Summary
I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l'uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l'isolamento, l'etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.
Abstract
Le barriere coralline sono minacciate da fattori di stress antropogenici. La risposta biologica del corallo a questi fattori di stress può verificarsi a livello cellulare, ma i meccanismi non sono ben compresi. Per studiare la risposta dei coralli ai fattori di stress, abbiamo bisogno di strumenti per analizzare le risposte cellulari. In particolare, abbiamo bisogno di strumenti che facilitino l'applicazione di saggi funzionali per capire meglio come le popolazioni cellulari reagiscono allo stress. Nello studio attuale, utilizziamo lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare e separare diverse popolazioni di cellule nei coralli rocciosi. Questo protocollo comprende: (1) la separazione dei tessuti del corallo dallo scheletro, (2) la creazione di una sospensione a singola cella, (3) l'etichettatura delle cellule coralline utilizzando vari marcatori per la citometria di flusso e (4) strategie di gating e smistamento delle cellule. Questo metodo consentirà ai ricercatori di lavorare sui coralli a livello cellulare per analisi, analisi funzionali e studi sull'espressione genica di diverse popolazioni di cellule.
Introduction
Le barriere coralline sono uno degli ecosistemi più importanti della Terra. Facilitano la biodiversità fornendo habitat critici per pesci e invertebrati e sono fondamentali per sostenere le comunità antropogeniche fornendo cibo e sostentamento economico attraverso il turismo1. In qualità di costruttore chiave di barriere coralline, l'animale corallo (Phylum: Cnidaria) aiuta anche le comunità costiere creando grandi quadri di carbonato di calcio che mitigano i danni delle onde e delle tempeste2.
I coralli come adulti sono animali sessili che ospitano una vasta gamma di partner endosimbiotici, tra cui virus, archea, batteri, protisti, funghi, e, in particolare, i membri della famiglia dinoflagellate algalellate Symbiodiniaceae3. I cambiamenti nell'ambiente possono causare squilibri in questa comunità, spesso portando a focolai di malattia e sbiancamento dei coralli in cui le simbiotiche Symbiodiniaceae vengono espulse dalla colonia del corallo, eliminando così la principale fonte di nutrizione per il corallo. Entrambi questi scenari spesso causano la morte dell'ospite corallo4,5,6. Gli effetti dei fattori di stress antropogenici, come il rapido cambiamento climatico, stanno accelerando gli eventi di morte dei coralli di massa, portando ad un declino globale delle barriere coralline7 .
Recentemente, sono stati sviluppati molti metodi diversiper contribuire a mitigare la perdita della barriera corallina. Questi metodi includonollo posizionamento di coralli sulle barriere coralline esistenti, attraversamento genetico con genotipi termalmente tolleranti e manipolazione cellulare delle comunità microbiche e simbiotiche ospitate all'interno del corallo8,9. Nonostante questi sforzi, molto rimane sconosciuto sulla diversità delle cellule coralline e la funzione cellulare10,11,12,13. Una comprensione approfondita della diversità del tipo di cellule coralline e della funzione cellulare è necessaria per capire come l'organismo corallo si comporta in condizioni normative e stressanti. Gli sforzi per massimizzare l'efficienza del ripristino e della conservazione beneficeranno di una migliore comprensione del modo in cui la diversità cellulare e la funzione genica sono accoppiate.
Precedenti lavori sulla diversità e la funzione cellulare si sono concentrati principalmente sugli studi istologici e sul campionamento dell'RNA a tutto tessuto14,15,16,17. Per ottenere maggiori dettagli sulla funzione specifica del tipo di cellula nei coralli, ci devono essere metodi per l'isolamento di specifiche popolazioni di cellule coralline vive. Questo è stato fatto con successo in organismi modello non classici per mezzo di fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tecnologia di citometria di flusso18. FACS utilizza una combinazione di laser sintonizzati su lunghezze d'onda variabili per misurare diverse proprietà cellulari endogene a livello di singola cellula, come la dimensione relativa delle cellule, la granularità cellulare e l'autofluorescenza. Inoltre, le cellule possono essere contrassegnate da composti fluorescenti etichettati per misurare specifiche proprietà desiderate18,19.
Finora, l'applicazione della citometria di flusso alle cellule coralline è stata principalmente per l'analisi di Symbiodiniaceae simbiotica e altre popolazioni batteriche utilizzando la loro forte, naturale autofluorescenza20,21,22. FACS è stato utilizzato anche per stimare le dimensioni del genoma del corallo utilizzando il segnale marcatore del DNA fluorescente rispetto alle cellule dell'organismo modello di riferimento23,24. L'applicazione efficiente del FACS fornisce tre strumenti distinti che sono utili per gli studi di biologia cellulare: 1) descrizione morfologica e funzionale delle singole cellule; 2) identificazione, separazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule per studi a valle; e 3) l'analisi dei saggi funzionali a livello di singola cellula.
Lo sviluppo e l'applicazione di vari marcatori fluorescenti esogeni per lo studio delle cellule coralline rimane quasi inesplorato. Tali marcatori possono includere proteine taggate, substrati marcati per enzimi o risposte fluorescenti ad altri composti. Questi marcatori possono essere utilizzati per identificare i tipi di cellule che hanno proprietà uniche, come l'evidenziazione di celle che producono quantità variabili di una specifica funzione di raggruppamento cellulare, come i lisosomi. Un ulteriore esempio è l'uso di perline etichettate fluorescentmente per identificare funzionalmente le cellule competenti per la fagocitosi, o l'inghiottimento di un agente patogeno mirato25. Le popolazioni di cellule attive nelle risposte immunitarie possono essere facilmente identificate dalla FACS dopo l'inghiottimento di queste perline applicate esogenamente. Mentre i metodi istologici tradizionali richiedono tessuto conservato e molte ore per approssimare la percentuale di cellule positive per l'inghiottimento del tallone, un saggio funzionale basato su FACS per l'inghiottimento degli agenti patogeni può essere eseguito relativamente rapidamente su cellule vive isolate. Oltre a studiare le risposte specifiche delle cellule allo stress, questa tecnologia ha il potenziale per chiarire l'espressione gene-specifica e illuminare la storia evolutiva e evolutiva dei tipi di cellule interamente unica per i cnidariani, come i calicoblasti e i cnidociti.
Recentemente, abbiamo eseguito uno screening intensivo di oltre 30 marcatori cellulari che ha portato all'identificazione di 24 che sono in grado di etichettare le cellule coralline, 16 delle quali sono utili per distinguere le popolazioni uniche18, rendendole cluster di differenziazione (CD). Qui descriviamo il processo di isolamento delle cellule coralline in Pocillopora damicornis dalla rimozione delle cellule dallo scheletro di carbonato di calcio all'identificazione e isolamento di specifiche popolazioni di cellule con FACS (Figura 1).
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Protocol
1. Dissociazione dei tessuti dallo scheletro del corallo tramite aerografo e compressore
NOTA: Eseguire passi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti.
- Assemblare il kit dell'aerografo collegando il compressore d'aria, il tubo flessibile e l'aerografo (Figura 2). Impostare l'indicatore di pressione tra 276-483 kPa.
NOTA: Il compressore e il tubo dell'aria consigliati utilizzati per questo studio sono stati preimpostati a una pressione massima di 393 kPa. Uso al di fuori di questo 276-483 kPa gamma può provocare sia una rimozione cellulare inadeguata dallo scheletro o rottura delle membrane cellulari. Questa gamma può differire per ogni specie e può richiedere un test di fattibilità. Un test di fattibilità può essere eseguito con un sottoinsieme del liquame cellulare con un semplice emocitometro e un test di esclusione del colorante daPI (4,6-diamidino_2-phenylindole), visualizzato su un microscopio composto. - Preparare 100 mL di supporti di colorazione cellulare in un sterile contenitore di vetro aggiungendo 33 mL di 10x salina tamponata da fosfato (PBS; senza calcio e magnesio) ad una concentrazione finale di 3,3x, 2 mL di siero di vitello fetale (FCS; calore inattivato a 56 gradi centigradi per 30 minuti) al 2% del volume totale e 2 mL di 1 M HEtt a una concentrazione finale di 20 m. Poi si ricarica a 100 mL con acqua sterile.
NOTA: La concentrazione di 3,3x PBS è stata scelta per imitare la salinità dell'acqua di mare, come dimostrato in Rosental et al.18. Questa concentrazione deve essere regolata per le specie che si trovano in altri ambienti per imitare la loro salinità. - Trasferire 10 mL di supporti di colorazione delle celle in una bottiglia di aerografo (etichettata "F" nella Figura 2) e collegare il coperchio dell'adattatore per il connettore dell'aerografo.
NOTA: frammenti più grandi e specie con strati di tessuto più spessi possono richiedere più supporti per un'adeguata rimozione dei tessuti. - Per le specie coralline ramificate qui, utilizzare una fresa ossea per tagliare o tagliare un frammento di corallo di circa 3 5 cm di lunghezza o 4 cm2 in area.
NOTA: Il frammento deve essere chiaro dalle macroalga e da altri organismi multicellulari perché questi non possono essere rimossi dal campione a valle e contaminano il campione durante i processi di analisi e selezione FACS. Un frammento di 1 cm di P. damicornis dà circa 2x 10 x 106 cellule dopo aver filtrato, colorato e lavato. - Posizionare il frammento di corallo all'interno di un sacchetto di plastica e utilizzare l'aerografo per spruzzare il supporto di colorazione della cella sul corallo (Figura 2). Continuare questo processo fino a quando la maggior parte dell'ossatura è esposta. Rimuovere lo scheletro rimanente dal sacchetto di raccolta.
2. Dissociazione delle cellule dal tessuto corallino
NOTA: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti.
- Filtrare il liquame cellulare attraverso un colino a cellule di nylon da 40 m in un tubo centrifuga da 50 ml per ottenere una singola sospensione cellulare.
NOTA: diverse dimensioni delle maglie del ceppo cellulare possono essere più appropriate per diverse specie. Tuttavia, dimensioni maggiori possono provocare una dissociazione dei tessuti inadeguata a causa del passaggio di detriti e grumi di cellule.- Per gli esemplari con strati di muco più spessi, utilizzare lo stantuffo sterilizzato di una siringa di plastica da 1 mL e macinarla delicatamente contro il filtro per rompere i grumi e aiutare le cellule a passare attraverso il colino. Sciacquare il colino e lo stantuffo con i supporti di colorazione cellulare nel tubo di centrifuga.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 4 gradi centigradi a 450 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 1 mL di supporto di colorazione cellulare.
3. Colorazione delle cellule
NOTA: Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio e proteggere le mani con i guanti. Le macchie presenti in questo protocollo sono a scopo di rappresentazione. Le macchie alternative richiederanno concentrazioni e tempi di incubazione diversi.
- Trasferire 500 l di celle risospese su un tubo rotondo-inferiore da 5 mL e mettere da parte come campione di controllo. Non aggiungere macchie a questo aliquota.
- Per la sospensione cellulare rimanente, aggiungere 0,42 luna di 12 mM colorante vitale (Tabella dei materiali), 1 -L di 5 m di specie reattive dell'ossigeno (ROS) ( Tabella deimateriali) e 0,1 luna di 0,2 m colorazione lisosoma ( Tabelladei materiali). Pipette bene per mescolare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio per evitare il fotosbiancamento.
NOTA: DAPI viene utilizzato in questo esempio per funzionare come colorante di DNA e vitalità per l'gating differenziale delle cellule morte sulla macchina FACS. Questo presuppone che DAPI penetri cellule morenti a causa dell'integrità della membrana. La macchia ROS emette luce nell'intervallo di 520 nm (verde), mentre il marcatore lisosomiale emette luce a circa 668 nm (rosso). - Pellet 500 L delle cellule macchiate per centrifugazione a 4 gradi centigradi a 450 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in 500 gradi l di supporti di colorazione cellulare. Trasferire in un nuovo tubo rotondo-bottom da 5 mL e conservarlo sul ghiaccio.
4. Avvio FACS
NOTA: I passaggi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro a causa delle differenze nei laser e nei canali. Per questo protocollo, è stato utilizzato un citometro con laser a lunghezza d'onda 405, 488, 535 e 640 nm. I filtri presenti in questo protocollo sono a scopo di rappresentazione. Le macchie cellulari alternative possono richiedere un diverso set di filtri e laser.
- Iniziare a creare un nuovo modello di progetto sul software di selezione e scegliere il pannello laser. Per la combinazione rappresentata di macchie e fluorescenza naturale, selezionare tutti e quattro i laser (405, 488, 535 e 640 nm).
- Selezionare i filtri appropriati per ogni colore previsto rappresentato nell'esperimento.
- Per rilevare l'emissione di DAPI e aiutare nella separazione delle cellule vive e morte, utilizzare un filtro con un passabanda (BP) di 450/50 (425-475 nm) come un filtro DAPI, Hoeschst o Pacific Blue.
- Per il rilevamento della luce emessa dal segnale ROS verde, utilizzare un filtro con un BP di 530/30 (intervallo di lunghezza d'onda di 515-545 nm) come un filtro di isotoniamina fluorescente (FITC) o proteina fluorescente verde (GFP). Questo filtro misurerà la concentrazione di ROS in ogni cellula.
- Aggiungere un filtro aggiuntivo con un BP di 670/30 (655-685 nm range) come un filtro allphycocyanin (APC) per il rilevamento dell'emissione di macchie lisosomiche.
NOTA: Il canale APC consentirà la misurazione dell'attività fagocitica. Questo canale rileverà anche l'autofluorescenza generata dalle alghe simbiotiche coralline della famiglia Symbiodiniaceae. Questo segnale può essere separato utilizzando un canale aggiuntivo che ha una lunghezza d'onda più lunga rispetto al filtro APC, tuttavia. - Includere un filtro con un BP di 780/60 (750-810 nm range), ad esempio la ficoerythrina più comunemente utilizzata, il filtro cianina (APC-Cy7), che rileva l'emissione di autofluorescenza troppo rossa da Symbiodiniaceae e ausili nell'isolamento delle cellule aposimbiosi.
5. Impostazione del gating FACS
NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato con il cilindro.
- Nella schermata sperimentale del progetto del software di citometria, creare un grafico a dispersione e selezionare la dispersione in avanti (FCS) come metrica per l'asse X e la dispersione laterale (SSC) per l'asse Y.
NOTA: FCS è correlato alle dimensioni della cella e SSC è correlato alla granularità. Ciò consentirà la rimozione della maggior parte dei detriti, in quanto la maggior parte sarà di dimensioni inferiori rispetto alle cellule intatte. - Impostare gli assi su scale logaritmiche o biesponenziali, poiché le dimensioni e la granularità delle celle possono variare in base a diversi ordini di grandezza (Figura 3A), in particolare nei coralli.
6. Analisi FACS e isolamento cellulare
NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato.
- Posizionare il controllo (cioè il sottoinsieme di celle non colorate) nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura. Quando il computer inizia a ricevere dati da ogni cella o evento, i punti inizieranno a comparire nel grafico a dispersione. Per eliminare eventuali detriti lasciati nelle camere del citometro da esperimenti precedenti, lasciare passare circa 30 s prima di iniziare l'analisi.
- Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per centrare i punti.
NOTA: La tensione PMT viene utilizzata per amplificare la potenza del segnale dei fotoni misurati; se la tensione PMT è troppo debole, verranno lette meno celle e se la tensione PMT è troppo forte, le celle saranno misurate vicino al valore massimo e diversi tipi di cellule saranno indistinguibili l'una dall'altra. Una tensione PMT adeguata garantisce che gli eventi distinguibili in modo indipendente popoleranno il grafico a dispersione. La separazione degli eventi è più facile da visualizzare proiettando scale logaritmiche o biesponenziali su grafici a dispersione FSC e SSC. - Avviare la registrazione degli eventi. Per risparmiare l'esempio, sospendere l'acquisizione dei dati dopo la lettura di circa 15.000 eventi. Nella maggior parte dei casi, questo sarà adeguato per visualizzare i modelli di popolazione cellulare complessiva. Registra più eventi se analizzi piccole popolazioni di cellule specializzate.
- Nel primo grafico di FSC e SSC, creare una selezione, o cancello, delle celle intorno al marchio 102 e superiore sull'asse X FSC. Qualsiasi cosa al di sotto di questa soglia è probabilmente detriti cellulari. Disegnare cancelli rettangolari, che è un'opzione regolare sui programmi software di citometria di flusso e buono per chiare, popolazioni di cellule distinte. Per le popolazioni di cellule che assumono una forma più irregolare sui grafici a dispersione, utilizzare un'opzione di gating poligonale.
NOTA: Un taglio minimo di 102 sulla dispersione in avanti dovrebbe selezionare per le più piccole cellule coralline, ma può consentire la contaminazione dei detriti. Per modificare questo, aumentare il limite inferiore del gating per essere più conservatore. - Creare un nuovo grafico a dispersione che esprima il filtro DAPI sull'asse X e il filtro APC-Cy7 sull'asse Y. A tale scopo, selezionare il cancello per le celle intatte create nel passaggio 6.4, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare l'opzione per creare un nuovo grafico a dispersione. Regolare gli assi su scale logaritmiche o biesponenziali.
NOTA: i passaggi necessari per creare un nuovo grafico possono variare con diversi programmi software. - Ora rimuovere il campione di controllo dalla camera del citometro e sostituirlo con le cellule colorate. Lasciare passare 30 s prima di avviare l'analisi e registrare i dati. Registrare circa 15.000 celle prima di mettere in pausa.
NOTA: Le popolazioni distinte all'estremità superiore della scala APC-Cy7 sono quelle con elevata autofluorescenza rossa da Symbiodiniaceae. Non è necessaria alcuna macchia per visualizzare queste interruzioni della popolazione e possono essere visualizzate anche nella registrazione dei campioni di controllo (Figura 3C). Selezionare per le popolazioni solo corallo, quelli più bassi sull'asse Y, per un'ulteriore differenziazione. - Creare un nuovo grafico a dispersione delle celle aposymbiotiche per visualizzare le concentrazioni ROS (filtro FITC) e le cellule positive ai lisosomi (filtro APC), utilizzando nuovamente scale logaritmiche o biesbifiche.
NOTA: Se sono presenti più popolazioni di cellule distinte che sono aposimbiotiche, ognuna di esse può essere ulteriormente distinta nel proprio grafico a dispersione (Figura 3C,D). - Confrontare il gruppo di campioni colorato con il controllo, il sottoinsieme non colorato utilizzando la prima registrazione dell'esempio di controllo o reinserendo e riutilizzando il gruppo di controlli. Gate gli eventi che sono unici per il gruppo di campioni colorato.
7. Ordinamento e raccolta FACS
NOTA: I passi possono variare a seconda della marca e del modello del citometro e del programma di acquisizione accoppiato con il cilindro.
- Con una selezione di cellule scelte per la raccolta, posizionare i tubi di microcentrismo (contenenti 250-500 l di coltura cellulare o buffer di lisi in base al numero di cellule raccolte e al metodo di stoccaggio) nella camera di raccolta del citometro.
NOTA: Il citometro di flusso rappresentato è in grado di smistare quattro diverse popolazioni alla volta, e la macchina può essere configurata per contenere una varietà di dispositivi di raccolta, tra cui vari tubi di centrifuga e 96 piastre di pozzo. - Una volta che il citometro inizia a leggere il campione ed è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, iniziare a smistare le popolazioni desiderate e raccogliere ovunque da 20.000 cellule a diversi milioni.
- Per più di 500.000 celle, regolare il volume dei supporti di coltura cellulare o buffer di lisi e il volume del dispositivo di raccolta.
- Per gli studi in vitro, conservare le cellule sul ghiaccio fino a quando non vengono poste in un ambiente sterilizzato o in un incubatore.
- Per gli studi molecolari, avviare immediatamente il processo di isolamento DNA/RNA/proteina o congelare il flash e conservarlo a -80 gradi centigradi fino all'estrazione.
- Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o selezionatrice, eseguire un controllo di purezza sulla popolazione di interesse smistando almeno 20.000 celle di interesse in 500 : L di supporti di colorazione, quindi ri-analizzando le celle ordinate e confermando che le cellule vengono lette all'interno del cancello utilizzato per ordinare inizialmente (Figura 4).
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Representative Results
Nel complesso, questo protocollo è utile perché facilita l'identificazione e la raccolta delle popolazioni di cellule coralline vive che possono essere utilizzate per analisi funzionali. Il flusso di lavoro è iniziato con la separazione meccanica dei tessuti corallini dallo scheletro di carbonato di calcio sottostante (Figura 1). Questo è uno dei passi iniziali più importanti perché tecnica impropria si traduce in alta mortalità cellulare e può creare grandi quantità di detriti. La separazione enzimatica non è consigliata perché può provocare un aumento della tosatura dei tessuti e un'elevata mortalità cellulare. La separazione meccanica con un aerografo riduce queste sfide (Figura 2), riducendo la mortalità media delle cellule al 10% (dati non mostrati). In seguito alla separazione meccanica mediata dall'aerografo dei tessuti dallo scheletro, il liquame risultante è stato filtrato in una sospensione cellulare mediante filtrazione attraverso un colino cellulare. La sospensione cellulare è stata poi macchiata con DNA (DAPI), ROS e marcatori lisosomici e letta dal citometro FACS. È stata quindi sviluppata una strategia di gating per isolare specifiche popolazioni di cellule in base ai marcatori cellulari utilizzati. Le popolazioni di cellule gated sono state poi ordinate in tubi di raccolta (Figura 1).
Durante l'analisi dei campioni sul citometro FACS, sono state prese diverse misure per rimuovere i detriti e le cellule morte dal campione. Le cellule symbiodiniaceae potrebbero essere rimosse selettivamente se lo si desidera a causa della loro autofluorescenza. In primo luogo, i detriti e altre particelle non cellulari che non condividevano la stessa forma o granularità delle cellule coralline sono stati rimossi dalle analisi creando una selezione di gating sulla dispersione in avanti (dimensione) e laterale (granularità) (Figura 3A). Successivamente, le cellule morte sono state escluse confrontando la sospensione delle celle di controllo incontaminate con il campione macchiato DAPI e il canale di colore lontano rosso, quindi rilevando le cellule positive per un'elevata colorazione DAPI nel campione colorato (Figura 3B, popolazione cellulare P6). Parallelamente, le cellule che ospitano Symbiodiniaceae autofluorescente sono state rimosse attildo contro le cellule con un segnale elevato nel canale molto rosso (Figura 3B, APC-Cy7). Dopo questo processo iterativo di gating, le cellule rimanenti per le analisi rappresentano le popolazioni intatte di cellule coralline vive prive di Symbiodiniaceae.
Queste cellule potrebbero quindi essere classificate in diverse sottopopolazioni cellulari confrontando il controllo e i campioni macchiati aggiungendo macchie esogene per caratteristiche come l'attività ROS e/o il contenuto del lisosoma (Figura 3C). Ad esempio, l'esame dei dati sui filtri ROS e lisosomiche ha rivelato quattro sottopopolazioni distinte di cellule coralline. Una popolazione di cellule aveva un segnale relativamente basso per il contenuto lisosomiale (filtro APC) e le altre tre avevano un segnale elevato nel contenuto lisosomico e una gamma di attività ROS (filtro FITC) (Figura 3C). Ognuna di queste sottopopolazioni può essere ordinata singolarmente per l'analisi a valle, o ulteriormente analizzata e analizzata in sottopopolazioni più discrete dall'intersezione di dimensioni, granularità, autofluorescenza e/o contenuto di DNA. In questo studio, DNA, attività ROS, e contenuto lisosomico sono stati utilizzati per identificare le ampie caratteristiche delle cellule coralline. È importante sottolineare che questo protocollo generale può essere adattato a una serie di marcatori fluorescenti e a specifiche sonde anticorpali che possono essere utilizzate in combinazione per l'isolamento di popolazioni cellulari specializzate di interesse come le cellule staminali.
Figura 1: Flusso di lavoro generale del processo di smistamento delle celle coralline. Il protocollo in primo piano consente la rimozione delle cellule di corallo dallo scheletro per la colorazione, che vengono poi attraversate attraverso il citometro FACS, misurate, analizzate e isolate nelle popolazioni cellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rimozione di tessuti e cellule dallo scheletro del corallo. Il compressore d'aria (A) forza il supporto di colorazione dell'aria e delle cellule (F) fuori dall'aerografo (E) e lavora per far saltare il tessuto dallo scheletro del corallo (C) e crea un liquame cellulare nel sacchetto (D). La pressione massima dell'aria è controllata dal misuratore di pressione (B) sul compressore d'aria (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gating selezione di cellule coralline vive. (A) Le cellule vive sono state isolate dai detriti utilizzando un valore minimo di dispersione in avanti di 102. (B) Il filtro APC-Cy7 è stato utilizzato per identificare l'autofluorescenza rossa, separando efficacemente le cellule ospitate a simbionti, mentre DAPI è stato utilizzato per identificare le cellule altamente positive per la colorazione del DNA. Quelle persone altamente positive per daPI erano indicative di cellule morte e morenti. (C,D) Sono stati utilizzati marcatori aggiuntivi per l'attività ROS e il contenuto di lysosomi per differenziare ulteriormente le diverse popolazioni di cellule coralline. Tutti i dati sono stati successivamente rianalizzati su FlowJo (v10) per generare questi grafici. L'etichetta e la percentuale di popolazione inserite corrispondono alle microscopiche foto scattate di ogni popolazione ordinata (E). Le percentuali mostrate in ogni grafico sono delle celle totali all'interno del grafico. Barra in basso a destra della scala - 20 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Controllo della purezza delle cellule associate ad autofluorescente Symbiodiniaceae. (A) Sono state ordinate le celle positive per la fluorescenza sul filtro APC-Cy7 del campione di controllo incontaminato. (B) Questo gruppo ordinato di cellule è stato poi rieseguito sul citometro e rianalizzato nelle stesse condizioni, mostrando il 94% di purezza. Per l'asse di ancoraggio è stato utilizzato lo sdispersione in avanti (asse X, FSC), ma è intercambiabile con qualsiasi altro parametro. Lo stesso processo può essere eseguito su campioni macchiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è stato adattato da Rosental et al.18 e sviluppato per l'identificazione e l'isolamento delle cellule di P. damicornis. La metodologia si concentra sul processo di filtraggio dei campioni per rimuovere detriti, cellule non vitali e cellule ospitate da Symbiodiniaceae attraverso l'esame di fattori intrinseci cellulari, tra cui la dimensione delle cellule relative, la granularità relativa delle cellule, l'autofluorescenza cellulare e la presenza di membrane cellulari intatte. Queste tecniche possono essere applicate ad altre specie di corallo. Tuttavia, le strategie di gating FACS possono variare a causa delle differenze specifiche delle specie nelle caratteristiche della popolazione cellulare.
L'utilità della FACS per comprendere la salute del corallo sta nella sua capacità di utilizzare diversi fattori intrinseci cellulari per identificare e isolare in modo differenziale le cellule. Inoltre, questo protocollo descrive l'uso aggiuntivo della colorazione cellulare esogena per differenziare le cellule coralline in base alla vitalità, alla concentrazione di specie reattive di ossigeno e al contenuto di lisosomi. Dei più di 30 marcatori commerciali precedentemente testati in Rosental et al.18, 24 cellule denominate P. damicornis, di cui 16 producevano segnale differenziale, gruppi di differenziazione che consentirebbero la selezione delle sottopopolazioni cellulari.
Uno dei passaggi critici di questo protocollo è la corretta rimozione e filtraggio dei tessuti per garantire che i grumi di tessuto siano dissociati e non blocchino il flusso laminare del citometro di flusso. Una corretta regolazione della tensione PMT è fondamentale per il rilevamento accurato e l'analisi degli eventi di rilevamento delle cellule indipendenti. Rispetto al lavoro precedente18, il processo di isolamento delle cellule coralline dallo scheletro sottostante tramite interruzioni meccaniche dell'aerografo migliora significativamente i metodi tradizionali di raschiatura riducendo i detriti e massimizzando la fattibilità delle cellule (90%, Figura 2 e Figura 3A), migliorando così le analisi successive riducendo i falsi positivi dovuti al rumore.
La metodologia descritta in questo documento facilita la separazione delle popolazioni di cellule coralline attraverso la selezione differenziale su un'intersezione di caratteristiche morfologiche e funzionali a un livello non precedentemente possibile. Con lo sviluppo di metodologie FACS per le cellule coralline, è ora possibile selezionare sottopopolazioni cellulari specifiche per la creazione di colture cellulari definite, nonché per sondare profili trascrittomici ed epigenetici associati a specifiche sottopopolazioni cellulari. L'applicazione di queste informazioni su scala fine fornirà informazioni sul tipo di cellula, il comportamento e la funzione, e può rivelare caratteristiche associate all'evoluzione di tipi di cellule specifiche del cnidariana come calicoblasti e cnidociti. Inoltre, l'applicazione della tecnologia FACS allo sviluppo di migliori analisi dello stress e biomarcatori può rivelarsi utile per la protezione delle barriere coralline gravemente minacciate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
NTK vorrebbe riconoscere l'Università di Miami Research Awards in Scienze Naturali e Ingegneria per finanziare questa ricerca. BR desidera ringraziare Alex e Ann Lauterbach per aver finanziato il Laboratorio di Immunologia Comparata ed Evoluzione. Il lavoro di BR è stato supportato dai numeri della Israel Science Foundation (ISF): 1416/19 e 2841/19, e HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Ringraziamo la signora Kozhekbaeva e Mike Connelly per l'assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare la risorsa condivisa Cytometry Flow della Miller School of Medicine presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center per l'accesso al citometro FACS e a Shannon Saigh per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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