Summary
Detta protokoll presenterar en integrerad Raman spektroskopi-masspektrometri (MS) plattform som kan uppnå encells-upplösning. Raman spektroskopi kan användas för att studera cellulära svar på läkemedel, medan MS kan användas för riktad och kvantitativ analys av läkemedelsupptag och metabolism.
Abstract
Celler är kända för att vara till sin natur heterogena i sina svar på droger. Det är därför viktigt att en heterogenitet för enskilda celler redovisas i studier av läkemedels upptäckt. Detta kan uppnås genom att noggrant mäta den uppsjö av cellulära interaktioner mellan en cell och läkemedel på encelliga nivå (dvs, drog upptag, metabolism, och effekt). Denna uppsats beskriver en encellig Raman spektroskopi och masspektrometri (MS) plattform för att övervaka metaboliska förändringar av celler som svar på läkemedel. Med hjälp av denna plattform, metaboliska förändringar som svar på drogen kan mätas med Raman spektroskopi, medan drogen och dess metabolit kan kvantifieras med masspektrometri i samma cell. Resultaten tyder på att det är möjligt att få tillgång till information om läkemedelsupptag, metabolism och respons på en enda cellnivå.
Introduction
Celler reagerar olika på förändringar i deras mikromiljö på Single-cellnivå, ett fenomen som kallas cellulära heterogenitet1. Trots detta, nuvarande Drug discovery studier bygger på genomsnittliga mätningar av cellpopulationer, som fördunkla information om potentiella subpopulationer samt Single-cell variationer2. Denna saknade information kan förklara varför vissa celler är mer mottagliga för droger medan andra är resistenta. Intressant, bristen på Single-cellinformation om läkemedelssvar är en möjlig orsak till misslyckandet av fas II kliniska prövningar av läkemedel3. Därför, för att lösa detta problem, cellulära interaktioner med drogen (dvs, upptag, metabolism, och respons) måste mätas på encelliga nivå.
För att uppnå detta har vi utformat ett unikt system där levande singelceller screenas med hjälp av etikettfri Raman-spektroskopi och därefter karaktäriseras med masspektrometri4. Raman spektroskopi ger ett molekylärt fingeravtryck av det cellulära tillståndet, ett komplext spektrum som följer av bidragen från många molekyler inuti cellen. Trots denna komplexitet, kan det anses att Raman fingeravtryck återspeglar en hel cells struktur och metabolism5,6. Raman spektroskopi utmärker sig vid mätning av cellulära tillstånd i en noninvasiv och relativt hög genomströmning sätt, vilket gör det användbart för screening och bedömning av läkemedelssvar på Single-cellnivå.
Däremot ger medlemsstaterna erforderlig känslighet och selektivitet för att mäta upptaget av läkemedel på encellig nivå. Eftersom MS är destruktivt (provet [cell] vanligtvis förbrukas under analys), integrera det med icke-förstörande, etikettfri Raman spektroskopi kan ge en hög genomströmning och känsligt system. Denna kombinerade plattform kan ge mer information om läkemedelsupptag, metabolism och effekter på encellig nivå.
Detta manuskript belyser ett protokoll som används för att studera cellulära interaktioner med läkemedel på encellig nivå med hjälp av in vitro-kulturer med hjälp av en integrerad Raman-MS-plattform. För att göra detta, hepatocellulära carcinom celler (HepG2) och tamoxifen används som modell. HepG2 celler valdes eftersom de tar upp tamoxifen och metabolisera drogen, och de påverkas samtidigt på grund av dess hepatotoxiska effekter. Två stater används i detta manuskript: läkemedelbehandlade celler kontra icke-behandlade celler (kontroll).
Protocol
1. cell odling
- Kultur celler av intresserar i en anslå kulturmassmedia. Penicillin-streptomycin kan tillsättas för att undvika kontaminering. När det gäller HepG2 celler, kultur celler i en kultur media som innehåller Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) och 0,1% penicillin-streptomycin. För att faciltate Raman spektroskopi mätningar, celler kan odlas på en 0,1% gelatin-belagda glasbotten skålen eller kvarts diabilder.
- Inkubera cellerna i 2 dagar vid 37 ° c och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Synkronisera cellkulturer för att nå 70% confluency.
- Subkultur celler i en 35 mm glasbotten rutnät skålen eller kvarts diabilder med samma medium vid en sådd densitet 0,7 x 106, sedan inkubera vid 37 ° c för 24 h.
Obs: kultur rätter eller diabilder kan pre-belagda med kollagen eller gelatin beläggning lösning med en kultur yta förhållandet 5 UG/cm2 för att de ska kunna fastställa, säkerställa deras överlevnad under mätningen.
2. läkemedelsbehandling
- Ta bort cellkulturer från inkubatorn och tvätta 2x med förvärmda PBS-buffert (37 ° c).
Anmärkning: det är optimalt att ta bort celler för läkemedelsbehandling vid en sammanlänkning på 50%-60%. - Dela upp celler i läkemedelbehandlade och obehandlade undergrupper i 35 mm kultur rätter.
- Blanda drogen av primat med kulturmassmedia. Till exempel, lös tamoxifen i dimetylsulfoxid (DMSO) och blanda med odlingsmediet för att få en slutlig volym på 2 mL och tamoxifen koncentration av 10 μM. Detta kommer att vara den läkemedelsbehandlade gruppen.
- Blanda en motsvarande volym spädningsvätska (DMSO) i mediet som en kontroll för att studera effekterna av DMSO. Detta kommer att vara kontrollgruppen.
- Inkubera båda grupperna i 2 mL av spetsiga medier beredda i steg 2.3-2.4 för 24 h. Den förväntade sammanlänkning efter inkubering bör vara 70%-80%.
3. Raman spektralavbildning och spektralbearbetning
Även om Raman-spektroskopiska system finns kommersiellt tillgängliga är Raman-spektroskopinssystemet som används här ett hem-byggt linje scanning-konfokalmikroskop som tidigare beskrivits som7,8. Kortfattat, detta system är utrustad med en 532 nm diod pumpas Solid-State laser. Laserljuset formas till ett plan med hjälp av en cylindrisk lins, som möjliggör mätning av 400 spektra i en enda exponering. Raman spectra spelades in med en kyld CCD-kamera monterad på en polykromator som använder en 1 200 spår/mm galler för att maximera den spektrala upplösningen av fingeravtrycks området (från 500-1800 cm-1). Detta spektralområde innehåller en hög densitet av frekvenser som är specifika för molekyler som genererar Raman spridning. En vatten-immersionobjective lins (NA = 0,95) används också. Den rumsliga upplösningen av detta system är ~ 300 nm och den spektrala upplösningen är 1 cm-1. För att säkerställa cellernas överlevnad under experimentet används en mikrokammare som fixeras på ett motoriserat Mikroskop Stadium.
- Innan spektrala mätningar, kontrollera anpassningen av optiken. En 50 μm hål kan användas för att kontrollera att hål och laser position matchar exakt. Ange spektrofotometerskåran när den är smalare så mycket som möjligt.
- Använd etanol för att kalibrera spektrofotometern före varje experiment. För att göra det, placera EtOH i en glasbotten skålen, mäta spektrumet vid en viss laser intensitet (mätt på prov) för 1 s, och associera toppen till kända våglängder7.
- Minimera laserintensiteten vid provet till ~ 2,4 mW/μm2 så att cellerna överlever laser exponeringen.
- Ställ in mikrokammaren vid 5% CO2 och 37 ° c.
- När mikroskopet systemet är klart, ta bort celler från inkubatorn och skölj omedelbart celler 2x med värmde PBS (37 ° c) buffert, tillsätt sedan 2 mL värmda PBS (37 ° c) eller DMEM att Omsuspendera cellerna.
ANMÄRKNINGAR: både PBS och Fluorobrit DMEM-baserade medier är tillräckliga alternativ för Raman spektroskopi mätningar eftersom de ger en minimal bakgrunds signal. - Tillsätt 10 μL vatten på mål linsen för vatten nedsänkning och placera försiktigt glasbotten cellens rätt på mikroskopets scen.
- Mät varje cell genom att fokusera laserlinjen. En 15 s exponeringstid per cell är tillräckligt här för att få ett tvärsnitt av en cell med en tydlig Raman signal. En Galvano spegel tillåter skanning av en cell eller en grupp av celler inom flera dussin minuter.
ANMÄRKNINGAR: högre upplösning av fullständig spektralavbildning av celler kräver mer tid och kan leda till foto skador. Här mättes celler med en enda rad exponering för att få ett tvärsnitt av varje cell. Detta tillvägagångssätt är en bra avvägningen för att öka genomströmningen och få tillräcklig information för att diskriminera celler, samtidigt som man säkerställer cellernas lönsamhet genom att begränsa photodamage.
4. förbehandling av spektrala data och multivariat analyser
Anmärkning: förbehandling är ett nödvändigt steg före ytterligare analys för att ta bort oönskade tekniska variationer inom spektraldata. På grund av mångfalden av metoder och programvara, en uttömmande lista kan inte tillhandahållas, och det finns många hjälpsamma recensioner finns i litteraturen7,8. I det här avsnittet beskriver vi kortfattat den metod som används för att analysera och tolka spektrala Raman-data som erhållits från levande enskilda celler.
- Extrahera och förbehandla Raman bilder för att ta bort eventuella kosmisk strålning störningar.
Notera: Spektralaxel av spektra som erhålls under olika dagar/veckor/månader kan innefatta vissa variationer på grund av små tekniska variationer vid kalibrering med etanol. Detta kommer att starkt påverka efterföljande multivariat analyser och statistiska jämförelser. I de fall experiment utförs under olika veckor/månader, förväntas små optiska variationer. I det här fallet måste data interpoleras för att korrigera för eventuella spektralförskjutningar av data över experiment. Interpolation med cubic spline används här. Efter det här steget ska alla Spectra-axlar justeras. En räckvidd på 500-1800 cm-1 anses för efterföljande analys. - Extrahera spektrala data av celler och bakgrund (frånvaro av celler) från varje bild med hjälp av en hemlagad algoritm. Subtrahera bakgrunds signalen från cellens signal. Sedan genomsnittliga spektra av de återstående pixlarna, som bör motsvara en enda cell. Följande steg utförs med 2D-spektra av celler.
- Utför en baslinjekorrigering med ModPoly9 eller någon annan algoritm som det uppskattas att passa tillräckligt. Trimma spektralområdet till 600-1700 cm-1 för att välja fingeravtrycks området och se till att det inte finns några oönskade kanteffekter på spektrat på grund av dålig polynom montering.
- Utför ett normaliserings steg såsom vektor normalisering (intensitet vid varje Vågtal divideras med den globala L2-normen eller det högsta singulära värdet av ett spektrum) för att normalisera spektralintensiteten10, även om andra normaliseringar kan övervägas.
- Förbered en datauppsättning med lämplig etikett för varje klass/villkor.
Anm.: jämförande spektrala analyser kan användas för att undersöka arten av möjliga skillnader mellan cell klass/villkor (t. ex. genom att subtrahera kontrollgruppens genomsnittliga spektrum till andra grupper för att identifiera intresse regioner [såsom potentiella biomarkörer]). ANOVA-och Fisher-poängberäkningar kan också utföras10. - För att identifiera behandlade och obehandlade celler baserade på spektrala egenskaper kan multivariat analyser appliceras. En normaliserad spektraldata ska användas som träningsdata uppsättning och en okänd datauppsättning (utan etikett) från ett replikerat experiment ska användas som testdata om det är möjligt.
Anmärkning: diskriminantanalys utförs på vissa vektor av en huvudkomponent analys (PCA-DA10), projektion på latent Poäng följt av DISKRIMINANTANALYS (pls-da), och stöd Vector maskiner (SVM)11 är modeller som ofta används i fältet, och varje presenterar olika statistiska överväganden. Förbehandling av data bör därför utföras. - Använd maskininlärning som passar de experimentella målen. Här är en projektion på latent struktur (PLS) modell byggd med hjälp av spektrala fingeravtryck regionen Raman spectra (600-1710 cm-1)11,12. Mean-centrera data efter behov. För korsvalidering av modellen kan olika tekniker tillämpas.
Observera: här tillämpas en persienner med korsvalidering med 10 delningar. Modellens komplexitet (antal komponenter eller latent variabel) ska testas så att den bästa modellen minimerar värdet för rot medelvärdet för kvadratfel (RMSE). Det konstaterades att tre latent vektorer (LVs) gav den bästa diskrimineringen med vår DataSet. - Identifiera vilka Raman spektraltoppar bidrar till diskriminering av cellerna (t. ex. genom att plotta poängen av varierande betydelse i projektion [VIP] för varje Raman Vågtal eller omfattningen av regressionskoefficienten).
ANMÄRKNINGAR: VIP-poängen för en variabel beräknas som en viktad summa av de kvadrerade korrelationerna mellan PLS-DA-komponenterna och den ursprungliga variabeln. Information om pls och VIP-poäng algoritm finns i litteraturen11,12.
5. uppsättning och procedurer för provtagning i en cell
- Fixera cell provtagningssystemet på Raman-mikroskopet som visas i figur 1. Anslut 3D micromanipulator till den kapillärhållare i glas som är ansluten till en tom spruta för prov sugning genom att använda ett negativt tryck (figur 1).
- Ställ in mikroskopet till en hög förstoring fält (40x) att observera spetsen av glaset kapillär och se till att det inte bryts. Kontrollera placeringen av glaset kapillär med hjälp av micromanipulator (x-, y-, z-axlar). Se till att kapillärspetsen är centrerad i synfältet, flytta sedan kapillär upp på z-axeln för att ge utrymme för kultur skålen senare.
Anmärkning: Mikroprovtagning av cellerna utförs av glas kapillär för celler med diametrar mellan 10-15 μm. En kapillär med en borr storlek på ~ 5 μm rekommenderas. Om borrstorleken är för liten, kommer kapillärspetsen att anslutas av cellen, och om den är för stor kan känsligheten för senare MS-mätningar äventyras. - Placera prov plattan/skålen på mikroskopets scen, justera förstoringen och fokusera, Välj målcellen på rutnäts skålen och flytta den till mitten av vyn. Sedan försiktigt sänka ner glaset kapillär med micromanipulator (z-axeln) tills spetsen kommer i fokus.
Obs: se till att inte flytta kapillär i x-och y-axlarna tills kapillär är i fokus. - Under mikroskopisk observation, tryck på målet enda cellen med kapillär spetsen, sedan börja tillämpa negativt tryck med hjälp av sprutan för att fälla cellen inuti kapillärspetsen. Spela in den här proceduren genom att ta ett foto eller en video för att kontrollera tidpunkten och sög placeringen av cellen exakt, om det behövs.
- Flytta kapillär upp på z-axeln. Ta sedan loss kapillärfästet från kapillärhållaren med hjälp av pinmett som förberedelse för MS-analys.
6. mätningar av masspektrometri
- Kalibrera MS-instrumentets Mass noggrannhet enligt tillverkarens rekommendationer. Kontrollera att Mass felet inte överstiger 3 ppm efter kalibreringen.
- Optimera MS-instrumentet till parametrar som är bäst lämpade för analyten av intresse.
Anmärkning: i fråga om tamoxifen och 4-OHT-analys är instrumentets parametrar inställda på följande: inlopps kapillärtemperatur: 400 ° c, sprayspänning: 1500 V, automatiskt förstärkningskontroll mål (AGC): 5,00 E + 06, S-lins RF-nivå: 90%, SIM-intervall: 347-397 m/z, SIM maximal insprutningstid: 200 MS SIM upplösning: 140 000 FWHM, MS/MS intervall: 50-400 m/z, MS/MS AGC Target: 2.00 E + 05, MS/MS maximal injektion tid: 100 MS, MS/MS upplösning: 17 500 FWHM, MS/MS isolering fönster: 1 m/z, MS/MS normaliserade kollision energi (NCE): 35. - Ställ in en automatisk förvärvsmetod med en varaktighet på 5 min för SIM-läge för att uppnå relativ kvantifiering, och en annan MS/MS-metod för positiv identifiering av läkemedlet och dess metabolit. Parametrarna för Anskaffningsmetoden bör ställas in på de optimerade värden som nämns i steg 6,2.
- Bered joniseringsvätskan under ett draghuv. Lösningsmedels sammansättningen beror på analyten av intresse. Här, den organiska lösningsmedel som används består av 80% MeOH, 10% DMSO, och 0,1% myrsyra.
- Blanda en lämplig intern standard med det organiska lösningsmedlet före mätningarna. I detta experiment används 5,31 nM D5-tamoxifen som en intern standard.
- För att undvika falska positiva, aspirera medierna som omger de celler som behandlats med drogen med hjälp av en 1 μm Bore-Storlek kapillär med konstant mikroskopisk observation för att undvika provtagning några cellulära delar.
- Tillsätt 2 μL av joniseringsvätskan till den breda änden av kapillär som innehåller mediet med hjälp av en pipett fäst i lastare tips. Sedan analysera urvalet media av MS, kontrollera förekomsten av analyten av intresse (normalt, det bör inte upptäckas).
- Tillsätt 2 μL joniseringsvätskan till kapillär som innehåller cellen, fixera kapillär till en nanoelektrosprayadapter (nano-ESI) ansluten till en lämplig masspektrometer, och starta den automatiska förvärvsmetoden.
7. masspektrometri databehandling och analys
Anmärkning: alla lämpliga program kan användas för att utföra dataanalys. Men om forskare vill utföra dataanalys med hjälp av en programvara som inte tillhandahålls av MS-leverantören, då rådata ska konverteras från proprietär leverantör format till ett öppet format eller som en textfil först (som gjordes här).
- Normalisera data genom att dividera den högsta arean av intresse (er) av den interna standarden från samma MS Scan. Logga sedan omvandla Peak nyckeltal för att minska skewness.
- Rita den normaliserade intensiteten av drogen eller dess metabolit som en boxplot eller densitet kurva för att visualisera distribution över enskilda celler. Här används R statistisk programvara, tillsammans med ggplot2 paketet.
- Beräkna den metaboliserade drogen till ometaboliserat drog förhållande genom att dividera överflödet av drogen metaboliten av den av den ometaboliserat förälder molekylen i varje cell (dvs., 4-oht och tamoxifen, respektive.
Anmärkning: sambandet mellan variationer av specifika Raman toppar av intresse och variationer i MS toppar av drogen eller dess metaboliter kan studeras. Detta är ett tillägg till det möjliga sambandet mellan drogen själv och dess metabolit i enskilda celler. Detta kan göras genom att beräkna Pearsons korrelationskoefficient med hjälp av ett tvåsidiga test. Mer avancerade integrerande metoder bör också övervägas.
Representative Results
Single-cell analys av läkemedelsinteraktioner (upptag, metabolism, och effekter) är viktigt att avslöja någon dold eller läkemedelsresistent subpopulation samt förstå effekterna av cellulära heterogenitet. I detta protokoll användes två kompletterande tekniker för att mäta de ovannämnda interaktionerna i enstaka celler: Raman-spektroskopi och MS. Raman-spektrometri identifierar snabbt celler som påverkas av läkemedel baserade på spektrala biomarkörer för läkemedelsresponsen. MS används för att övervaka upptaget och metabolismen av läkemedlet på ett selektivt och semikvantitativt sätt. Celler först screenades av Raman spektroskopi sedan individuellt samplas för analys av MS.
En jämförande analys av det genomsnittliga spektrat av varje tillstånd (med och utan läkemedelsbehandling) visas i figur 2. Det genomsnittliga spektrumet av de två förhållandena skiljer sig tydligt åt vid olika toppar, som tidigare identifierades och tilldelades molekylära föreningar2. I synnerhet, topparna på 1000 cm- (tilldelas aromatiska föreningar såsom fenylalanin och tyrosin) visar starka skillnader. Betydelsen av den statistiska skillnaden bör bedömas genom ytterligare multivariat analyser.
Datauppsättningen användes sedan för att utbilda en PLS-modell (steg 4.5-4.8) syftade till att skilja de två cell behandlingar (med läkemedel: n = 290, utan läkemedel: n = 115). Den prediktiva förmågan att klassificera cellerna odlade i närvaro av tamoxifen nådde 100% känslighet och 72% specificitet i testdata (okänt från den kors validerade tränade modellen). Känslighet är ett mått på de sanna positiva identifieringar som är korrekt identifierade av modellen, medan specificitet är ett mått på de faktiska negativa som identifieras av modellen. Alternativa modeller som SVMs, LDAs, och neurala nätverk kan ge liknande eller bättre resultat, även om en omfattande jämförelse inte har utförts i denna studie.
Baserat på PLS-modellen beräknades VIP-poängen, som representerar betydelsen av våglängder (Raman-skiften) för att diskriminera försöks förhållandena (figur 3). Viktigare, de högsta topparna av VIP-profilerna motsvarade Raman toppar för vilka starka skillnader sågs mellan de två behandlingarna. Detta bekräftade de specifika molekylära skillnaderna mellan behandlade och obehandlade celler. Följaktligen kan forskarna identifiera möjliga spektrala biomarkörer som återspeglar svaret från enskilda celler till läkemedelsbehandling. Dessa biomarkörer kan testas ytterligare för att kontrollera deras biologiska relevans och generalisering över olika förhållanden och cellinjer.
En levande Single-cell masspektrometri (LSC-MS) systemet kunde upptäcka både drogen och dess metaboliter i enstaka, läkemedelsbehandlade HepG2 celler som tidigare mättes av Raman spektroskopi. Dessutom kan tandem MS användas för att bekräfta strukturen hos båda molekylerna. Efter positiv identifiering, den relativa överflöd av drogen och dess metaboliter mättes i varje cell och jämfört med bakgrund toppar i obehandlade celler. Stark variation observerades i tamoxifen överflöd, och detta fenomen var ännu mer uttalad i fråga om dess metabolit, 4-OHT (figur 4). Förhållandet mellan tamoxifen överflöd och dess metaboliter studerades också, där en signifikant positiv korrelation konstaterades mellan de två (r = 0,54, p = 0,0001, n = 31).
Figur 1: cell plock system monterat på ett Mikroskop Stadium. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Genomsnittligt spektrum av de läkemedelsbehandlade cellerna (med tamoxifen: n = 295) och obehandlade celler (utan tamoxifen: n = 115). Raman Peaks kan identifieras från litteraturen. De flesta av de starka spektralskillnaderna är statistiskt signifikanta (ANOVA, p ≤ 0,5) som beskrivits tidigare4. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: VIP-poäng som extraheras från den prediktiva pls-modellen. VIP-poäng återspeglar våglängder som bidrar till att skilja mellan de två klasserna i modellen. De flesta av topparna motsvarar specifika molekyler som observeras som spektrala biomarkörer för läkemedels effekter på läkemedelsbehandlade celler. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: distribution av tamoxifen-överflöd och dess metabolit. Distribution av tamoxifen överflöd och dess metabolit, 4-OHT (mätt på encellig nivå) jämfört med endogena toppar i de obehandlade cellerna (kontroll). Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I detta manuskript valdes ett enkelt fall där HepG2 celler exponerades (eller inte) till tamoxifen. Förmågan hos en Raman spektroskopi och masspektrometri system demonstreras för att övervaka effekterna av tamoxifen på celler. Raman spektroskopi tillät identifiering av potentiella biomarkörer som reflekterade en generell respons från enstaka celler till läkemedelsexponering. Vissa heterogenitet mellan enskilda celler observerades, vilket tyder på att vissa celler inte svarade på läkemedelsexponering. Å andra sidan, LSC-MS var kapabel att utföra en riktad analys av läkemedlet och dess metabolit på Single-cellnivå, där en hög grad av heterogenitet observerades i drogen och dess metabolit överflöd. Denna heterogenitet hjälper till att förklara varför vissa celler påverkas av drogen medan andra är till synes inte, trots de celler som härrör från en förment enhetlig befolkning12.
Bland särskilda aspekter av denna teknik som kräver uppmärksamhet, är det viktigt att utvärdera kvaliteten på mikroskopet set-up och signalbehandling för att säkerställa reproducerbarhet av data. Om förbehandling av spektra görs noggrant, bör signalen variationer maximeras på den lokala maximum av varje topp. I motsats till detta bör spektrat och kantens utgångsvärde överlappa varandra mellan de testade cell förhållandena. En annan viktig aspekt är multivariat-modellen som används för att undersöka skillnader mellan behandlingarna. Man måste noggrant utvärdera modellerna och modell parametrarna för att säkerställa en exakt och noggrann analys. En fördel med PLS-modellen, till skillnad från neurala nätverk, är att det ger tillgång till vikter som förknippas med varje våglängd (Raman skift) som bäst skiljer de villkor som testas av modellen.
Trots Raman spektroskopi framgångsrikt diskriminera drogen svar, bör det betonas att denna teknik är begränsad i dess användning för att ge biologisk tolkning. Detta beror främst på komplexiteten i spektralsignalen, som omfattar en blandning av tusentals molekyler. Därför krävs ytterligare utredning för att utvärdera systematiska variationer mellan Ramanspektralintensitet och variationer i läkemedelskoncentrationer. Också, liknande studier av andra cellinjer krävs för att utvärdera generaliseringen av spektralbiomarkers i samband med tamoxifen.
Vidare, det kan vara av intresse att utföra levande vävnader mätningar för att bedöma farmakodynamik och studera hur läkemedel tränger in och flödar inom varje cell. Det bör dessutom noteras att provtagnings steget i LSC-MS är mycket beroende av operatörens skicklighet. Parametrar såsom rumslig upplösning, cell position inuti kapillär efter provtagning, och genomströmning styrka är helt operatörsberoende, vilket begränsar storskaliga antagande av LSC-MS. Även om automatiserade provtagningssystem kan lindra problemet. Dessutom, medan LSC-MS utmärker sig vid provtagning anhängare eller flytande celler i sina inhemska stater, det presterar mer dåligt i provtagning celler inbäddade i Vävnadsdelar. Detta beror på provtagning kapillärspetsen tendens att bryta om provet densitet är hög. Därför kan en annan metod som Single-PROBE vara mer lämpade i sådana fall14,15.
Eftersom de celler som används här samplas i omgivningsförhållanden med minimal provberedning kan LSC-MS enkelt integreras med andra teknologier, vilket framgår av dess integrering med Raman i detta protokoll. En annan liknande integration med 3D holografi har tillåtit för att uppnå absolut kvantifiering av cellulära metaboliter på subcellulära nivå16. Dessutom, integration med flödescytometri har tillåtit för avtäckning av metabola biomarkörer i enstaka cirkulerande tumörceller av neuroblastom cancerpatienter17,18.
I framtiden, på grund av det senaste ökande intresset för att kombinera datauppsättningar från Imaging modaliteter19, det kan också vara av intresse att studera de systematiska variationer mellan Raman signaler och masspektrometri resultat (liksom andra omics metoder) med hjälp av integrativa beräkningsmetoder. Intressant nog har vi redan hittat flera svaga men betydande linjära korrelationer mellan de intensiteter av Raman toppar identifierats av VIP-poäng och överflödet av tamoxifen eller dess metabolit på encellig nivå som identifierats av MS4. Dessa data kan tyda på en metabolisk relation mellan MS Profiles och Raman spectra och möjligheten att förutsäga dessa värden.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Toshio Yanagida för hans stöd och RIKEN interna samarbets fonder tillskrivs Dr Arno germond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| 35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
| 4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
| 532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
| BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
| CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
| d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
| fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
| Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
| HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
| MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
| Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
| MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
| NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
| Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
| On-stage incubator | ibidi | ||
| Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
| PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
| Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
| Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |
References
- Altschuler, S. J., et al. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Ali, A., et al. Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. , (2019).
- Bunnage, M., et al. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Ali, A., et al. Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (4), 2710-2718 (2019).
- Wu, H., et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3809-3814 (2011).
- Okada, M., et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 28-32 (2012).
- Palonpon, A. F., et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. Nature Protocols. 8 (4), 677-692 (2013).
- Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols. 11 (4), 664-687 (2016).
- Mark, H., Workman, J. Jr Chemomtrics in Spectroscopy. , Second Edition, Academic Press. (2018).
- Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
- Germond, A., et al. Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli. Communications Biology. 1, 85 (2018).
- Wold, S., et al. Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry. Encyclopedia of Computational Chemistry. , (2002).
- Chong, I. G., Jun, C. H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).
- Inde, Z., Dixon, S. J. The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1), 99-114 (2018).
- Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Analytical chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Rao, W., et al. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).
- Ali, A., et al. Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (2), 125-127 (2016).
- Abouleila, Y., et al. Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells. Cancer Science. 110, 697-706 (2018).
- Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31 (12), 1215-1217 (2015).
- Ryabchykov, O., et al. Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples. Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).
