Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Laser-indusert fluorescens utslipp (L.I.F.E.) som Novel ikke-invasiv verktøy for in-situ målinger av biomarkører i Cryospheric habitater

Published: October 26, 2019 doi: 10.3791/60447
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 1,2
1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

Summary

Carbon flukser i kryosfæren er neppe vurdert ennå, men er avgjørende om klimaendringer. Her viser vi en ny prototype enhet som fanger phototrophic potensialet i supraglacial miljøer basert på laser-indusert fluorescens utslipp (L.I.F.E.) teknologi som tilbyr høy Spectral og romlig oppløsning data under in situ forhold.

Abstract

Global oppvarming påvirker mikrobielle samfunn i en rekke økosystemer, spesielt cryospheric habitater. Men lite er kjent om mikrobiell-mediert karbon flukser i ekstreme miljøer. Derfor er metodikken av prøven oppkjøpet beskrevet i svært få studier tilgjengelig innebærer to store problemer: A) høyoppløselige data krever et stort antall prøver, som er vanskelig å få tak i fjerntliggende områder; B) uunngåelig prøve manipulasjon som skjæring, saging, og smelting av is kjerner som fører til en misforståelse av in situ forhold. I denne studien, en prototype enhet som krever verken prøveforberedelse eller prøve ødeleggelse er presentert. Enheten kan brukes til in situ målinger med en høy Spectral og romlig oppløsning i bakke-og is økosystemer og er basert på teknikken Laser-induced Fluorescence EMission (L.I.F.E.). Photoautotrophic supraglacial lokalsamfunn kan identifiseres ved påvisning av L.I.F.E. signaturer i photopigments. Den L.I.F.E. instrumentet kalibrering for porfyrin derivater klorofylla (CHLa) (405 NM laser eksitasjon) og B-FYKOERYTRIN (b-PE) (532 nm laser eksitasjon) er demonstrert. For validering av denne metodikken ble L.I.F.E.-data ratifisert av en konvensjonell metode for CHL aven kvantifisering som involverte pigment ekstraksjon og påfølgende absorpsjons spektroskopi. Prototypen anvendelse i feltet ble påvist i ekstreme polare miljøer. Ytterligere testing på terrestriske habitater fant sted i løpet av mars analoge simuleringer i marokkansk dessert og på en østerriksk isbre. L.I.F.E.-instrumentet muliggjør høyoppløsnings skanninger av store områder med akseptabel drifts logistikk og bidrar til en bedre forståelse av det økologiske potensialet i supraglacial samfunn i sammenheng med global endring.

Introduction

Den kryosfæren havner sjø isen, isbreer, høye fjellvann, snø områder, innsjø isen, smeltevann bekker, og permafrost. Disse områdene dekker ca 11% av jordens land Masses1,2 og er overarched av atmosfæren som et anerkjent cryospheric miljø. Nyere studier viser at massive områder av kryosfæren raskt trekker tilbake3,4. The Antarctic5,6, Alpene7, Arktis8, og andre regioner viser negative isen masse balanserer. Retrett av isen caps og isbreer fører til tømming av vår største ferskvann reservoaret på jorden. I noen områder er isbre retrett ustoppelig5.

I lang tid ble is økosystemer betraktet som sterile miljøer. Men til tross for tøffe forhold, tilstedeværelsen av aktivt liv i jordens kryosfæren er tydelig9,10,11,12,13,14,15 . På grunn av trenden mot massive tap av is ved smelting, er kryosfæren går gjennom et skifte i biologisk aktivitet, påvirker tilstøtende habitater. For å forstå de delvis irreversible endringene vi krever metoder for å undersøke biologisk aktivitet i isen under in situ forhold med høy romlig og Temporal oppløsning.

I supraglacial miljøer, kan livet bli funnet i cryoconite hull, snø dekker, smeltet vann, bekker, og på bare isen overflater. Men de mest åpenbare supraglacial habitater er cryoconite hull. De opptrer globalt i breer miljøer og ble først beskrevet av den svenske oppdagelsesreisende Adolf Erik Nordenskjold under en ekspedisjon til Grønland i 1870-tallet16,17. Navnet stammer fra det greske ordet "kryos" (kald) og "Konia" (støv). Eoliske-avledet mørk organisk og uorganisk rusk feste på isen overflaten og redusere albedo lokalt. Solstråling fremmer smelting av rusk i dypere islag, forming sylindriske bassenger med sediment (cryoconite) i bunnen9. Cryoconite hull deksel 0.1 – 10% av bre ablasjon sonene11.

Cryoconite lokalsamfunn består av virus, sopp, bakterier, cyanobakterier, mikroalger og protozoer. Avhengig av regionen, kan metazoan organismer som rotatorier, nematoder, Raudåta, tardigrades, og insekt larver også bli funnet. Edwards og andre18 beskriver cryoconite hull som "iskald hotspots". De har også spores funksjonelle gener i cryoconite hull som er ansvarlig for N, Fe, S, og P sykling. Den mini innsjøen økosystemer annet og fotosyntesere på priser som finnes i mye varmere og mer næringsrike habitater11. Disse funnene understreker den viktige rollen til mikrobiell opptak i supraglacial miljøer. Foruten levende samfunn i cryoconite hull, bare isen overflater er bebodd av is alger. Deres fysiologi er godt studert19 , men deres romlige fordelingen har ikke blitt vurdert20. Deres tilstedeværelse i supraglacial miljøer minsker albedo og dermed fremmer smelting som fører til en nærings outwash og næringsstoffer innspill til nedstrøms habitater9. Økende temperaturer og dermed, en høyere tilgjengelighet av flytende vann, påvirker netto økosystem produktiviteten i disse iskalde økosystemer.

I supraglacial miljøer, Fotosyntetisk aktive organismer transformere uorganisk karbon og nitrogen til organiske, tilgjengelige kilder for mikrobiell Food Web21,22. Inntil nå er det få studier som anslår supraglacial Carbon flukser11,20,23. Avviket i foreslåtte utbredelsen av karbon Flux resultater fra en lav romlige og timelige data oppløsning. Videre er den romlige fordelingen av supraglacial samfunn utenfor cryoconite hullene knapt vurdert. Cook og andre20 spådd i sine modeller som supraglacial alger samfunn fikse opp til 11x mer karbon enn moderne cryoconite hull på grunn av deres store overflate dekning. Påvisning av supraglacial alger samfunn sikre prøve integritet er fortsatt hindret på grunn av manglende verktøy for in situ deteksjon og kvantifisering.

Som svar på vanskeligheter i logistikk, er is økosystemer sjeldnere studert enn habitater i tempererte områder. Data oppløsningen avhenger av antallet prøver som er vurdert, og avhenger av tilgjengeligheten til studiestedene. Standard Prøvetaking metoder som saging, Coring, og påfølgende smelting innebære manipulering av mikrobiell samfunnet. For eksempel, klorofylla (CHLa) vurdering i solide is prøver er umulig med standard metoder uten betydelig interferens. Derfor, smelting-indusert temperaturendringer innenfor de undersøkte mikrobielle samfunn er uunngåelig. Som svar på thermolability av photosystem II og andre cellulære strukturer i psychrophiles22, vil laboratorieanalyser av smeltet isen prøver alltid føre til en forfalskning av in situ forhold.

Ikke-destruktive in situ-målinger er den eneste fornuftige måten å oppnå pålitelige data på. Dette målet kan oppnås ved hjelp av fluorescens-baserte metoder. På grunn av deres lys høsting funksjon, CHLa og b-Fykoerytrin (b-PE) er til stede i organismer som bidrar til karbon syklus i supraglacial miljøer, som har blitt bevist av Anesio og andre11. Derfor er disse fluorescerende molekyler egnet biomarkører for kvantifisering av mikrobielle mediert karbon flukser i isen økosystemer.

I denne studien presenterer vi utvikling, kalibrering og anvendelse av et nytt, ikke-invasiv verktøy for in situ kvantifisering av CHLa -og B-PE-molekyler innen bakke-og is økosystemer. Prototypen enheten er basert på laser-indusert fluorescerende utslipp, også kjent som L.I.F.E. Den optiske instrumentet (figur 1) fanger fluorescerende biomarkør signaturer etter laser-indusert fluorescens eksitasjon. Prosedyren er ikke-destruktiv og kan utføres på studiestedet eller i et laboratorium.

Figure 1
Figur 1: L.I.F.E. prototype. Venstre: Foto av instrumentet uten et beskyttende lokk. Høyre: Skjematisk illustrasjon av instrumentet. Total masse = 5,4 kg (laser og optikk = 4,025 kg, bærbar PC = 1,37 kg). Aluminiumsramme = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. optisk rør: 18,4 cm x 4 cm (diameter). CCD: bluefox mv220g sensor; F: servo styrte lang pass filtre (450 nm og 550 NM); L: optiske linser; M1: speil; M2: dichroic speil; MC: microcontroller; P: prisme; PBS: polarisert stråle splitter; S: slit blenderåpning laget av justerbare barberblader. Scale bar = 70 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den bærbare dual-bølgelengde Kit veier 4,5 kg og brukes på et stativ i kombinasjon med en ekstern datamaskin. Feltoppsettet er raskt og enkelt. Instrumentet er festet til stativet, og linse røret er festet til enheten sammen med en USB-kabel og kamerakabelen. Den eksterne datamaskinen er koblet til instrumentet med en USB-kabel. Stativ bena justeres på en slik måte at linse røret rettes mot og dekker prøven. Deretter, en 5 mW grønn laser treff prøven etter å ha passert en polarisert stråle splitter som viderekobler polarisert lys mot den optiske aksen av spektrometer. Prøven viser et fluorescerende lys som er illustrert i rødt i figur 1. Halvparten av det collimated lyset passerer polarisert stråle splitter og er fokusert gjennom en servo-styrt Long-pass filter som fjerner laser signaler. Deretter treffer signalet en blender splitt som består av to justerbare barberblad. Et prisme Spectrally skiller den fine linjen av lys ortogonale til slit blenderåpning før signalet er fanget av sensoren. Prosedyren gjentas med en blå laser. Rådata overføres automatisk til en bærbar datamaskin som også brukes til programvare operasjonen.

Instrumentet styres av en ekstern datamaskin ved hjelp av et LabVIEW-miljø som synkroniserer bildet som tar med CCD-kameraet, slår på/av lasere og roterer det lange pass filter hjulet. Det grafiske brukergrensesnittet (GUI) er delt inn i tre hoveddeler. Eksponerings justeringen utføres manuelt. Selv om korreksjonen mellom eksponeringstid og signal intensitet er lineær (figur 2b), er maksimal eksponeringstid begrenset til 10 s fordi lengre integrasjons tider fører til en betydelig reduksjon i signal-til-støy-forhold. Merknadsfeltet brukes for beskrivelsen av prøven (figur 2a). I den høyre delen vises RAW-bilder så snart målingene er fullført. Denne funksjonen er avgjørende for umiddelbar data evaluering i feltet (figur 2C – E). Røde områder indikerer overeksponert piksler, som kan unngås ved å redusere eksponeringstiden.

Den påfølgende rådata reduksjon prosessen er koblet fra bildet oppkjøpet prosedyre og kan gjøres når som helst etter bilde oppkjøpet.

Figure 2
Figur 2: L.I.F.E. grafisk brukergrensesnitt for datainnsamling og rådata evaluering. (A) programvaren muliggjør manuell skriving for eksempel beskrivelser. (B) eksponeringstiden kan justeres før målingen. (C − E) De rå bildene vises på høyre side av grensesnittet. (E) røde farger indikerer en metning av sensoren. (F) aktiveringen av knappen Kjør måling utløser datainnsamlingsprosessen. I matrisen (G) blir alle kommandoer som kjøres automatisk under datainnhenting, vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempel på et RAW-bilde. Venstre: Rådata til CHLen standard i aceton løsning, innspilt med i.e. E instrumentet. På grunn av enhetens optiske egenskaper vises signalet som en skjev linje. Høyre: Tolkning av rå bildet per piksel (px). Spectral aksen (5 NM/px oppløsning) er plottet mot romlig akse (30 μm/px oppløsning). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De 12-bits grå-skala rå bilder viser en romlig komponent på grunn av den todimensjonale blenderåpning slit og en Spectral komponent på grunn av prisme foran CCD (Figur 3). Som svar på optiske begrensninger de rå bildene er forvrengt. Derfor må de beskjæres og dewarped ved å bruke en kode som gjenkjenner graden av forvrengning. Dette gjøres med en programvare veiviser (Figur 4). Deretter blir bølgelengden kalibrering gjort med 532 nm laser. Det grønne lyset er produsert ved frekvens dobling av en 1 064 NM infrarød laser. Begge bølgelengder kan oppdages av CCD og derfor kan Spectral posisjon hver piksel beregnes i dewarped bilder automatisk (Figur 4).

Bildet beskjæres deretter ned til et gitt bølgelengdeområde (550 – 1000 NM for grønne laser målinger og 400 – 1000 for blå laser målinger). Grå verdier fra hvert bildepunkt i en valgt piksel linje telles og summeres opp. En grå verdi kan variere fra 0 – 255. Etter det, hver piksel linje står for ett nummer. Videre programvareinstruksjoner på skjermen føre til generering av et plott som viser den grå verdien teller fra hver piksel linje plottet mot romlige koordinater. Dette gjør det mulig for en kvantitativ romlig diskriminering av CHLa og B-PE samtidig i utvalget. I tillegg kan Spectral egenskapene til en prøve tegnes inn fra valgte piksel linjer automatisk.

Figure 4
Figur 4: Dewarping RAW-bilder. Venstre: RAW-bilde tatt med en grønn laser. Ingen filtre ble brukt. Signalene vises ved 532 nm og 1 064 NM. Eksponeringstid = 0,015 s. Center: det beskjæres 532 nm-signalet brukes som referanselinje for å dewarp et sett med bilder. Høyre: Det dewarped bildet fra den rå bildekilden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. kalibrering og validering

Merk: for pigment kalibreringen, klargjør du fortynnings rader fra lager løsninger av CHLa og B-PE. CHLen lagerløsning er fortynnet med aceton og B-PE fortynnes med destillert sterilt vann. Senere vil 15 mL av hvert fortynnings trinn være nødvendig. Beskytt pigmenter fra lys ved å pakke dem med aluminiumsfolie. Oppbevar CHLa i en fryser og B-PE i et kjøleskap til videre bruk. En detaljert protokoll for fortynning rad følger i seksjoner 1,1 for CHLa og 1,2 for B-PE. Både CHLa og B-PE laboratorie kalibrering for pigment deteksjon og kvantifisering med L.I.F.E.-instrumentet er beskrevet nedenfor. En tidligere kalibrering24 ble gjort med de samme pigmenter som i denne studien.

  1. Klorofyllen fortynning rad
    1. Løs opp 1 mg CHLa (renset fra a. nidulans alger) med aceton i et 50 ml prøverør og fortynne dette CHLen lagerløsning med aceton til følgende endelige konsentrasjoner: 1 000; for 800; for 640; for 320; for 160; for 80; for 40; 20 10 5 1 og 0,5 ng/mL.
    2. Overfør 15 mL av hver fortynning til 50 mL prøverør og dekk dem i aluminiumsfolie på grunn av lysfølsomhet. Oppbevar rørene i en-20 ° c fryseboks til kalibrerings målingene er tatt.
      Merk: protokollen kan avbrytes her.
    3. Mål CHLen absorpsjon funksjoner fra hver fortynning i en dobbel-bjelke spektrofotometer som triplicates og beregne CHLet innhold som beskrevet av Lorenzen25, som vil bli beskrevet i detalj i avsnitt 2.2.2.
  2. PE fortynning rad
    1. Fortynne en 4 mg/mL B-PE lagerløsning med sterilt filtrert vann (pH = 7) til følgende endelige konsentrasjoner: 1 000; for 800; for 640; for 320; for 160; for 80; for 40; 20 10 og 5 ng/mL B-PE. Overfør 15 mL av hver fortynning i et 50 mL prøverør og dekk den med aluminiumsfolie. Oppbevares ved 4 ° c inntil videre bruk.
      Merk: protokollen kan avbrytes her.
  3. Oppsett for kalibrering
    1. Bygg et rack som vist i figur 5 for å etablere tre måle plattformer, hver 1,5 cm høyere enn den neste.
      Merk: stativet og Kol onne høyden spiller en viktig rolle for målingene fordi væskeoverflaten skal forbli i fokuspunktet til L.I.F.E.-instrumentet som angitt i figur 5.
    2. Tilsett 5 mL av den høyeste konsentrerte fortynning i et polyscintillation plast hetteglass og legg det på det høyeste punktet på stativet. Mål fluorescens intensitet.
    3. Plasser hetteglasset midt i stativet og tilsett ytterligere 5 mL (10 mL totalt volum). Mål fluorescens intensitet. Gjenta prosedyren på den laveste posisjonen på stativet med ytterligere 5 mL (15 mL totalt volum; totalt 45 mm i kolonnehøyde).
      Merk: Tilpass eksponeringstiden for hvert fortynnings trinn for å forhindre detektor metning (grå verdier over 255 i 12-biters bilder) og for et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for de svake fluorescens signalene.
    4. Gjenta trinn 1.3.2 og 1.3.3 med alle fortynninger (trinn 1.1.1 og 1.2.1) av CHLa og B-PE.
    5. Last de genererte datafilene inn i veiviseren for data reduksjon for å telle automatisk og summere de grå verdiene fra hver piksel linje langs Y-aksen (romlig fordeling).
      Merk: varierende eksponeringstider kompenseres automatisk ved å normalisere den fluorescens intensiteten til en integrasjons tid på 1 s.
    6. Beregn pigment område tettheten med en Poisson-regresjonsanalyse ved hjelp av kjente konsentrasjoner fra fortynning-serien og normalisert fluorescens intensitet som ble beregnet. Deretter normaliserer fluorescens teller fra de tre forskjellige Kol onne høyder til 1,5 cm (5 mL) ved å multiplisere teller fra hver kolonnehøyde med en faktor (faktorer 1, 0,5 og 0,33, for henholdsvis 5 mL, 10 mL og 15 mL konsentrasjons løsninger).

Figure 5
Figur 5: oppsett for L.I.F.E.-kalibrering med CHLa og B-PE under laboratorieforhold.
(A) linse rør av instrumentet. (B) grønn laser for B-PE-eksitasjon. (C) blå laserfor CHL av eksitasjon. (D) Scintillation hetteglass. (E) midtpunktet på det L.I.F.E. instrumentet. (F) B-PE/vann eller CHLen/acetone-løsning med 5 ml, 10 ml og 15 ml. (G) avstandsstykker som holder overflaten på hver løsning på fokalplanet for tre forskjellige volumer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. prøvetaking og prøve behandling

  1. Innsamling av snø og is
    1. Samle snø og supraglacial isen fra en isbre i sterile polyetylen poser og oppbevar dem frosset inntil videre behandling.
      Merk: for denne studien ble prøvene samlet på midtre Lovenbreen (MLB), en polythermal bre i nærheten av forsknings landsbyen ny-Ålesund i den høye arktiske øygruppen Svalbard (78 ° 53 ' N, 12 ° 03 ' E).
    2. Prøve bakterielle matter fra breen forefield i sterile polyetylen poser og transportere alle prøvene til et laboratorium for videre behandling.
    3. Smelt frosset materiale langsomt i mørket ved 4 ° c. Filtrer væskeprøver på GF/F-filtre (47 mm diameter) og Legg merke til det filtrerte volumet. Hold filtrene frosset inntil videre behandling.
  2. Klorofylla målinger
    1. Bruk L.I.F.E.-instrumentet til å måle filteret i fire tilfeldige områder, hver i triplicates ved hjelp av den grønne og blå laseren. Beregn den generelle pigment konsentrasjonen ved å multiplisere område tettheten med det filtrerte området og det filtrerte volumet. Normalisere pigment konsentrasjonen (μg/L) til et volum på 1 L.
    2. Vurder CHLet innhold av GF/F-filtrene med en laboratorie standard i henhold til protokollen fra Lorenzen25. For å gjøre dette, Legg hvert av filtrene i et hetteglass med 13 mL aceton og oppbevar dem i mørket ved 4 ° c over natten. Deretter ta et hetteglass og legg den på isen før sonikering i 2 min ved 50% strøm i kontinuerlig modus. Klem sammen og Fjern filteret fra hetteglasset.
    3. Fest tygon slangen til en sprøyte og fjern CHLen ekstraksjon-aceton blanding fra hetteglasset. Skift ut tygon slangen med en GF-5 filter holder. Overfør løsningen til en kvarts Cuvette.
    4. Etter kalibrering av absorbansen spektrometer for aceton, plasser prøven i Cuvette i spektrometer og mål absorbansen funksjonene mellom 400 – 750 NM. Deretter fjerner du Cuvette fra spektrometer og legger til 200 μL av 2 M HCl i prøven. Deretter gjentar du absorbansen mål for å måle det phaeophytin innholdet i prøven.
  3. Måling av mikrobiell aktivitet via radiomerket markører og virkningen av laser intensitet og eksponeringstid på produktivitets rater
    FORSIKTIG: Pass på markør radioaktiviteten (β-stråling). Bruk en Laboratoriefrakk, hansker og vernebriller, og arbeid under en avtrekksvifte i en lisensiert isotop Lab.
    1. For bakteriell produksjon overføring fem alikvoter av bakterielle matter i sterile polyetylen poser. Deaktiver kontrollene med formaldehyd til en 4% sluttkonsentrasjon.
      Merk: tre alikvoter brukes for 3H-merket leucine opptak, og to alikvoter brukes som kontroller.
    2. Utsett matter med en blå laser (405 NM, 5 mW) og med en grønn laser (532 nm, 5 mW) for 10 s og 30 s hver. Gjenta prosedyren med 50 mW lasere. Deretter deaktivere prøvene som ikke ble behandlet med formaldehyd.
      Merk: én matte brukes til bare én laser eksponering. Bruk ikke-eksponerte mikrobielle matter som kontroller.
    3. Etter laser behandling, anslå bakteriell og primærproduksjon ved å innlemme 3H-leucine og NaH14co3, henholdsvis. For bakterielle produksjons målinger, bruk fem alikvoter per prøve (20 mL) og tilsett formaline (4% endelig konsentrasjon) til to av paralleller, som fungerer som kontroller for abiotiske inkorporering av markøren. Tilsett 3h-leucine (40 nM) til alle prøver av de ulike behandlingene og ruge dem for 4 timer under in situ-forhold (0,1 ° c). Avslutte reaksjonen ved å legge formaline til de resterende Live prøvene.
    4. For bakteriell produksjon av bakterielle matter, overføre merket prøver i cryovials. Trekk ut celler med 5% Trekloredikksyre syre og sentrifuge ved 10 000 x g i 5 min i henhold til protokollene ved Kirchman26 og Bell27. Tilsett scintillation væske og Legg cryovial i et polyscintillation hetteglass. Analyser prøvene med en flytende scintillation teller og Beregn opptakshastigheten.
      Merk: tre alikvoter brukes for 3H-merket leucine opptak, to alikvoter brukes som kontroller.
    5. For primærproduksjon, Forbered fem replikerer av ulike behandlinger (100 mL), Pakk to av dem i aluminiumsfolie for å etterligne de mørke prøvene, og Legg til NaH14co3 (1 μCi) til alle. Ruge for 4 timer i omgivelseslyset og in situ temperatur (0,1 ° c). Avslutte reaksjonen ved å mørkere de resterende tre replikerer og filtrere prøven på GF/F-filtre (25 mm diameter).
    6. Tilsett 100 μL av 2 N HCl til filtrene for å fjerne all overflødig karbon og la det luft ut under avtrekks panseret. Tørk prøvene på en varmeplate ved 80 ° c og plasser prøver i polyscintillation hetteglass.
    7. For å måle radioaktivt disintegrations per minutt (DPM) av alle behandlinger av primær-og bakteriell produksjon, plasserer cryovials i polyscintillation hetteglass og tilsett 5 mL scintillation cocktail. Mål DPM med en flytende scintillation teller og Beregn opptaket priser.

Representative Results

Laboratorie kalibrering for B-PE
Svar signalene fra fortynnings raden B-PE ble målt med L.I.F.E.-instrumentet i et mørkt rom ved 20 ° c (figur 6). Telle raten var avhengig av både konsentrasjonen og Kol onne høyden på den målte prøven. Lav konsentrasjon og lav kolonnehøyde B-PE prøve fluoresced sterkere sammenlignet med prøver av samme konsentrasjon og høyere kolonnehøyde.

Figure 6
Figur 6: B-PE laboratorie kalibrering. Kalibrering av B-PE-innhold og Kol onne tetthet vises. Normalisert Count priser ble beregnet for en kolonnehøyde på 1,5 cm. opptrykk med tillatelse28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det ble brukt en Poisson-regresjon for at den endelige kalibreringslinjen skal passe. Det var en lineær korrelasjon mellom området tetthet og piksel grå verdi teller. Funksjonen til kurven var y = 81.04 x (figur 7), noe som betyr at en grå verdi telle rate på 8 104 i en 1 s eksponert prøve likeverdig et områdetetthet på 100 ng/cm2 B-PE. CHLen kalibrering er satt opp på en analog måte. Funksjonen var y = 8.94 x.

Figure 7
Figur 7: endelig kalibrerings kurve for B-PE. Den grå verdien teller ble normalisert til en eksponeringstid på 1 s og plottet mot området tetthet. Skriv ut med tillatelse28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Søknad om cryoconite prøver fra Svalbard og laboratorie validering av data
Gjennomsnittet verdier av L.I.F.E. målinger og enkelt målinger av de samme prøvene avledet fra konvensjonell ekstraksjon ved hjelp av aceton og påfølgende analyse med en spektrofotometer er illustrert i Figur 8.

Figure 8
Figur 8: data validering med naturlige prøver. Prøvene (MLB) er rangert av CHLet innhold, basert på resultatene av et laboratorium spektrofotometer (enkeltverdier) og sammenlignet med CHLen fluorescens data målt på fire tilfeldige områder per filter. Feilfeltene representerer standardavviket for L.I.F.E.-målingene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

CHLet innhold som spenner fra 48 μg/l – 67 μg/L ble undervurdert, og lavere CHLet innhold som spenner fra 0,7 μg/l – 7 μg/l ble overvurdert av L.I.F.E.-prototypen. Standardavvik fra L.I.F.E. målingene var lave.

Sammenligning av Spectral data fra in situ målinger med laboratorie standarder
CHLa Spectra var sammenlignbare mellom cryoconite prøver og de fra renset fra a. nidulans alger. Fluorescens topper i alle prøvene ble plassert på 700 NM – 710 NM. Men Spectra avledet fra cryoconite prøver viste høyere støy signaler mellom 400 nm – 650 NM og fra 800 NM – 1000 NM sammenlignet med Spectra av CHLen pigment standard (figur 9).

Figure 9
Figur 9: Spectral data tolkning. Målinger av fire cryoconite granulat (blå) og en CHLen standard pigment løsning (rød) etter eksitasjon med 405 NM lasere. The Spectra ble spilt inn 1 år etter sample samling. Prøvene ble holdt frosset og ble ikke utsatt for lys før målingen. Som svar på bølgelengde kalibrering problemer, den fluorescens peak ligger på 700 NM-710 NM i stedet for 680 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Automatisert cryoconite korn analyse
I et eksempel på en automatisert analyse av et cryoconite hull (Figur 10) ble tettheten av det høyeste pigment området observert på piksel linje 50. Prøve spekteret etter eksitasjon med en 532 nm laser viste en topp med en avskåret på en grå verdi på 255 som svar på oversaturation av sensoren. Denne toppen avledet fra den grønne laseren og ikke fra fluorescerende signal.

Figure 10
Figur 10: automatisert dataanalyse av en enkelt cryoconite granule med en diameter på 1 mm. Prøven ble samlet på vestre Brøggerbreen (VBB) og målt innen 4 timer etter prøvetaking i et mørkt laboratorie rom ved Arctic Station (GB)-anlegget i ny-Ålesund. Den venstre kolonnen viser B-PE-målinger, og den høyre kolonnen representerer CHL aven data. Det ømt punkt profilen er vist på topp. Laser-indusert fluorescens svar vises i grått. Røde områder indikerer responsen fra standard pigmenter. Den midterste delen illustrerer den romlige fordelingen av mål pigmenter. Spectral egenskapene til det fluorescens signalet vises i de nedre bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Effekt av laser eksitasjon på produktiviteten i bakterielle matter
Verken primær eller bakteriell produktivitet ble påvirket når du øker kraften i laseren og/eller eksponeringstiden (Figur 11). Det ble ikke oppdaget signifikante forskjeller under laser behandling med økt effekt.

Figure 11
Figur 11: produktivitets målinger av prøver fra Svalbard. Bakterielle matter ble eksponert med grønne og blå lasere av varierende laser intensitet og eksponeringstider. Dataene er farget i henhold til laser bølgelengde kilde (grønn og blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kalibrering
Det var en lineær sammenheng mellom pigment konsentrasjon og fluorescens intensitet etter normalisering Foton teller til en eksponeringstid på 1 s. prøver med lav kolonnehøyde og lave pigment konsentrasjoner førte til en overvurdering av mål pigmenter, sammenlignet med høyere Kol onne høyder med samme pigment konsentrasjon. Videre krever svake fluorescens signaler lang eksponeringstid for tilstrekkelig Foton-tellinger på sensoren. Lang integrasjons tid økte imidlertid også mengden av spredt lys på sensoren, noe som resulterte i en reduksjon av signal-til-støy-forholdet. I sin nåværende versjon kan ikke programvaren skille mellom støy og signal under data reduksjonsprosessen. Derfor, lav fluorescens intensitet målinger førte til en pigment overvurdering fordi støy ble regnet som et signal som stammer fra målet pigmenter. Videre viste fluorescens intensitet fra mer konsentrerte pigment løsninger en større variasjon enn lave konsentrasjons løsninger. Denne effekten kan forklares ved absorpsjon prosesser innenfor pigment løsninger som ble brukt for kalibrering kurve.

Data validering for klorofylla kvantifisering
Etter filtrering av is og snø prøver, de tre-dimensjonale prøvene nesten dukket opp som en todimensjonal prøve på filteret. Dette begrunnet en direkte sammenligning mellom Spektrofotometriske E (areal tetthet) og data (volumet måling).

Datasettet (Figur 8) indikerte at høy pigment konsentrasjon fører til en undervurdering, mens lav pigment konsentrasjon fører til en overvurdering av den faktiske verdien. Denne effekten kan forklares med tykkelsen på filteret kaken og dermed den volum karakter av prøven. Lasers Tramp dybden var avhengig av den optiske tettheten og tykkelsen på prøven. Høyt pigment innhold ble undervurdert fordi laseren ikke kunne indusere pigment fluorescens i dypere lag. I tynne filter kaker ble imidlertid lav fluorescens signaler fanget på grunn av lav områdetetthet av pigmenter. Angivelig, filteret selv viste laser-indusert signaler etter bestått 450 nm Long-pass filter (Figur 12). Dette signalet ble villedende regnet som fluorescens signal avledet fra CHLa. Derfor er tynne og for tykke filter kaker vanskelige å måle med L.I.F.E.-instrumentet.

Figure 12
Figur 12: fluorescens signaler fra tykt (A) og tynne (B) filter kaker på et GF/F-filter. (A) selv skyggelegging hindrer laser-indusert fluorescens fra dypere lag, noe som resulterer i en undervurderer av den faktiske pigment konsentrasjonen. (B) fluorescens utslipp fra filter kake med overlegg av filter refleksjoner. (C) rå data Vis filter refleksjon (grå). Den Spectral eiendommen til et laboratorium avledet CHLet fluorescens mønster er illustrert i rødt. Scale bar = 45 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Begrensninger av L.I.F.E. prototype
Under data reduksjonen tolket den MATLAB-kodede programvaren RAW-bildene ved å summere opp piksel linjer innenfor et gitt bølgelengdeområde. Den nåværende versjonen av programvaren ikke skille mellom organiske og uorganiske avledet signaler. Tilstedeværelsen av flere signaler kan føre til en overvurdering av det faktiske pigment innholdet. Lange eksponeringstider på grunn av lav fluorescens intensitet førte til en reduksjon av signal-til-støy-forholdet, og fremmet effekten som beskrevet ovenfor (se Figur 8 og Figur 12).

En Geode rock vist i figur 13 utstilt rødt fluorescerende lys når de utsettes med grønt og blått lys. Foreløpig er det ikke klart om fluorescens skyldes mineraler eller fra porfyrin-baserte molekyler. Derfor kan en overlapping av biologiske og nonbiological signaler begrense anvendelsen av denne metoden og krever etablering av en fluorescens database spesielt laget for L.I.F.E. prototype.

Figure 13
Figur 13: mineral fluorescens fra en Geode stein, funnet i ny-Ålesund. Klippen var spent med en 532 nm 50 mW laser (a) og en 405 NM 50 MW laser (B). Begge bildene ble tatt med en polarisering filterfestet på objektivet, noe som førte til en forfalskning av de faktiske fluorescens farger. (C) True farge bilde uten bruk av en polarisering filter under dagslys forhold. Scale bar = 40 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Beutler og andre29 konkluderte med at karakteristiske utslipp Spectra av cyanobakterier i marine økosystemer er avhengige av miljøforhold. Også har metabolsk tilstand en innvirkning på fluorescens egenskaper i phototrophic organismer30. I.e. E instrument kan skille mellom alger og cyanobacterial fluorescens mønster ved hjelp av bio-fingeravtrykk biblioteker som inneholder Spectral informasjon av prøven korrelert med miljøforhold.

I mørk-tilpasset CHLa molekyler, alle reaksjons sentre er fullt oksidert og tilgjengelig for fotokjemi og ingen fluorescens yield er slukket31. Ved hjelp av L.I.F.E. prosedyren, er en prøve først opphisset av en 532 nm laser (grønn) og deretter med en 405 NM laser (blå). Under den andre eksitasjon av den blå laseren, kan CHLa vise en redusert fluorescens respons på grunn av tidligere eksitasjon av den grønne laseren. CHLa absorberer energi ved 532 nm bølgelengde, til tross for avstanden fra sin absorpsjon maksimal bølgelengde32. Før den faktiske chlen måling ved 405 NM, kan den grønne laseren forårsake fotokjemisk reaksjoner, aktivere slukke mekanismer i mål pigmenter. Videre, pre-belysning av marine phototrophic organismer ikke føre til en endring i Spectral norm kurver mellom 450 nm-600 NM mens standardavviket i fluorescens intensitet økte med 25%29. Avhengig av arten, fluorescens intensitet selv økt i respons til tidligere eksitasjon. Dette emnet krever videre etterforskning.

Anvendbarhet
Vi testet L.I.F.E. instrumentet i ulike habitater med vekt på cryoconite hull. Laseren ble med hell anvendt i jord-og biofilm habitater på grunn av fraværet av omgivelseslys under målingen. Cryoconite granulater kan måles når sediment lag blokkerte lys fra under hullet (figur 14a,C). Tynne sediment cryoconite hull ble gjennomtrengelig for spredt lys fra under (figur 14B). Stray Light forstyrrer målingen. Således er pigment konsentrasjon på bare is overflater ikke målbare under dagslys ennå. Signal behandlings arbeidet pågår for tiden for å muliggjøre drift av systemet ved høye omgivelseslys forhold.

Figure 14
Figur 14: Cryoconite hull med flytende vann på toppen. (A) Cryoconite på isbre med L.I.F.E. linse rør. Scale bar = 70 mm. (B) sediment lag (rød) er svært tynn. Stray Light blør gjennom cryoconite laget. (C) sediment laget er tykt nok til å blokkere den bortkommen lys fra under. Denne typen cryoconite hull er målbar med L.I.F.E. instrumentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som konklusjon, vår L.I.F.E. instrumentet oppdaget photoautotrophic organismer i terrestriske habitater som jord, bakteriell matter, biofilm, og i cryoconite hull på breen overflater. Målmolekylene var CHLa og B-PE. Den romlige oppløsningen var 30 μm/px. Deteksjons grensen for CHLa var 250 PG/ml og 2 ng/ml for B-PE. Etter en laboratorie kalibrering var vi i stand til å kvantifisere pigment innholdet i prøvene som ble samlet inn på vårt studiested i Arktis. Vi anvendt selv-programmert programvare for en automatisert data reduksjon forarbeide. Virkningene av tilstedeværelsen av mineraler og skiftende lysforhold under målingene krever videre etterforskning.

Med klima oppvarming, øker temperaturen føre til økt tilgjengelighet av flytende vann, noe som resulterer i høyere biologisk aktivitet på isete overflater av autotrofe og heterotrofe natur. Det bør gjøres kraftig innsats for å oppdage heterotrofe organismer in situ for å gi et fullstendig bilde av aktivt liv i kryosfæren. Dette kan testes med andre mål pigmenter og egnede laser eksitasjon bølgelengder. Herav, L.I.F.E. skaffer en passende avlytting system skaffer høy Temporal og romlig resolution for supraglacial vilkårene inne sammenheng med fleste endre likeledes idet mulig astrobiological søknadene.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takknemlig takker oberst (IL) J.N. Pritzker, den Tawani Foundation, USA, den østerrikske Federal Ministry of Science, forskning og økonomi (Sparkling Science SPA04_149 og SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), østerrikske Space Forum ( ÖWF), romersk Erler fra Hintertuxer natur EIS Palast, den østerrikske føderale skogbruk og base manager Nick Cox fra Arctic Station i ny Alesund (Svalbard). Vi står også i gjeld til Sabrina Obwegeser, Carina Rofner, og Fabian Drewes for deres hjelp under filmingen. Til slutt ønsker vi å takke James Bradley for å gi stemme for samtidig video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
aceton Merck 67-64-1
B-Phycoerythrin Invirtrogen P6305
Chlorophyll a standard Sigma-Aldrich C6144-1MG
formaline Merck HT501128 36%
GF/C filters Whatman WHA1822025 25mm diameter
HCl Merck H1758 36,5-38%
L.I.F.E. Prototype University of Innsbruck built on demand
LabView National Instruments Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench
Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi Perkin Elmer NET1166001MC radioactive
Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use Beckman not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard
liquid scintillation counter Beckman out of stock LSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 µCi/ml) DHI Denmark 4 μCi/ml, 1 ml radioactive
Osmonics polycarbonate filters DHI Denmark PCTE 25mm diameter, 0,2µm pore size
Polyscintillation vials Perkin Elmer WHA1825047 20ml
sample tubes Sigma Aldrich T2318-500EA Greiner centrifuge tubes, 50ml
Spectrophotometer Hitachi NA Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate
trichloric acetic acid (TCA) Merck T6399 100%
ultrasonic probe nano lab QS1T-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. Methanogenesis in subglacial sediments. Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).
  2. Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).
  3. Good, P., et al. A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system. Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).
  4. Fountain, A. G., et al. The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss. BioScience. 62, 405-415 (2012).
  5. Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011. Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).
  6. McMillan, M., et al. Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2. Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).
  7. Barletta, V. R., et al. Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps. Geophysical Research Letters. 33, 14307 (2006).
  8. Nuth, C., et al. Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard. The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).
  9. Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier. Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).
  10. Takeuchi, N. Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite. Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).
  11. Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).
  12. Anesio, A. M., et al. Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces. Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).
  13. Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes. Astrobiology. 9, 659-672 (2009).
  14. Murray, A. E., et al. Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).
  15. Edwards, A., et al. A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard. Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).
  16. Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).
  17. Yallop, M. L., et al. Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet. The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).
  18. Edwards, A., et al. A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem. Environmental Research Letters. 8, 035003 (2013).
  19. Remias, D., et al. Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers. FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).
  20. Cook, J., et al. An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet. Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).
  21. Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats. Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).
  22. Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).
  23. Hodson, A., et al. The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet. Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).
  24. Tilg, M., et al. L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems. Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).
  25. Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations. Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).
  26. Kirchman, D. Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments. Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).
  27. Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).
  28. Groemer, G., et al. Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission. Astrobiology. 14, 391-405 (2014).
  29. Beutler, M. Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).
  30. Krogmann, K. D. Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective. Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).
  31. Corrêa, D. S., et al. Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions. Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).
  32. Kaňa, R., et al. The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).

Tags

Environmental Sciences utstede 152 laser-indusert fluorescens utslipp (L.I.F.E.) ikke-invasiv cryospheric habitater is fykoerytrin klorofyll bre smelte
Laser-indusert fluorescens utslipp (L.I.F.E.) som Novel ikke-invasiv verktøy for in-situ målinger av biomarkører i Cryospheric habitater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weisleitner, K., Hunger, L.,… More

Weisleitner, K., Hunger, L., Kohstall, C., Frisch, A., Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats. J. Vis. Exp. (152), e60447, doi:10.3791/60447 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter