Summary
Presentert her er en protokoll for ikke-invasiv mesenchymal Stem Cell (MSC) levering og sporing i en mus modell av traumatisk hjerneskade. Superparamagnetic jernoksid nanopartikler anvendes som en MRI-sonde (magnetisk resonans imaging) for MSC-merking og ikke-invasiv in vivo-sporing etter intranasal levering med sann tids MRI.
Abstract
Stem Cell-baserte terapier for hjerne skader, slik som traumatisk hjerneskade (TBI), er en lovende tilnærming for kliniske studier. Men tekniske hekk som invasiv celle levering og sporing med lav transplantasjon effektivitet fortsatt utfordringer i translational Stem-basert terapi. Denne artikkelen beskriver en ny teknikk for stilk cellen merking og sporing basert på merking av Mesenchymal stamceller (MSCs) med superparamagnetic jernoksid (SPIO) nanopartikler, samt intranasal levering av merket MSCs. Disse nanopartikler er fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded og trygt å merke MSCs, som senere leveres til hjernen av TBI-indusert mus av intranasal ruten. De spores deretter ikke-invasivt in vivo av magnetisk resonans (MRI) i sanntid. Viktige fordeler med denne teknikken som kombinerer SPIO for cellemerking og intranasal levering inkluderer (1) ikke-invasiv, in vivo MSC-sporing etter levering for lange oppfølgingsperioder, (2) muligheten for flere doseringsregimer på grunn av de ikke-invasive veien for MSC levering, og (3) mulige søknader til mennesker, på grunn av sikkerheten til SPIO, ikke-invasiv karakter av cellen-sporing metoden ved MRI, og administrasjonsvei.
Introduction
Mesenchymal stamceller (MSC) er attraktive kandidater for stilk cellen-basert terapi i behandlinger av sentralnervesystemet (CNS) lidelser og skader hos mennesker. Videre har MSCs blitt brukt som et redskap for levering av terapeutiske proteiner ved skadeområder1,2. I de senere årene har lovende innovasjoner er utviklet for å etablere 1) romanen ruter av celle levering og 2) celle sporing for stilk cellen-basert behandling av CNS lidelser. Den intranasal levering av stamceller inn i hjernen avhenger av evnen til celler til å omgå cribriform plate og angi olfactory pære delvis via en parenkymatøs rute3. Kombinasjonen av intranasal levering og merking av MSCs med superparamagnetic jernoksid (SPIO) nanopartikler representerer en lovende tilnærming for kliniske anvendelser av MSCs i behandling av CNS lidelser, siden SPIO nanopartikler er trygge sonder for magnetisk resonans imaging (MRI) og tillate ikke-invasiv følsom langsgående sporing av MSCs etter levering av MRI3,4,5. Videre er intranasal levering en trygg og ikke-invasiv rute som tillater gjentatt administrering i løpet av en kort tidsperiode.
Denne artikkelen beskriver en svært følsom og ikke-invasiv teknikk for å spore MSCs in vivo post-intranasal levering i en musemodell av traumatisk hjerneskade (TBI), som sysselsetter SPIO-merket celler og MRI. En viktig fordel med SPIO merking er sensitiv påvisning av SPIO i vev av MRI, som gjør det mulig å spore celler effektivt og ikke-invasivt. Den SPIO nanopartikler brukes her er kommersielt tilgjengelig og merket med en fluorescein isothiocyanate (FITC) fluoroforen, som gjør det mulig for påvisning av SPIO i vev uten immunostaining eller ytterligere behandling. Videre er det mulig å utføre langsgående sanntids sporing og undersøke biodistribusjon av leverte MSCs.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr i denne protokollen ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee, med godkjennelse av etikk komité for dyr bruk i Taipei Medical University (godkjenning nei. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. merking av MSCs med SPIO nanopartikler
- For å merke MSCs med SPIO, tilsett 6 mL merkings medier (25 μg/mL av SPIO i Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium [DMEM] uten fosterets storfe serum [FBS]) til en T75 kolbe som inneholder MSCs (80% confluency).
-
Ruge cellene med merkings mediene i en CO2 inkubator (37 ° c, 5% co2) uten risting. Etter 24 h, forsiktig fjerne merkingen Media ved hjelp av en steril Pasteur pipette med en plast spissen festet til et vakuum. Vask cellene monolag 2x med 6 mL fosfat bufret saltvann (PBS) for å fjerne eventuelle spor av uninternalized SPIO.
- For å finne ut om cellene er merket med en vellykket etikett, Sjekk de merkede cellene under et fluorescerende mikroskop eller konfokalmikroskopi mikroskop hvis SPIO er merket med en fluoroforen (dvs. som de som brukes her; Figur 1B, C). Du kan også utføre prøyssiske blå farging for cellene (se trinn 6.2 – 6.4 for farge protokollen).
- Høste tilhenger celler ved behandling med 3 mL Trypsin og ruge ved 37 ° c. Etter 5 min av inkubasjons, tilsett 7 mL av pre-varmet DMEM medium med 10% FBS (v/v) å deaktivere Trypsin. Samle celle fjæringen ved hjelp av en pipette i et 15 mL konisk rør.
- Centrifugate celle fjæringen ved 300 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend celle PELLET i PBS. Telle levedyktige celler ved hjelp trypan blå farge og en hemocytometer.
Merk: Celle pellet av de merkede cellene vil vises som en mørk farge på grunn av jern lasting (figur 1d). Denne protokollen er relevant for MSC merking og MRI Imaging. Prosedyren for MSC merking6 har tidligere blitt optimalisert, og bare trinnene for å forberede merket MSCs å spore in vivo er inkludert her, siden in vivo sporing er fokus. Protokollen for dyrking og merking av andre celletyper bør optimaliseres av forskeren. - Juster celle konsentrasjonen ved hjelp av PBS til 150 000 celler (eller et tall som resulterer i et tilstrekkelig MRI-signal) i 18 μL av PBS (eller det totale volumet som skal brukes i intranasal leverings prosedyre).
Merk: Det ble lagt merke til at en celle konsentrasjon høyere enn 150 000 celler/18 μL av PBS fører til celle aggregering, noe som kan påvirke effektiviteten av intranasal levering. Hvis et høyere antall celler er nødvendig for intranasal levering, øke det totale volumet av celle suspensjon og øke antall intranasal administrasjoner, som intranasal administrasjon er en ikke-invasiv prosedyre, og flere dosering er mulig.
2. kontrollert kortikale Impact (CCI) skade
Merk: I denne protokollen, hann C57 BL/6 mus (7 – 8 uker gammel) ble holdt i en 12/12 h lys/mørk syklus med ad lib tilgang til mat og vann.
- For å forberede hver mus for CCI skade, administrere zolazepam (50 mg/kg) og xylazine (20 mg/kg) anesthetizing cocktail via intraperitoneal (IP) injeksjon (1 mL/kg). Sørg for at dybden av anestesi er tilstrekkelig med mangel på tå-klype respons. Alternativt kan du plassere musen i et kammer som leveres med 2% – 4% isoflurane for 60 s.
- Barbere pelsen av rygg flaten av skallen mellom ørene ved hjelp av en elektronisk hårklipper. Rengjør det barberte området flere ganger ved hjelp av en steril bomullsdott dynket i jod. Bruk en bomullsdott fuktet i 70% etanol for å rense av jod.
- Plasser anesthetized musen i stereotactic rammen og fest musen ved hjelp av øre linjer og nese barer. Lag en midsagittal snitt (ca 2,5 cm) i den barberte huden ved hjelp av sterile saks for å få tilgang til overflaten av skallen.
- Fjern vevet på benet ved hjelp av en bomullsdott for å avdekke skallen. Rengjør hodeskallen overflaten ved hjelp av en bomullsdott fuktet i en 3% H2O2 for 10 s, deretter Rengjør den med en tørr bomullsdott.
Merk: Hodeskallen sting og både bregma og lambda kan nå lett identifiseres. - Identifiser koordinatene til valg på hodeskallen overflaten for CCI skaden og tegne en sirkel (4 mm diameter) rundt koordinatene ved hjelp av en blyant eller riktig markør.
Merk: I denne protokollen, koordinatene på anteeroposterior (AP)-2,0 mm og mediolateral (ML) + 1,5 mm ble brukt for CCI induksjon. - Bruk en microdrill og rund Burr (0,5 mm diameter) for å tynne skallen på den markerte sirkelen. Unngå å påføre press mens du borer, da boring gjennom benet kan forårsake skade på hjerne parenchyma. Rengjør Ben støvet med en ren og tørr bomullsdott.
- Forsiktig fjerne benet klaff ved hjelp av sterile fine tang for å avdekke Dura mater mens du holder den intakt. Fjern musen fra stereotactic ammen som ble brukt til forberedelser før Skadebehandling, og plasser den i den stereotactic rammen på CCI-enheten.
- Stabilisere hodet av musa ved hjelp av øre barer og nese barer. Pass på at hodet på musen er Plant i rostral-caudal retning og Juster nese stolpene, om nødvendig.
- Følg instruksjonene på kontrollboksen for å null nedslaget spissen til den eksponerte kortikale overflaten. Pass på at nedslaget spissen er justert rett over de ønskede cortex-koordinatene som skal påvirkes ved hjelp av X-og Y-kontroll hjulene på undersiden av nedslaget.
- Angi eksperiment parameterne ved hjelp av kontrollboksen med en hastighet på 5 m/s, hold tiden for 250 MS, og skade dybden på 1 mm for å indusere mild skade i musen.
- Indusere skade ved å trykke på ' ' Impact ' ' knappen på kontrollboksen. Tørk eventuelle blødninger som oppstår ved hjelp av en steril bomullsdott.
- Fjern musen fra stereotactic rammen og Lukk snittet ved hjelp av silke kirurgiske sting. Ikke bruk metallklips for å lukke operasjonsstedet, siden musen vil bli utsatt for et magnetisk felt for MRI.
- Påfør aktuelle antibiotika (bacitracin Neomycin) til operasjonsstedet for å forebygge infeksjoner. Hold musen på varmeputen og overvåke den nøye under utvinning fase.
- Administrer ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) daglig i 3 dager etter operasjonen, med mindre ketoprofen administrasjon strider mot studie målene.
3. intranasal levering
- På 1 dag post-CCI induksjon, administrere zolazepam (50 mg/kg) og xylazine (20 mg/kg) anesthetizing cocktail via IP injeksjon. Sikre det musa er dype anesthetized av mangel på toe-hugge svaret.
-
Forbered musen for intranasal levering av MSCs ved Hyaluronidase behandling.
- Grab musa er scruff og slå på ryggen fast mens immobilizing skallen. Plasser tuppen av en pipette som inneholder Hyaluronidase i steril PBS (4 U/μL) nær baugen på musen i en vinkel på 45 °.
- Administrer 3 μL av Hyaluronidase suspensjon i hvert nesebor. Hold muse immobilisert og vendt oppover på en ren pad i 5 min. Gjenta Hyaluronidase behandling 4X (totalt 100 U Hyaluronidase suspensjon).
- Etter Hyaluronidase behandling, holde den behandlede musen på en ren pad vendt opp i 30 min.
- For å levere MSCs inn i hjernen, Hold musen fast, som beskrevet i trinn 3.2.1. Administrer 3 μL/nesebor av MSC fjæring med et intervall på 3 s. Hold holde musen i samme posisjon i 30 s til prøven dråper har helt forsvunnet.
Merk: Unngå dannelse av luftbobler under administrering. - Gjenta administrasjonen med en 2 min intervall opp til 3x.
Merk: Det totale antall celler som skal leveres er 150 000, slik at 18 μL av celle fjæringen kan leveres til en 3 μL dose for hvert nesebor, 3x hver. - Returner musen til buret sitt og overvåke den tett inntil den fullt ut gjenoppretter fra anestesi.
4. i vivo magnetisk resonans imaging
Merk: Histologiske farging av hjernevevet har tidligere blitt brukt til å bekrefte vellykket levering av stamceller etter intranasal administrasjon. Denne metoden kan imidlertid bare brukes som et endepunkt i en studie, ikke lengderetningen. Ved hjelp av MRI-sonder for å merke terapeutiske stamceller vil tillate for langsgående, ikke-invasiv, in vivo sporing av cellene ved hjelp av MRI. Viktigere, denne protokollen effektivt reduserer antall dyr som kreves. I denne protokollen ble Mr-skanning utført ved dag 1, 7 og 14 etter levering av MSCs.
- For å klargjøre musen for MRI-skanning, bedøve musen med isoflurane (5% isoflurane i 1 L/min av O2 for induksjon, 1,5% – 2% isoflurane for vedlikehold). Utfør en tå-klype for å sikre at musen når ønsket anestesi nivå.
- Plasser musen på bilde holde ren og sikre posisjonen ved hjelp av kraner eller andre egnede metoder. Flytt holderen til midten av Mr-spolen (7 T/40 cm magnet) og koble til overvåknings tilkoblingen.
- Hvis du vil anskaffe T2 *-vektet skanninger ved hjelp av en spin-Echo sekvens, angi repetisjon tid (TR) til 1500 MS og ekko tid (TE) til 2,8 MS.
- Bruk en 16 mm x 16 mm synsfelt (FOV), 128 x 128 oppkjøp matrise (MTX), og skive tykkelse på 0,75 x 0,8 mm2 med fire signal gjennomsnitt og en 90 ° flip vinkel (FA).
- Trekk muse holderen ut av Mr-spole senteret etter at du har fullført skanninger. Returner musen til buret sitt og overvåke den tett inntil den helt gjenoppretter fra anestesi.
-
For å spore og kvantifisere den merkede MSCs på T2 *-vektet bilder, bruk ITK-SNAP programvare (versjon 3.8.0)7.
- Overfør rådata for Mr-skanninger fra MRI-maskinens datamaskin til datamaskinen som brukes til analyse i et DICOM-format (digital bildebehandling og kommunikasjon i medisin).
- Kjør ITK-SNAP-programvaren og Last inn MRI-bildene ved å klikke på fil- knappen. Så, falle i staver opp på åpen hovedavdeling image inne menyen. Trykk på Åpne bilde knappen i visningsvinduet, og Finn og åpne MRI-bildene ved hjelp av Bla gjennom -knappen.
Merk: Visualiseringen av merkede celler i MRI-bilder vises som hypointense områder. Hvis bildekontrasten må justeres, velger du verktøy | Bilde kontrast. - Opprett Segmentations av hypointense områder og lesjon eller andre hjerne deler ved å velge Active Label i delen segmentering etiketter. Bruk forskjellige etikettfarger for ulike segmenter (hvis det er behov for segmentering av mer enn én del).
- Bruk polygon -verktøyet på hovedverktøylinjen for å tegne rundt de HYPOINTENSE områdene som representerer SPIO-merket MSCs. Velg godta, som ligger under MRI-bildet. De segmentert områdene vil vises som samme farge på den aktive etiketten som er tilordnet det bestemte segmentet. Gjenta dette segmentering trinnet for alle MRI-sektorer.
- Utvikle et 3D-kart over segmentert områder til å representere MSC-distribusjonen i hele hjernen ved å velge skalpell Tool nederst på 3D Toolbar, som ligger i Segmentering etiketter delen nederst på TheITK-snap verktøykasse. Deretter trykker du på godta nederst i det opprettede 3D-kartet.
- For å utføre en kvantitativ analyse (volum og intensitet bety) av segmentert hypointense områder som representerer merket celler, trykker du på Segmentering knappen i toppanelet og velg volum og statistikk.
5. fiksering av Mouse Brain og kryosnitt
-
For å fikse mus hjernen, Utfør transcardiac med 4% paraformaldehyde (PFA) etter siste Mr-skanning, som tidligere beskrevet8.
- Halshugge hodet og trekke ut hjernen8. Fest hjernen med 4% PFA i minst 48 h ved 4 ° c.
- Tørke hjernen ved å senke den inn i en 30% sukrose oppløsning ved 4 ° c til hjernen synker til bunnen av løsningen.
- Bygg inn hjernen i den optimale kutte temperaturen (OCT) løsning og fryse ved-20 ° c. § Hjernen med en kryostaten mikrotomen i skiver med 14 μm tykkelse og montere dem på lysbilder. Oppbevar delene lysbildene ved-20 ° c til videre bruk.
sjette prøyssiske blå farging
Merk: Prøyssiske blå farging er vanligvis brukes til å oppdage jerninnholdet i SPIO-merket celler. Her brukes prøyssiske blå farging til å bekrefte at hypointense signalene i MRI-bildene tilsvarer SPIO-merket MSCs og ikke gjenstander. Prøyssiske blå farging er en av de mest følsomme histochemical metoder som brukes til å oppdage jern i vev og kan brukes til å identifisere selv en enkelt granule av jern i cellene.
- Vask lysbildene i hjernen seksjoner med destillert vann i 5 min.
- Utfør prøyssiske blå flekker ved å senke lysbildene i 30 min i farge løsningen, som inneholder like deler saltsyre (10%) og kalium ferrocyanide (10%) tilberedt umiddelbart før bruk.
- Vask 3x med destillert vann, i 5 min hver. Counterstain seksjonene med kjernefysisk rask rødt i 5 min. skyll lysbildene 2x med destillert vann.
- Tørke delene gradvis ved å fordype lysbildene i 95% og 100% alkohol i 2 min hver. Legg til dekkglass med et resinous festemiddel.
- Bruk et lett mikroskop for å oppdage fargede celler i hjernen seksjoner.
Merk: Jernet i de merkede cellene vil vises som blå fargede innskudd.
Representative Results
Tjuefire timer etter intranasal levering, SPIO-merket MSCs ble oppdaget som sterke hypointense områder midtre til kortikale skade på T2 *-vektet bilder (figur 2b), som indikerer målrettet MIGRERING av SPIO til skaden området. Denne migreringen forble synlig opp til 14 dager etter levering, da hypointense signalene ble funnet å være synlige uten signifikant reduksjon for denne tidsperioden (figur 2b). Den skadde dyr behandlet med PBS viste ingen hypointense områder, noe som indikerer at de observerte hypointense områdene tilsvarer SPIO merket MSCs og ikke å signalisere artefakter (figur 2a) biodistribusjon av den merkede MSCs som ble observert i vivo med MRI ble vist ved hjelp av 3D-rekonstruksjon (figur 2C, D). Migrering av MSCs til den skadde cortex ble bekreftet histologisk av prøyssiske blå farging og FITC kanal deteksjon av FITC-Tagged SPIO i merket MSCs (Figur 3A, B).
Figur 1: skjematisk flytskjema av protokollen og in vitro bekreftelse av SPIO opptak av MSCs. (A) MSCs var inkubert med SPIO for 24 h for merking. Deretter ble merket MSCs levert inn i en TBI musemodell via en intranasal (IN) rute. Mr på ulike tidspunkter ble utført for å spore merket MSCs. bekreftelse av tilstrekkelig merking av MSCs av SPIO ble oppnådd ved (B) fluorescens mikroskopi og (C) konfokalmikroskopi mikroskopi bruker FITC kanalen, siden SPIO NANOPARTIKLER ble merket med FITC. (D) cellen pellet av merket MSCs dukket mørk i fargen på grunn av jern lasting. FITC = fluorescein isothiocyanate; SPIO = superparamagnetic partikler av jernoksid; MSCs = Mesenchymal stamceller; MRI = magnetisk resonans imaging; IN = intranasal; TBI = traumatisk hjerneskade. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sann tids Mr gjør det mulig å oppdage og spore SPIO-merket MSC-migrering mot skadeområder i hjernen til TBI-indusert mus. (A) mus ble utsatt for TBI, etterfulgt av behandling med PBS eller SPIO-merket MSCs, administrert via en intranasal rute 24 timer etter skade. Koronale seksjoner av T2 *-vektet bilder viste merket MSCs som et hypointense område (pil spiss) på kanten av skaden området (skissert området) på 1, 7 og 14 dager etter levering. Musene som ble behandlet av PBS viser ingen hypointense område. (B) segmentering prosessen av skaden området området (grønn) og merket MSCs (rød) basert på koronale T2 *-MRI bilder. (C) 3D rekonstruksjon av musen hjernen behandling basert på T2 *-vektet bilder som illustrerer BIODISTRIBUSJON av SPIO-merket MSCs i hjernen 14 dager etter levering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: histologiske analyse bekrefter tilstedeværelsen av SPIO-merket MSCs i hjernen til de behandlede dyrene. Prøyssiske blå farging av hjernen deler av en (a) mus behandlet med PBS (kontroll) og (C) mus behandlet med SPIO-merket MSCs. SPIO-positive celler ble påvist i MSC-behandlet mus (eske celler, blå), mens kontrollen musen viste ingen positive celler på skaden området i cortex på 14 dager etter levering, bekrefter MRI observasjoner. Fluorescens mikroskopi analyse av cortex på en (B) kontroll mus behandlet med PBS og (D) mus behandlet med SPIO-merket MSCs ble gjennomført 14 dager etter levering. Analysen avdekket tilstedeværelsen av FITC-Tagged SPIO-positive celler (eske celler, grønn) ved den skadde cortex i MSC-behandlet mus, men ingen FITC signaler ble observert i cortex på PBS-behandlet musen. Skala bars = 50 μm, med mindre annet er oppgitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen beskrevet her representerer generelle prosedyrer for SPIO merking av MSCs og Mr sporing av SPIO-merket MSCs post-intranasal levering. Protokollen gir mulighet til å studere migrasjon og biodistribusjon av MSCs etter levering in vivo i hjernen, ved hjelp av en ikke-invasiv metode.
MSCs er attraktive kandidater for stilk cellen-basert terapi for CNS lidelser og skader på grunn av deres evne til å skille trofiske faktorer som 1) utløse neurorestorative prosesser og 2) gi neuroprotection, på grunn av deres antiinflammatoriske effekter innenfor skaden området9,10,11,12. Selv om langsiktig Mr-sporing og påvisning av SPIO-merket MSCs kan begrenses på grunn av fortynning av intercellulære SPIO med celledeling, merket celler kan oppdages for opptil flere uker etter transplantasjon i hjernen av dyremodeller13.
Også beskrevet her er merkingen protokollen av MSCs med SPIO nanopartikler belagt med dextran uten transfeksjoner agenter. Andre protokoller har blitt brukt i litteraturen14,15,16. I alle tilfeller bør imidlertid disse protokollene justeres for celle type, SPIO-størrelse, inkubasjons-tid og SPIO-konsentrasjon. MSCs har vist å ha nedsatt chondrogenic differensiering potensial, men ikke adipogenic differensiering på SPIO merking17. Derfor er det sterkt anbefalt at differensiering analyser utføres før Stamcelle levering å evaluere påvirkning av SPIO på differensiering styrken av stamceller. I en tidligere studie ble det demonstrert at MSC merking med samme SPIO type og konsentrasjon som brukes i her ikke påvirke osteogen eller adipogenic differensiering potens av MSCs6.
Den intranasal ruten av terapeutisk stilk cellen levering for hjerne lidelser og skader er en lovende tilnærming for klinisk anvendelse av stamceller. Men den iboende og molekylære mekanismer som dikterer oppførselen til stamceller i nesehulen forblir uklart. Selv om den intranasal ruten er allment utforsket for levering av små molekyler, er størrelsen og biodistribusjon atferden til den terapeutiske stammen forskjellig fra små molekyler. Den gjeldende protokollen viser at MSCs har en tendens til å migrere mot skaden området etter intranasal levering.
Her ble T2 *-vektet bilder brukt til å spore SPIO-merket MSCs. Andre rapporter har brukt gradient Echo Imaging. Imidlertid er mottakelighet gjenstander ofte observert i gradient ekko Imaging grunn intercellulære SPIO. I den gjeldende protokollen, plasseringen av hypointense områder som representerer SPIO-merket MSCs på T2 *-vektet bilder var den samme som plasseringen av SPIO i hjernen seksjoner som oppdages av histologiske undersøkelse (Figur 3). Dette indikerer tilstrekkelig følsomhet for T2 *-vektet spin Echo Imaging for SPIO-merket MSC sporing i hjernen.
Oppsummert er den beskrevne protokollen gunstig for in vivo stilk cellen sporing studier av hjernen skader og lidelser. Den langsgående sporing av stamceller in vivo har tradisjonelt blitt utført ved å ofre dyr på flere tidspunkter. Den nåværende protokollen gir en ikke-invasiv og effektiv tilnærming for MSCs levering og sporing, som representerer en potensiell prosedyre for stilk cellen-basert terapi for hjerne skader og lidelser i kliniske miljøer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi Grants, Taiwan (mest 104-2923-B-038-004-MY2, MOST 107-2314-B-038-063, og mest 107-2314-B-038-042) og Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 og DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
References
- Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
- Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
- Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
- Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
- Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
- Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
- Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
- Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
- Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).
- Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
- Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).
