이 프로토콜은 단일 세포 분해능을 달성할 수 있는 통합 된 라만 분광법 질량 분석법 (MS) 플랫폼을 제공합니다. 라만 분광법은 약물에 대한 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수 있으며 MS는 약물 섭취 및 신진 대사의 표적 및 정량 분석에 사용될 수 있습니다.
세포는 약물에 대한 그들의 반응에서 본질적으로 이질적인 것으로 알려져 있습니다. 따라서, 단세포 이질성은 신약 개발 연구에서 고려되는 것이 필수적이다. 이는 단일 세포 수준(즉, 약물 섭취, 대사 및 효과)에서 세포와 약물 간의 과다한 세포 상호작용을 정확하게 측정함으로써 달성될 수 있다. 이 논문에서는 약물에 반응하여 세포의 대사 변화를 모니터링하는 단일 세포 라만 분광법 및 질량 분석법(MS) 플랫폼에 대해 설명합니다. 이 플랫폼을 사용하여 약물에 대한 반응의 대사 변화는 라만 분광법에 의해 측정 될 수 있으며 약물과 대사 산물은 동일한 세포에서 질량 분석법을 사용하여 정량화 될 수 있습니다. 결과는 단세포 수준에서 약 장악, 물질 대사 및 반응에 관하여 정보에 접근하는 것이 가능하다는 것을 건의합니다.
세포는 단세포 수준에서 그들의 미세 환경의 변화에 다르게 반응합니다, 현상은 세포 이질성1이라고합니다. 그럼에도 불구하고, 현재 의약 발견 연구는 잠재적인 소집단뿐만 아니라 단세포 변이에 대한 정보를 난독화하는 세포 집단의 평균 측정을 기반으로합니다 2. 이 누락된 정보는 왜 몇몇 세포가 그 외가 저항하는 동안 약에 더 영향을 받기 쉬운지 설명할 수 있습니다. 흥미롭게도, 약물 반응에 대한 단세포 정보의 부족은 약물의 단계 II 임상 시험의 실패에 대한 가능한 이유입니다3. 따라서, 이 문제를 해결 하기 위해, 약물과 세포 상호 작용 (즉, 전자, 전자 물질 대사, 그리고 응답) 단일 세포 수준에서 측정 해야 합니다.
이를 달성하기 위해, 우리는 살아있는 단일 세포가 라벨없는 라만 분광법을 사용하여 선별 된 다음 질량 분석4를사용하여 더욱 특징 지어지는 독특한 시스템을 설계했습니다. 라만 분광법은 세포 상태의 분자 지문, 세포 내부의 많은 분자의 기여로 인한 복잡한 스펙트럼을 제공합니다. 이러한 복잡성에도 불구하고 라만 지문은 전체 세포의 구조와 신진 대사를 반영한다고 볼 수 있습니다5,6. 라만 분광법은 비침습적이고 상대적으로 높은 처리량 방식으로 세포 상태를 측정하는 데 탁월하므로 단일 세포 수준에서 약물 반응을 선별하고 평가하는 데 유용합니다.
대조적으로, MS는 단세포 수준에서 약물 섭취를 측정하기 위한 필요한 감도 및 선택성을 제공한다. MS는 파괴적이기 때문에(샘플 [세포]는 일반적으로 분석 중에 소비됨) 비파괴적이고 라벨이 없는 라만 분광법과 통합하면 높은 처리량과 민감한 시스템을 제공할 수 있습니다. 이 결합된 플랫폼은 단세포 수준에서 약물 섭취, 신진 대사 및 효과에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 원고는 통합 된 라만-MS 플랫폼을 사용 하 여 체 외 배양 을 사용 하 여 단일 세포 수준에서 약물과 세포 상호 작용을 연구 하는 데 사용 하는 프로토콜을 해명. 이를 위해 간세포암세포(HepG2)와 타목시펜이 모델로 사용된다. HepG2 세포는 타목시펜을 취하고 약물을 대사하기 때문에 선택되었으며, 간 독성 효과로 인해 동시에 영향을받습니다. 이 원고에는 약물 처리 된 세포 대 비 처리 된 세포 (제어)의 두 가지 상태가 사용됩니다.
이 원고에서는 HepG2 세포가 타목시펜에 노출되거나 노출되지 않는 간단한 사례가 선택되었습니다. 라만 분광법 및 질량 분광법의 능력은 타목시펜이 세포에 미치는 영향을 모니터링하는 것으로 입증되었습니다. 라만 분광법은 약물 노출에 대한 단일 세포의 일반적인 반응을 반영한 잠재적바이오마커의 식별을 허용했습니다. 단 하나 세포 사이 몇몇 이질성은 관찰되었습니다, 몇몇 세포가 약 노출에 반응하지 않았다는 것을 건의했습니다. 한편, LSC-MS는 단일 세포 수준에서 약물 및 그 대사 산물의 표적 분석을 수행할 수 있었으며, 이종성의 높은 수준이 약물 및 그 대사 산물 풍부에서 관찰되었다. 이 이질성은 왜 몇몇 세포가 약에 의해 영향을 받는지 설명하는 것을 돕습니다 그 외는 겉으로는, 가정으로 균일한 인구12에서유래한 세포에도 불구하고.
주의가 필요한 이 기술의 특정 측면 들 중에서도 데이터의 재현성을 보장하기 위해 현미경 설정 및 신호 처리의 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 스펙트럼의 전처리가 신중하게 수행되면 각 피크의 로컬 최대값으로 신호 변동을 최대화해야 합니다. 반대로 스펙트럼의 기준선과 가장자리는 테스트된 셀 조건 간에 겹쳐야 합니다. 또 다른 중요한 양상은 처리 사이 다름점을 조사하기 위하여 이용된 다변량 모형입니다. 정확하고 정확한 해석을 위해 모델 및 모델 매개변수를 신중하게 평가해야 합니다. PLS 모델의 한 가지 장점은 신경망과 달리 각 파장(라만 시프트)과 관련된 가중치에 대한 액세스를 허용하여 모델에 의해 테스트된 조건을 가장 잘 구별할 수 있다는 것입니다.
라만 분광법이 약물 반응을 성공적으로 차별함에도 불구하고,이 기술은 생물학적 해석을 제공하기 위해 사용에 제한적이라는 점을 강조해야합니다. 이것은 주로 수천 개의 분자의 혼합물을 포괄하는 스펙트럼 신호의 복잡성 때문입니다. 따라서 라만 스펙트럼 강도와 약물 농도의 변화 사이의 체계적인 변화를 평가하기 위해 추가 조사가 필요합니다. 또한, 타목시펜과 관련된 스펙트럼 바이오마커의 일반화를 평가하기 위해 다른 세포주의 유사한 연구가 요구된다.
또한, 약력역학을 평가하고 약물이 각 세포 내에서 침투하고 흐르는 방법을 연구하기 위해 살아있는 조직 측정을 수행하는 것이 흥미로울 수 있습니다. 또한 LSC-MS의 샘플링 단계는 작업자의 기술에 크게 의존한다는 점에 유의해야 한다. 샘플링 후 모세관 내부의 공간 해상도, 셀 위치 및 처리량 강도와 같은 파라미터는 전적으로 작업자에 의존하므로 LSC-MS의 대규모 채택이 제한됩니다. 자동화된 샘플링 시스템은 이 문제를 완화할 수 있습니다. 또한, LSC-MS는 그들의 모국어 상태에서 부착또는 부동 세포를 샘플링에 탁월하지만, 조직 섹션에 내장 된 샘플링 세포에서 더 저조한 수행. 이는 샘플링 모세관 팁이 시료 밀도가 높으면 파손되는 경향 때문입니다. 따라서, 단일 프로브와 같은 또 다른 접근법은 이러한 경우에 더 적합할 수있다(14,15).
여기에 사용된 셀은 최소한의 시료 전처리로 주변 조건에서 샘플링되기 때문에 LSC-MS는 이 프로토콜의 라만과의 통합에 의해 나타난 바와 같이 다른 기술과 쉽게 통합될 수 있습니다. 3D 홀로그래피와의 또 다른 유사한 통합은 세포 이하수준 16에세포 대사 산물의 절대 적인 양을 달성하기를 허용했습니다. 부가적으로, 유세포분석과의 통합은 신경아세포종암 환자17,18의단일 순환 종양 세포에서 대사 바이오마커의 발견을 허용하였다.
미래에는 이미징 양식19에서데이터 세트를 결합하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라 통합 계산 접근법을 사용하여 라만 신호와 질량 분석 결과 (및 기타 omics 방법) 간의 체계적인 변화를 연구하는 것도 흥미로워질 수 있습니다. 흥미롭게도, 우리는 이미 VIP 점수로 확인된 라만 피크의 강도와 MS4에의해 확인된 단일 세포 수준에서 타목시펜 또는 대사 산물의 풍부 사이의 몇 가지 약하지만 중요한 선형 상관 관계를 발견했습니다. 이 데이터는 MS 단면도와 라만 스펙트럼 사이 신진 대사 관계 및 이 값을 예측하는 가능성을 건의할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 아르노 게르몬드 박사에 기인 그의 지원과 RIKEN 내부 협력 기금에 대한 토시오 야나기다 감사.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |