Summary
이 프로토콜은 단일 세포 분해능을 달성할 수 있는 통합 된 라만 분광법 질량 분석법 (MS) 플랫폼을 제공합니다. 라만 분광법은 약물에 대한 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수 있으며 MS는 약물 섭취 및 신진 대사의 표적 및 정량 분석에 사용될 수 있습니다.
Abstract
세포는 약물에 대한 그들의 반응에서 본질적으로 이질적인 것으로 알려져 있습니다. 따라서, 단세포 이질성은 신약 개발 연구에서 고려되는 것이 필수적이다. 이는 단일 세포 수준(즉, 약물 섭취, 대사 및 효과)에서 세포와 약물 간의 과다한 세포 상호작용을 정확하게 측정함으로써 달성될 수 있다. 이 논문에서는 약물에 반응하여 세포의 대사 변화를 모니터링하는 단일 세포 라만 분광법 및 질량 분석법(MS) 플랫폼에 대해 설명합니다. 이 플랫폼을 사용하여 약물에 대한 반응의 대사 변화는 라만 분광법에 의해 측정 될 수 있으며 약물과 대사 산물은 동일한 세포에서 질량 분석법을 사용하여 정량화 될 수 있습니다. 결과는 단세포 수준에서 약 장악, 물질 대사 및 반응에 관하여 정보에 접근하는 것이 가능하다는 것을 건의합니다.
Introduction
세포는 단세포 수준에서 그들의 미세 환경의 변화에 다르게 반응합니다, 현상은 세포 이질성1이라고합니다. 그럼에도 불구하고, 현재 의약 발견 연구는 잠재적인 소집단뿐만 아니라 단세포 변이에 대한 정보를 난독화하는 세포 집단의 평균 측정을 기반으로합니다 2. 이 누락된 정보는 왜 몇몇 세포가 그 외가 저항하는 동안 약에 더 영향을 받기 쉬운지 설명할 수 있습니다. 흥미롭게도, 약물 반응에 대한 단세포 정보의 부족은 약물의 단계 II 임상 시험의 실패에 대한 가능한 이유입니다3. 따라서, 이 문제를 해결 하기 위해, 약물과 세포 상호 작용 (즉, 전자, 전자 물질 대사, 그리고 응답) 단일 세포 수준에서 측정 해야 합니다.
이를 달성하기 위해, 우리는 살아있는 단일 세포가 라벨없는 라만 분광법을 사용하여 선별 된 다음 질량 분석4를사용하여 더욱 특징 지어지는 독특한 시스템을 설계했습니다. 라만 분광법은 세포 상태의 분자 지문, 세포 내부의 많은 분자의 기여로 인한 복잡한 스펙트럼을 제공합니다. 이러한 복잡성에도 불구하고 라만 지문은 전체 세포의 구조와 신진 대사를 반영한다고 볼 수 있습니다5,6. 라만 분광법은 비침습적이고 상대적으로 높은 처리량 방식으로 세포 상태를 측정하는 데 탁월하므로 단일 세포 수준에서 약물 반응을 선별하고 평가하는 데 유용합니다.
대조적으로, MS는 단세포 수준에서 약물 섭취를 측정하기 위한 필요한 감도 및 선택성을 제공한다. MS는 파괴적이기 때문에(샘플 [세포]는 일반적으로 분석 중에 소비됨) 비파괴적이고 라벨이 없는 라만 분광법과 통합하면 높은 처리량과 민감한 시스템을 제공할 수 있습니다. 이 결합된 플랫폼은 단세포 수준에서 약물 섭취, 신진 대사 및 효과에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 원고는 통합 된 라만-MS 플랫폼을 사용 하 여 체 외 배양 을 사용 하 여 단일 세포 수준에서 약물과 세포 상호 작용을 연구 하는 데 사용 하는 프로토콜을 해명. 이를 위해 간세포암세포(HepG2)와 타목시펜이 모델로 사용된다. HepG2 세포는 타목시펜을 취하고 약물을 대사하기 때문에 선택되었으며, 간 독성 효과로 인해 동시에 영향을받습니다. 이 원고에는 약물 처리 된 세포 대 비 처리 된 세포 (제어)의 두 가지 상태가 사용됩니다.
Protocol
1. 세포 배양
- 적절한 배양 배지에 관심 있는 배양 세포. 페니실린-스트렙토마이신은 오염을 피하기 위해 첨가될 수 있습니다. HepG2 세포의 경우, Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 함유하는 배양 배지에서 배양 세포는 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 0.1 % 페니실린 스트렙 토마이신으로 보충되었습니다. 라만 분광법 측정을 촉진하기 위해 세포는 0.1 % 젤라틴 코팅 유리 바닥 접시 또는 석영 슬라이드에서 재배 할 수 있습니다.
- 가습 된 인큐베이터에서 37 °C 및 5 %CO2에서 2 일 동안 세포를 배양합니다.
- 70% conconncy에 도달하기 위하여 세포 배양을 동기화하십시오.
- 하위 배양 세포는 0.7 x 106의파종 밀도에서 동일한 배지를 사용하여 35 mm 유리 바닥 격자 접시 또는 석영 슬라이드로, 24 시간 동안 37 °C에서 배양한다.
참고: 배양 접시 나 슬라이드는 5 ug /cm2의 배양 표면 비율로 콜라겐 또는 젤라틴 코팅 용액으로 미리 코팅하여 고정 할 수 있으므로 측정 중에 생존을 보장 할 수 있습니다.
2. 약물 치료
- 인큐베이터에서 세포 배양을 제거하고 미리 온화한 PBS 버퍼(37°C)로 2x 세척합니다.
참고 : 50 %-60 %의 결합에서 약물 치료를위한 세포를 제거하는 것이 최적입니다. - 35 mm 배양 접시에 약물 처리 및 처리되지 않은 하위 그룹으로 세포를 분할합니다.
- 선택한 약물을 배양 배지와 혼합하십시오. 예를 들어, 타목시펜을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 배양 배지와 혼합하여 2 mL 및 10 μM의 타목시펜 농도의 최종 부피를 얻었다. 이것은 약물 치료 그룹이 될 것입니다.
- DMSO의 효과를 연구하기 위한 대조군으로서 매액에 상응하는 용매(DMSO)를 혼합한다. 이 그룹은 제어 그룹이 됩니다.
- 24시간 동안 2.3-2.4단계로 제조된 스파이크 된 매체의 2 mL에서 두 군을 배양하였다. 배양 후 예상 되는 수렴 70%-80%이어야 한다.
3. 라만 스펙트럼 이미징 및 스펙트럼 처리
참고: 라만 분광 시스템은 시판되고 있지만, 여기서 사용되는 라만 분광 시스템은 앞서 설명한7,8. 간단히, 이 시스템은 532 nm 다이오드 펌핑 솔리드 스테이트 레이저가 장착되어 있습니다. 레이저 광은 원통형 렌즈를 사용하여 평면으로 형성되어 단일 노출로 400 스펙트럼을 측정할 수 있습니다. 라만 스펙트럼은 지문 영역의 스펙트럼 해상도를 최대화하기 위해 1,200 그루브 / mm 격자를 사용하는 폴리 크로마토에 장착 된 냉각 된 CCD 카메라를 사용하여 기록되었습니다 (500-1,800cm-1). 이 스펙트럼 영역은 라만 산란을 생성하는 분자에 특이적인 고밀도의 주파수를 포함합니다. 수몰입목표 렌즈(NA = 0.95)도 사용됩니다. 이 시스템의 공간 해상도는 ~ 300 nm이고 스펙트럼 해상도는 1cm-1입니다. 실험 중 세포 생존을 보장하기 위해 전동 현미경 단계에 고정된 마이크로챔버가 사용됩니다.
- 스펙트럼 측정 전에 광학의 정렬을 확인하십시오. 50 μm 핀홀을 사용하여 핀홀과 레이저 위치가 정확히 일치하는지 확인할 수 있습니다. 가능한 한 좁아지면 분광광도계 슬릿을 입력합니다.
- 에탄올을 사용하여 각 실험 전에 분광광도계를 교정합니다. 이렇게하려면, 유리 바닥 접시에 EtOH를 배치, 주어진 레이저 강도에서 스펙트럼을 측정 (샘플에서 측정) 1 s, 알려진 파장7피크를연결.
- 세포가 레이저 노출에서 살아남을 수 있도록 샘플에서 레이저 강도를 ~ 2.4 mW/μm2로 최소화합니다.
- 마이크로 챔버를 5% CO2 및 37°C에 설치합니다.
- 현미경 시스템이 준비되면, 인큐베이터에서 세포를 제거하고 즉시 따뜻하게 한 PBS (37 °C) 버퍼로 세포를 2 x 헹구고, 2 mL의 따뜻하게 한 PBS (37 °C) 또는 DMEM을 추가하여 세포를 다시 중단시되게하십시오.
참고: PBS와 플루오로브리트 DMEM 기반 미디어는 최소한의 배경 신호를 생성하기 때문에 라만 분광법 측정에 충분한 옵션입니다. - 물 10 μL을 물에 담그는 목표 렌즈에 넣고 유리 바닥 세포 접시를 현미경 단계에 섬세하게 놓습니다.
- 레이저 라인에 초점을 맞추어 각 셀을 측정합니다. 셀당 15s의 노출 시간은 명확한 라만 신호를 가진 세포의 단면을 얻기에 충분하다. galvano 거울은 수십 분 안에 1개의 세포 또는 세포의 단의 스캐닝을 허용합니다.
참고 : 세포의 전체 스펙트럼 이미징의 높은 해상도는 더 많은 시간이 필요하고 광손상으로 이어질 수 있습니다. 여기서, 세포는 각 셀의 단면을 얻기 위해 단일 라인 노출을 사용하여 측정하였다. 이 방법은 처리량을 높이고 세포를 구별하는 데 충분한 정보를 얻는 동시에 광손상을 제한하여 세포 생존 가능성을 보장하는 좋은 절충안입니다.
4. 스펙트럼 데이터의 전처리 및 다변량 분석
참고: 전처리는 스펙트럼 데이터 내에서 원치 않는 기술적 변형을 제거하기 위해 추가 분석 전에 필요한 단계입니다. 방법과 소프트웨어의 다양성으로 인해 철저한 목록을 제공 할 수 없으며 문헌7,8에서많은 유용한 리뷰가 있습니다. 이 섹션에서는 살아있는 단일 세포에서 얻은 스펙트럼 라만 데이터를 분석하고 해석하는 데 사용되는 접근 법을 간략하게 설명합니다.
- 라만 이미지를 추출하고 전처리하여 가능한 우주 선 간섭을 제거합니다.
참고: 다른 요일/주/월 동안 얻은 스펙트럼 축에는 에탄올을 사용하여 교정하는 동안 약간의 기술적 변화로 인한 일부 변형이 포함될 수 있습니다. 이는 후속 다변량 분석 및 통계 비교에 큰 영향을 미칩니다. 여러 주/개월 동안 실험이 수행되는 경우 작은 광학 적 변형이 예상됩니다. 이 경우 실험 전반에 걸쳐 데이터의 최종 스펙트럼 이동에 대해 데이터를 보정하기 위해 데이터를 보간해야 합니다. 입방 스프라인을 사용한 보간이 여기에 사용됩니다. 이 단계 후에는 모든 스펙트럼 축을 정렬해야 합니다. 500-1,800cm-1의 범위는 후속 분석을 위해 고려된다. - 홈메이드 알고리즘을 사용하여 각 이미지에서 셀 및 배경(셀 부재)의 스펙트럼 데이터를 추출합니다. 셀의 신호에서 배경 신호를 뺍니다. 그런 다음 단일 셀에 해당해야 하는 나머지 픽셀의 스펙트럼을 평균화합니다. 다음 단계는 세포의 2D 스펙트럼을 사용하여 수행됩니다.
- ModPoly9 또는 충분히 맞도록 추정된 다른 알고리즘을 사용하여 기준 선 수정을 수행합니다. 스펙트럼 범위를 600-1,700cm-1로 트리밍하여 지문 영역을 선택하고 잘못된 다항식 피팅으로 인해 스펙트럼에 원치 않는 가장자리 효과가 없는지 확인합니다.
- 벡터 정규화(각 파수의 강도는 전역 l2 규범 또는 스펙트럼의 최대 단수 값으로 나눈 값)과 같은 정규화를 수행하여 스펙트럼 세기10을정규화하지만 다른 정규화를 고려할 수 있습니다.
- 각 클래스/조건에 적합한 레이블이 있는 데이터 집합을 준비합니다.
참고: 비교 스펙트럼 분석은 세포 클래스/조건 간의 가능한 차이의 본질을 탐구하기 위해 천공될 수 있습니다(예: 대조군의 평균 스펙트럼을 다른 그룹으로 빼서 관심 영역을 식별합니다[예: 잠재적 바이오마커]). ANOVA 및 피셔 점수 계산도10을수행할 수 있습니다. - 스펙트럼 특징을 기반으로 처리및 처리되지 않은 세포를 식별하기 위해 다변량 분석을 적용할 수 있습니다. 정규화된 스펙트럼 데이터는 학습 데이터 집합으로 사용해야 하며 복제 실험의 알 수 없는 데이터 집합(레이블 없음)은 가능하면 테스트 데이터로 사용해야 합니다.
참고: 주성분 분석(PCA-DA10)의일부 벡터에서 수행된 판별 분석, 잠재 점수에 대한 예측 및 판별 분석(PLS-DA) 및 지원 벡터 머신(SVM)11은 현장에서 자주 사용되는 모델이며 각각 다른 통계적 고려 사항을 제시합니다. 따라서 데이터의 전처리를 수행해야 합니다. - 실험 목표에 맞는 기계 학습을 사용합니다. 여기서, 라만 스펙트럼(600-1,710cm-1)의스펙트럼 지문 영역을 이용하여 잠복 구조(PLS) 모델에 대한 프로젝션이 구축되어11,12. 필요에 따라 데이터를 중앙에 두는 것입니다. 모델의 교차 유효성 검사를 위해 다양한 기술을 적용할 수 있습니다.
참고: 여기서는 10개의 분할이 있는 베네치아 블라인드 교차 유효성 검사가 적용됩니다. 최상의 모델이 RMSE(루트 평균 제곱 오차) 값을 최소화할 수 있도록 모델 복잡성(구성 요소 수 또는 잠재 변수 수)을 테스트해야 합니다. 세 개의 잠재 벡터(LV)가 데이터 집합에서 최상의 차별을 제공하는 것으로 나타났습니다. - 라만 스펙트럼 피크가 셀의 판별에 기여하는 지 식별합니다(예: 각 라만 파수 또는 회귀 계수의 크기에 대한 투영 [VIP]에서 가변 중요도 점수를 플로팅하여).
참고: 변수의 VIP 점수는 PLS-DA 구성 요소와 원래 변수 간의 제곱 상관 관계의 가중 합계로 계산됩니다. PLS 및 VIP 점수 알고리즘에 대한 자세한 내용은 문헌11,12에서확인할 수 있습니다.
5. 단세포 샘플링 설정 및 절차
- 그림 1과같이 셀 샘플링 시스템을 라만 현미경에 고정합니다. 음압을 가하여 시료 를 빠는 빈 주사기에 부착된 유리 모세관 홀더에 3D 마이크로 매니더기를 연결합니다(그림1).
- 현미경을 고배율장(40x)으로 설정하여 유리 모세관의 끝을 관찰하고 파손되지 않았는지 확인합니다. 마이크로 조작기(x-, y-, z 축)를 사용하여 유리 모세관의 위치를 제어합니다. 모세관 팁이 시야의 중심에 있는지 확인한 다음 모세관을 z축 위로 이동하여 나중에 배양 접시에 대한 간격을 부여합니다.
참고 : 세포의 미세 샘플링은 10-15 μm 사이의 직경을 가진 세포에 대한 유리 모세관에 의해 수행됩니다. ~5 μm의 보어 크기의 모세관을 권장합니다. 보어 크기가 너무 작으면 모세관 팁이 셀에 연결되고 너무 크면 이후 MS 측정의 감도가 손상될 수 있습니다. - 현미경의 단계에 샘플 플레이트 / 접시를 배치, 배율과 초점을 조정, 그리드 접시에 대상 셀을 선택하고, 보기의 중심으로 이동합니다. 그런 다음 팁이 초점에 들어갈 때까지 미세 조작기 (z 축)를 사용하여 유리 모세관을 조심스럽게 낮추어 둡니다.
참고: 모세관이 초점이 맞을 때까지 x 축과 y 축에서 모세관을 움직이지 않도록 하십시오. - 현미경 관찰하에 모세관 팁으로 대상 단일 세포를 터치한 다음 주사기를 사용하여 모세관 팁 내부의 세포를 포획하기 위해 음압을 가하기 시작합니다. 필요한 경우 사진이나 비디오를 촬영하여 셀의 타이밍과 흡입 위치를 정확하게 확인하여 이 절차를 기록합니다.
- 모세관을 z축위로 이동합니다. 그런 다음 MS 분석을 준비하기 위해 집게를 사용하여 모세관 홀더에서 모세관을 분리합니다.
6. 질량 분석 측정
- 제조업체의 권장 사항에 따라 MS 계측기의 질량 정확도를 보정합니다. 보정 후에는 질량 오차가 3ppm을 초과하지 않는지 확인합니다.
- 관심 있는 분석에 가장 적합한 매개 변수에 맞게 MS 계측기를 최적화합니다.
참고: 타목시펜 및 4-OHT 분석의 경우, 계측기 파라미터는 입구 모세관 온도: 400°C, 분무 전압: 1500V, 자동 게인 제어 대상(AGC): 5.00E+06, S-렌즈 RF 레벨: 90%, SIM 범위: 347-397 m/z, SIM 최대 사출 시간: 200 ms, SIM 해상도: 140,000 FWHM, MS/MS 범위: 50-400 m/z, MS/MS AGC 대상: 2.00E+05, MS/MS 최대 사출 시간: 100 ms, MS/MS 해상도: 17,500 FWHM, MS/MS 절연 창: 1m/z, MS/z: MS/z: MS/z: 1m/z, MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: 1m/z, MS/z: MS/z: MS/z: MS/MS 절연 창: 17,500FWHM, MS/z/ MS 절연 창: 1m/z, MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/MS 절연 창: 1m/z, MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: 17,500 FWHM, MS/z/ MS 절연 창: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: MS/z: 17,500FWHM, MS/z/ MS+3[MS/z] - 상대적 정량을 달성하기 위해 SIM 모드의 지속 시간 5 분과 약물 및 대사 산물의 긍정적 인 식별을위한 또 다른 MS / MS 방법을 설정하는 자동 수집 방법을 설정합니다. 수집 방법의 매개 변수는 6.2단계에서 언급한 최적화된 값으로 설정되어야 합니다.
- 연기 후드 아래에 이온화 용매를 준비합니다. 용매 조성물은 관심있는 세포에 의존합니다. 여기서, 사용되는 유기 용매는 80 % MeOH, 10 % DMSO 및 0.1 % 포름 산으로 구성됩니다.
- 측정 전에 적절한 내부 표준을 유기 용매와 혼합하십시오. 본 실험에서, 5.31 nM의 d5-타목시펜은 내부 표준으로서 사용된다.
- 거짓 긍정을 피하기 위해, 세포 부품을 샘플링하지 않도록 일정한 현미경 관찰과 함께 1 μm 보어 크기의 모세관을 사용하여 약물로 처리 된 세포를 둘러싼 매체를 흡인합니다.
- 로더 팁에 부착된 피펫을 사용하여 매질이 포함된 모세관의 넓은 단부에 이온화 용매의 2 μL을 추가합니다. 그런 다음, MS에 의해 샘플링 된 매체를 분석하고, 관심있는 분석물의 존재를 확인하십시오 (일반적으로 검출 할 수 없습니다).
- 세포를 포함하는 모세관에 2 μL의 이온화 용매를 추가하고, 모세관을 적합한 질량 분석기에 연결된 나노 전기 스프레이 어댑터(nano-ESI)에 고정하고, 자동 수집 방법을 시작한다.
7. 질량 분광법 데이터 처리 및 분석
참고: 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 그러나 연구원이 MS 공급업체에서 제공하지 않는 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하려면 원시 데이터를 독점 공급업체 형식에서 개방형 형식으로 변환하거나 먼저 텍스트 파일로 변환해야 합니다(여기서 수행된 경우).
- 관심 분석물의 피크 영역을 동일한 MS 스캔에서 내부 표준의 영역으로 나누어 데이터를 정규화합니다. 그런 다음 로그 피크 비율을 변환하여 기울이기를 줄입니다.
- 단일 세포에 걸쳐 분포를 시각화하기 위해 박스 플롯 또는 밀도 곡선으로 약물 또는 대사 산물의 정규화 된 강도를 플롯. 여기서는 ggplot2 패키지와 함께 R 통계 소프트웨어가 사용됩니다.
- 대사된 약물을 각 세포에서 대사되지 않은 부모 분자의 물질대사로 대사되지 않은 분자의 그것으로 나누어 대사되지 않은 약물 비율(즉, 4-OHT 및 타목시펜)을 각각 계산한다.
참고: 관심 있는 특정 라만 피크의 변화와 약물 또는 그 대사 산물의 MS 피크의 변화 사이의 상관 관계를 연구할 수 있습니다. 이것은 단일 세포에서 약물 자체와 대사 산물 사이의 가능한 상관 관계에 추가. 이 작업은 두 개의 꼬리 테스트를 사용하여 Pearson 상관 계수를 계산하여 수행할 수 있습니다. 보다 진보된 통합 접근법도 고려해야 합니다.
Representative Results
약물 상호 작용의 단 세포 분석 (전자 메일, 신진 대사, 그리고 효과) 어떤 숨겨진 또는 약물 내성 하위 집단을 폭로 뿐만 아니라 세포 이질성의 효과 이해에 필수적이다. 이 프로토콜에서, 2개의 상보적인 기술은 단 하나 세포에 있는 전술한 상호 작용을 측정하기 위하여 이용되었습니다: 라만 분광법 및 MS. 라만 분광법은 약 반응의 스펙트럼 biomarkers에 근거를 둔 약에 의해 영향을 받는 세포를 급속하게 식별합니다. MS는 선택적이고 반정적인 방식으로 약물의 섭취 및 대사를 모니터링하는 데 사용된다. 세포는 먼저 라만 분광법에 의해 선별된 다음 MS에 의해 분석을 위해 개별적으로 샘플링하였다.
각 조건의 평균 스펙트럼(약물 치료 유무)에 대한 비교 분석은 그림 2에나와 있습니다. 두 조건의 평균 스펙트럼은 이전에 식별되고 분자 화합물2에할당 된 다양한 피크에서 명확하게 다릅니다. 특히, 1000 cm에서 피크- (페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 화합물에 할당) 강한 차이를 보여줍니다. 통계적 차이의 유의는 추가 다변량 분석에 의해 평가되어야 합니다.
데이터 세트는 두 세포 치료(약물: n=290, 약물 없음: n=115)를 구별하기 위한 PLS 모델(단계 4.5-4.8)을 훈련시키는 데 사용되었다. 타목시펜의 존재에서 배양된 세포를 분류하는 예측 능력은 테스트 데이터에서 100% 감도 및 72% 특이성에 도달하였다(교차 검증된 훈련된 모델에서 알 수 없음). 민감도는 모델에 의해 올바르게 식별되는 실제 긍정의 척도이며 특이성은 모델에 의해 식별되는 실제 네거티브의 척도입니다. 이 연구에서포괄적인 비교가 수행되지는 않았지만 SVM, LDA 및 신경망과 같은 대체 모델은 유사하거나 더 나은 결과를 제공할 수 있습니다.
PLS 모델을 기반으로, VIP 점수는 실험 조건을 차별하는 파장(Raman shifts)의 중요성을 나타내는 계산되었다(그림3). 중요한 것은, VIP 프로파일의 가장 높은 피크는 두 치료 사이에 강한 차이가 보인 라만 봉우리에 해당합니다. 이것은 처리되고 처리되지 않은 세포 사이 특정 분자 다름을 확인했습니다. 따라서, 연구원은 약물 치료에 단 하나 세포의 반응을 반영하는 가능한 스펙트럼 biomarkers를 확인할 수 있습니다. 이러한 바이오마커는 다양한 조건 및 세포주전반에 걸친 생물학적 관련성 및 일반화를 확인하기 위해 추가로 시험될 수 있다.
살아있는 단세포 질량 분석법 (LSC-MS) 시스템은 이전에 라만 분광법에 의해 측정된 단일 약물 처리 HepG2 세포에서 약물과 대사 산물을 모두 검출할 수 있었습니다. 또한, 탠덤 MS는 두 분자의 구조를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 양성 확인 후, 약물과 그 대사 산물의 상대적 풍부도는 각 세포에서 측정되었고 치료되지 않은 세포의 배경 피크와 비교되었습니다. 타목시펜 풍부에서 강한 변이가 관찰되었고, 이 현상은 대사산물인 4-OHT의 경우 더욱 두드러졌다(그림4). 타목시펜 풍부와 그 대사 산물 사이의 관계도 연구되었으며, 이 둘 사이에 유의한 양성 상관관계가 발견되었습니다(r = 0.54, p = 0.0001, n = 31).
그림 1: 현미경 단계에 장착된 세포 피킹 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 약물 처리 된 세포의 평균 스펙트럼 (타목시펜 함유: n = 295) 및 치료되지 않은 세포 (타목시펜 없음: n = 115). 라만 피크는 문헌에서 확인할 수 있다. 대부분의 강한 스펙트럼 차이는앞서4에 설명된 바와 같이 통계적으로 유의한(ANOVA, p ≤ 0.5)이다. 이 그림은 이전 발행물4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 예측 PLS 모델에서 추출된 VIP 점수입니다. VIP 점수는 모델의 두 클래스를 구별하는 데 기여하는 파장을 반영합니다. 피크의 대부분은 약물 처리 된 세포에 대한 약물 효과의 스펙트럼 바이오 마커로 관찰되는 특정 분자에 해당합니다. 이 그림은 이전 발행물4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 타목시펜 풍부와 대사 산물의 분포. 타목시펜 풍부의 분포및 그의 대사산물, 4-OHT(단세포 수준에서 측정) 처리되지 않은 세포에서 내인성 피크에 비해 (대조군). 이 그림은 이전 발행물4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 원고에서는 HepG2 세포가 타목시펜에 노출되거나 노출되지 않는 간단한 사례가 선택되었습니다. 라만 분광법 및 질량 분광법의 능력은 타목시펜이 세포에 미치는 영향을 모니터링하는 것으로 입증되었습니다. 라만 분광법은 약물 노출에 대한 단일 세포의 일반적인 반응을 반영한 잠재적바이오마커의 식별을 허용했습니다. 단 하나 세포 사이 몇몇 이질성은 관찰되었습니다, 몇몇 세포가 약 노출에 반응하지 않았다는 것을 건의했습니다. 한편, LSC-MS는 단일 세포 수준에서 약물 및 그 대사 산물의 표적 분석을 수행할 수 있었으며, 이종성의 높은 수준이 약물 및 그 대사 산물 풍부에서 관찰되었다. 이 이질성은 왜 몇몇 세포가 약에 의해 영향을 받는지 설명하는 것을 돕습니다 그 외는 겉으로는, 가정으로 균일한 인구12에서유래한 세포에도 불구하고.
주의가 필요한 이 기술의 특정 측면 들 중에서도 데이터의 재현성을 보장하기 위해 현미경 설정 및 신호 처리의 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 스펙트럼의 전처리가 신중하게 수행되면 각 피크의 로컬 최대값으로 신호 변동을 최대화해야 합니다. 반대로 스펙트럼의 기준선과 가장자리는 테스트된 셀 조건 간에 겹쳐야 합니다. 또 다른 중요한 양상은 처리 사이 다름점을 조사하기 위하여 이용된 다변량 모형입니다. 정확하고 정확한 해석을 위해 모델 및 모델 매개변수를 신중하게 평가해야 합니다. PLS 모델의 한 가지 장점은 신경망과 달리 각 파장(라만 시프트)과 관련된 가중치에 대한 액세스를 허용하여 모델에 의해 테스트된 조건을 가장 잘 구별할 수 있다는 것입니다.
라만 분광법이 약물 반응을 성공적으로 차별함에도 불구하고,이 기술은 생물학적 해석을 제공하기 위해 사용에 제한적이라는 점을 강조해야합니다. 이것은 주로 수천 개의 분자의 혼합물을 포괄하는 스펙트럼 신호의 복잡성 때문입니다. 따라서 라만 스펙트럼 강도와 약물 농도의 변화 사이의 체계적인 변화를 평가하기 위해 추가 조사가 필요합니다. 또한, 타목시펜과 관련된 스펙트럼 바이오마커의 일반화를 평가하기 위해 다른 세포주의 유사한 연구가 요구된다.
또한, 약력역학을 평가하고 약물이 각 세포 내에서 침투하고 흐르는 방법을 연구하기 위해 살아있는 조직 측정을 수행하는 것이 흥미로울 수 있습니다. 또한 LSC-MS의 샘플링 단계는 작업자의 기술에 크게 의존한다는 점에 유의해야 한다. 샘플링 후 모세관 내부의 공간 해상도, 셀 위치 및 처리량 강도와 같은 파라미터는 전적으로 작업자에 의존하므로 LSC-MS의 대규모 채택이 제한됩니다. 자동화된 샘플링 시스템은 이 문제를 완화할 수 있습니다. 또한, LSC-MS는 그들의 모국어 상태에서 부착또는 부동 세포를 샘플링에 탁월하지만, 조직 섹션에 내장 된 샘플링 세포에서 더 저조한 수행. 이는 샘플링 모세관 팁이 시료 밀도가 높으면 파손되는 경향 때문입니다. 따라서, 단일 프로브와 같은 또 다른 접근법은 이러한 경우에 더 적합할 수있다(14,15).
여기에 사용된 셀은 최소한의 시료 전처리로 주변 조건에서 샘플링되기 때문에 LSC-MS는 이 프로토콜의 라만과의 통합에 의해 나타난 바와 같이 다른 기술과 쉽게 통합될 수 있습니다. 3D 홀로그래피와의 또 다른 유사한 통합은 세포 이하수준 16에세포 대사 산물의 절대 적인 양을 달성하기를 허용했습니다. 부가적으로, 유세포분석과의 통합은 신경아세포종암 환자17,18의단일 순환 종양 세포에서 대사 바이오마커의 발견을 허용하였다.
미래에는 이미징 양식19에서데이터 세트를 결합하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라 통합 계산 접근법을 사용하여 라만 신호와 질량 분석 결과 (및 기타 omics 방법) 간의 체계적인 변화를 연구하는 것도 흥미로워질 수 있습니다. 흥미롭게도, 우리는 이미 VIP 점수로 확인된 라만 피크의 강도와 MS4에의해 확인된 단일 세포 수준에서 타목시펜 또는 대사 산물의 풍부 사이의 몇 가지 약하지만 중요한 선형 상관 관계를 발견했습니다. 이 데이터는 MS 단면도와 라만 스펙트럼 사이 신진 대사 관계 및 이 값을 예측하는 가능성을 건의할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 아르노 게르몬드 박사에 기인 그의 지원과 RIKEN 내부 협력 기금에 대한 토시오 야나기다 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| 35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
| 4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
| 532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
| BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
| CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
| d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
| fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
| Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
| MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
| Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
| MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
| NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
| Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
| On-stage incubator | ibidi | ||
| Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
| PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
| Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
| Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |
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