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Biochemistry

一个集成拉曼光谱和质谱平台,用于研究单细胞药物接受、代谢和效果

doi: 10.3791/60449 Published: January 9, 2020

Summary

该协议提供了一个集成的拉曼光谱-质谱(MS)平台,能够实现单细胞分辨率。拉曼光谱可用于研究细胞对药物的反应,而MS可用于药物获取和代谢的靶向和定量分析。

Abstract

众所周知,细胞在药物反应中本质上是异质的。因此,在药物发现研究中考虑单细胞异质性至关重要。这可以通过在单细胞水平上准确测量细胞和药物之间的大量细胞相互作用来实现的(即药物获取、代谢和效果)。本文介绍了一个单细胞拉曼光谱和质谱(MS)平台,用于监测细胞对药物的反应的代谢变化。使用此平台,通过拉曼光谱法可以测量对药物的反应的代谢变化,而药物及其代谢物可以通过同一细胞中的质谱法进行定量。结果表明,有可能在单细胞水平上获得药物获取、代谢和反应的信息。

Introduction

细胞在单细胞水平上对微环境的变化有不同的反应,这种现象称为细胞异质性1。尽管如此,目前的药物发现研究是基于细胞群的平均测量,这混淆了有关潜在亚群以及单细胞变异2的信息。这种缺失的信息可以解释为什么有些细胞更容易受到药物的影响,而其他细胞则具有抗药性。有趣的是,缺乏关于药物反应的单细胞信息是药物3II期临床试验失败的一个可能原因。因此,要解决这个问题,细胞与药物的相互作用(即摄取、代谢和反应)必须在单细胞水平上测量。

为了实现这一目标,我们设计了一个独特的系统,其中活的单细胞使用无标签的拉曼光谱进行筛选,然后使用质谱4进一步描述。拉曼光谱提供了细胞状态的分子指纹,这是一个复杂的光谱,由细胞内许多分子的贡献产生。尽管如此复杂,可以认为拉曼指纹反映了整个细胞的结构和代谢5,6。拉曼光谱擅长以非侵入性和相对较高的通量方式测量细胞状态,这使得它在单细胞水平上筛选和评估药物反应非常有用。

相反,MS为单细胞水平的药物摄入量测量提供了所需的灵敏度和选择性。由于 MS 具有破坏性(样品 [cell] 通常在分析过程中使用),因此将其与无损、无标签的拉曼光谱集成可提供高通量和敏感系统。这个组合平台能够提供有关药物在单细胞水平上的药物获取、代谢和效果的更多信息。

本手稿阐明了使用集成拉曼-MS平台在单细胞水平上使用体外培养物研究细胞与药物的细胞相互作用的协议。为此,肝细胞癌细胞(HepG2)和他莫西芬被用作模型。选择HepG2细胞是因为它们服用他莫西芬并代谢药物,同时由于其肝毒性作用而受到影响。本手稿使用了两种状态:药物治疗细胞未治疗细胞(对照)。

Protocol

1. 细胞培养

  1. 适当培养介质中感兴趣的培养单元。可添加青霉素-链霉素以避免污染。在HepG2细胞的情况下,培养细胞在培养基中含有Dulbeco的改性Eagle的培养基(DMEM),辅以10%的胎儿牛血清(FBS)和0.1%青霉素链霉素。为了便利拉曼光谱测量,可以在0.1%明胶涂层玻璃底盘或石英幻灯片上生长细胞。
  2. 在加湿培养箱中,在37°C和5%CO2下孵育细胞2天。
  3. 同步细胞培养达到70%的汇合。
  4. 亚培养细胞在35毫米玻璃底网格盘或石英幻灯片中使用同一介质,播种密度为0.7 x 106,然后在37°C孵育24小时。
    注:培养皿或幻灯片可以预涂有胶原蛋白或明胶涂层溶液,培养表面比为5微克/厘米2,以进行修复,确保其在测量过程中存活。

2. 药物治疗

  1. 从培养箱中取出细胞培养物,用预热的PBS缓冲液(37°C)洗涤2倍。
    注:在50%-60%的汇合下,最好去除用于药物治疗的细胞。
  2. 在35毫米培养皿中将细胞分成药物处理和未经治疗的子组。
  3. 将选择的药物与文化介质混合。例如,将他莫西芬溶解在二甲基亚硫酸盐(DMSO)中,并与培养基体混合,以获得2 mL的最终体积和10μM的他莫西芬浓度。这将是药物治疗组。
  4. 将相应的溶剂体积 (DMSO) 混合到介质中作为对照,以研究 DMSO 的影响。这将是控制组。
  5. 在步骤 2.3-2.4 中准备的 2 mL 中孵育两组,以 24 小时。孵育后的预期汇合率应为70%-80%。

3. 拉曼光谱成像和光谱处理

注:虽然拉曼光谱系统已上市,但此处使用的拉曼光谱系统是一种自制线扫描共聚焦显微镜,之前描述为 7、8。简而言之,该系统配备了532nm二极管泵送固态激光器。激光使用圆柱透镜形成平面,允许在一次曝光中测量 400 个光谱。拉曼光谱是使用安装在多色计的冷却CCD相机录制的,该摄像机使用1,200个凹槽/毫米光栅来最大化指纹区域的光谱分辨率(从500-1,800厘米-1)。该光谱区域包含特定于产生拉曼散射的分子的高密度频率。还使用浸入式镜片(NA = 0.95)。该系统的空间分辨率为+300nm,光谱分辨率为1cm-1。为了确保实验期间的细胞存活,使用固定在电动显微镜台上的微室。

  1. 在进行光谱测量之前,请验证光学器件的对准。50 μm 针孔可用于验证针孔和激光位置是否完全匹配。尽可能缩小时输入分光光度计狭缝。
  2. 在每次实验之前,使用乙醇校准分光光度计。为此,将 EtOH 放在玻璃底盘中,以给定的激光强度(在采样时测量)测量 1 s 的光谱,并将峰值与已知波长7相关联。
  3. 将样品上的激光强度最小化至±2.4 mW/μm2,使细胞在激光照射下存活下来。
  4. 将微室设置为 5% CO2和 37 °C。
  5. 一旦显微镜系统准备就绪,从培养箱中取出细胞,立即用加热的PBS(37°C)缓冲液冲洗细胞2x,然后加入2 mL的加热PBS(37°C)或DMEM,以重新悬浮细胞。
    注:PBS 和基于氟布里特 DMEM 的介质都是拉曼光谱测量的充分选择,因为它们产生的背景信号最小。
  6. 将 10 μL 的水添加到浸入式物镜中,并巧妙地将玻璃底细胞盘置于显微镜台上。
  7. 通过聚焦激光线测量每个电池。每个细胞15s的暴露时间足以获得具有清晰拉曼信号的细胞的横截面。galvano镜像允许在几十分钟内扫描一个细胞或一组细胞。
    注:细胞全光谱成像的更高分辨率需要更多的时间,并可能导致光损伤。在这里,使用单线暴露测量细胞,以获得每个细胞的横截面。这种方法是一个很好的权衡,以提高吞吐量和获得足够的信息,以区分细胞,同时通过限制光损伤确保细胞的生存能力。

4. 光谱数据的预处理和多变量分析

注: 预处理是附加分析之前的必要步骤,以便消除光谱数据中不需要的技术变化。由于方法和软件的多样性,无法提供详尽的列表,在文献7,8中发现许多有用的评论。在本节中,我们简要介绍了用于分析和解释从活的单细胞获得的光谱拉曼数据的方法。

  1. 提取并预处理拉曼图像,以消除可能的宇宙射线干扰。
    注: 不同天/周/月获得的光谱光谱轴可能包含一些变化,因为使用乙醇校准过程中技术变化很小。这将严重影响后续的多变量分析和统计比较。如果实验在不同周/月进行,则预期光学变化很小。在这种情况下,必须对数据进行插值,以纠正数据在实验中的最终光谱偏移。此处使用使用立方样条线的插值。此步骤后,所有光谱轴都应对齐。考虑在500-1,800厘米-1的范围内进行后续分析。
  2. 使用自制算法从每个图像中提取单元格和背景的光谱数据(缺少单元格)。从电池信号中减去背景信号。然后,对剩余像素的光谱进行平均,该光谱应对应于单个单元格。以下步骤使用细胞的 2D 光谱执行。
  3. 使用 ModPoly9或它估计足够拟合的任何其他算法执行基线校正。将光谱范围修剪为 600-1,700 cm-1,以选择指纹区域,并确保由于多项式拟合不良,对光谱没有不必要的边缘影响。
  4. 执行规范化步骤,如矢量规范化(每个波数的强度除以全局 l2 规范或光谱的最大奇异值),以规范化光谱强度10,尽管可以考虑其他规范化。
  5. 为每个类/条件准备具有相应标签的数据集。
    注:可以进行比较光谱分析,以探讨细胞类/条件之间可能存在的差异的性质(例如,通过将对照组的平均光谱减去其他组,以确定感兴趣的区域[如潜在的生物标志物])。ANOVA和费舍尔分数计算也可以执行10。
  6. 为了根据光谱特征识别经过处理和未经处理的细胞,可以应用多变量分析。规范化的光谱数据应用作训练数据集,复制实验中的未知数据集(无标签)应用作测试数据(如果可能)。
    注:对主要分量分析(PCA-DA10)的某些向量执行的区分分析,对潜在分数进行投影,然后是鉴别性分析(PLS-DA),支持向量机(SVM)11是现场常用的模型,每种模型都有不同的统计考虑因素。因此,应对数据进行预处理。
  7. 使用适合实验目标的机器学习。在这里,利用拉曼光谱的光谱指纹区域(600-1,710厘米-1)11、12,构建潜质结构(PLS)模型。根据需要对数据进行均心中心。对于模型的交叉验证,可以应用不同的技术。
    注: 此处应用了具有 10 个拆分的威尼斯盲交叉验证。应测试模型复杂性(组件数或潜在变量数),以便最佳模型将根均方误差 (RMSE) 值降至最低。结果发现,三个潜在向量 (LV) 为我们的数据集提供了最佳区分。
  8. 确定哪些拉曼光谱峰有助于对细胞的区分(例如,通过绘制每个拉曼波数或回归系数的幅度在投影 [VIP] 中可变重要性的分数)。
    注:变量的 VIP 分数计算为 PLS-DA 组件和原始变量之间的平方相关性的加权总和。有关 PLS 和 VIP 分数算法的详细信息,请参阅文献11、12

5. 单单元取样设置和程序

  1. 将细胞采样系统固定在拉曼显微镜上,如图1所示。通过施加负压将 3D 微操作器连接到连接到空注射器上的玻璃毛细管支架,以便吸吮样品(图1)。
  2. 将显微镜设置为高放大倍率场(40 倍),以观察玻璃毛细管的尖端并确保其未损坏。使用微操作器(x-、y-、z 轴)控制玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视场中,然后在 z 轴上向上移动毛细管,以便稍后为培养皿提供间隙。
    注:细胞的微采样由玻璃毛细管对直径在10-15 μm之间的细胞进行。建议使用孔径为 ±5 μm 的毛细管。如果孔尺寸太小,则毛细管尖端将被电池插入,如果尺寸过大,则后期 MS 测量的灵敏度可能会受到影响。
  3. 将样品板/碟放在显微镜的舞台上,调整放大倍率和对焦,选择网格盘上的目标细胞,并将其移到视图中心。然后,使用微操作器(z 轴)小心地降低玻璃毛细管,直到尖端进入焦点。
    注:在毛细管聚焦之前,请确保不要移动 x 轴和 y 轴中的毛细管。
  4. 在微观观察下,用毛细管尖触摸目标单细胞,然后开始使用注射器施加负压,将细胞困在毛细管尖端内。如有必要,通过拍摄照片或视频来准确检查细胞的定时和吸合位置,从而记录此过程。
  5. 在 z 轴上向上移动毛细管。然后,使用钳子将毛细管从毛细管支架上分离,为 MS 分析做准备。

6. 质谱测量

  1. 根据制造商的建议校准 MS 仪器的质量精度。校准后,确保质量误差不超过 3 ppm。
  2. 优化 MS 仪器,以最适合感兴趣的检测仪的参数。
    注:在塔莫西芬和4-OHT分析的情况下,仪器参数设置为:入口毛细管温度:400°C,喷涂电压:1500 V,自动增益控制目标(AGC):5.00E+06,S透镜射频电平:90%,SIM范围:347-397 m/z, SIM 最大注入时间:200 ms,SIM 分辨率:140,000 FWHM,MS/MS 范围:50-400 m/z,MS/MS AGC 目标:2.00E+05,MS/MS 最大注射时间:100 ms,MS/MS 分辨率:17,500 FWHM,MS/MS 隔离窗口:1 m/z,MS/MS 标准化碰撞能量(NCE)35。
  3. 设置一种持续时间为5分钟的自动采集方法,以实现相对定量,另一种MS/MS方法用于药物及其代谢物的阳性识别。采集方法的参数应设置为步骤 6.2 中提到的优化值。
  4. 在烟机罩下准备电离溶剂。溶剂成分取决于感兴趣的合成物。这里使用的有机溶剂包括80%MeOH、10%DMSO和0.1%的甲酸。
  5. 在测量之前,将适当的内部标准与有机溶剂混合。在本实验中,5.31 nM 的 d5-他莫西芬用作内部标准。
  6. 为避免误报,使用1μm孔状毛细管对药物治疗的细胞周围介质吸气,并持续进行微观观察,避免对任何细胞部件进行取样。
  7. 使用连接到装载机尖端的移液器,将 2 μL 电离溶剂添加到毛细管的宽端,其中包含介质。然后,通过 MS 分析采样介质,检查是否存在感兴趣的分析剂(通常,它不应被检测到)。
  8. 将电离溶剂加入2 μL,将电离溶剂添加到包含电池的毛细管中,将毛细管固定到连接到合适质谱仪的纳米电喷适配器(纳米-ESI)上,然后启动自动采集方法。

7. 质谱数据处理和分析

注:任何合适的软件都可用于执行数据分析。但是,如果研究人员希望使用 MS 供应商未提供的软件执行数据分析,则应首先将原始数据从专有供应商格式转换为打开格式或作为文本文件(在此处完成)。

  1. 通过将利益关系分子的峰值区域除以同一 MS 扫描中内部标准的峰值区域来标准化数据。然后,对数变换峰值比率以减少偏斜度。
  2. 将药物或其代谢物的归一化强度绘制为箱形图或密度曲线,以可视化单个细胞之间的分布。在这里,使用R统计软件,以及ggplot2软件包。
  3. 通过将药物代谢物的丰度除以每个细胞中未代谢的父分子(即4-OHT和他莫西芬)来计算代谢药物未代谢药物比率。
    注:可以研究特定拉曼兴趣峰的变化与药物或其代谢物MS峰的变化之间的相关性。这是药物本身与单细胞中代谢物之间可能相关性的补充。这可以通过使用双尾测试计算 Pearson 相关系数来实现。还应考虑更先进的综合方法。

Representative Results

药物相互作用的单细胞分析(摄入、代谢和影响)对于发现任何隐藏或耐药亚群以及了解细胞异质性的影响至关重要。在该协议中,使用两种互补技术来测量单细胞中的上述相互作用:拉曼光谱学和MS. 拉曼光谱学根据药物反应的光谱生物标志物快速识别受药物影响的细胞。MS用于以选择性和半定量的方式监测药物的接受和代谢。细胞首先通过拉曼光谱学进行筛选,然后单独采样,由MS进行分析。

图2显示了对每种疾病(有和没有药物治疗)的平均光谱的比较分析。这两个条件的平均光谱在不同峰上明显不同,这些峰先前被识别并分配给分子化合物2。特别是,1000厘米的峰- (分配给芳香化合物,如苯丙氨酸和酪氨酸)表现出强烈的差异。统计差异的意义应通过进一步的多变量分析来评估。

然后,数据集用于训练 PLS 模型(步骤 4.5-4.8),旨在区分两种细胞治疗(药物:n = 290,无药物:n = 115)。在存在他莫西芬的情况下对培养的细胞进行分类的预测能力在测试数据中达到 100% 的灵敏度和 72% 的特异性(从交叉验证的定型模型中未知)。灵敏度是模型正确标识的真实正数的度量,而特异性是模型标识的实际负数的度量。替代模型(如 SVM、LDA 和神经网络)可能会提供类似或更好的结果,尽管本研究中尚未执行全面的比较。

基于PLS模型,计算了VIP分数,表示波长(拉曼移位)在区分实验条件方面的重要性(图3)。重要的是,VIP配置文件的最高峰值对应于拉曼峰,两种治疗之间存在显著差异。这证实了治疗细胞和未经治疗的细胞之间的特定分子差异。因此,研究人员可以识别可能反映单个细胞对药物治疗的反应的光谱生物标志物。这些生物标志物可以进一步测试,以验证其生物学相关性和在各种条件和细胞系的概括。

活单细胞质谱仪(LSC-MS)系统能够检测药物及其代谢物在单一,药物治疗的HepG2细胞,以前测量拉曼光谱。此外,串联MS可用于确认两个分子的结构。阳性鉴定后,在每个细胞中测量药物及其代谢物的相对丰度,并将其与未治疗细胞的背景峰进行比较。在塔莫西芬丰度中观察到了强烈的变异,这种现象在其代谢物4-OHT(图4)的情况下更为明显。还研究了他莫西芬丰度与其代谢物之间的关系,其中发现两者之间存在显著的正相关关系(r = 0.54,p = 0.0001,n = 31)。

Figure 1
图1:安装在显微镜台上的细胞拣选系统。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:药物治疗细胞(他莫西芬:n = 295)和未处理细胞(不含他莫西芬:n = 115)的平均光谱。拉曼峰可以从文献中辨认出来。大多数强光谱差异具有统计显著性(ANOVA,p = 0.5),如前4所述。此图已由以前的出版物4中修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:从预测 PLS 模型中提取的 VIP 分数。VIP 分数反映了有助于区分模型中两个类别的波长。大多数峰对应于特定分子,这些分子被观察为药物对药物治疗细胞作用的光谱生物标志物。此图已由以前的出版物4中修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:他莫西芬丰度及其代谢物的分布。与未处理细胞的内源性峰(对照)相比,他莫西芬丰度及其代谢物的分布,4-OHT(在单细胞水平上测量)。此图已由以前的出版物4中修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

在这份手稿中,选择了一个简单的案例,其中 HepG2 细胞暴露于他莫西芬中(或不接触)。拉曼光谱和质谱系统的能力被证明监测他莫西芬对细胞的影响。拉曼光谱可以识别潜在的生物标志物,反映单个细胞对药物暴露的一般反应。观察到单细胞之间的一些异质性,这表明一些细胞对药物暴露没有反应。另一方面,LSC-MS能够在单细胞水平上对药物及其代谢物进行有针对性的分析,在单细胞水平上观察到药物的异质性程度及其代谢物丰度。这种异质性有助于解释为什么一些细胞受药物影响,而其他细胞似乎不受影响,尽管细胞来自所谓的统一种群12。

在需要注意的这种技术的特定方面中,评估显微镜设置和信号处理的质量以确保数据的可重复性非常重要。如果仔细处理光谱,信号变化应在每个峰值的局部最大值处最大化。相比之下,光谱的基线和边缘应在被测的细胞条件之间重叠。另一个重要方面是用于研究治疗差异的多变量模型。必须仔细评估模型和模型参数,以确保精确和准确的分析。与神经网络不同,PLS 模型的一个优点是,它允许访问与每个波长(拉曼偏移)相关的权重,从而最好地区分模型测试的条件。

尽管拉曼光谱成功地区分了药物反应,但应该强调的是,这种技术在提供生物解释方面是有限的。这主要是由于光谱信号的复杂性,包括数千个分子的混合物。因此,需要进一步的调查,以评估拉曼光谱强度和药物浓度变化之间的系统变化。此外,还需要对其他细胞系进行类似的研究,以评估与他莫西芬相关的光谱生物标志物的普遍性。

此外,进行活组织测量以评估药效学和研究药物如何渗透和流动在每个细胞内可能有兴趣。此外,还应注意的是,LSC-MS 中的采样步骤高度依赖于操作员的技能。空间分辨率、采样后毛细管内的单元位置和吞吐量强度等参数完全依赖于操作员,这限制了 LSC-MS 的大规模采用。虽然,自动采样系统可以缓解这个问题。此外,虽然LSC-MS擅长对原生状态的附着细胞或浮动细胞进行采样,但在嵌入组织部分的采样细胞中表现较差。这是因为采样毛细管尖端在样品密度高时有断裂的倾向。因此,另一种方法,例如单探针,可能更适合于这种情况14,15。

由于此处使用的电池在环境条件下采样,样品制备最少,LSC-MS 可轻松与其他技术集成,如该协议中与 Raman 的集成所示。另一种与3D全息的类似集成已经允许在亚细胞级16实现细胞代谢物的绝对定量。此外,与流细胞学的整合使得神经母细胞癌患者17、18的单循环肿瘤细胞中代谢生物标志物的发现得以发现。

将来,由于最近人们越来越关注合并来自成像模式19的数据集,因此,使用综合计算方法研究拉曼信号和质谱结果(以及其他组学方法)之间的系统变化可能也值得关注。有趣的是,我们已经发现,在MS4所识别的单细胞水平上,由VIP分数识别的拉曼峰的强度与塔莫西芬或其代谢物的丰度之间存在几个弱但显著的线性相关性。这些数据可能表明MS型材和拉曼光谱之间的代谢关系,以及预测这些值的可能性。

Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢Toshio Yanagida的支持和ARno Germond博士的RIKEN内部合作基金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% penicillin-streptomycin Nacalai Tesque 09367-34
35mm glass bottom grid dish Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 94873
532 nm diode pumped solid-state laser Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries HUMANIX
d5-Tamoxifen standard Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade Nacalai Tesque D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium Sigma-Aldrich D5796
Eppendorf GELoader tips Eppendorf
fetal bovine serum Hyclone laboratories SH3006603
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade Sigma-Aldrich 33015
HepG2 cell line (RCB1886) RIKEN cell bank center RCB1886
MC0-19A1C Incubator Sanyo Electric Co. MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade Sigma-Aldrich 1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator Narshige MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor Thermo Fisher Scientific ES071
On-stage incubator ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution Thermo Fisher Scientific 88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 85256

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一个集成拉曼光谱和质谱平台,用于研究单细胞药物接受、代谢和效果
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Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).More

Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).

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