שמתואר ברוזנטל ואח '18. ריכוז זה צריך להיות מותאם עבור מינים שנמצאו בסביבות אחרות כדי לחקות את המליחות שלהם. - העבר 10 mL של תא צביעת מדיה לבקבוק מברשת אוויר (המסומן "F" באיור 2) וחבר את מכסה המתאם עבור מחבר airbrush.
הערה: שברים ומינים גדולים יותר עם שכבות רקמה עבות יותר עשויים לדרוש מדיה נוספת להסרת רקמות מתאימות. - עבור מינים אלמוגים הסתעפות הפגינו כאן, להשתמש חותך עצם לגזור או לחתוך רסיס אלמוג כ 3-5 ס מ אורך או 4 ס מ2 באזור.
הערה: על הרסיס להיות ברור של מאקרואצות ואורגניזמים אחרים בעלי ממון, מכיוון שלא ניתן להסיר את הדגימה מהמדגם במורד הזרם ולזהם את המדגם במהלך ניתוח ה-FACS ומיון התהליכים. קטע 1 ס מ של P damicornis נותן כ 2-10 x 106 תאים לאחר סינון, כתמים, וכביסה. - מניחים את רסיס אלמוג בתוך שקית אוסף פלסטיק ולהשתמש מברשת אוויר כדי לרסס את התא צביעת המדיה על האלמוג (איור 2). המשך בתהליך זה עד שרוב השלד נחשף. הסר את השלד הנותר משקית הגבייה.
2. דיסוציאציה של תאים מרקמת האלמוגים
הערה: בצע את כל השלבים על הקרח ולהגן על הידיים עם כפפות.
- לסנן את התא מתוך דרך מסננת 40 יקרומטר תא ניילון לתוך צינור הצנטריפוגה 50 mL כדי להשיג השעיה תא יחיד.
הערה: שינוי גודל מסננת תאים שונים עשוי להתאים יותר למינים שונים. עם זאת, גודל גדול יותר עלול לגרום לדיסוציאציה רקמת לקוי בשל מעבר של פסולת וגושים תאים.- עבור דגימות עם שכבות ריר עבה יותר, להשתמש בבוכנה מעוקר של מזרק פלסטיק 1 mL בעדינות לטחון אותו נגד המסנן כדי לשבור את הגושים ולעזור התאים לעבור דרך מסננת. לשטוף את מסננת ואת הבוכנה עם תא צביעת מדיה לתוך צינורית צנטריפוגה.
- להוריד את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° צ' ב 450 x g עבור 5 דקות. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1 mL של מדיות תאים לצביעת.
3. צביעת תאים
הערה: בצע את כל השלבים על הקרח ולהגן על הידיים עם כפפות. כתמים המוצגים בפרוטוקול זה הם למטרות ייצוג. כתמים חלופיים ידרוש ריכוזים שונים וזמני דגירה.
- העבר 500 μL של תאים ממושהים לשפופרת באורך 5 מ ל והגדר בצד כדוגמת בקרה. אל תוסיף כתם לסימן זה.
- אל ההשעיה התא הנותרים, להוסיף 0.42 μl של 12 מ"מ dapi הכדאיות לצבוע (טבלת חומרים), 1 μl של 5 מיני חמצן מגיב μm (רוס) כתם (לוח חומרים), ו 0.1 μl של 0.2 μm ליזוזום כתם (לוח חומרים). פיפטה היטב כדי לערבב ו-דגירה על הקרח 30 דקות בחושך כדי למנוע הלבנה.
הערה: DAPI משמש בדוגמה זו כדי לעבוד ככתם דנ א לצבוע את היכולת הדיפרנציאלית של תאים מתים במכונת FACS. ההנחה היא כי DAPI חודר לתאי המוות בשל שלמות הממברנה. הכתם של רוס פולט אור בטווח ננומטר 520 (ירוק), בעוד סמן lysoזומל פולט אור ב כ 668 ננומטר (אדום). - גלולה 500 μL של התאים ויטראז על ידי צנטריפוגה ב 4 ° c ב 450 x g עבור 5 דקות. להסיר את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב 500 μl של מדיה צביעת תאים. העבר לצינור חדש באורך 5 מ ל. והחנות על הקרח
4. הפעלת FACS
הערה: השלבים עשויים להשתנות בהתאם להפוך ודגם של cytometer עקב הבדלים של לייזרים וערוצים. עבור פרוטוקול זה, cytometer עם 405, 488, 535, ו 640 לייזרים באורך גל ננומטר שימש. מסננים המוצגים בפרוטוקול זה הם למטרות ייצוג. כתמי תאים חלופיים עשויים לדרוש ערכה שונה של מסננים ולייזרים.
- התחל ליצור תבנית פרוייקט חדשה בתוכנת הסדרן ובחר בלוח הלייזר. עבור השילוב המיוצג של כתמים וקרינה פלואורסצנטית טבעי, בחר את כל ארבע לייזרים (405, 488, 535, ו 640 nm).
- בחר את המסננים המתאימים עבור כל צבע צפוי המיוצג בניסוי.
- כדי לזהות את פליטת ה-DAPI ולסייע בהפרדת התאים החיים והמתים, השתמש במסנן עם מעבר בנדנה (BP) של 450/50 (425-475 מגוון ננומטר) כגון DAPI, Hoeschst או מסנן כחול פסיפיק.
- לאיתור אור הנפלט על ידי האות הירוק ROS, להשתמש במסנן עם BP של 530/30 (אורך הגל של 515-545 ננומטר) כגון fluorescein isothiocyanate (FITC) או חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מסנן. מסנן זה יהיה למדוד את הריכוז של רוס בכל תא.
- הוסף מסנן נוסף עם BP של 670/30 (655-685 ננומטר טווח) כגון מסנן allophycocyanin (APC) לאיתור פליטת הכתם lysoזומבית.
הערה: ערוץ APC יאפשר מדידה של פעילות phagocytic. ערוץ זה יזהה גם את הפלואורסצנטית האוטומטי שנוצר על ידי אצות סימביוטי אלמוגים מהמשפחה Symbiodiniaceae. האות ניתן להפריד באמצעות ערוץ נוסף בעל אורך גל ארוך יותר מאשר מסנן APC, עם זאת. - כלול מסנן שיש לו BP של 780/60 (750-810 ננומטר טווח), כגון phycoerythrin הנפוץ ביותר, cyanine filter (APC-Cy7), אשר מזהה את הפליטה של האדום הרחוק באופן אוטומטי מSymbiodiniaceae ומסייע בבידוד של תאים האפוסימביוזה.
5. התקנת ההתקנה של FACS
הערה: השלבים עשויים להשתנות בהתאם לייצור ולדגם של הציטומטר ותוכנית הרכישה יחד עם הציטומטר.
- על המסך הנסיוני של הפרוייקט של התוכנה cy, ליצור מגרש פיזור ובחר פיזור הקדמי (FCS) כמדד עבור ציר ה-X ופיזור הצד (הסוכנות התחתית) עבור ציר ה-Y.
הערה: FCS מתאים לגודל התא ולקשר עם צפיפות הרשת. זה יאפשר הסרת רוב פסולת, כפי שרוב יהיה קטן יותר תאים שלמים. - הגדר את הצירים לסרגל לוגריתמי או לסולמות דו-מעריכית, כאשר גודל התאים וצפיפות הרשת עשויים להשתנות לפי מספר הזמנות של סדר גודל (איור 3א), במיוחד באלמוגים.
6. מכונות ניתוח ובידוד תאים
הערה: השלבים עשויים להשתנות בהתאם לסוג ולדגם של הציטומטר ותוכנית הרכישה המממנת.
- מקם את הפקד (כלומר, מערכת המשנה של התא הבלתי מוכתם) בחדר המדגם של cytometer ולהתחיל את תהליך הקריאה. כאשר המחשב מתחיל לקבל נתונים מכל תא או אירוע, הנקודות יתחילו להופיע בהתוויה של פיזור. כדי לנקות את כל הפסולת שנותרה בתאי cytometer מן הניסויים הקודמים, לאפשר כ 30 s לעבור לפני תחילת הניתוח.
- בחלקת הפיזור, התאימו את מתח הצינור הפוטוסולייתי (PMT) במטרה למרכז את הנקודות.
הערה: מתח ה-PMT משמש כדי להגביר את עוצמת האות של הפוטונים הנמדדים; אם מתח ה-PMT חלש מדי, מספר קטן יותר של תאים ייקרא, ואם מתח ה-PMT חזק מדי, התאים יימדדו בקרבת ערך מרבי וסוגי תאים שונים יהיו זהים זה לזה. מתח מספיק של PMT מבטיח שאירועים באופן עצמאי יאכלס את מגרש הפיזור. קל יותר להמחיש את הפרדת האירועים על-ידי הקרנת קשקשים לוגריתמיים או מעריכי על חלקות פיזור של FSC ו-אס. אס. - התחל להקליט את האירועים. כדי לשמר את המדגם, להשהות רכישת נתונים לאחר כ 15,000 אירועים נקראו. ברוב המקרים, זה יהיה מספיק כדי להמחיש את דפוסי האוכלוסיה הכוללת של התאים. הקלט אירועים נוספים אם יש לנתח ולבודד אוכלוסיות תאים קטנות ומיוחדות.
- בגרף הראשון של FSC ו-אס. אס. או, צור בחירה, או שער, של התאים מסביב לסימן 102 וגבוה יותר בציר ה-X fsc. כל מה שמתחת לסף זה. הוא כנראה שרידים סלולאריים לצייר שערים מלבני, שהיא אופציה רגילה על הזרימה cy, לנסות תוכנות תוכנה וטוב ברור, אוכלוסיות תאים נפרדות. עבור אוכלוסיות תאים המשתמשות בצורה חריגה יותר על מחלקות הפיזור, השתמשו באפשרות ' מצולע '.
הערה: ניתוק מינימלי של 102 על פיזור קדימה צריך לבחור עבור התאים האלמוגים הקטנים ביותר אך עשוי לאפשר זיהום של פסולת. כדי לתקן את זה, להגדיל את הגבול התחתון של השביל להיות שמרני יותר. - צור מגרש פיזור חדש המבטא את מסנן DAPI בציר ה-X והמסנן APC-Cy7 בציר ה-Y. לשם כך, בחר את השער עבור תאים שלמים שנוצרו בשלב 6.4, לחץ לחיצה ימנית ובחר באפשרות כדי ליצור מגרש פיזור חדש. התאם את הצירים לסולמות לוגריתמי או לקשקשים מעריכיים.
הערה: השלבים הדרושים ליצירת מזימה חדשה עשויים להשתנות עם תוכנות שונות. - עכשיו להסיר את דגימת בקרת מן התא cytometer ולהחליף עם תאים ויטראז '. אפשר 30 s לעבור לפני תחילת הניתוח והקלטת את הנתונים. הקלט כ 15,000 תאים לפני השהיה.
הערה: האוכלוסיה הנבדלת (ים) בקצה העליון של קנה המידה של APC-Cy7 הם אלה עם קרינה אוטומטית גבוהה אדום מ-Symbiodiniaceae. אין צורך בכתם כדי להמחיש את הפסקות האוכלוסיה הללו, וניתן גם לצפות בהן בהקלטה לדגימת הבקרה (איור 3ג). בחרו לאוכלוסיות האלמוגים בלבד, אלה הנמוכות יותר על ציר Y, לצורך בידול נוסף. - צור מגרש פיזור חדש של התאים האפוסימביוזה כדי להמחיש את ריכוזי ה-ROS (מסנן FITC) והתאים חיוביים לlysosomes (מסנן APC), שוב ניצול קשקשים לוגריתטיות או מעריכי.
הערה: אם יש מספר אוכלוסיות תאים שונות, כי הם שיתופי, כל אחד יכול להיות מכובד יותר בתוך מגרש פיזור משלו (איור 3C, D). - השווה את קבוצת הדוגמאות המוכתמת כנגד הפקד, תת-ערכה ללא המוכתמת על-ידי שימוש בהקלטה הראשונה של דגימת הפקד או הוספה מחדש של קבוצת הבקרה והכנסתו. שער את האירועים הייחודיים לקבוצת הדוגמאות המוכתמת.
7. מיון וגבייה של FACS
הערה: השלבים עשויים להשתנות בהתאם לייצור ולדגם של הציטומטר ותוכנית הרכישה יחד עם הציטומטר.
- עם מבחר של תאים שנבחרו לאסוף, מקום צינורות מיקרוצנטריפוגה (המכיל 250-ליטר μL של מדיה תרבות התא או מאגר לליזה מבוסס על מספר תאים שנאספו ושיטת אחסון) בחדר האוסף cytometer.
הערה: cytometer הזרימה המיוצגת מסוגל למיין ארבע אוכלוסיות שונות בכל פעם, ואת המכונה ניתן להגדיר להחזיק מגוון של התקני איסוף, כולל צינורות צנטריפוגה שונים ו 96 צלחות היטב. - לאחר cytometer מתחיל לקרוא את המדגם וכמות מתאימה של זמן עבר לשטוף את הפסולת, להתחיל למיין את האוכלוסיות הרצויות לאסוף מקום מ 20,000 תאים לכמה מיליונים.
- עבור יותר מ-500,000 תאים, התאם את נפח המדיה של תרבות התא או מאגר הליזה, ואת אמצעי האחסון של התקן האיסוף.
- עבור לימודי חוץ גופית, לאחסן תאים על הקרח עד ממוקם בחממה או בסביבה מחוטאת.
- למחקרים מולקולריים, באופן מיידי להתחיל את התהליך בידוד DNA/RNA/חלבון או להקפיא פלאש ולאחסן ב-80 ° c עד החילוץ.
- בכל פעם כתם חדש, מינים, או מסדר משמש, לבצע בדיקת טוהר על אוכלוסיית העניין על ידי מיון לפחות 20,000 תאים של עניין לתוך 500 μL של צביעת מדיה, לאחר מכן ניתוח מחדש של תאים ממוינים מאשרת כי התאים הם להיקרא בתוך השער המשמש בתחילה מיון (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באופן כללי, פרוטוקול זה שימושי משום שהוא מסייע לזיהוי ולאיסוף של אוכלוסיות של תאי אלמוגים חיים שניתן להשתמש בהן לניתוחים פונקציונליים. זרימת העבודה החלה עם הפרדה מכנית של רקמות אלמוגים מן השלד סידן פחמתי הבסיסית (איור 1). זהו אחד השלבים הראשוניים החשובים ביותר, כי התוצאות טכניקה לא הולמת בתמותת תאים גבוהה והוא יכול ליצור כמויות גדולות של פסולת. הפרדה אנזימטית אינה מומלץ משום שהיא עלולה לגרום להטיה מוגברת של רקמות ולתמותת תאים גבוהה. הפרדה מכנית באמצעות מברשת אוויר מקטינה את האתגרים (איור 2), הפחתת תמותת התאים הממוצעת ל-~ 10% (נתונים לא מוצגים). בעקבות airbrush-תיווך הפרדה מכנית של רקמות מן השלד, השאיפה שנוצר היה מסונן לתא השעיה על ידי סינון דרך מסננת תא. ההשעיה התא היה אז מוכתם ב-DNA (dapi), ROS, ו ליזוזום סמנים ולקרוא על ידי cytometer facs הציטומטר. אסטרטגיה מבוססת אז פותחה לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות המבוססות על סמני התא בשימוש. לאחר מכן מוינו אוכלוסיות תאים מגודרת לצינורות גבייה (איור 1).
בעת ניתוח דגימות על cytometer מספר צעדים נלקחו כדי להסיר את הפסולת ואת התאים המתים מן המדגם. תאים Symbiodiniaceae יכול להיות הוסר באופן סלקטיבי אם הצורך עקב שלהם autoפלואורסצנטית. ראשית, פסולת וחלקיקים לא-סלולריים אחרים שלא שתפו את אותה צורה או את אותה הצפיפות כמו תאי אלמוגים הוסרו מניתוחים על-ידי יצירת בחירת מעבר (גודל) ופיזור (איור 3א). בשלב הבא, תאים מתים לא נכללו על ידי השוואת ההשעיה תא בקרה בלתי מוכתם נגד DAPI מוכתם הערוץ האדום הרחוק, ואז להוציא את התאים החיוביים לצביעת DAPI גבוה במדגם מוכתם (איור 3B, P6 האוכלוסייה תאים). במקביל, תאים המארחים פלורסנט autofluorescent הוסרו על ידי באמצעות באמצעות באמצעות התאים עם אות גבוה בערוץ הרחוק-אדום (איור 3B, APC-Cy7). לאחר תהליך איטרטיבי זה, התאים הנותרים לניתוח מייצגים את אוכלוסיית תאי האלמוגים החיה ללא הSymbiodiniaceae.
תאים אלה יכול להיות מסווג לתוך אוכלוסיות שונות משנה על ידי השוואת שליטה ומוכתם דגימות על ידי הוספת כתמי אקסוגני עבור תכונות כגון הפעילות ROS ו/או ליסוקכמה תוכן (איור 3ג). לדוגמה, בחינת הנתונים על המסננים ROS-ו lysosome המכילים מסננים התגלו ארבע אוכלוסיות משנה נפרדות של תאי אלמוגים. אחד האוכלוסייה התא היה אות נמוך יחסית עבור תוכן lysoזומבית (מסנן APC) ושלושה אחרים היה אות גבוה בתוכן lysoזומא ומגוון של פעילות ROS (מסנן FITC) (איור 3ג). כל אחת מאוכלוסיות משנה אלה יכולה להיות ממוינת בנפרד עבור ניתוח במורד הזרם, או מנותח נוספת ומנותח לתוך אוכלוסיות משנה דיסקרטית יותר על ידי הצטלבות של גודל, צפיפות, התאמה אוטומטית, ו/או תוכן DNA. במחקר זה, דנ א, הפעילות ROS, ותוכן lysoזומא שימשו כדי לזהות מאפיינים רחבים של תאי אלמוגים. חשוב מכך, פרוטוקול כללי זה יכול להיות מותאם למגוון של סמנים פלורסנט, כמו גם בדיקה נוגדנים ספציפיים כי ניתן להשתמש בשילוב לבידוד של אוכלוסיות תאים מיוחדות של עניין כגון תאי גזע.
איור 1: זרימת העבודה הכללית של תהליך המיון של תאי האלמוגים. הפרוטוקול הכולל מאפשר הסרה של תאי אלמוגים מן השלד עבור כתמים, אשר לאחר מכן להפעיל דרך cytometer מודד, מנותח, ומבודדים לתוך אוכלוסיות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הסרת רקמות ותאים משלד האלמוגים. מדחס האוויר (א) כוחות האוויר ותא מכתים מדיה (F) מתוך מברשת האוויר (E) ועובד לפוצץ את הרקמה משלד האלמוגים (ג) ויוצר שאיפה תא בשקית (ד). לחץ האוויר המקסימלי נשלט על ידי מד לחץ (ב) על מדחס האוויר (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבחר של תאי אלמוגים חיים. (א) תאים חיים מבודדים מפסולת תוך שימוש בערך פיזור מינימלי של 102. (ב) מסנן APC-Cy7 שימש כדי לזהות באופן אוטומטי אדום, המפריד ביעילות את התאים המתארחים באמצעות הסימביוזה, בעוד dapi שימש לזיהוי תאים חיוביים מאוד לצביעת DNA. אלה חיוביים מאוד עבור DAPI הצביע על תאים מתים וגוססים. (ג,ד) סמנים נוספים עבור פעילות ROS ו ליזוזום תוכן שימשו כדי להבדיל עוד יותר אוכלוסיות תאים אלמוגים שונים. כל הנתונים נותחו מחדש במועד מאוחר יותר ב-FlowJo (v10) כדי ליצור גרפים אלה. תווית האוכלוסיה שנוספה ואחוז המתאים לתצלומים המיקרוסקופיים של כל אוכלוסיה ממוינת (E). האחוזים המוצגים בכל אחת מההתוויה הם של התאים הכולל בחלקה זו. סרגל בקנה מידה ימני תחתון = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בדיקת טוהר של התאים הSymbiodiniaceae-פלורסנט האוטומטית. (A) תאים בעלי הקרינה הפלואורסצנטית על מסנן APC-Cy7 מתוך דגימת בקרת הבלתי מוכתם היו ממוינים. (ב) זו קבוצה ממוינת של תאים הופעל לאחר מכן על cytometer ונותח מחדש בתנאים זהים, מראה 94% טוהר. פיזור העברה (ציר X, FSC) שימש עבור ציר העיגון, אך הוא להחלפה עם כל אחד מהפרמטרים האחרים. ניתן לבצע את אותו תהליך על דגימות מוכתמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הותאם מרוסנטל ואח 'בן 18 והתפתח לזיהוי ולבידוד של התאים המדמוליים . המתודולוגיה מתמקדת בתהליך של סינון דגימות כדי להסיר פסולת, תאים שאינם קיימא, ו-Symbiodiniaceae תאים מתארחים באמצעות בחינת גורמים פנימיים תא, כולל גודל תא יחסי, צפיפות תא יחסי, התאים האוטומטיים של התא, ואת הנוכחות של קרומים סלולריים שלמים. טכניקות אלה ניתן להחיל על מינים אלמוגים אחרים. עם זאת, האסטרטגיות של FACS לאחר מכן עשויות להשתנות עקב הבדלים ספציפיים למינים במאפיינים של אוכלוסיית תאים.
השירות של FACS להבנת בריאות האלמוגים טמון ביכולתה להשתמש גורמים פנימיים מגוונים של התא כדי לזהות ולבודד תאים באופן דיפרנציאלי. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר את השימוש הנוסף של כתמים סלולריים אקסוגני כדי להבדיל בין תאי אלמוגים המבוססים על יכולת הקיום, ריכוז מיני חמצן תגובתי, ו ליזוזום תוכן. מתוך 30 הסמנים המסחריים שנבדקו בעבר ברוסנטל ואח '18, 24 מתויג בתאי damicornis , שמהם 16 הופק אות דיפרנציאלי, אשכולות של בידול שיאפשרו בחירת אוכלוסיות משנה של תאים.
אחד השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הוא הסרת רקמות נאות וסינון כדי להבטיח כי הגושים הרקמה הם הנתק ולא לחסום את הזרימה למינארי של הזרימה cytometer. התאמה נכונה של מתח ה-PMT חיונית לאיתור וניתוח מדויקים של אירועי זיהוי תאים עצמאיים. בהשוואה לעבודה הקודמת18, התהליך של בידוד תא אלמוג מן השלד הבסיסי באמצעות airbrush שיבוש מכני משתפר באופן משמעותי על ידי הפחתת הפסולת ולמקסם את הכדאיות התא (~ 90%, איור 2 איור 3A), ובכך לשפר את הניתוחים הבאים על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שווא בשל רעש.
המתודולוגיה המתוארת במאמר זה מקלה על הפרדת אוכלוסיות של תאי אלמוגים באמצעות בחירה דיפרנציאלית בהצטלבות של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים ברמה שאינה אפשרית בעבר. עם התפתחות של מתודולוגיות FACS עבור תאי אלמוגים, כעת ניתן לבחור אוכלוסיות משנה ספציפיות ליצירת מוגדרים של תרביות תאים, כמו גם עבור בדיקה הטרנססקריפט ו אפיגנטיים פרופילים הקשורים לאוכלוסיות משנה מסוימים תאים. היישום של מידע משובח זה יספק תובנה לסוג תא, התנהגות ופונקציה, ועשוי לחשוף מאפיינים הקשורים לאבולוציה של סוגי תאים ספציפיים של cנדבך, כגון calicoblasts ו cnidocציטים. בנוסף, היישום של טכנולוגיית FACS לפיתוח של הלחץ משופרת מדגיש ובסמנים עשויים להוכיח שימושי להגנה על שוניות אלמוגים חמורות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
NTK מעוניין להכיר בפרסי המחקר של אוניברסיטת מיאמי במדעי הטבע והנדסה למימון מחקר זה. BR רוצה להודות לאלכס ואן נשקף על מימון המעבדה השוואתית והאבולוציונית לאימונולוגיה. עבודתו של BR נתמכת על ידי מספרי הקרן הלאומית למדע: 1416/19 ו-2841/19, ו-HFSP מלגת מחקר, RGY0085/2019. אנחנו רוצים להודות לזחנה קוז'קאבה ולמייק קונלי לסיוע טכני. היינו גם רוצים להודות לאוניברסיטת מיאמי, בית הספר מילר של זרימה cy, מחלקת הרפואה של משאבים משותפים במרכז הסרטן סילבסטר מקיף לקבלת גישה לציטוטוטר FACS ו שאנון סאין לתמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
