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Émission de fluorescence induite par le laser (L.I.F.E.) comme nouvel outil non invasif pour la mesure in situ des biomarqueurs dans les habitats cryosphériques

Published: October 26, 2019 doi: 10.3791/60447
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 1,2
1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

Summary

Les flux de carbone dans la cryosphère ne sont guère encore évalués, mais sont cruciaux en ce qui concerne le changement climatique. Ici, nous montrons un nouveau prototype de dispositif qui capture le potentiel phototrophique dans des environnements supraglaciaires basés sur l'émission de fluorescence induite par le laser (L.I.F.E.) technologie offrant des données de haute résolution spectrale et spatiale dans des conditions in situ.

Abstract

Le réchauffement climatique affecte les communautés microbiennes dans une variété d'écosystèmes, en particulier les habitats cryosphériques. Cependant, on sait peu de choses sur les flux de carbone microbiens dans les environnements extrêmes. Par conséquent, la méthodologie d'acquisition d'échantillons décrite dans les très rares études disponibles implique deux problèmes majeurs : A) les données à haute résolution nécessitent un grand nombre d'échantillons, ce qui est difficile à obtenir dans les régions éloignées; B) manipulation inévitable de l'échantillon comme la coupe, le sciage et la fonte des carottes de glace qui conduit à une mauvaise compréhension des conditions in situ. Dans cette étude, un prototype de dispositif qui ne nécessite ni préparation d'échantillon ni destruction d'échantillon est présenté. L'appareil peut être utilisé pour des mesures in situ avec une résolution spectrale et spatiale élevée dans les écosystèmes terrestres et de glace et est basé sur la mission Laser-Induced Fluorescence E(L.I.F.E.) technique. Les communautés supraglaciaires photoautotrophes peuvent être identifiées par la détection des signatures L.I.F.E. dans les photopigments. L'étalonnage de l'instrument L.I.F.E. pour la porphyrine dérive la chlorophyllea (chla) (405 nm d'excitation laser) et B-phycoerythrin (B-PE) (532 nm excitation laser) est démontré. Pour la validation de cette méthodologie, les données L.I.F.E. ont été ratifiées par une méthode conventionnelle pour chlune quantification qui a impliqué l'extraction de pigment et la spectroscopie d'absorption ultérieure. L'applicabilité prototype sur le terrain a été prouvée dans des environnements polaires extrêmes. D'autres essais sur les habitats terrestres ont eu lieu lors de simulations analogiques martiennes dans le dessert marocain et sur un glacier rocheux autrichien. L'instrument L.I.F.E. permet de scanner à haute résolution de grandes zones avec une logistique d'exploitation acceptable et contribue à une meilleure compréhension du potentiel écologique des communautés supraglaciaires dans le contexte du changement global.

Introduction

La cryosphère abrite de la glace de mer, des glaciers, des lacs de haute montagne, des zones de neige, de la glace de lac, des ruisseaux d'eau de fonte et du pergélisol. Ces zones couvrent environ 11 % des masses terrestres1,2 et sont dépassées par l'atmosphère comme un environnement cryosphérique reconnu. Des études récentes montrent que les zones massives de la cryosphère reculent rapidement3,4. L'Antarctique5,6, les Alpes7, l'Arctique8, et d'autres régions montrent des soldes négatifs de masse de glace. Le recul des calottes glaciaires et des glaciers entraîne l'épuisement de notre plus grand réservoir d'eau douce sur Terre. Dans certaines régions, le recul des glaciers est imparable5.

Pendant longtemps, les écosystèmes de glace ont été considérés comme des milieux stériles. Cependant, malgré des conditions difficiles, la présence de la vie active dans la cryosphère de la terre est évidente9,10,11,12,13,14,15 . En raison de la tendance à des pertes massives de glace par la fonte, la cryosphère traverse un changement dans l'activité biologique, affectant les habitats adjacents. Pour comprendre ces changements partiellement irréversibles, nous avons besoin de méthodes pour étudier l'activité biologique dans la glace dans des conditions in situ avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Dans les environnements supraglaciaires, la vie se retrouve dans les trous de cryoconite, les couvertures de neige, l'eau fondue, les ruisseaux et sur les surfaces de glace nue. Cependant, les habitats supraglaciaires les plus évidents sont les trous de cryoconite. Ils apparaissent dans le monde entier dans des environnements glaciés et ont été décrits pour la première fois par l'explorateur suédois Adolf Erik Nordenskjold lors d'une expédition au Groenland dans lesannées 1870 16,17. Le nom vient des mots grecs "kryos" (froid) et "konia" (poussière). Les débris organiques et inorganiques foncés dérivés de l'éolian attachent à la surface de la glace et réduisent l'albédo localement. Le rayonnement solaire favorise la fonte des débris en couches de glace plus profondes, formant des bassins cylindriques avec des sédiments (cryoconite) dans le fond9. Les trous de cryoconite couvrent 0,1 à 10 % des zones d'ablation glaciaire11.

Les communautés de cryoconite se composent de virus, de champignons, de bactéries, de cyanobactéries, de microalgues et de protozoaires. Selon la région, on trouve également des organismes métazoaires comme les rotifères, les nématodes, les copépodes, les tardigrades et les larves d'insectes. Edwards et d'autres18 décrivent les trous de cryoconite comme des « points chauds glacés ». Ils ont également tracé des gènes fonctionnels dans les trous de cryoconite qui sont responsables du cycle N, Fe, S et P. Les mini-écosystèmes lacustres respirent et photosynthétisent à des taux trouvés dans des habitats beaucoup plus chauds et riches en nutriments11. Ces résultats soulignent le rôle important de la séquestration microbienne dans les environnements supraglaciaires. À côté des communautés vivantes dans les trous de cryoconite, les surfaces de glace nuesont habitées par des algues de glace. Leur physiologie est bienétudiée 19 mais leur répartition spatiale n'a pas été évaluée20. Leur présence dans les environnements supraglaciaires diminue l'albédo et favorise donc la fonte qui conduit à un délavage des nutriments et à l'apport de nutriments dans les habitats en aval9. L'augmentation des températures et, par conséquent, une plus grande disponibilité d'eau liquide, affecte la productivité nette de l'écosystème dans ces écosystèmes glacés.

Dans les environnements supraglaciaires, les organismes photosynthétiquement actifs transforment le carbone et l'azote inorganiques en sources organiques disponibles pour le réseau alimentaire microbien21,22. Jusqu'à présent, il existe peu d'études qui estiment les flux de carbone supraglaciaires11,20,23. L'écart dans les taux proposés de flux de carbone résulte d'une faible résolution de données spatiales et temporelles. De plus, la répartition spatiale des communautés supraglaciaires à l'extérieur des trous cryoconites est à peine évaluée. Cook et d'autres20 ont prédit dans leurs modèles que les communautés d'algues supraglaciaires fixent jusqu'à 11 fois plus de carbone que les trous cryoconites contemporains en raison de leur grande couverture de surface. La détection des communautés d'algues supraglaciaires garantissant l'intégrité de l'échantillon est toujours entravée en raison de l'absence d'outils de détection et de quantification in situ.

En réponse aux difficultés logistiques, les écosystèmes de glace sont moins fréquemment étudiés que les habitats dans les zones tempérées. La résolution des données dépend du nombre d'échantillons évalués et dépend de l'accessibilité des sites d'étude. Les méthodes d'échantillonnage standard telles que le sciage, le carottage et la fonte subséquente impliquent la manipulation de la communauté microbienne. Par exemple, l'évaluation de la chlorophyllea (chla)dans les échantillons de glace solide est impossible avec des méthodes standard sans interférence substantielle. Par conséquent, les changements de température induits par la fonte au sein des communautés microbiennes étudiées sont inévitables. En réponse à la thermolabilité du photosystème II et d'autres structures cellulaires chez les psychrophiles22, les analyses en laboratoire d'échantillons de glace fondue mèneront toujours à une falsification des conditions in situ.

Les mesures in situ non destructives sont le seul moyen raisonnable d'obtenir des données fiables. Cet objectif peut être atteint en utilisant des méthodes basées sur la fluorescence. En raison de leur fonction de récolte de lumière, chla et B-phycoerythrin (B-PE) sont présents dans les organismes qui contribuent au cycle du carbone dans les environnements supraglaciaires, comme l'a prouvé Anesio et d'autres11. Par conséquent, ces molécules fluorescentes sont des biomarqueurs appropriés pour la quantification des flux de carbone microbiens médiés dans les écosystèmes de glace.

Dans cette étude, nous présentons le développement, l'étalonnage et l'applicabilité d'un nouvel outil non invasif pour la quantification in situ des molécules de chla et de B-PE dans les écosystèmes terrestres et glaciaires. Le prototype est basé sur l'émission fluorescente induite par le laser, également connu sous le nom de L.I.F.E. L'instrument optique (Figure 1) capture les signatures fluorescentes de biomarqueur après l'excitation de fluorescence induite par laser. La procédure n'est pas destructive et peut être effectuée sur le site de l'étude ou en laboratoire.

Figure 1
Figure 1 : Le prototype L.I.F.E. À gauche : Photo de l'instrument sans couvercle protecteur. À droite: Illustration schématique de l'instrument. Masse totale de 5,4 kg (laser et optique 4,025 kg, ordinateur portable 1,37 kg). Cadre en aluminium 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Tube optique : 18,4 cm x 4 cm (diamètre). CCD: capteur bluefox mv220g; F : filtres à longue passe servo-dirigés (450 nm et 550 nm); L: lentilles optiques; M1: miroirs; M2: miroir dichroïque; MC: microcontrôleur; P: prisme; PBS : séparateur de faisceau polarisant ; S : ouverture de lafeture faite de lames de rasoir réglables. Barre d'échelle de 70 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le kit portable à double longueur d'onde pèse 4,5 kg et est utilisé sur un trépied en combinaison avec un ordinateur externe. La configuration sur le terrain est rapide et facile. L'instrument est fixé au trépied, et le tube de lentille est attaché à l'appareil avec un câble USB et le câble de la caméra. L'ordinateur externe est connecté à l'instrument à l'aide d'un câble USB. Les pattes de trépied sont ajustées de telle sorte que le tube de lentille est dirigé vers et couvre le spécimen. Puis, un laser vert de 5 mW frappe l'échantillon après avoir passé un séparateur de faisceau polarisant qui redirige la lumière polarisée vers l'axe optique du spectromètre. Le spécimen présente une lumière fluorescente, illustrée en rouge à la figure 1. La moitié de la lumière collimated passe le séparateur de faisceau polarisant et est concentrée par un filtre de servo-steered de long-pass qui enlève les signaux laser. Ensuite, le signal frappe une élitdoire d'ouverture qui se compose de deux lames de rasoir réglables. Un prisme sépare spectralement la fine ligne de lumière orthogonale de l'ouverture de la fendue avant que le signal ne soit capté par le capteur. La procédure est répétée avec un laser bleu. Les données brutes sont transférées automatiquement sur un ordinateur portable qui est également utilisé pour l'opération du logiciel.

L'instrument est contrôlé par un ordinateur externe à l'aide d'un environnement LabVIEW qui synchronise la prise de vue avec la caméra CCD, allume/éteint les lasers et fait pivoter la roue du filtre à longue passe. L'interface utilisateur graphique (GUI) est divisée en trois sections principales. Le réglage de l'exposition se fait manuellement. Bien que la correction entre le temps d'exposition et l'intensité du signal soit linéaire(figure 2B),le temps d'exposition maximal est limité à 10 s parce que des temps d'intégration plus longs entraînent une diminution significative du rapport signal-bruit. Le champ de commentaires est utilisé pour la description de l'échantillon (figure 2A). Dans la section de droite, les images brutes sont affichées dès que les mesures sont terminées. Cette caractéristique est cruciale pour l'évaluation immédiate des données sur le terrain (Figure 2C-E). Les zones rouges indiquent des pixels surexposés, qui peuvent être évités en réduisant le temps d'exposition.

Le processus de réduction des données brutes subséquent est découplé de la procédure d'acquisition d'images et peut être effectué à tout moment après l'acquisition d'images.

Figure 2
Figure 2 : Interface utilisateur graphique L.I.F.E. pour l'acquisition de données et l'évaluation des données brutes. (A) Le logiciel permet l'entrée manuelle de texte pour les descriptions d'échantillons. (B) Le temps d'exposition peut être ajusté avant la mesure. (C-E) Les images brutes sont affichées sur le côté droit de l'interface. (E) Les couleurs rouges indiquent une saturation du capteur. (F) L'activation du bouton RUN MEASUREMENT déclenche le processus d'acquisition de données. Dans le tableau (G), toutes les commandes exécutées automatiquement lors de l'acquisition de données sont affichées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d'image brute. À gauche : Données brutes de chlune norme dans la solution d'acétone, enregistrée avec l'instrument L.I.F.E. En raison des propriétés optiques de l'appareil, le signal s'affiche sous la forme d'une ligne déformée. À droite: Interprétation de l'image brute par pixel (px). L'axe spectral (résolution de 5 nm/px) est tracé contre l'axe spatial (résolution de 30 m/px). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les images brutes à l'échelle grise 12 bits montrent une composante spatiale due à la pari identifique unidimensionnelle et une composante spectrale due au prisme devant le CCD (Figure 3). En réponse aux contraintes optiques, les images brutes sont déformées. Par conséquent, ils doivent être recadrés et déwarped en appliquant un code qui reconnaît le degré de distorsion. Cela se fait avec un assistant logiciel (Figure 4). Ensuite, l'étalonnage de la longueur d'onde se fait avec le laser 532 nm. La lumière verte est produite par le doublement de fréquence d'un laser infrarouge de 1 064 nm. Les deux longueurs d'onde peuvent être détectées par le CCD et, par conséquent, la position spectrale de chaque pixel peut être calculée automatiquement en images déwarped (Figure 4).

L'image est ensuite recadrée à une plage de longueur d'onde donnée (550 à 1 000 nm pour les mesures laser vertes et 400 à 1 000 pour les mesures laser bleues). Les valeurs grises de chaque pixel d'une ligne de pixels sélectionnée sont comptées et résumées. Une valeur grise peut varier de 0 à 255. Après cela, chaque ligne de pixels représente un numéro. D'autres instructions logicielles à l'écran conduisent à la génération d'une parcelle montrant les comptes de valeur grise de chaque ligne de pixels tracées par rapport aux coordonnées spatiales. Cela permet une discrimination spatiale quantitative de chla et B-PE simultanément dans l'échantillon. En outre, les propriétés spectrales d'un échantillon peuvent être tracées à partir de lignes de pixels sélectionnées automatiquement.

Figure 4
Figure 4 : Déwarping images brutes. À gauche : Image brute capturée avec un laser vert. Aucun filtre n'a été utilisé. Les signaux sont affichés à 532 nm et 1 064 nm. Temps d'exposition de 0,015 s. Centre : Le signal recadré de 532 nm est utilisé comme ligne de référence pour dénouer un ensemble d'images. À droite: L'image déwarped de la source d'image brute. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocol

1. Calibration et validation

REMARQUE : Pour l'étalonnage des pigments, préparer les lignes de dilution à partir de solutions de stock de chla et B-PE. Le chlune solution de stock est diluée avec de l'acétone et B-PE est dilué avec de l'eau stérile distillée. Plus tard, 15 ml de chaque étape de dilution seront nécessaires. Protégez les pigments de la lumière en les enveloppant de papier d'aluminium. Conserver le chla dans un congélateur et le B-PE dans un réfrigérateur jusqu'à ce qu'il soit utilisé davantage. Un protocole détaillé pour la ligne de dilution suit dans les sections 1.1 pour chla et 1.2 pour B-PE. L'étalonnage du laboratoire B-PEet du laboratoire B-PE pour la détection et la quantification des pigments avec l'instrument L.I.F.E. est décrit ci-dessous. Un étalonnage précédent24 a été fait avec les mêmes pigments que dans cette étude.

  1. Chlorophylle une lignede dilution
    1. Dissoudre 1 mg de chla (purifié à partir d'algues A. nidulans) avec de l'acétone dans un tube d'échantillon de 50 ml et diluer ce chld'une solution de stock avec de l'acétone aux concentrations finales suivantes : 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; et 0,5 ng/mL.
    2. Transférer 15 ml de chaque dilution dans des tubes d'échantillon de 50 ml et les recouvrir de papier d'aluminium en raison de la sensibilité à la lumière. Conserver les tubes dans un congélateur de -20 oC jusqu'à ce que les mesures d'étalonnage soient prises.
      REMARQUE: Le protocole peut être interrompu ici.
    3. Mesurer les caractéristiquesd'absorption chl a de chaque dilution dans un spectrophotomètre à double faisceau comme tripliates et calculer le chlun contenu tel que décrit par Lorenzen25, qui sera décrit en détail dans la section 2.2.2.
  2. Ligne de dilution PE
    1. Diluer une solution de stock B-PE de 4 mg/mL avec de l'eau filtrée stérile (pH no 7) aux concentrations finales suivantes : 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; et 5 ng/mL B-PE. Transférer 15 ml de chaque dilution dans un tube échantillondeur de 50 ml et le recouvrir de papier d'aluminium. Conserver à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé davantage.
      REMARQUE: Le protocole peut être interrompu ici.
  3. Configuration pour l'étalonnage
    1. Construire un rack comme indiqué à la figure 5 pour établir trois plates-formes de mesure, chacune de 1,5 cm de plus que la suivante.
      REMARQUE : La hauteur du support et de la colonne joue un rôle important pour les mesures parce que la surface des liquides doit rester dans le point focal de l'instrument L.I.F.E. tel qu'indiqué dans la figure 5.
    2. Ajouter 5 ml de dilution concentrée la plus élevée dans un flacon de plastique de polyscintillation et le mettre sur le point le plus élevé de la grille. Mesurer l'intensité de la fluorescence.
    3. Placer le flacon dans la position médiane de la grille et ajouter un autre 5 ml (10 ml de volume total). Mesurer l'intensité de la fluorescence. Répétez la procédure à la position la plus basse sur le support avec un autre 5 ml (15 ml de volume total; total de 45 mm de hauteur de colonne).
      REMARQUE : Adapter le temps d'exposition pour chaque étape de dilution afin d'éviter la saturation du détecteur (valeurs grises de plus de 255 en images 12 bits) et pour un rapport signal-bruit suffisant des signaux de fluorescence faibles.
    4. Répétez les étapes 1.3.2 et 1.3.3 avec toutes les dilutions (étapes 1.1.1 et 1.2.1) de chla et B-PE.
    5. Chargez les fichiers de données générés dans l'assistant de réduction des données pour compter et résumer automatiquement les valeurs grises de chaque ligne de pixels le long de l'axe Y (distribution spatiale).
      REMARQUE : Les temps d'exposition variables sont compensés automatiquement par la normalisation de l'intensité de fluorescence à un temps d'intégration de 1 s.
    6. Calculer la densité de la surface pigmentaire à l'aide des concentrations connues de la série de dilution et des intensités de fluorescence normalisées qui ont été calculées. Ensuite, normalisez les comptes de fluorescence des trois hauteurs différentes de colonne à 1,5 cm (5 ml) en multipliant les comptes de chaque hauteur de colonne avec un facteur (facteurs 1, 0,5 et 0,33, pour les solutions de concentration de 5 ml, 10 ml et 15 ml, respectivement).

Figure 5
Figure 5 : Configuration de l'étalonnage L.I.F.E. avec chla et B-PE dans des conditions de laboratoire.
(A) Tube de lentille de l'instrument. (B) Laser vert pour l'excitation B-PE. (C) Laser bleu pour chlune excitation. (D) Flacon de scintillation. (E) Point focal de l'instrument L.I.F.E. (F) B-PE/eau ou chl a/acétone solution avec 5 ml, 10 ml, et 15 ml. (G) Les spacers qui gardent la surface de chaque solution au plan focal pour trois volumes différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Échantillonnage et traitement de l'échantillon

  1. Collection de neige et de glace
    1. Recueillir la neige et la glace supraglaciaire d'un glacier dans des sacs de polyéthylène stériles et les conserver congelés jusqu'à ce qu'ils soient traités.
      REMARQUE : Pour cette étude, les échantillons ont été prélevés à Midtre Lovenbreen (MLB), un glacier polythermique près du village de recherche de Ny-Leslesund dans l'archipel arctique du Svalbard (78'53' N, 12'03' E).
    2. Échantillonnez des tapis bactériens de l'avant-champ glaciaire dans des sacs de polyéthylène stériles et transportez tous les échantillons à un laboratoire pour un traitement ultérieur.
    3. Faire fondre lentement les matières congelées dans l'obscurité à 4 oC. Filtrer les échantillons liquides sur les filtres GF/F (47 mm de diamètre) et noter le volume filtré. Gardez les filtres congelés jusqu'à ce que le traitement se relisse.
  2. Chlorophyllea mesures
    1. À l'aide de l'instrument L.I.F.E., mesurez le filtre dans quatre zones aléatoires, chacune en tripliciats à l'aide du laser vert et bleu. Calculer la concentration globale de pigments en multipliant la densité de la zone avec la zone filtrée et le volume filtré. Normaliser la concentration de pigments (g/L) à un volume de 1 L.
    2. Évaluer le chlun contenu des filtres GF/F avec une norme de laboratoire selon le protocole de Lorenzen25. Pour ce faire, placez chacun des filtres dans une fiole avec 13 ml d'acétone et entreposez-les dans l'obscurité à 4 oC pendant la nuit. Ensuite, prenez une fiole et placez-la sur la glace avant la sonication pendant 2 min à 50% de puissance en mode continu. Presser et retirer le filtre du flacon.
    3. Fixez le tube de tygon à une seringue et retirez le chlun mélange extraction-acétone du flacon. Remplacez le tube tygon par un porte-filtre GF-5. Transférer la solution dans une cuvette à quartz.
    4. Après avoir étalonné le spectromètre absorbant pour l'acétone, placez l'échantillon dans la cuvette dans le spectromètre et mesurez les caractéristiques d'absorption entre 400 et 750 nm. Ensuite, retirez la cuvette du spectromètre et ajoutez 200 L de 2 M HCl à l'échantillon. Ensuite, répétez la mesure de l'absorption pour mesurer la teneur en phaéophytine dans l'échantillon.
  3. Mesure de l'activité microbienne au moyen de marqueurs radio-étiquetés et impact de l'intensité et du temps d'exposition au laser sur les taux de productivité
    ATTENTION : Méfiez-vous de la radioactivité marqueur (rayonnement de l'A). Utilisez une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes, et travaillez sous une hotte de fumée dans un laboratoire d'isotopes agréé.
    1. Pour la production bactérienne transférer cinq aliquots de tapis bactériens dans des sacs de polyéthylène stérile. Inactivez les commandes avec du formaldéhyde à une concentration finale de 4%.
      REMARQUE : Trois aliquots sont utilisés pour l'utilisation de leucine 3 H et deux aliquots sont utilisés comme contrôles.
    2. Exposer les nattes avec un laser bleu (405 nm, 5 mW) et avec un laser vert (532 nm, 5 mW) pour 10 s et 30 s chacun. Répétez la procédure avec des lasers de 50 mW. Ensuite, inactiver les échantillons qui n'ont pas été traités avec du formaldéhyde.
      REMARQUE : Un tapis est utilisé pour une seule exposition au laser. Utilisez des tapis microbiens non exposés comme témoins.
    3. Après le traitement au laser, estimez la production bactérienne et primaire en incorporant respectivement 3H-leucine et NaH14CO3. Pour les mesures de production bactérienne, utiliser cinq aliquots par échantillon (20 ml) et ajouter de la formaline (4 % de concentration finale) à deux des parallèles, qui servent de contrôles pour l'incorporation abiotique du marqueur. Ajouter 3H-leucine (40 nM) à tous les échantillons des différents traitements et les incuber pendant 4 h dans des conditions in situ (0,1 oC). Terminez la réaction en ajoutant de la formaline aux échantillons vivants restants.
    4. Pour la production bactérienne de tapis bactériens, transférer les échantillons étiquetés en cryovials. Extraire les cellules avec 5% d'acide trichloroacétique et centrifugeuse à 10.000 x g pendant 5 min selon les protocoles de Kirchman26 et Bell27. Ajouter le liquide de scintillation et mettre le cryovial dans un flacon de polyscintillation. Analyser les échantillons à l'eau à l'eau et calculer les taux d'intérêt.
      REMARQUE : Trois aliquots sont utilisés pour l'utilisation de leucine 3 H, deux aliquots sont utilisés comme contrôles.
    5. Pour la production primaire, préparer cinq répliques de divers traitements (100 ml), envelopper deux d'entre eux dans du papier d'aluminium pour imiter les échantillons sombres, et ajouter NaH14CO3 (1 'Ci) à tous. Incuber pendant 4 h dans la lumière ambiante et la température in situ (0,1 oC). Terminer la réaction en assombrissant les trois autres répliques et filtrer l'échantillon sur les filtres GF/F (25 mm de diamètre).
    6. Ajouter 100 L de 2 N HCl aux filtres pour enlever tout l'excès de carbone et laisser l'air sous le capot de fumée. Séchez les échantillons sur une plaque chauffante à 80 oC et placez les échantillons dans des flacons de polyscintillation.
    7. Pour mesurer les désintégrations radioactives par minute (dpm) de tous les traitements de production primaire et bactérienne, placez les cryovials dans des flacons de polyscintillation et ajoutez 5 ml de cocktail de scintillation. Mesurez le dpm à l'eau à l'eau avec un compteur de scintillation liquide et calculez les taux d'intérêt.

Representative Results

Étalonnage en laboratoire pour B-PE
Les signaux de réponse de la ligne de dilution B-PE ont été mesurés à l'aide de l'instrument L.I.F.E. dans une pièce sombre à 20 oC(figure 6). Le taux de comptage dépendait à la fois de la concentration et de la hauteur de la colonne de l'échantillon mesuré. Faible concentration et faible hauteur de colonne B-PE spécimen fluoresced plus fort par rapport aux échantillons de la même concentration et la hauteur de la colonne plus élevée.

Figure 6
Figure 6 : étalonnage de laboratoire B-PE. L'étalonnage de la teneur en B-PE et de la densité des colonnes s'affiche. Les taux de comptage normalisés ont été calculés pour une hauteur de colonne de 1,5 cm. Réimpression avec autorisation28. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Une régression de Poisson a été utilisée pour l'ajustement final de la ligne d'étalonnage. Il y avait une corrélation linéaire entre les densités de zone et le nombre de valeurs grises pixel. La fonction de la courbe était de 81,04x(figure 7),ce qui signifie qu'un taux de numération de la valeur grise de 8 104 dans un échantillon exposé de 1 s équivalait à une densité de surface de 100 ng/cm2 B-PE. Le chlun étalonnage est mis en place d'une manière analogique. La fonction était y '8.94x.

Figure 7
Figure 7 : Courbe d'étalonnage final pour B-PE. Les comptes de valeur grise ont été normalisés à un temps d'exposition de 1 s et tracés par rapport à la densité de la zone. Réimprimer avec la permission28. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Application sur des échantillons de cryoconite de Svalbard et validation en laboratoire des données
Les valeurs moyennes des mesures L.I.F.E. et les mesures uniques des mêmes échantillons dérivés de l'extraction conventionnelle à l'aide de l'acétone et de l'analyse subséquente à l'aide d'un spectrophotomètre sont illustrées dans la figure 8.

Figure 8
Figure 8 : Validation des données avec des échantillons naturels. Les échantillons (MLB) sont classés par chlun contenu, basé sur les résultats d'un spectrophotomètre de laboratoire (valeurs uniques) et comparés avec le chlune données de fluorescence mesurées sur quatre zones aléatoires par filtre. Les barres d'erreur représentent l'écart standard des mesures L.I.F.E. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Chlun contenu allant de 48 g/L-67 g/L a été sous-estimé, et uncontenu inférieur de chl allant de 0,7 g/L-7 g/L a été surestimé par le prototype l.I.F.E. Les écarts types par rapport aux mesures De l'I.F.E. étaient faibles.

Comparaison des données spectrales des mesures in situ avec les normes de laboratoire
Chla spectras étaient comparables entre les échantillons de cryoconite et ceux provenant d'algues A. nidulans. Les pics de fluorescence dans tous les échantillons ont été localisés à 700 nm-710 nm. Cependant, les spectres dérivés d'échantillons de cryoconite montraient des signaux sonores plus élevés entre 400 nm et 650 nm et de 800 nm à 1 000 nm par rapport aux spectres du chlune norme pigmentaire (Figure 9).

Figure 9
Figure 9 : Interprétation spectrale des données. Mesures de quatre granules de cryoconite (bleu) et d'un chlune solution pigmentaire standard (rouge) après excitation avec des lasers de 405 nm. Les spectres ont été enregistrés 1 an après la collecte d'échantillons. Les échantillons ont été conservés congelés et n'ont pas été exposés à la lumière avant la mesure. En réponse aux problèmes d'étalonnage de la longueur d'onde, le pic de fluorescence est situé à 700 nm-710 nm au lieu de 680 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Analyse automatisée du grain cryoconite
Dans un exemple d'analyse automatisée d'un trou de cryoconite (figure 10), les densités de surface pigmentaire les plus élevées ont été observées à la ligne de pixel 50. Le spectre de l'échantillon après l'excitation avec un laser de 532 nm a montré un pic avec une coupure à une valeur grise de 255 en réponse à la sursaturation du capteur. Ce pic provient du laser vert et non du signal fluorescent.

Figure 10
Figure 10 : Analyse automatisée des données d'un seul granule de cryoconite d'un diamètre de 1 mm. L'échantillon a été prélevé à Vestre Bràggerbreen (VBB) et mesuré dans un rayon de 4 h après avoir été prélevé dans une pièce de laboratoire sombre de l'installation de la station arctique (GB) à Ny-Leslesund. La colonne de gauche affiche les mesures B-PE et la colonne de droite représentechl une donnée. Les images brutes sont affichées sur le dessus. Les réponses de fluorescence induites par le laser sont affichées en gris. Les zones rouges indiquent la réponse des pigments standard. La section centrale illustre la distribution spatiale des pigments cibles. Les propriétés spectrales du signal de fluorescence sont affichées dans les images inférieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Impact de l'excitation laser sur la productivité des tapis bactériens
Ni la productivité primaire ni la productivité bactérienne n'ont été affectées lors de l'augmentation de la puissance du laser et/ou du temps d'exposition (figure 11). Aucune différence significative n'a été détectée dans le cadre de traitements au laser avec une puissance accrue.

Figure 11
Figure 11 : Mesures de la productivité des échantillons de Svalbard. Les tapis bactériens ont été exposés avec des lasers verts et bleus de différentes intensités laser et les temps d'exposition. Les données sont colorées selon la source de longueur d'onde laser (vert et bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Étalonnage
Il y avait une corrélation linéaire entre la concentration de pigments et l'intensité de fluorescence après la normalisation du nombre de photons à un temps d'exposition de 1 s. Des échantillons avec une faible hauteur de colonne et de faibles concentrations de pigments ont conduit à une surestimation des pigments cibles, par rapport aux hauteurs de colonne plus élevées avec la même concentration de pigment. De plus, les signaux de fluorescence faibles nécessitaient de longs temps d'exposition pour un nombre suffisant de photons sur le capteur. Cependant, de longs temps d'intégration ont également augmenté la quantité de lumière parasite sur le capteur, ce qui a entraîné une diminution du rapport signal-bruit. Dans sa version actuelle, le logiciel ne peut pas faire la distinction entre le bruit et le signal pendant le processus de réduction des données. Par conséquent, les mesures de faible intensité de fluorescence ont mené à une surestimation de pigment parce que le bruit a été compté comme signal qui a dérivé des pigments cibles. En outre, les intensités de fluorescence des solutions pigmentaires plus concentrées ont montré une plus grande variabilité que les solutions à faible concentration. Cet effet pourrait s'expliquer par des processus d'absorption dans les solutions pigmentaires qui ont été utilisées pour la courbe d'étalonnage.

Validation des données pour la chlorophylleune quantification
Après avoir filtré des échantillons de glace et de neige, les échantillons tridimensionnels sont presque apparus comme un spécimen bidimensionnel sur le filtre. Cela justifiait une comparaison directe entre les données L.I.F.E (densité de zone) et spectrophotométriques (mesure volumétrique).

L'ensemble de données (figure 8) indique qu'une forte concentration de pigments conduit à une sous-estimation, tandis qu'une faible concentration de pigments conduit à une surestimation de la valeur réelle. Cet effet peut s'expliquer par l'épaisseur du gâteau filtre et donc par le caractère volumétrique de l'échantillon. La profondeur de pénétration du laser dépendait de la densité optique et de l'épaisseur du spécimen. Une teneur élevée en pigments a été sous-estimée parce que le laser ne pouvait pas induire la fluorescence pigmentaire dans les couches plus profondes. Cependant, dans les gâteaux à filtre mince, les signaux de faible fluorescence ont été capturés en raison de faibles densités de surface de pigments. Apparemment, le filtre lui-même a montré des signaux induits par laser après avoir passé le filtre de 450 nm à longue passe (Figure 12). Ce signal a été compté à tort comme signal de fluorescence dérivé de chla. Ainsi, les gâteaux filtres minces et trop épais sont difficiles à mesurer avec l'instrument L.I.F.E.

Figure 12
Figure 12 : Signaux de fluorescence provenant de gâteaux filtres épais (A) et minces (B) sur un filtre GF/F. (A) L'auto-ombrage empêche la fluorescence induite par le laser à partir de couches plus profondes, ce qui se traduit par une sous-estimation de la concentration réelle de pigments. (B) Émission de fluorescence du gâteau filtre avec la pardessus par des réflexions de filtre. (C) Les données brutes montrent la réflexion du filtre (gris). La propriété spectrale d'un chl dérivé de laboratoireun modèle de fluorescence est illustrée en rouge. Barre d'échelle de 45 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Limitations du prototype L.I.F.E.
Pendant la réduction des données, le logiciel codé MATLAB a interprété les images brutes en résumant les lignes de pixels dans une plage de longueur d'onde donnée. La version actuelle du logiciel ne faisait pas de distinction entre les signaux dérivés organiques et inorganiques. La présence de signaux multiples peut conduire à une surestimation de la teneur réelle en pigments. Les longs temps d'exposition en raison de faibles intensités de fluorescence ont entraîné une diminution du rapport signal-bruit, favorisant l'effet tel que décrit ci-dessus (voir la figure 8 et la figure 12).

Une roche géodése montrée dans la figure 13 exhibait la lumière fluorescente rouge lorsqu'elle était exposée avec de la lumière verte et bleue. À l'heure actuelle, il n'est pas clair si la fluorescence résultait de minéraux ou de molécules à base de porphyrine. Par conséquent, une couverture de signaux biologiques et non biologiques peut limiter l'application de cette méthode et nécessiter l'établissement d'une base de données de fluorescence spécifiquement faite pour le prototype L.I.F.E.

Figure 13
Figure 13 : Fluorescence minérale d'une roche géodése, trouvée à Ny-Leslesund. La roche était excitée avec un laser de 532 nm 50 mW (A) et un laser de 405 nm 50 mW (B). Les deux images ont été capturées avec un filtre de polarisation attaché sur l'objectif, ce qui a conduit à une falsification des couleurs de fluorescence réelle. (C) Image couleur vraie sans l'utilisation d'un filtre de polarisation dans des conditions de lumière du jour. Barre d'échelle de 40 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Beutler et d'autres29 ont conclu que les spectres d'émission caractéristiques des cyanobactéries dans les écosystèmes marins dépendent des conditions environnementales. En outre, l'état métabolique a un impact sur les propriétés de fluorescence dans les organismes phototrophiques30. L'instrument L.I.F.E peut faire la distinction entre le modèle de fluorescence algale et cyanobactérienne en utilisant des bibliothèques de bio-empreintes digitales qui contiennent des informations spectrales du spécimen corrélées avec les conditions environnementales.

Dans les molécules de chla adaptées à l'obscurité, tous les centres de réaction sont entièrement oxydés et disponibles pour la photochimie et aucun rendement de fluorescence n'est éteint31. À l'aide de la procédure L.I.F.E., un spécimen est d'abord excité par un laser de 532 nm (vert) puis avec un laser de 405 nm (bleu). Au cours de la deuxième excitation par le laser bleu, chla pourrait montrer une diminution de la réponse à la fluorescence due à l'excitation antérieure par le laser vert. Chla absorbe l'énergie à 532 nm longueur d'onde, malgré sa distance de sa longueur d'onde maximale d'absorption32. Avant le chl réelune mesure à 405 nm, le laser vert peut causer des réactions photochimiques, activant des mécanismes d'étanchéité dans les pigments cibles. De plus, le pré-illumination des organismes phototrophiques marins n'a pas entraîné de changement des courbes de la norme spectrale entre 450 nm et 600 nm, tandis que l'écart type dans les intensités de fluorescence a augmenté de 25 %29. Selon l'espèce, les intensités de fluorescence ont même augmenté en réponse à l'excitation antérieure. Ce sujet nécessite une enquête plus approfondie.

applicabilité
Nous avons testé l'instrument L.I.F.E. dans divers habitats en mettant l'accent sur les trous de cryoconite. Le laser a été appliqué avec succès dans le sol et les habitats de biofilm en raison de l'absence de lumière ambiante pendant la mesure. Les granules de cryoconite pourraient être mesurés lorsque les couches de sédiments bloquaient la lumière sous le trou (Figure 14A,C). Les trous de cryoconite de sédiments minces étaient perméables pour la lumière parasite du dessous (figure 14B). La lumière errante interfère avec la mesure. Ainsi, la concentration de pigments dans les surfaces de glace nue n'est pas encore mesurable dans les conditions de lumière du jour. Des efforts de traitement des signaux sont actuellement en cours pour permettre l'exploitation du système dans des conditions de lumière ambiante élevée.

Figure 14
Figure 14 : Trou de cryoconite avec de l'eau liquide sur le dessus. (A) Cryoconite sur glacier avec tube de lentille L.I.F.E. Barre d'échelle de 70 mm (B) La couche de sédiments (rouge) est très mince. La lumière sifvaàe à travers la couche de cryoconite. (C) La couche de sédiments est assez épaisse pour bloquer la lumière parasite par le dessous. Ce type de trou cryoconite est mesurable avec l'instrument L.I.F.E. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

En conclusion, notre instrument L.I.F.E. a détecté des organismes photoautotrophiques dans des habitats terrestres tels que les sols, les tapis bactériens, les biofilms et les trous de cryoconite sur les surfaces glaciaires. Les molécules cibles étaient chla et B-PE. La résolution spatiale était de 30 m/px. La limite de détection pour le chla était de 250 pg/mL et de 2 ng/mL pour B-PE. Après un étalonnage en laboratoire, nous avons pu quantifier la teneur en pigments dans des échantillons qui ont été recueillis à notre site d'étude dans l'Arctique. Nous avons appliqué un logiciel autoprogrammé pour un processus automatisé de réduction des données. Les effets de la présence de minéraux et de l'évolution des conditions de lumière pendant les mesures nécessitent une étude plus approfondie.

Avec le réchauffement climatique, l'augmentation des températures conduit à une disponibilité accrue de l'eau liquide, ce qui entraîne une activité biologique plus élevée sur les surfaces glacées de nature autotrophe et hétérotrophe. Des efforts vigoureux devraient être faits pour détecter les organismes hétérotrophes in situ afin de donner une image complète de la vie active dans la cryosphère. Cela pourrait être testé avec d'autres pigments cibles et des longueurs d'onde d'excitation laser appropriées. Par conséquent, L.I.F.E. fournit un système de surveillance approprié fournissant une résolution temporelle et spatiale élevée pour les conditions supraglaciaires dans le contexte du changement global ainsi que des applications astrobiologiques possibles.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le colonel (IL) J.N. Pritzker, la Fondation Tawani, États-Unis, le Ministère fédéral autrichien de la science, de la recherche et de l'économie (Sparkling Science SPA04-149 et SPA05-201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Austrian Space Forum ( Roman Erler du Hintertuxer Natur Eis Palast, le directeur fédéral autrichien des forêts et de la base Nick Cox de la station arctique de Ny Alesund (Svalbard). Nous sommes également redevables à Sabrina Obwegeser, Carina Rofner et Fabian Drewes pour leur aide pendant le tournage. Enfin, nous tenons à remercier James Bradley d'avoir donné la voix pour la vidéo concomitante.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aceton Merck 67-64-1
B-Phycoerythrin Invirtrogen P6305
Chlorophyll a standard Sigma-Aldrich C6144-1MG
formaline Merck HT501128 36%
GF/C filters Whatman WHA1822025 25mm diameter
HCl Merck H1758 36,5-38%
L.I.F.E. Prototype University of Innsbruck built on demand
LabView National Instruments Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench
Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi Perkin Elmer NET1166001MC radioactive
Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use Beckman not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard
liquid scintillation counter Beckman out of stock LSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 µCi/ml) DHI Denmark 4 μCi/ml, 1 ml radioactive
Osmonics polycarbonate filters DHI Denmark PCTE 25mm diameter, 0,2µm pore size
Polyscintillation vials Perkin Elmer WHA1825047 20ml
sample tubes Sigma Aldrich T2318-500EA Greiner centrifuge tubes, 50ml
Spectrophotometer Hitachi NA Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate
trichloric acetic acid (TCA) Merck T6399 100%
ultrasonic probe nano lab QS1T-2

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Émission de fluorescence induite par le laser (L.I.F.E.) comme nouvel outil non invasif pour la mesure in situ des biomarqueurs dans les habitats cryosphériques
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