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Biology

स्लेरेक्टिनियन सेल आबादी के अलगाव के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/60446
Automatic Translation
1, 2, *1, *3
1Department of Marine Biology and Ecology, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, University of Miami, 2Department of Biology, University of Miami, 3The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, Faculty of Health Sciences, and Regenerative Medicine and Stem Cell Research Center, Ben Gurion University of the Negev
* These authors contributed equally

Summary

कोरल मनुष्यों और समुद्री जीवों दोनों के लिए महत्वपूर्ण जैव विविध पारिस्थितिकी तंत्र बनाते हैं। हालांकि, हम अभी भी कई कोरल कोशिकाओं की पूरी क्षमता और कार्य को नहीं समझते हैं। यहां, हम पथरीले कोरल सेल आबादी के अलगाव, लेबलिंग और पृथक्करण के लिए विकसित एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

Abstract

मानवजनित तनाव के कारण प्रवाल भित्तियों को खतरा है। इन तनावों के लिए कोरल की जैविक प्रतिक्रिया सेलुलर स्तर पर हो सकती है, लेकिन तंत्र को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। तनाव के लिए कोरल प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, हम सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए उपकरणों की जरूरत है । विशेष रूप से, हम उपकरण है कि कार्यात्मक परख के आवेदन की सुविधा को बेहतर समझने की कैसे सेल आबादी तनाव पर प्रतिक्रिया कर रहे है की जरूरत है । वर्तमान अध्ययन में, हम पथरीले कोरल में विभिन्न सेल आबादी को अलग करने और अलग करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करते हैं। इस प्रोटोकॉल में शामिल हैं: (1) कंकाल से कोरल ऊतकों का पृथक्करण, (2) एक सेल निलंबन का निर्माण, (3) प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विभिन्न मार्कर का उपयोग करके कोरल कोशिकाओं को लेबल करना, और (4) गेटिंग और सेल छंटाई रणनीतियां। इस विधि शोधकर्ताओं को विश्लेषण, कार्यात्मक परख, और विभिन्न सेल आबादी के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए सेलुलर स्तर पर कोरल पर काम करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।

Introduction

प्रवाल भित्तियां पृथ्वी पर सबसे महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी प्रणालियों में से एक हैं। वे मछली और अकशेरुकी के लिए महत्वपूर्ण आवास प्रदान करके जैव विविधता को सुगम बनाते हैं और पर्यटनकेमाध्यम से भोजन और आर्थिक आजीविका प्रदान करके मानवजनित समुदायों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । प्रवाल भित्तियों के प्रमुख निर्माता के रूप में, कोरल पशु (फिलम: Cnidaria) भी बड़े कैल्शियम कार्बोनेट चौखटे है कि लहर और तूफान क्षति2को कम बनाने के द्वारा तटीय समुदायों एड्स ।

वयस्कों के रूप में कोरल सेसिले जानवर हैं जो वायरस, आर्काया, बैक्टीरिया, प्रोटिस्ट, कवक और सबसे विशेष रूप से, शैवाल डिनोफ्लेलेट परिवार के सदस्यों सहित एंडोसिम्बिक भागीदारों की एक विस्तृत सरणी की मेजबानी करतेहैं। पर्यावरण में परिवर्तन इस समुदाय में असंतुलन पैदा कर सकता है, अक्सर रोग फैलने और कोरल ब्लीचिंग का कारण बनता है जिसमें सहजीवी सिम्बायोडिनेसी को कोरल कॉलोनी से निष्कासित कर दिया जाता है, इस प्रकार कोरल के लिए पोषण के प्रमुख स्रोत को नष्ट कर देता है। ये दोनों परिदृश्य अक्सर मूंगा मेजबान4,5,6की मृत्यु का कारण बनते हैं . मानवजनित प्रेरित तनावों के प्रभाव, जैसे कि तेजी से जलवायु परिवर्तन, बड़े पैमाने पर प्रवाल मृत्यु की घटनाओं में तेजी ला रहे हैं, जिससे प्रवाल भित्तियों की वैश्विक गिरावट7है ।

हाल ही में, प्रवाल चट्टान के नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए कई अलग-अलग तरीके विकसित किए गए हैं। इन तरीकों में मौजूदा भित्तियों पर कोरल का रोपण, थर्मल सहिष्णु जीनोटाइप का उपयोग करके आनुवंशिक क्रॉसिंग, और कोरल8,,9के भीतर आयोजित माइक्रोबियल और सहजीवी समुदायों में सेलुलर हेरफेर शामिल हैं। इन प्रयासों के बावजूद, कोरल सेल विविधता और सेल फ़ंक्शन10,11 ,12,,1313के बारे में बहुत कुछ अज्ञात है। कोरल सेल प्रकार विविधता और सेल फ़ंक्शन की पूरी समझ यह समझने के लिए आवश्यक है कि प्रवाल जीव मानक और तनावपूर्ण परिस्थितियों में कैसे व्यवहार करता है। बहाली और संरक्षण दक्षता को अधिकतम करने के प्रयासों को कैसे सेल विविधता और जीन समारोह युग्मित कर रहे है की एक बढ़ाया समझ से लाभ होगा ।

सेल विविधता और कार्य पर पिछला कार्य मुख्य रूप से हिस्टोलॉजिकल अध्ययन और पूरे ऊतक आरएनए नमूने14,15,1616,17पर केंद्रित है । कोरल में विशिष्ट सेल प्रकार समारोह पर अधिक से अधिक विस्तार प्राप्त करने के लिए, लाइव कोरल कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी के अलगाव के लिए तरीके होने की आवश्यकता है। यह फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) प्रवाह साइटोमेट्री प्रौद्योगिकी18के माध्यम से गैर-शास्त्रीय मॉडल जीवों में सफलतापूर्वक किया गया है। FACS एकल कोशिका स्तर पर विभिन्न एंडोजेनस सेलुलर गुणों जैसे सापेक्ष कोशिका आकार, सेल दानेदारता और ऑटोफ्लोरेसेंस को मापने के लिए अलग-अलग तरंगदैर्ध्य को देखते लेजर के संयोजन का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को विशिष्ट, वांछित गुणों को मापने के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल यौगिकों द्वारा चिह्नित किया जा सकता है18,,19।

इस प्रकार अब तक, कोरल कोशिकाओं में प्रवाह साइटोमेट्री का अनुप्रयोग मुख्य रूप से अपने मजबूत, प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस20,,21,,22का उपयोग करके सहजीवी सिम्बायोडिनेसी और अन्य जीवाणु आबादी के विश्लेषण के लिए किया गया है। रेफरेंस मॉडल ऑर्गेज्म कोशिकाओं23,24की तुलना में फ्लोरोसेंट डीएनए मार्कर सिग्नल का उपयोग करके प्रवाल जीनोम आकार का अनुमान लगाने के लिए एफएसीएस का भी उपयोग किया गया है । FACS का कुशल अनुप्रयोग तीन अलग-अलग उपकरण प्रदान करता है जो सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उपयोगी हैं: 1) एकल कोशिकाओं का रूपात्मक और कार्यात्मक विवरण; 2) डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए विशिष्ट सेल आबादी की पहचान, अलगाव और अलगाव; और 3) एकल कोशिका स्तर पर कार्यात्मक परखों का विश्लेषण।

कोरल कोशिकाओं के अध्ययन के लिए विभिन्न एक्सोजेनस फ्लोरोसेंट मार्कर का विकास और अनुप्रयोग लगभग बेरोज़गार रहता है। इस तरह के मार्कर में टैग किए गए प्रोटीन, एंजाइमों के लिए टैग किए गए सब्सट्रेट्स, या अन्य यौगिकों के लिए फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकती हैं। इन मार्कर का उपयोग उन कोशिका ओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिनमें अद्वितीय गुण होते हैं, जैसे कि कोशिकाओं को हाइलाइट करना जो एक विशिष्ट सेलुलर डिब्बे सुविधा की अलग-अलग मात्रा का उत्पादन करते हैं, जैसे लिसोसोम्स। एक अतिरिक्त उदाहरण फ्लोरोसेंटी लेबल वाले मोतियों का उपयोग है ताकि फैगोसाइटोसिस के लिए सक्षम कोशिकाओं की कार्यात्मक पहचान की जा सके, या लक्षित रोगजनक25की चपेट में आ जाए। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में सक्रिय कोशिकाओं की आबादी को इन बहिर्जात रूप से लागू मोतियों की चपेट में आने के बाद FACS द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। जबकि पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तरीकों को संरक्षित ऊतक और कई घंटों की आवश्यकता होती है जो मनका छाहट के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान लगाते हैं, रोगजनक छाई के लिए एक FACS आधारित कार्यात्मक परख को अलग-अलग जीवित कोशिकाओं पर अपेक्षाकृत जल्दी किया जा सकता है। तनाव के लिए सेल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के अलावा, इस तकनीक में जीन-विशिष्ट अभिव्यक्ति को स्पष्ट करने और कोशिका प्रकारों के विकासवादी और विकासात्मक इतिहास को पूरी तरह से सीनिडिएरियन के लिए अद्वितीय रोशन करने की क्षमता है, जैसे कैलिकोब्लास्ट और सीनिडोसाइट्स।

हाल ही में, हमने 30 से अधिक सेलुलर मार्कर की गहन स्क्रीनिंग की, जिसके परिणामस्वरूप 24 की पहचान की गई जो कोरल कोशिकाओं को लेबल करने में सक्षम हैं, जिनमें से 16 अद्वितीय आबादी18को अलग करने के लिए उपयोगी हैं, जिससे उन्हें भेदभाव (सीडी) के समूह बना रहे हैं। यहां हम कैल्शियम कार्बोनेट कंकाल से कोशिकाओं को हटाने से लेकर एफएसीएस(चित्रा 1)के साथ विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान और अलगाव तक पोसिललोपोरा डैमिकॉर्निस में कोरल सेल अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

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Protocol

1. एयरब्रश और कंप्रेसर के माध्यम से कोरल कंकाल से ऊतकों का विसोजन

नोट: बर्फ पर कदम प्रदर्शन और दस्ताने के साथ हाथ की रक्षा।

  1. एयर कंप्रेसर, नली और एयरब्रश(चित्रा 2)को जोड़कर एयरब्रश किट को इकट्ठा करें। प्रेशर गेज को 276−483 केपीए के बीच सेट करें।
    नोट: इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल की जाने वाली अनुशंसित कंप्रेसर और हवा की नली 393 केपीए के अधिकतम दबाव के लिए पूर्वनिर्धारित थी। इस 276-483 kPa रेंज के बाहर उपयोग कंकाल या कोशिका झिल्ली के टूटने से या तो अपर्याप्त सेल हटाने में परिणाम हो सकता है । यह सीमा प्रत्येक प्रजाति के लिए भिन्न हो सकती है और इसके लिए व्यवहार्यता परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है। एक व्यवहार्यता परीक्षण एक साधारण हीमोसाइटोमीटर और एक 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) डाई अपवर्जन परख, एक यौगिक माइक्रोस्कोप पर कल्पना के साथ सेल घोल के एक सबसेट के साथ किया जा सकता है ।
  2. एक ऑटोक्लेव्ड में सेल धुंधला मीडिया के 100 मीटर तैयार करें, बाँझ ग्लास कंटेनर 10x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस; कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) के 33 एमएल जोड़कर 3.3x, भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) की अंतिम एकाग्रता में 3.3 x, 2 एमएल भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस; 30 न्यूनतम के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय गर्मी) कुल मात्रा का 2% और 2 एम एचईपीई बफर का 2 एमएल जोड़कर 20 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए। फिर बाँझ पानी के साथ 100 मीटर पर ऊपर।
    नोट: 3.3 x PBS एकाग्रता समुद्री जल की लवणता की नकल करने के लिए चुना गया था, के रूप में Rosental एट अल18में प्रदर्शन किया । इस एकाग्रता को उनकी लवणता की नकल करने के लिए अन्य वातावरण में पाई जाने वाली प्रजातियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है।
  3. सेल धुंधला मीडिया के 10 mL को एयरब्रश बोतल में स्थानांतरित करें (चित्रा 2में "एफ" लेबल) और एयरब्रश कनेक्टर के लिए एडाप्टर ढक्कन संलग्न करें।
    नोट: बड़े टुकड़े और मोटा ऊतक परतों के साथ प्रजातियों के लिए पर्याप्त ऊतक हटाने के लिए और अधिक मीडिया की आवश्यकता हो सकती है ।
  4. शाखाओं में बंटी कोरल प्रजातियों के लिए यहां प्रदर्शित, एक हड्डी कटर का उपयोग करने के लिए क्लिप या एक कोरल टुकड़ा लगभग 3−5 सेमी लंबाई में या क्षेत्र में 4 सेमी2 काट ।
    नोट: टुकड़ा मैक्रोएल्गे और अन्य बहुकोशिकीय जीवों से स्पष्ट होना चाहिए क्योंकि इन्हें नमूना डाउनस्ट्रीम से नहीं हटाया जा सकता है और यह FACS विश्लेषण और छंटाई प्रक्रियाओं के दौरान नमूने को दूषित करेगा। पी डैमिकॉर्निस का 1 सेमी टुकड़ा फ़िल्टरिंग, धुंधला और धोने के बाद लगभग 2−10 x 106 कोशिकाओं को देता है।
  5. एक प्लास्टिक संग्रह बैग के अंदर कोरल टुकड़ा रखें और कोरल(चित्रा 2)पर सेल धुंधला मीडिया स्प्रे करने के लिए एयरब्रश का उपयोग करें । इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि अधिकांश कंकाल उजागर न हो जाए। संग्रह बैग से शेष कंकाल निकालें।

2. कोरल ऊतक से कोशिकाओं का विसोजन

नोट: बर्फ पर सभी कदम प्रदर्शन और दस्ताने के साथ हाथ की रक्षा।

  1. एक ही सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में एक 40 μm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से सेल घोल फ़िल्टर।
    नोट: विभिन्न कोशिका छलनी जाल आकार विभिन्न प्रजातियों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। हालांकि, मलबे और सेल झुरमुट के पारित होने के कारण बड़े आकार अपर्याप्त ऊतक विसोजन में परिणाम हो सकते हैं।
    1. मोटा बलगम परतों के साथ नमूनों के लिए, एक 1 मिलीआर प्लास्टिक सिरिंज के निष्फल प्लंजर का उपयोग करें और धीरे से यह फिल्टर के खिलाफ पीसने के लिए झुरमुट तोड़ने और कोशिकाओं को छलनी के माध्यम से पारित करने में मदद । सेल धुंधला मीडिया के साथ छलनी और प्लंजर को अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुल्ला करें।
  2. 5 मिन के लिए 4डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। सुपरनेटेंट को हटा दें और कोशिकाओं को सेल धुंधला मीडिया के 1 mL में फिर से निलंबित करें।

3. सेल धुंधला

नोट: बर्फ पर सभी कदम प्रदर्शन और दस्ताने के साथ हाथ की रक्षा। इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए दाग प्रतिनिधित्व उद्देश्यों के लिए हैं। वैकल्पिक दाग अलग सांद्रता और इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता होगी।

  1. 5 00 माइक्रोन रीस्क्रिड कोशिकाओं को 5 मिलीएल राउंड-बॉटम ट्यूब पर स्थानांतरित करें और नियंत्रण नमूने के रूप में अलग सेट करें। इस एलिकोट पर दाग न डालें।
  2. शेष सेल निलंबन के लिए, 12 एमएम DAPI व्यवहार्यता रंग(सामग्री की तालिका),5 μM प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) दाग(सामग्री की मेज)के 1 μL, और 0.2 μM lysosome दाग(सामग्री की मेज)के 0.1 μL जोड़ें । फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए अंधेरे में 30 मिन के लिए बर्फ पर मिश्रण और इनक्यूबेट करने के लिए पिपेट अच्छी तरह से।
    नोट: DAPI इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है एक डीएनए दाग और FACS मशीन पर मृत कोशिकाओं के अंतर गेटिंग के लिए व्यवहार्यता रंगाई के रूप में काम करते हैं । यह मानता है कि डीपीआई झिल्ली अखंडता के कारण मरने वाली कोशिकाओं में प्रवेश करता है। ओएस दाग 520 एनएम रेंज (हरे) में प्रकाश उत्सर्जित करता है, जबकि lysosomal मार्कर लगभग 668 एनएम (लाल) पर प्रकाश उत्सर्जित करता है।
  3. 5 00 ग्राम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा दागित कोशिकाओं की 500 माइक्रोन। 5 00 ग्राम के लिए 4डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा दागित कोशिकाओं का 500 माइक्रोन। एक नया 5 mL राउंड-बॉटम ट्यूब पर स्थानांतरित करें और बर्फ पर स्टोर करें।

4. FACS स्टार्टअप

नोट: लेजर और चैनलों में अंतर के कारण साइटोमीटर के मेक और मॉडल के अनुसार कदम भिन्न हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए 405, 488, 535 और 640 एनएम तरंगदैर्ध्य लेजर के साथ एक साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए फ़िल्टर प्रतिनिधित्व उद्देश्यों के लिए हैं। वैकल्पिक सेल दाग फिल्टर और लेजर का एक अलग सेट की आवश्यकता हो सकती है।

  1. सॉर्टर सॉफ्टवेयर पर एक नया प्रोजेक्ट टेम्पलेट बनाना शुरू करें और लेजर पैनल चुनें। दाग और प्राकृतिक फ्लोरेसेंस के प्रतिनिधित्व संयोजन के लिए, सभी चार लेजर (405, 488, 535, और 640 एनएम) का चयन करें।
  2. प्रयोग में प्रतिनिधित्व किए गए प्रत्येक अपेक्षित रंग के लिए उपयुक्त फ़िल्टर चुनें।
    1. लाइव और मृत कोशिकाओं के पृथक्करण में डीएपीआई उत्सर्जन और सहायता का पता लगाने के लिए, 450/50 (425−475 एनएम रेंज) जैसे डीपीआई, होशेस्ट या पैसिफिक ब्लू फिल्टर के बैंडपास (बीपी) के साथ फ़िल्टर का उपयोग करें।
    2. ग्रीन आरओएस सिग्नल द्वारा उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने के लिए 530/30 (515-545 एनएम की तरंगदैर्ध्य रेंज) जैसे फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) फिल्टर के साथ फिल्टर का इस्तेमाल करें । यह फिल्टर प्रत्येक कोशिका में आरओसी की एकाग्रता को मापेगा।
    3. lysosomal दाग उत्सर्जन का पता लगाने के लिए एक allophycocyanin (एपीसी) फिल्टर जैसे 670/30 (655−685 एनएम रेंज) के बीपी के साथ एक अतिरिक्त फिल्टर जोड़ें।
      नोट: एपीसी चैनल फागोसाइटिक गतिविधि के माप के लिए अनुमति देगा। यह चैनल सहजीवी परिवार से कोरल सिम्बायोटिक शैवाल द्वारा उत्पन्न ऑटोफ्लोरेसेंस का भी पता लगाएगा। इस संकेत को एक अतिरिक्त चैनल का उपयोग करके अलग किया जा सकता है जिसमें एपीसी फ़िल्टर की तुलना में लंबी तरंगदैर्ध्य है, हालांकि।
    4. एक फ़िल्टर शामिल करें जिसमें 780/60 (750-810 एनएम रेंज) का बीपी होता है, जैसे कि सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला फाइकोरिथ्रिन, सायनाइन फिल्टर (एपीसी-Cy7), जो सिम्बायोडिनेसी से दूर-लाल ऑटोफ्लोरेसेंस के उत्सर्जन का पता लगाता है और अपोसिमबायोटिक कोशिकाओं के अलगाव में एडकरता है।

5. FACS गेटिंग सेटअप

नोट: साइटोमीटर के मेक और मॉडल और साइटोमीटर के साथ मिलकर अधिग्रहण कार्यक्रम के अनुसार कदम भिन्न हो सकते हैं।

  1. साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर की परियोजना प्रायोगिक स्क्रीन पर, वाई-एक्सिस के लिए एक्स-एक्सिस और साइड स्कैटर (एसएससी) के लिए मीट्रिक के रूप में एक स्कैटर प्लॉट बनाएं और आगे स्कैटर (एफसीएस) का चयन करें।
    नोट: FCS सेल के आकार के साथ सहसंबंधित है और एसएससी दानेदारता के साथ संबंधित है । यह सबसे अधिक मलबे को हटाने के लिए अनुमति देगा, के रूप में सबसे बरकरार कोशिकाओं की तुलना में आकार में छोटा हो जाएगा ।
  2. कुल्हाड़ियों को या तो लोगरिथिक या द्विघातीय तराजू पर सेट करें, क्योंकि सेल आकार और दानेदारता परिमाण के कई आदेशों(चित्रा 3ए),विशेष रूप से कोरल में भिन्न हो सकती है।

6. FACS विश्लेषण और सेल अलगाव

नोट: कदम साइटोमीटर और युग्मित अधिग्रहण कार्यक्रम के मेक और मॉडल के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।

  1. साइटोमीटर के सैंपल चैंबर में कंट्रोल (यानी अनसने सजे सेल सबसेट) रखें और रीडिंग की प्रक्रिया शुरू करें। जब कंप्यूटर को प्रत्येक सेल, या घटना से डेटा प्राप्त करना शुरू हो ता है, तो स्कैटर प्लॉट पर डॉट्स दिखाई देना शुरू हो जाएंगे। पिछले प्रयोगों से साइटोमीटर कक्षों में छोड़े गए किसी भी मलबे को साफ करने के लिए, विश्लेषण शुरू करने से पहले लगभग 30 एस को पारित करने की अनुमति दें।
  2. स्कैटर प्लॉट में पॉइंट्स को सेंटर करने के लिए फोटोमल्टीकर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज को एडजस्ट करें ।
    नोट: पीएमटी वोल्टेज का उपयोग फोटॉनों की सिग्नल ताकत को बढ़ाने के लिए किया जाता है; यदि पीएमटी वोल्टेज बहुत कमजोर है, तो कम कोशिकाएं पढ़ी जाएंगी, और यदि पीएमटी वोल्टेज बहुत मजबूत है, तो कोशिकाओं को अधिकतम मूल्य के पास मापा जाएगा और विभिन्न सेल प्रकार एक दूसरे से अविवेच्य होंगे। एक पर्याप्त पीएमटी वोल्टेज यह सुनिश्चित करता है कि स्वतंत्र रूप से विशिष्ट घटनाएं तितर-बितर भूखंड को पॉप्युलेट करेंगी। इवेंट सेपरेशन एफएससी और एसएससी स्कैटर प्लॉट्स पर लॉगरिथिक या बाइएक्सपोनेसिक तराजू पेश करके कल्पना करना आसान है।
  3. घटनाओं की रिकॉर्डिंग शुरू करें। नमूने के संरक्षण के लिए, लगभग 15,000 घटनाओं को पढ़ने के बाद डेटा अधिग्रहण को रोकें। ज्यादातर मामलों में, यह समग्र सेल जनसंख्या पैटर्न की कल्पना करने के लिए पर्याप्त होगा। छोटे, विशेष सेल आबादी का विश्लेषण और अलग-थलग होने पर अधिक घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
  4. एफएससी और एसएससी के पहले ग्राफ पर, 102 निशान के आसपास कोशिकाओं का चयन, या गेट बनाएं और एफएससी एक्स-एक्सिस पर अधिक। इस दहलीज के नीचे कुछ भी होने की संभावना सेलुलर मलबे है । आयताकार द्वार, जो प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों पर एक नियमित विकल्प है और स्पष्ट, विशिष्ट सेल आबादी के लिए अच्छा है ड्रा। सेल आबादी के लिए जो स्कैटर भूखंडों पर अधिक अनियमित आकार लेते हैं, पॉलीगोनल गेटिंग विकल्प का उपयोग करते हैं।
    नोट: आगे के स्कैटर पर 102 की न्यूनतम कटऑफ सबसे छोटी कोरल कोशिकाओं के लिए चयन करना चाहिए लेकिन मलबे के संदूषण की अनुमति दे सकती है। इसमें संशोधन करने के लिए गेटिंग की निचली सीमा को और अधिक रूढ़िवादी बनाने के लिए बढ़ाएं ।
  5. वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और एपीसी-साइ7 फिल्टर पर डीपीआई फिल्टर व्यक्त करते हुए एक नया स्कैटर प्लॉट बनाएं। ऐसा करने के लिए, चरण 6.4 में बनाई गई अक्षुण्ण कोशिकाओं के लिए गेट का चयन करें, सही क्लिक करें, और एक नया स्कैटर प्लॉट बनाने के विकल्प का चयन करें। कुल्हाड़ियों को या तो लोगरिथिक या द्विघातीय तराजू में समायोजित करें।
    नोट: एक नया प्लॉट बनाने के लिए आवश्यक कदम विभिन्न सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों के साथ भिन्न हो सकते हैं।
  6. अब साइटोमीटर चैंबर से कंट्रोल सैंपल निकालें और दाग वाली कोशिकाओं से बदल ें। विश्लेषण शुरू करने और डेटा रिकॉर्ड करने से पहले 30 एस को पारित करने की अनुमति दें। रुकने से पहले लगभग 15,000 कोशिकाओं को रिकॉर्ड करें।
    नोट: एपीसी-Cy7 पैमाने के उच्च अंत पर अलग आबादी (एस) सिम्बायोडिनियासे से उच्च लाल ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ हैं। इन जनसंख्या टूट कल्पना करने के लिए कोई दाग की जरूरत है, और वे भी नियंत्रण नमूना रिकॉर्डिंग(चित्रा 3सी)पर देखा जा सकता है । कोरल-केवल आबादी के लिए चुनें, आगे भेदभाव के लिए वाई-एक्सिस पर कम।
  7. आरओएस सांद्रता (एफवाईसी फिल्टर) और कोशिकाओं को सकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए एपोसिम्बबायोटिक कोशिकाओं का एक नया स्कैटर प्लॉट बनाएं, जो फिर से लॉगरिथमिक या बाइएक्सपोन्शियल तराजू का उपयोग करते हैं।
    नोट: यदि कई अलग-अलग सेल आबादी हैं जो अपोसिमबायोटिक हैं, तो प्रत्येक को अपने स्कैटर प्लॉट(चित्रा 3सी, डी)में आगे प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
  8. नियंत्रण नमूना की पहली रिकॉर्डिंग का उपयोग करके या नियंत्रण समूह को फिर से डालने और फिर से चलाने से नियंत्रण के खिलाफ दागित नमूना समूह की तुलना करें। उन घटनाओं को गेट करें जो दागदार नमूना समूह के लिए अद्वितीय हैं।

7. FACS छंटाई और संग्रह

नोट: साइटोमीटर के मेक और मॉडल और साइटोमीटर के साथ मिलकर अधिग्रहण कार्यक्रम के अनुसार कदम भिन्न हो सकते हैं।

  1. साइटोमीटर संग्रह कक्ष में एकत्र की गई कोशिकाओं की संख्या और भंडारण की विधि के आधार पर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब (सेल कल्चर मीडिया या एलिसिस बफर के 250−500 माइक्रोन युक्त) को इकट्ठा करने के लिए चुनी गई कोशिकाओं के चयन के साथ।
    नोट: प्रतिनिधित्व प्रवाह साइटोमीटर एक समय में चार अलग-अलग आबादी को छांटने में सक्षम है, और मशीन को विभिन्न अपकेंद्रित्र ट्यूबों और 96 अच्छी प्लेटों सहित विभिन्न संग्रह उपकरणों को पकड़ने के लिए कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।
  2. एक बार साइटोमीटर नमूना पढ़ना शुरू कर देता है और मलबे को बाहर निकालने के लिए उचित समय बीत चुका है, वांछित आबादी को छांटना शुरू कर देता है और 20,000 कोशिकाओं से कई लाखों तक कहीं भी इकट्ठा होता है।
    1. 500,000 से अधिक कोशिकाओं के लिए, सेल संस्कृति मीडिया या लिसिस बफर की मात्रा और संग्रह डिवाइस की मात्रा को समायोजित करें।
    2. इन विट्रो अध्ययनों के लिए, बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेटर या निष्फल वातावरण में रखने तक स्टोर करें।
    3. आणविक अध्ययनों के लिए, या तो तुरंत डीएनए/आरएनए/प्रोटीन अलगाव प्रक्रिया शुरू करें या फ्लैश फ्रीज करें और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. हर बार एक नया दाग, प्रजातियों, या सॉर्टर का उपयोग किया जाता है, धुंधला मीडिया के ५०० μL में ब्याज की कम से २०,००० कोशिकाओं छंटाई द्वारा ब्याज की आबादी पर एक शुद्धता की जांच करते हैं, तो फिर से हल कोशिकाओं का विश्लेषण और पुष्टि है कि कोशिकाओं को शुरू में सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल गेट के भीतर पढ़ा जा रहा है(चित्रा 4)।

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Representative Results

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल उपयोगी है क्योंकि यह लाइव कोरल सेल आबादी की पहचान और संग्रह की सुविधा प्रदान करता है जिसका उपयोग कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है। कार्यप्रवाह अंतर्निहित कैल्शियम कार्बोनेट कंकाल(चित्रा 1)से कोरल ऊतकों के यांत्रिक पृथक्करण के साथ शुरू हुआ। यह सबसे महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरणों में से एक है क्योंकि अनुचित तकनीक के परिणामस्वरूप उच्च कोशिका मृत्यु दर होती है और बड़ी मात्रा में मलबे का निर्माण हो सकता है। एंजाइमैटिक जुदाई की सलाह नहीं दी जाती है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ऊतक बाल काटना और उच्च कोशिका मृत्यु दर में वृद्धि हो सकती है। एयरब्रश का उपयोग करके यांत्रिक पृथक्करण इन चुनौतियों(चित्रा 2)को कम करता है, औसत कोशिका मृत्यु दर को ~ 10% तक कम करता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। कंकाल से ऊतकों के एयरब्रश-मध्यस्थता यांत्रिक अलगाव के बाद, जिसके परिणामस्वरूप घोल को सेल छलनी के माध्यम से निस्पंदन द्वारा सेल निलंबन के लिए फ़िल्टर किया गया था। इसके बाद सेल सस्पेंशन को डीएनए (डीपीआई), आरओ, और लासोसोम मार्कर से दाग दिया गया और फाक्स साइटोमीटर द्वारा पढ़ा गया । इसके बाद इस्तेमाल किए जा रहे सेल मार्कर के आधार पर विशिष्ट सेल आबादी को अलग-थलग करने के लिए गेटिंग रणनीति विकसित की गई । गेटेड सेल आबादी तो संग्रह ट्यूबों में हल किया गया(चित्रा 1)।

जब FACS साइटोमीटर पर नमूनों का विश्लेषण, कई कदम उठाए गए ताकि नमूने से मलबे और मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए । यदि उनके ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण वांछित हो तो सिम्बायोडिनेसी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से हटाया जा सकता है। सबसे पहले, मलबे और अन्य गैर-कोशिकीय कण ों ने एक ही आकार या दानेदारता को साझा नहीं किया क्योंकि कोरल कोशिकाओं को आगे (आकार) और साइड (दानेदारता) तितर-बितर(चित्रा 3ए)पर गेटिंग चयन बनाकर विश्लेषण से हटा दिया गया था। इसके बाद, मृत कोशिकाओं को DAPI-दाग नमूना और दूर लाल चैनल के खिलाफ अनदाग नियंत्रण सेल निलंबन की तुलना करके बाहर रखा गया था, फिर दाग वाले नमूने में उच्च डीपीआई धुंधला के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को गेटिंग(चित्रा 3बी,सेल जनसंख्या P6)। समानांतर में, ऑटोफ्लोरोसेंट सिम्बायोडिनेसी की मेजबानी करने वाली कोशिकाओं को दूर-लाल चैनल(चित्रा 3बी,एपीसी-Cy7) में उच्च संकेत के साथ कोशिकाओं के खिलाफ गेटिंग द्वारा हटा दिया गया था। इस पुनरावृत्ति गेटिंग प्रक्रिया के बाद, विश्लेषण के लिए शेष कोशिकाएं सिम्बायोडिनिया की कमी वाली अक्षुण्ण लाइव कोरल सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं।

इन कोशिकाओं को तब नियंत्रण और दाग दार नमूनों की तुलना करके ओएस गतिविधि और/या lysosome सामग्री(चित्रा 3सी)जैसी सुविधाओं के लिए बहिर्जात दाग जोड़कर विभिन्न सेल उपआबादी में वर्गीकृत किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आरओएस और lysosome-धुंधला फिल्टर पर डेटा की जांच कोरल कोशिकाओं की चार अलग उपआबादी से पता चला । एक सेल आबादी में लिसोसोमल सामग्री (एपीसी फिल्टर) के लिए अपेक्षाकृत कम संकेत था और अन्य तीन में लिसोसोमल सामग्री में उच्च संकेत था और आरओसी गतिविधि (फिटसी फिल्टर)(चित्रा 3सी)की एक श्रृंखला थी। इन उपआबादी में से प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए हल किया जा सकता है, या आगे विश्लेषण और आकार, दानेदारता, स्वत: प्रवाह, और/या डीएनए सामग्री के चौराहे से अधिक असतत उपआबादी में पार्स । इस अध्ययन में, कोरल कोशिकाओं की व्यापक विशेषताओं की पहचान करने के लिए डीएनए, आरओएस गतिविधि और लिसोसोमल सामग्री का उपयोग किया गया था। महत्वपूर्ण बात, इस सामान्य प्रोटोकॉल को फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ-साथ विशिष्ट एंटीबॉडी जांच की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उपयोग स्टेम सेल जैसे ब्याज की विशेष कोशिका आबादी के अलगाव के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: कोरल सेल छंटाई प्रक्रिया का सामान्य कार्यप्रवाह। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल धुंधला है, जो तो FACS साइटोमीटर के माध्यम से चला रहे हैं, मापा, विश्लेषण, और सेल आबादी में अलग के लिए कंकाल से कोरल कोशिकाओं को हटाने में सक्षम बनाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कोरल कंकाल से ऊतक और कोशिकाओं को हटाना। एयर कंप्रेसर(ए)एयरब्रश(ई)से वायु और कोशिका धुंधला मीडिया(एफ)को मजबूर करता है और कोरल कंकाल(सी)से ऊतक को विस्फोट करने का काम करता है और बैग(डी)में एक कोशिका घोल बनाता है। वायु कंप्रेसर(ए)पर दबाव गेज(बी)द्वारा अधिकतम वायु दबाव नियंत्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: लाइव कोरल कोशिकाओं का गेटिंग चयन। (क) जीवित कोशिकाओं को मलबे से अलग किया गया था जिसमें न्यूनतम वायदा मूल्य 10 2 का उपयोग कियागयाथा . (ख)एपीसी-Cy7 फिल्टर का उपयोग लाल ऑटोफ्लोरेसेंस की पहचान करने के लिए किया गया था, जो सिम्बायोंट-होस्ट की गई कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से अलग करता था, जबकि डीएपीआई का उपयोग डीएनए धुंधला के लिए अत्यधिक सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था । DAPI के लिए अत्यधिक सकारात्मक मृत और मरने की कोशिकाओं का संकेत थे । (C,D) विभिन्न कोरल सेल आबादी को और अलग करने के लिए आरओएस गतिविधि और lysosome सामग्री के लिए अतिरिक्त मार्कर का उपयोग किया गया था। इन रेखांकन ों को उत्पन्न करने के लिए सभी डेटा को बाद में फ्लोजो (v10) पर पुनर्विश्लेषण किया गया था। डाला जनसंख्या लेबल और प्रतिशत प्रत्येक हल आबादी(ई)के लिए लिया सूक्ष्म तस्वीरें से मेल खाती है । प्रत्येक भूखंड में दिखाए गए प्रतिशत उस भूखंड के भीतर कुल कोशिकाओं के होते हैं। बॉटम राइट स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ऑटोफ्लोरोसेंट सिम्बायोडिनेसी से जुड़ी कोशिकाओं की शुद्धता जांच। (A)अनदाग्ड कंट्रोल सैंपल से एपीसी-साइ7 फिल्टर पर फ्लोरेसेंस के लिए पॉजिटिव कोशिकाओं को सुलझा लिया गया । (ख)कोशिकाओं के इस हल समूह को साइटोमीटर पर फिर से चलाया गया और उन्हीं शर्तों के तहत पुनर्विश्लेषण किया गया, जिसमें ९४% शुद्धता दिखाई गई । फॉरवर्ड स्कैटर (एक्स-एक्सिस, एफएससी) का उपयोग एंकरिंग एक्सिस के लिए किया जाता था, लेकिन अन्य किसी भी पैरामीटर के साथ विनिमेय है। एक ही प्रक्रिया दाग नमूनों पर किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल को रोसेनटाल एट अल18 से अनुकूलित किया गया था और पी डेमियाकॉर्निस कोशिकाओं की पहचान और अलगाव के लिए विकसित किया गया था। कार्यप्रणाली मलबे, अव्यवहार्य कोशिकाओं, और सिम्बायोडिनिया-होस्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए नमूनों को फ़िल्टर करने की प्रक्रिया पर केंद्रित है, जिसमें सेल आंतरिक कारकों की जांच, जिसमें सापेक्ष सेल आकार, सापेक्ष सेल दानेदारता, सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, और बरकरार सेलुलर झिल्ली की उपस्थिति शामिल है। इन तकनीकों को अन्य कोरल प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, कोशिका जनसंख्या विशेषताओं में प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों के कारण FACS गेटिंग रणनीतियां भिन्न हो सकती हैं।

कोरल स्वास्थ्य को समझने के लिए FACS की उपयोगिता कोशिकाओं की अलग पहचान और अलग करने के लिए विविध सेल आंतरिक कारकों का उपयोग करने की क्षमता में निहित है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल व्यवहार्यता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की एकाग्रता और lysosome सामग्री के आधार पर कोरल कोशिकाओं में अंतर करने के लिए एक्सोजेनस सेलुलर धुंधला के अतिरिक्त उपयोग का वर्णन करता है। 30 + वाणिज्यिक मार्कर है कि पूर्व में Rosental एट अल में परीक्षण किया गया ।18,24 लेबल पी डेमियकॉर्निस कोशिकाओं, जिनमें से 16 अंतर संकेत, भेदभाव के समूहों का उत्पादन किया है कि सेल उपआबादी के चयन के लिए अनुमति होगी ।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक उचित ऊतक हटाने और यह सुनिश्चित करने के लिए फ़िल्टर करना है कि ऊतक झुरमुट विसोइन किए जाते हैं और प्रवाह साइटोमीटर के लैमिनार प्रवाह को अवरुद्ध नहीं करते हैं। स्वतंत्र सेल डिटेक्शन घटनाओं का सटीक पता लगाने और विश्लेषण के लिए पीएमटी वोल्टेज का उचित समायोजन महत्वपूर्ण है। पिछले काम18 कीतुलना में, एयरब्रश यांत्रिक व्यवधान के माध्यम से अंतर्निहित कंकाल से कोरल सेल अलगाव की प्रक्रिया मलबे को कम करने और सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करके पारंपरिक खुरचन विधियों पर काफी सुधार करती है (~ 90%, चित्रा 2 और चित्रा 3ए),जिससे शोर के कारण झूठे सकारात्मक को कम करके बाद के विश्लेषणों में सुधार होता है।

इस पेपर में वर्णित पद्धति पहले संभव नहीं स्तर पर रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं के चौराहे पर अंतर चयन के माध्यम से कोरल सेल आबादी को अलग करने की सुविधा प्रदान करती है। कोरल कोशिकाओं के लिए FACS पद्धतियों के विकास के साथ, अब परिभाषित सेल संस्कृतियों के निर्माण के लिए विशिष्ट सेल उपआबादी का चयन करना संभव है, साथ ही विशिष्ट सेल उपआबादी से जुड़े ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनेटिक प्रोफाइल की जांच करना संभव है। इस ठीक पैमाने पर जानकारी के आवेदन सेल प्रकार, व्यवहार, और समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, और इस तरह के कैलिकोब्लास्ट और cnidocytes के रूप में cnidarian विशिष्ट सेल प्रकार के विकास के साथ जुड़े विशेषताओं प्रकट हो सकता है । इसके अतिरिक्त, बेहतर तनाव परख और बायोमार्कर के विकास के लिए FACS प्रौद्योगिकी का आवेदन गंभीर रूप से धमकी दी प्रवाल भित्तियों की सुरक्षा के लिए उपयोगी साबित हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एनटीके इस शोध के वित्तपोषण के लिए प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग में मियामी अनुसंधान पुरस्कार विश्वविद्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं । बीआर तुलनात्मक और विकासवादी इम्यूनोलॉजी प्रयोगशाला के वित्तपोषण के लिए एलेक्स और ऐन लॉटरबाख का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । बीआर के काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ) संख्या: 1416/19 और 2841/19, और एचएफएसपी रिसर्च ग्रांट, आरजीवाई0085/2019 द्वारा समर्थित किया गया था। हम तकनीकी सहायता के लिए झन्ना कोजेकबावा और माइक कोनेली का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम भी मियामी विश्वविद्यालय, मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन के फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सिल्वेस्टर व्यापक कैंसर केंद्र में FACS साइटोमीटर के लिए उपयोग के लिए और तकनीकी सहायता के लिए शांनोन Saigh के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airbrush Kit & Compressor TCP Global ABD KIT-H-SET Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria II BD 644832
Bone Cutters Bulk Reef Supply 205357 Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer Corning 352340 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon
CellRox Green Life Technologies C10444 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm
Collection bag Grainger 38UV35 Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness
DAPI Invitrogen D1306 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm
Fetal Calf Serum Sigma-Aldrich F2442-100ML Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 Bright-Line Hemacytometer
HEPES Buffer Sigma-Aldrich H0887
LysoTracker Deep Red Life Technologies L12492 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm
Microcentrifuge tubes VWR 87003-294 1.7 mL
Phophate Buffered Saline (PBS) Gibco 70011-044 pH 7.4; 10X
Round-bottom tubes VWR 352063 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube
Syringe BD 309628 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate

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References

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रिऐक्शन इश्यू 159 फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) कैनिडेरिया सेल बायोलॉजी कोरल स्लेर्एक्टिविया फ्लो साइटोमेट्री
स्लेरेक्टिनियन सेल आबादी के अलगाव के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई
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Snyder, G. A., Browne, W. E., Traylor-Knowles, N., Rosental, B. Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations. J. Vis. Exp. (159), e60446, doi:10.3791/60446 (2020).

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