Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.
Abstract
כחוליות הן קבוצה מגוונת של אורגניזמים פוטוסינתטיים prokaryotic שניתן לשנות גנטית עבור ייצור מתחדשת של סחורות תעשייתיות שימושי. ההתפתחויות האחרונות בביולוגיה סינתטית הובילו לפיתוח של כמה ערכות כלים שיבוט כגון ציאנוגייט, מערכת סטנדרטית שיבוט מודולרי לבניית וקטורים פלביניים עבור שינוי או העברה הזוגיות לתוך כחוליות. כאן אנו מתווה שיטה מפורטת להרכבת וקטור שכפול עצמי (למשל, נשיאת מחסנית ביטוי של סמן פלורסנט) והעברה בת הזוג של הווקטור לתוך זנים cyanobacterial של sy, pcc 6803 או Synechocystis elongatus utex 2973. בנוסף, אנו לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלק גנטי (למשל, מיזם) באמצעות קורא צלחת או זרימת cy, לנסות.
Introduction
כחוליות הautotrophic בקטריה שיכולה לשמש לביוסינתזה של מגוון רחב של מוצרים מטבוליים בעלי ערך גבוה והטרוולוגי,1,2,3,4,5, . שישה מטרים מכשולים מספר עדיין צריך להיות להתגבר כדי להרחיב את הכדאיות המסחרית שלהם, בעיקר, את התשואות העניים יחסית לעומת heterotrophic bio-פלטפורמות (למשל, Esהכלאיים קולי ושמרים)7. ההרחבה האחרונה של כלים הנדסה גנטית זמין וספיגת הפרדיגמה של ביולוגיה סינתטי במחקר cyanobacterial הוא עוזר להתגבר על אתגרים כאלה ועוד לפתח cyanחיידקים יעילים ביוקוסיטיות יעילות8, 9,10.
הגישות העיקריות להצגת ה-DNA לתוך הקיאובקטריה הם טרנספורמציה, היווצרות ואלקטרופורציה. הווקטורים שהועברו לציטואובקטריה על ידי טרנספורמציה או אלקטרופורציה הם "התאבדות" וקטורים (כלומר, וקטורים אינטגרטיבית המקלים על שילוב הומולוגי), בעוד שניתן להעביר וקטורים שמשכפלת את עצמם לציאנקטריה על ידי שינוי צורה, קוניוגציה או אלקטרופורציה. עבור הראשון, פרוטוקול זמין עבור מינים הנדסה מודל מאפשר שינוי טבעי11. לאחרונה, שיבוט מודולרי (MoClo) ערכת כלים עבור כחוליות הנקרא ציאנוגייט פותחה כי מעסיקה שיטת הרכבה סטנדרטית של שער הזהב להנדסה באמצעות שינוי טבעי, אלקטרופורציה או הקוניוגציה12.
שיטות הרכבה מסוג שער הזהב הפכו לפופולריות יותר ויותר בשנים האחרונות, ותקני הרכבה וספריות חלק זמינים כעת עבור מגוון של אורגניזמים13,14,15,16 ,בן 17 שער הזהב משתמש באנזימים של הגבלת IIS (לדוגמה, BsaI, Bsai, Bsb, BtgZI ו-AarI) וסידרה של קבלה והיתקעות ייחודיות כדי להקל על הרכבה הירארכית כיוונית של רצפים מרובים בתגובת הרכבה מסוג "סיר אחד". הקלד אנזימי הגבלת IIS מזהים רצף אסימטרי ייחודי וחותכים מרחק מוגדר מאתרי הזיהוי שלהם כדי ליצור התנדנד, גזור "בסוף דביק" (בדרך כלל 4 נוקלאוטיד [NT] overhang), אשר ניתן לנצל לאחר מכן הכונן DNA הזמנת תגובותהאסיפה 15,18. פעולה זו הפכה את ההתפתחות של ספריות גדולות של חלקים מודולריים ברמה 0 (למשל, היזמים, לפתוח מסגרות קריאה ומחסלים) המוגדרים על ידי תחביר משותף, כמו התקן פיטולבנים19. לאחר מכן, חלקים ברמה 0 יכולים להיות מורכבים בקלות לתוך קלטות ביטוי רמה 1, בעקבות הרכבות יותר מורכבות בסדר גבוה (g., ביטויים multigene בנייה) ניתן לבנות וקטור קבלה של בחירה12,15. יתרון מרכזי של טכניקות הרכבה מסוג שער הזהב הוא היכולת שלהם לאוטומציה במתקני תפוקה גבוהה, כגון שירותי דנ א20,21, אשר יכול לאפשר בדיקה של עיצובים ניסיוניים מורכבים ש לא ניתן להשיג בקלות על ידי עבודה ידנית.
כלציאנו-גייט בונה על מערכת. המפעל הוקמה12,15 כדי לשלב חלק חדש לתוך ציאנוגייט, על רצף החלקים להיות ממושמע, כלומר, אתרי זיהוי "לא חוקיים עבור BsaI ו-Bsai חייבים להיות מוסרים. במקרה של קידוד חלק עבור מסגרת קריאה פתוחה (כלומר, רצף קידוד, תקליטורים), אתרי הכרה יכולים להיות מופרת על ידי יצירת מוטציות נרדף ברצף (כלומר, שינוי העין לחלופה המקודד עבור אותו שאריות חומצות אמינו). זה יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של גישות, החל סינתזה של DNA לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי הגברה אסטרטגיות כגון מכלול גיבסון22. בהתאם למארח הביטוי המשמש, יש לנקוט כדי למנוע את המבוא של משתמשים נדירים שיכולים לעכב את היעילות של תרגום23. הסרת אתרי זיהוי ברצפים של יזם ושליחות קטלנית היא בדרך כלל מאמץ לגולש, מאחר ששינויים עלולים להשפיע על הפונקציה וייתכן שהחלק לא יפעל כמצופה. לדוגמה, שינויים באתרי האיגוד של גורמי הכריכה או באתר המחייב הריבוחלק בתוך מקדם יכולים לשנות כוח ותגובתיות לאינדוקציה/דיכוי. כמו כן, שינויים בתכונות מבניים שליחות קטלנית (g., הגזע העשיר GC, לולאה ו פולי-U הזנב) עשוי לשנות את יעילות הפסקת וביטוי גן ההשפעה24,25. למרות מספר משאבים מקוונים זמינים כדי לנבא את הפעילות של היזם ואת רצפי שליחות קטלנית, ולהודיע אם מוטציה המוצע ישפיע על ביצועים26,27, כלים אלה הם לעתים קרובות מנבא עניים של ביצועים בקיאנקטריה28,29,30... ככזה, באפיון vivo של חלקים שהשתנו עדיין מומלץ לאשר פעילות. כדי לסייע עם שיבוט של רצפים הסרבן, כוללות כולל העתק נמוך שיבוט קבלת וקטור מבוסס על הווקטור biobrick pSB4K512,16,31. יתר על כן, "עיצוב ובנייה" הפורטל זמין דרך בית היציקה של אדינבורו הגנום כדי לעזור עם עיצוב וקטורי (dab.genomefoundry.org). לבסוף, והכי חשוב, ציאנוגייט כוללת שני עיצובים וקטוריים ברמה 2 (שווה ערך לקבלת וקטורים ברמה 3)15 עבור החדרת דנ א לתוך כחוליות באמצעות וקטורים התאבדות, או וקטורים רחבים של טווח המארח המסוגל לשכפול עצמי בכמה מינים של cyanobacterial32,33,34.
כאן נתמקד בתיאור פרוטוקול ליצירת וקטורים ברמה שכפול עצמי והשינוי הגנטי של Syelongatus לוצילף pcc 6803 ו Synechocystis Utex 2973 (sy לוצילף pcc 6803 ו -S. elongatus Utex 2973 להלן) על ידי הקוניוגציה (המכונה גם ההזדווגות tri-הורים). העברת הזוגיות של דנ א בין התאים החיידקיים הוא תהליך מתואר היטב, כבר בשימוש בעבר עבור מינים הנדסה cyanobacterial, בפרט אלה שאינם מוכשרים באופן טבעי, כגון S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. בקצרה, תרבויות cyanobacterial הם מודבטים עם הזן E. coli נושאת את וקטור להיות הועבר ("מטענים" וקטור) ו וקטורים (או באותו מאמץ E. coli או בזנים נוספים) כדי לאפשר בניינים ("מגייס" ו "עוזר" וקטורים). ארבעה תנאים מרכזיים נדרשים עבור העברת הזוגיות להתרחש: 1) קשר ישיר בין התאים המעורבים בהעברת ה-DNA, 2) וקטור המטען חייב להיות תואם עם מערכת הקוניוגציה (כלומר, היא חייבת להכיל מקור העברה מתאים (אורית), ידוע גם בשם bom (בסיס של ניידות) האתר), 3) בדיקת דנ א בחלבון (g., מקודד על ידי הגן המאפיה ) כי הניקס ב אורית ליזום העברה אחת תקוע של ה-dna לתוך cyanקוביום חייב להיות נוכח ומבוטא מן המטען או מסייע וקטורים, ו -4) ה-DNA המועבר לא צריך להיהרס ב cyanobacterium הנמען (כלומר, חייב להיות עמיד בפני השפלה על ידי, למשל, הגבלה endonuclease פעילות)35,42. עבור וקטור המטען להמשיך, מקור השכפול חייב להיות תואם עם cyanקוביום הנמען כדי לאפשר שכפול עצמי והתפשטות לתוך מחלקת תאים ביתי הדואר. כדי לסייע עם תנאים 3 ו-4, מספר וקטורים מסייעים זמינים דרך Addgene ומקורות מסחריים אחרים המקודדים עבור המאפיה , כמו גם מתילסים מספר להגן מפני העין המקורית של cyanobacterium מארח43. בפרוטוקול זה הונחה הקוניוגציה על ידי זן MC1061 E. coli הנושא וקטורים מpRK24 (www. addgeneorg/51950) וpRL528 (www.addgene.org/58495), בהתאמה. הטיפול חייב להילקח בעת בחירת וקטורים לשמש להעברת הזוגיות. לדוגמה, בערכת ציאנושער שכפול המטען העצמי וקטור pPMQAK1-T מקודד עבור חלבון המאפיה12. עם זאת, pSEVA421-T אינו44, וככזה, האספסוף חייב להתבטא מתוך וקטור עוזר מתאים. הווקטורים המשמשים צריכים להיות גם מתאימים לאורגניזם היעד. לדוגמה, העברת הזוגיות יעילה ב- אננינה SP. pcc 7120 דורש וקטור עוזר המגן על וקטור מגייס נגד העיכול (למשל, pRL623, אשר מקודד עבור שלושה מתילסים Avaim, Eco47iiM ו Ecot22iM)45, 46.
בפרוטוקול זה אנו עוד לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלקים (כלומר, היזמים) עם סמן פלורסנט באמצעות קורא צלחת או cytometer זרימה. הציטומטרים זורמים מסוגלים למדוד את הקרינה הפלואורסצנטית על בסיס תא בודד עבור אוכלוסיה גדולה. יתר על כן, cytomטומטריים זרימה לאפשר למשתמשים "שער" את הנתונים הנרכשים ולהסיר רעשי רקע (למשל, מחומר חלקיקי בתרבות או זיהום). לעומת זאת, קוראי צלחות רוכשים מדידה בלתי מצטברת של כמות תרבותית מסוימת, בדרך כלל במספר בארות שכפול. יתרונות מרכזיים של קוראי צלחות על cytomטומטריים כוללים את העלות הנמוכה יותר, זמינות גבוהה יותר ובדרך כלל אין דרישה עבור תוכנות מומחה עבור ניתוח נתונים במורד. החסרונות העיקריים של קוראי צלחות הם רגישות נמוכה יחסית לעומת cytomטומטריים ובעיות פוטנציאליות עם צפיפות אופטית של תרבויות מדודות. עבור ניתוחים השוואתיים, יש לכלול בדוגמאות של קורא הצלחות באופן שטוח עבור כל באר (לדוגמה, למדידה של צפיפות התרבות, הנלקחת בדרך כלל כספיגת החומר בצפיפות האופטית ב-750 ננומטר [OD750]), שעלולה להוביל לאי אי-דיוקים עבור דגימות שאינן צפוף ו/או לא מעורבב היטב (למשל, כאשר מועדים לצבירה או לחיסון).
כסקירה, כאן אנו להדגים בפירוט את העקרונות של יצירת רמה 0 חלקים, ואחריו הרכבה הירארכית באמצעות ערכת ציאנוגייט ושיבוט לתוך וקטור מתאים להעברת הזוגיות. לאחר מכן אנו להדגים את תהליך העברת הזוגיות, מבחר של הזנים הטרנסמעית של היקום הבטא סמן פלורסנט, ובעקבות הרכישה של נתונים פלואורסצנטית באמצעות cytometer זרם או קורא צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבה וקטורית באמצעות המפעל וכלי הכלים של הצמח
הערה: לפני שתמשיך בהרכבה וקטורית, מומלץ מאוד למשתמשים להכיר את המבנים ברמה הווקטורית של המפעל ומערכות מוקלו12,15.
- בניית חלקים ברמה 0
הערה: חלקים ברמה 0 יכולים להיות מסונתז כווקטורים מלאים או כרצפים ליניאריים עבור הרכבה עם האפשרות ' רמה 0 ' (לדוגמה, gBlocks, IDT). לחילופין, רצפים יכולים להיות מוגבר מתבנית מקור (למשל, DNA וקטורי או מטוהר גנומית). כאן, כיצד ליצור חלק חדש מרמה 0 ממוצר מוגבר מתואר. מבט כולל על תהליך ההרכבה של שער הזהב מרמה 0 עד לרמה T מוצג באיור 1.- . עצב את התחל
- להחליט מה מודול רמה 0 להרכיב ולזהות את המתאים 5 ′ ו 3 ′ מסתובב (שולחן 1)12,15. בדוק את רצף הדנ א לשכפול לנוכחות אתרי הגבלה של BpiI או Bpii.
הערה: על רצף המכיל אחד מאתרים אלה להיות מבויתים על-ידי שינוי NTs אחד או יותר ברצף אתר ההגבלה. אסטרטגיה לעשיית זאת באמצעות מכלול שער הזהב מחולקת באיור 2. - כדי להגביר את רצף הדי-אן-איי, עצב זוג מתאים קדימה והפוך. עבור פריימר קדימה, בחר 18-30 bp משלימה את הקצה 5 ′ של רצף תבנית ה-DNA. עבור פריימר לאחור, בחר 18 על 30 bp לאחור משלימה את הקצה 3 ′ של רצף תבנית ה-DNA.
הערה: התחל בטמפרטורות ההיתוך (Tm) של 58 עד 62 ° צ' בדרך כלל נותנות את תוצאות ההגברה העקביות ביותר (איור 1א). - הוסף את הפרטים הבאים כדי לסיים את 5 ′ של פריימר קדימה: 1) מחרוזת אקראית של 4 שישה NTs בסוף 5 ′ של האתר BpiI, 2) באתר ההגבלה BpiI (GAAGAC), 3) שני אקראי NTs, ו 4) 5 ′ לתלות בשלב 1.1.1.1. הוסף את הפרטים הבאים כדי לסיים את 5 ′ של פריימר הפוכה: 1) מחרוזת אקראית של 4 שישה NTs בסוף 5 ′ של האתר BpiI, 2) באתר ההגבלה BpiI (GAAGAC), 3) שני אקראי NTs, ו 4) את המרחק 3 ′ שנבחרו בשלב 1.1.1.1. כאשר הסופיים מסודרים, הזמן את הצמדים הפריימר.
הערה: ראה איור 1א לדוגמה של זוג התחל והפוך.
- להחליט מה מודול רמה 0 להרכיב ולזהות את המתאים 5 ′ ו 3 ′ מסתובב (שולחן 1)12,15. בדוק את רצף הדנ א לשכפול לנוכחות אתרי הגבלה של BpiI או Bpii.
- להגביר רצף דנ א. מהדנ א גנומי
- לחלץ דנ א גנומית כפי שמתואר בסעיף 5. להגביר את המוצרים על ידי ה-PCR באמצעות דנ א באיכות גבוהה פולימראז (טבלת חומרים).
הערה: כדוגמה, הגדר את תגובות ה-PCR (20-50 μL) לפי הוראות היצרן. השתמש ~ 100 ng של דנ א גנומית לכל התגובה. השתמש בתוכנית רכיבה על אופניים תרמית המורכבת של צעד התחלתי הראשונית של 98 ° c עבור 30 s, ואחריו לא יותר מ -25 מחזורים של דנטורציה ב 98 ° צ' עבור 10 s, פריימר ריפוי ב 58 ° c עבור 15 s והרחבת המוצר ב 72 ° c עבור 30 (לשנות את האחרון בהתאם ל גודל של המוצר/סוג של DNA פולימראז בשימוש), ואחריו צעד הארכה הסופי של 72 ° c עבור 2 דקות. - אם מוצר ה-PCR הוא ג'ל מטוהר, הפעל את תגובת ה-PCR כולה על ג'ל שנוצר כמתואר בסעיף 6. חותכים את החומר מתוך ג'ל הצמח ומטהרו אותו בעזרת ערכת הפקת ג'ל (טבלת חומרים).
- חלופה לשלב 1.1.2.2, אם המוצר PCR יש להשתמש ללא טיהור ג'ל, לאמת את גודל הלהקה על ידי הפעלת סדרת מחלקים של מדגם התגובה PCR (~ 5 μl) על ג'ל צמח. אם הג מציג רק את הלהקה המתאימה ואין כל עדות לדימרס, טהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור DNA (טבלת חומרים).
- אליוט מטוהר DNA בנפח קטן של מים מאוהים (g., 10 μL) כדי לקבל ריכוז DNA גבוה (> 20 ng/μL הוא בדרך כלל מספיק).
- לחלץ דנ א גנומית כפי שמתואר בסעיף 5. להגביר את המוצרים על ידי ה-PCR באמצעות דנ א באיכות גבוהה פולימראז (טבלת חומרים).
- להרכיב את מוצר ה-DNA הוגבר (או מוצרים, ראה איור 2) ברמה 0. הכינו 20 שילוב של תגובת μL עם BpiI (איור 1B) והגדר את תוכנית הציקלייר התרמית כמתואר בטבלה 2. המשך המרה E. coli באמצעות 5 μl של תערובת התגובה ברמה 0 התאספו (כפי שמתואר בסעיף 2).
- . עצב את התחל
- בניית מכלולים ברמה 1
- החלט באיזה שלב 0 חלקים להרכיב (איור 1C וטבלה 1). בחר באפשרות מתאימה של הרמה 1 וקטור15.
הערה: בשלב זה חשוב לדעת מה העיצוב וקטורי הסופי יהיה ברמה T, כמו זה ישפיע על הבחירה של וקטור ברמה 1. ניתן להשתמש במיקום ברמה 1 (קדימה) לקבלה וקטור (pICH47732) כברירת מחדל אם המטרה היא לכלול הרכבה ברמה 1 (לדוגמה, קלטת של ביטוי גנים) ברמה T. עם זאת, אם יש לכלול שני הרכבות ברמה 1 או יותר ברמה T, יש לשקול את המיקום והכיוון של כל הרכבה ברמה 1. ניתן לשלב הרכבות עד שבעה מכלולים ברמה 1 בתוך וקטור ברמה 1 באמצעות שימוש בוקטורים מהרמה הראשונה באמצעות מיקומים מתאימים12. - הכנס את החלקים ברמה 0 ברמה 1. הכינו 20 שילוב תגובות μL עם BsaI והגדר את תוכנית הציקלייר התרמית כמתואר בטבלה 2. המשך המרה E. coli באמצעות 5 μl של תערובת התגובה ברמה 1 התאספו (כפי שמתואר בסעיף 2).
- החלט באיזה שלב 0 חלקים להרכיב (איור 1C וטבלה 1). בחר באפשרות מתאימה של הרמה 1 וקטור15.
- בניית מכלולים ברמה T
- החלט מה הרכבות רמה 1 להרכיב (איור 1ד). בחר וקטור ברמה המתאימה.
הערה: pUC19A-t (התנגדות אמפיצילין) ו pUC19S-t (spectinomycin עמידות) הם מספר העתק וקטורים אינטגרטיבי שאינם מסוגלים לשכפל בתוך כחוליות ומשמשים בעיקר לאינטגרציה גנומית (כלומר, להקיש-in או להקיש-out של גנים) באמצעות שילוב מחדש של הומוולוגי12. משלוח של וקטורים אינטגרטיבית יכול להמשיך על ידי טרנספורמציה טבעית בתוך המינים הניתנים להמרה11. pPMQAK1-T הוא טווח מארח רחב, וקטור replicative כי הוא נמסר על ידי העברת הזוגיות (סעיף 3). - בחר את הקצה המתאים הקישור כדי להאריך את הקצה של 3 ′ ההרכבה ברמה הסופית 1 לעמוד השדרה רמת T15.
הערה: הקישור לקצה הנדרש הוא אותו מספר כמו המיקום של החלק הסופי. לדוגמה, וקטור רמה T עם מיקום אחד ברמה 1 בלבד (העברה או הפוכה) ידרוש חלק קצה 1 (pICH50872) לחיבור לעמוד השדרה של רמת T. - הכנס מכלולים ברמה 1 או יותר ברמה T. הכינו שילוב תגובות עם BpiI ואת וקטור הקצה הנדרש והגדר את תוכנית הציקלייר התרמית כמתואר בטבלה 2. המשך המרה E. coli באמצעות 5 μl של תערובת התגובה ברמה T התאספו (כפי שמתואר בסעיף 2).
- החלט מה הרכבות רמה 1 להרכיב (איור 1ד). בחר וקטור ברמה המתאימה.
2. E. coli המרה וטיהור וקטורי
- המרה של E. coli (יום 1)
- הפשרה (~ 25 μL) של תאים E. coli כימית (טבלת חומרים) ופיפטה בעדינות לתוך שפופרת 1.5 mL על קרח. הוסף 5 μL של תמהיל ההרכבה (רמה 0, 1 או T) ומארג את השפופרת על הקרח במשך 30-60 דקות נוספות.
- חום-זעזועים תאים על ידי הרכבת הצינור באמבט מים ב 42 ° c עבור 30, ואז למקם את הצינור חזרה על הקרח עבור 2 דקות. הוספת טמפרטורת החדר (RT) ציר אופטימלי במיוחד עם דיכוי catabolite (S.O.C.) בינונית (250 μL) לשפופרת. מודיית את הצינור ב 37 ° צ' עבור 1 h ב 225 סל ד בחממה רועדת.
- צלחת 40 μl של התרבות על צלחת ליברות אגר המכיל את הריכוז הסופי המתאים של אנטיביוטיקה (100 μg/ml עבור spectinomycin דיהידרוטסטוסטרון הקרב [רמה 0], 100 μg/ml של carbenicillin ניתרן [רמה 1], או ש50 μg/ml של kanamycin סולפט [ רמה T]), 1 מ"מ איזופרופיל-ביתא-D-תאיוגלאוסייד (IPTG) ו-40 μg/mL של 5-bromo-4-כלורו-3-אינדולקסיל-β-D-גלפטוטויד (X-גל) עבור הקרנה כחול לבן. מודקת את הצלחת הלילה ב 37 ° c.
הערה: הכמות של ציפוי התרבות יכולה להיות מגוונת בהתאם ליעילות התאים המוסמכים של E. coli והתגובה הנגדית. צלחת נפח גדול יותר אם < 10 מושבות נצפו לאחר הדגירה הלילה.
- מבחר מושבות לבנות והכנת תרביות נוזלים (יום 2)
הערה: בהתאם ליעילות של תגובת ההרכבה והשינויים הבאים, לוחות LB אגר אינם מכילים מושבות, מושבות כחולות או מושבות לבנות (איור 3). מושבות כחולות מעידים על וקטורים אשר לא עברו הגבלה (כלומר, עותק פונקציונלי של Lacz עדיין קיים). מושבות לבנות מציינות כי הקלטת של ביטוי Lacz אבדה והוחלפה על-ידי חלק/הרכבה.- באופן אופציונלי, ודא שמושבות לבנות מכילות את הווקטור הצפוי על-ידי ביצוע ה-PCR כפי שמתואר בסעיף 7.
- לבחור מושבות לבנות יחיד (או מושבות ה-PCR מאומת) עם טיפ 10 μL ולהעביר ל 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה המכיל LB בינונית (5 mL) וריכוזי אנטיביוטי המתאים (שלב 2.1.3). מודיית את הצינורות ב 37 ° c לילה ב 225 rpm בחממה רועד.
- טיהור וקטורי פלמיד (יום 3)
- באופן אופציונלי, להכין מלאי גליצרול של התרבות לילה E. coli לאחסון לטווח ארוך של וקטורים. הוסף 500 μL של התרבות החיידקית כדי 500 μL של 50% (v/v) גליצרול בשפופרת מתאימה של 1.5-2.0 מ ל להקפאה ב-80 ° c. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 5-10x. להקפיא דגימות פלאש בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא של 80 ° c.
- ספין למטה תרבויות 15 מ ל שפופרות צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5-10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט בלי להפריע את הגלולה התא. לטהר את הווקטור באמצעות ערכת טיהור פלמיד (טבלת חומרים). וקטור מטוהר ב 35 μL של מים מוהים.
הערה: השתמש באמצעי אחסון נמוכים יותר כדי להגדיל עוד יותר את הריכוז הווקטורי. האלואנט אותו ניתן לשים דרך טור טיהור פעמיים על התשואות מוגברת. - למדוד את הריכוז של הווקטור בתוך החומק באמצעות ספקטרוסקופיה (טבלת חומרים).
הערה: וקטורים בעלי מספר העתקים גבוה ב -E. coli, כגון pUC19, מעניקים בדרך כלל תפוקה של 50 מספרי העתקה מסוג Ng/Μl נמוך, כגון PPMQAK1-T, בדרך כלל מעניקים תשואה של 15 עד 60 Ng/μl.
- אימות וקטורי
הערה: וקטורים יכולים להיות מאומתים על-ידי עיכול הגבלה (שלב 2.4.1) ו/או רצף (שלב 2.4.2).- הגבל 0.5-1 μg של וקטור עם אנזים הגבלה מתאים ובדוק את גודלי הלהקה הצפויים כמתואר בסעיף 6 (איור 4).
הערה: גדלי להקות שגויים מציינים בדרך כלל הרכבה שגויה, ובמקרה כזה ניתן לחזור על מושבות לבנות יותר או הרכבה. ניתן להשתמש ב-BsaI וב-Bsai כדי לאמת את הגודל הנכון של ההוספה עבור הרכבות Level 0 ו-Level 1, בהתאמה. ניתן להשתמש ב-BsaI או Bsai בשילוב עם אנזים מגבלה נוסף ותואם שחותך בתוך ההוספה ו/או בעמוד השדרה הווקטורי כדי ליצור קבוצה מובחנת של להקות מופרדות היטב לאחר העיכול. - רצף את הווקטור על ידי רצף שימוש באמצעות מתקן מתאים במעלה הזרם של האזור המורכב באמצעות רצף מסחרי (שולחן 3).
הערה: יש לרצף את כל חלקי הרמה החדשה 0 כדי לאשר את זהות הרצף הצפויה. אימות רצף של וקטורים מרמה 1 ו-T אינו נדרש בדרך כלל אם הורכב מחלקים ברמה 0 שעברו רצף בעבר.
- הגבל 0.5-1 μg של וקטור עם אנזים הגבלה מתאים ובדוק את גודלי הלהקה הצפויים כמתואר בסעיף 6 (איור 4).
3. יצירת מוטציות באמצעות קוניוגציה
הערה: להלן פרוטוקול להעברת הזוגיות של וקטור מטענים המשכפלת את עצמו לתוך sy, 6803 או S. elongatus utex 297311,47 מתוארת. פרוטוקול זה חל על מינים אחרים מודל (למשל, S. elongatus pcc 7942 ו Synechococcus sp. pcc 7002). כל העבודה עם כחוליות (וההכנות מאגר הקשורות) צריך להיעשות בתנאים סטריליים במכסה זרם למינארי.
- הצמיחה של התרבות הציאנקובאלית (יום 1)
- להכין BG11 בינוני לפי לאה-סמית ואח '11, ולוחות אגר עם LB-BG11 ו BG11 + Kan50 (סעיף 8).
- הגדר תרבות טרייה של sy, מ6803 או S. elongatus utex 2973 על ידי האפשרות מחדש בקבוקון של 100 mL של BG11 מדיום טריים (50 ml) עם תאים שמקור הצלחת BG11 אגר axenic. הגדל את מרבית התרבויות ה6803 בשנת 30 ° c, 100 μm בפוטונים מ-2s-1 ב 100 rpm ולגדול s. Elongatus utex 2973 ב 40 ° c, 300 μm בפוטונים מ-2s-1 ב 100 rpm. הגדל תרבויות עד OD750 = 0.5-1.5 (בדרך כלל 1-2 ימים).
הערה: s. elongatus utex 2973 תרבויות ניתן לגדל ב 40 ° c בעוצמות אור גבוה (g., 2000 μm בפוטונים מ-2S-1)48.
- צמיחת המסייע והמטען של E. coli זנים (יום 2)
- Inoculate LB בינונית המכילה (הריכוז הסופי 100 μg/mL) ו כלורמפננול (ריכוז סופי 25 μg/mL) עם זן MC1061 E. coli המכיל וקטורים PRK24 ו pRL528 (כלומר, המאמץ המסייע) ולצמוח ב 37 ° c לילה ב 225 rpm באינקובטור רועד. לגדול נפח מספיק של תרבות הזנים עוזר, בהנחה 1 mL של התרבות נדרשת לכל הקוניוגציה.
- מדיום ליברות (5 מ ל) המכיל אנטיביוטיקה מתאימה עם התרבות של E. coli הנושאת את וקטור המטען (כלומר, וקטור רמת T). לגדל את התרבות ב 37 ° c לילה ב 225 rpm בחממה רועד.
- העברת בת-זוגיות (הזדווגות שלוש-הורים) (יום 3)
- הכן את העוזר הקולי . וזני המטענים צנטריפוגה את העוזר ואת המטען E. coli לילה תרבויות ב 3,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית
- לשטוף את הגלולה על ידי הוספת מדיום ליברות טריים ללא אנטיביוטיקה. השתמש באותו אמצעי אחסון כמו התרבות הראשונית. השהה את הגלולה מחדש על-ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה. . אל תעשה מערבולת על התרבות חזור על שלב זה 3 x כדי להסיר אנטיביוטיקה שיורית מהתרבות הלילה.
- צנטריפוגה את התרבות שהושהתה מחדש (כמו בשלב 3.3.1), להיפטר supernatant ולהשעות מחדש במחצית נפח של ליברות בינונית של נפח התרבות הראשונית (למשל, 2.5 mL אם התרבות לילה היה 5 מ ל). שילוב 450 μL של המאמץ המסייע עם 450 μL של זן המטען בצינור 2 mL ולהגדיר בצד (לעזוב ב RT) עד שלב 3.3.6.
- . הכינו את התרבות הציטוקובאלית עבור כל תגובת הקוניוגציה, השתמש ב-1 מ ל של תרבות cyanobacterial (OD750 = 0.5-1.5).
- צנטריפוגה את הנפח הכולל הנדרש של התרבות cyanobacterial ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב-RT, ואז להיפטר supernatant בזהירות מבלי להפריע את הגלולה התא. לשטוף את הגלולה על ידי הוספת BG11 בינוני טרי של אותו נפח ראשוני. להשעות את הגלולה על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה, לא מערבולת את התרבות. חזור על שלב זה 3x ולהגדיר את התרבות שטף בצד.
- להוסיף סדרת מחלקים של התרבות שטף cyanקובאל (900 μl) כדי המשולב E. coli זנים (המסייע והמטען) (900 μl) בצינור 2 mL. לערבב את התרבויות על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה. . אל תעשה מערבולת כיצד לשנות את התערובת ב-RT עבור 30 דקות עבור sy, מ6803 או 2 שעות עבור S. elongatus utex 2973.
- צנטריפוגה את התערובת ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב-RT. הסר 1.6 mL של supernatant. השהה מחדש את הגלולה בנותרים ~ 200 μL של סופרנטאנט. מקום אחד 0.45 יקרומטר מסנן קרום על צלחת LB-BG11 אגר חסר אנטיביוטיקה (סעיף 8). התפשט בקפידה 200 μl של התרבות E. coli/cyanקובניאל תערובת על הקרום עם פסק סטרילי או קצה מודגש מעוקר ולאטום את הצלחת עם סרט פרפין.
- מודדת את צלחת LB-BG11 עם הקרום 24 שעות ביממה. שמירה על ממברנות עם 6803 התרבויות של מערכת המידע ב -30 °c, 100 μps -1. לשמור על ממברנות עם S. elongatus utex 2973 תרבויות ב 40 ° c ב 150 μm בפוטונים מ-2S-1.
- העברת ממברנה
- לאחר 24 שעות, בזהירות להעביר את הקרום באמצעות מלקחיים להבה מעוקר לצלחת BG11 אגר טרי המכיל אנטיביוטיקה המתאימה (סעיף 8) כדי לבחור עבור וקטור המטען. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין.
- מודקת צלחת BG11 אגר תחת תנאי הצמיחה המתאימים, כפי שמתואר לעיל עבור Sy לוצילף pcc 6803 או S. elongatus utex 2973, עד שמושבות מופיעות.
הערה: מושבות מופיעות בדרך כלל לאחר 7-14 ימים עבור sy, 6803 ו-3-7 ימים עבור S. elongatus utex 2973.
- מבחר מconjugants
הערה: רק מושבות cyanobacterial הנושאות את וקטור המטען יוכלו לצמוח על הקרום (איור 5).- באמצעות לולאה סטרילית חום, לבחור לפחות שתי מושבות בודדות מן הקרום ואת פס על צלחת חדש BG11 אגר המכיל אנטיביוטיקה המתאימה (איור 5ג).
הערה: מושבות מרועלות מחדש עשוי עדיין להיות מזוהם עם E. coli שנשאה מן הקוניוגציה (כלומר, אם מושבות לבנות קטנות בולט על הצלחת), כך שניים או שלושה סיבובים נוספים של הBG11 לוחות טרי אגר לוחיות בדרך כלל הם הייתי צריך להשיג תרבות האקקובלית. - אשר העדר זיהום של E. coli על ידי היעדר רצף של תרבות cyanobacterial לתוך 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת המכיל 5 מ ל ליברות ו-דגירה ב 37 ° c לילה ב 225 rpm בחממה רועד. בעקבות תקופת גידול מספקת (~ 7 ימים), לבחור מושבות axenic בודדים כדי להגדיר תרבויות נוזלי להקפאה ארוכת טווח או ניסויים הבאים.
- באמצעות לולאה סטרילית חום, לבחור לפחות שתי מושבות בודדות מן הקרום ואת פס על צלחת חדש BG11 אגר המכיל אנטיביוטיקה המתאימה (איור 5ג).
- קריואיחסון של זנים ציאנקובאיאלית
- הגדל תרבות נוזלית בBG11 (כמתואר בסעיף 3.1) עד OD750 = 1.5-3.0. צנטריפוגה 10 מ ל של תרבות עבור 10 דקות ב 1,500 x g, להסיר את supernatant ולהשעות את התאים בתוך 5 מ ל של טריים BG11 medium.
- הוסף 3.5 mL של אוטוקלב מעוקר 50% (v/v) גליצרול לריכוז הגליצרול הסופי של ~ 20% (v/v)49. גישה זו מתאימה מאוד לסירוס 6803. לחילופין, להוסיף 5 מ ל של מסנן מעוקר BG11 המכיל 16% (v/v) diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור ריכוז DMSO הסופי של ~ 8% (v/v)50. גישה זו מומלצת עבור רוב הזנים, כולל S. elongatus utex 2973.
התראה: DMSO הוא רעיל ויש לטפל בו עם הגנה מתאימה. - מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 5-10x. שיטת משנה ~ 1 מ ל של התרבות לתוך הקפאה נפרדת 1.5 mL ברגים-כובע צינורות (טבלת חומרים). מניחים צינורות ב-80 מקפיא ° צלזיוס עבור קריופיט. אל תהבהב בחנקן נוזלי.
הערה: לפחות שלושה מניות לכל זן מומלצים. - להתאוששות, להסיר את הצינור מ-80 ° c מקפיא ולהפשיר את התרבות באמבט מים 35 ° c בעוד מתערבב בעדינות. הוסיפו את התרבות המופשכה ל-50 mL של BG11 בינונית טרייה ותגדל כתרבות נוזלית (כמתואר בסעיף 3.1).
הערה: לחילופין, התרבות יכולה להיות מקוטעת וגדלה על צלחת BG11 אגר טרי. תרבויות טרנסגניים נושאת סמני בחירה חייב להיות לתחייה בתחילה על BG11 אגר צלחות ללא אנטיביוטיקה ולאחר מכן מסטרה על לוחות BG11 אגר עם אנטיביוטיקה המתאימה.
4. אפיון יזם
הערה: כאן גישה סטנדרטית מתוארת לניתוח החוזק של חלק היזם על ידי מדידת רמות הביטוי של סמן פלורסנט (eYFP) בעקבות תקופת הצמיחה 72 h באמצעות קורא צלחת או הזרמת cytometer12.
- צמיחה תרבותית
- הגדר את תרבויות הזרעים על ידי הענמה 10 מ ל של BG11 בינוני המכיל אנטיביוטיקה המתאים עם מושבה אחת של זן cyanobacterial הטרנסגניים נושאת את הקלטת הביטוי פלורסנט. כמו כן להכין תרביות זרעים עבור זנים בקרה שלילית המתאים (למשל, זן סוג פראי ו/או זן טרנסגניים נושאת את שדרה וקטור זהה, אך חסרה את הביטוי סמן פלורסנט).
הערה: לפחות ארבעה משכפל ביולוגי מומלצים. - הגדל את תרביות הזרעים עבור 48 h או עד OD750 = 1-1.5 בתנאי גידול המתאימים לזן המינים.
- כדי לעקוב אחר ביטוי היזם לאורך זמן, יש למדוד תחילה את ה-OD750 של כל תרבות seed. לחשב את דרישות הדילול כדי להביא כל תרבות החל OD750 = 0.2. הגדרת דגימות תרבות ניסיוני מדולל (2 mL נפח כולל) בצלחת שטוחה 24-באר (טבלת חומרים).
- מודקת את הצלחת באינקובטור רועד עם נורות LED לבן (טבלת חומרים) תחת תנאי הצמיחה המתאימים. מדידת צפיפות הצמיחה של התרבות (OD750) וחלבון פלורסנט צהוב משופר (eyfp) פלואורסצנטית באמצעות קורא צלחת (סעיף 4.2) או cytometer זרם (סעיף 4.3).
הערה: sy, 6803 ו -S. elongatus utex 2973 תרבויות ניתן לגדל כמו בשלב 3.1.2. מומלץ מאוד כי הצלחת תישמר תחת לחות גבוהה (95%) כדי להימנע מאידוי דגימות התרבות.
- הגדר את תרבויות הזרעים על ידי הענמה 10 מ ל של BG11 בינוני המכיל אנטיביוטיקה המתאים עם מושבה אחת של זן cyanobacterial הטרנסגניים נושאת את הקלטת הביטוי פלורסנט. כמו כן להכין תרביות זרעים עבור זנים בקרה שלילית המתאים (למשל, זן סוג פראי ו/או זן טרנסגניים נושאת את שדרה וקטור זהה, אך חסרה את הביטוי סמן פלורסנט).
- קורא לוחית
- לערבב בקצרה את התרבויות בצלחת 24-באר (שלב 4.1.4) עם ליטוף עדין. העבר מדגם משנה של כל אחת מהתרבות לצלחת שחורה בעלת תחתית שטוחה 96-באר (טבלת חומרים). דלל במידת הצורך (100 μL). הימנע היווצרות בועות כמו זה יכול להפריע לדיוק מדידה.
הערה: מומלץ לבצע את כל המדידות על דגימות ב-OD750 טווח של 0.2-1.0. כמו צפיפות התרבויות 24-גם יגדל עם הזמן, הדילול הבאים מומלץ מבוסס על עליות צפויות בתנאי צמיחה סטנדרטית: אין דילול ב 0 h, 1:4 בשעה 24 h, 1:10 ב 48 h ו 1:10 ב 72 h. כך למשל, ב 24 שעות הקציר 25 μL של התרבות ולערבב עם 75 μL של BG11 medium. - כלול שתי בארות ריקות בצלחת 96-באר (כלומר, 100 μL של BG11 בינוני). שים את הצלחת 96 לתוך קורא צלחות (טבלת חומרים). לנער את הצלחת עבור 60 s ב 500 rpm באמצעות שייקר מסלולית בקורא לוחית לערבב את הבארות.
הערה: תרבויות Cyanobacterial יכולות לצבור ו/או לאתר, כך שערבוב טוב הוא קריטי לפני קריאה למדידות מדויקות. - מדידה OD750 ו-הזריחה eyfp עם עירור/פליטת אורכי גל ב 485 nm/520 nm.
- להפחית את הממוצע של OD750 מדידות של שתי בארות ריקות מן od750 מדידה של כל מדגם שמכיל היטב את התרבות הקיאנקטריה.
- לנרמל את ערכי הקרינה הפלואורסצנטית של כל דגימת תרבות על-ידי חלוקת המדידה הפלואורסצנטית eYFP (שלב 4.2.3) על-ידי ה-OD המותאם750 של התרבות (שלב 4.2.4). לאחר מכן, הפחת את ערך הזריחה המנורמל הממוצע של המקור (עין פלואורסצנטית/OD750) של השכפל הביולוגי של זן מתאים של שליטה שלילית מן הזנים הטרנסגניים הנושאים את הקלטת הביטוי eyfp.
הערה: כחוליות הקיאנקטריה באופן טבעי כתוצאה מנוכחות פיגמנטים, כגון כלורופיל וחלבונים. - העלילה התרבות הצמיחה לאורך זמן (איור 6A) ואת ערכי הזריחה מנורמל eyfp של כל תרבות ניסויית בנקודות הזמן המבוקש (למשל, 72 h; איור 6ב).
- לערבב בקצרה את התרבויות בצלחת 24-באר (שלב 4.1.4) עם ליטוף עדין. העבר מדגם משנה של כל אחת מהתרבות לצלחת שחורה בעלת תחתית שטוחה 96-באר (טבלת חומרים). דלל במידת הצורך (100 μL). הימנע היווצרות בועות כמו זה יכול להפריע לדיוק מדידה.
- ציטומטר זרימה
- בחר צלחת תואמת עבור מערכת הטיפול הנוזלי של הזרימה cytometer. לדוגמה, השתמש בלוח ה96 עגול-למטה (לוח חומרים) עם הזרימה cytometer (טבלת חומרים) המשמשת בפרוטוקול זה.
- לערבב בקצרה את התרבויות בצלחת 24-באר (שלב 4.1.4) עם ליטוף עדין. לדלל תרבויות כדי OD750 = 0.1-0.2 כדי למנוע חסימות חרירים במערכת הטיפול הנוזלי. הוסף את הנפח המתאים של דגימת התרבות לצלחת 96-באר והבא לנפח הסופי של 250 μL עם תמיסת מלח מעוקר באגירה 1 x פוספט (PBS). כלול באר ריקה עבור פתרון בינוני על הצלחת המכילה 60 μL של BG11 ו 190 μL של 1x PBS.
הערה: אמצעי אחסון זה מומלץ במקרה שיש צורך להפעיל מחדש דגימות. אמצעי אחסון הגבוהים מ-250 μL אינם מומלצים כאמצעי האחסון המרבי של כל באר הוא 300 μL. - ברגע שהציטומטר הזרימה מוכן לשימוש, הציבו את הצלחת 96-באר עם דגימות תרבות בתחנת הטיפול הנוזלי. הגדר את פרוטוקול התוכנה עבור cytometer הזרימה כדי לאסוף את המידות של 10,000 אירועים בודדים (למשל, תאים). מדידת הקרינה הפלואורסצנטית עם עירור/פליטת אורכי גל של 488 ננומטר/515-545 nm. מדידה ראשונה ולבדוק את הקריאה מן הבאר הריק (איור 7א), ואז להפעיל את הדגימות.
- משערים את אוכלוסיית הקיאנקטריה בתוך ערכות הנתונים הקדמיים והצדדיים פיזור, למעט אזורים המשותפים עם הקריאה הריקה (איור 7ב). הפחת את ערכי הזריחה הממוצעת eYFP של השכפל הביולוגי של זן שליטה מתאים שלילי מתוך זנים טרנסגניים הנושאים את הקלטת הביטוי eYFP (איור 7C, D). להתוות את הממוצע של ערכי הזריחה החציוני לכל תא עבור כל תרבות ניסויית בנקודות הזמן הרצויות (למשל, 72 h; איור 7E).
5. הפקת דנ א גנוקטריה
הערה: הפרוטוקול שלהלן משתמש בערכת הפקת דנ א מסחרית (טבלת חומרים).
- הגדל תרבות נוזלית בBG11 (כמתואר בסעיף 3.1) עד OD750 = 1.5-3.0. ספין למטה 10 מ ל של התרבות ב 3,000 x g עבור 10 דקות ולהיפטר supernatant. להקפיא את הגלולה על ידי דגירה את הצינורות ב-20 ° c עבור 30 דקות.
- הוסף 400 μl של מאגר הליזה (מאגר AP1) ו 400 μl של הפתרון ריבונוקלאז (rnase A), ו 50% (w/v) של חרוזי זכוכית (0.5 מ"מ קוטר). הפרעה בדגימות באמצעות טחנת חרוז (טבלת חומרים) ב -30 הרץ (כלומר, שווה ל-1,800 תנודות/דקות) עבור 6 דקות.
- ספין את המדגם ב 17,000 x g עבור 5 דקות ובזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור חדש ולמחוק את הגלולה. המשך בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
6. אגבה ג'ל
- להטיל 1% (w/v) ג'ל המכיל 0.02% (v/v) אתידיום ברומיד. הטען דגימות והתייחסות. מתאימה לסולם דנ א
- הפעל את הדגימות עבור 50 דקות ב 125 V. בדוק אם הפרדת הלהקה על מעבר אולטרה סגול (UV).
הערה: ניתן לשנות את הזמן הפועל ואת אחוז ה-gel-ג'ל כדי להתאים לגודל הלהקה המצופה. לדוגמה, אחוז גבוה יותר העלה ג'ל וזמן ריצה ארוכה יותר עשוי לשפר את הרזולוציה הלהקה ואת ההפרדה של מוצרי DNA < 500 bp.
7. המושבה ה-PCR
- הגדר שילוב של תגובת PCR תוך שימוש בערכה סטנדרטית (טבלת חומרים) ושילוב מתאים של התחל (למשל, המאגף את אזור ההרכבה או ספציפי לרצפים בתוך אזור ההרכבה (שולחן 3). פיפטה 10 μL. לתוך צינור הPCR
- גע בעדינות בחלק העליון של מושבה לבנה אחת עם קיסם שיניים סטרילי או מיכל פיפטה בשילוב של 10 μL ואיחסן צינור PCR המכיל את המיקס של תגובת ה-PCR. . ולהתאים לצינור ה-PCR המסוים בעדינות לערבב את תערובת התגובה כדי להבטיח התאים E. coli הם לשפוך לתוך הפתרון.
- . להגביר את המוצרים ע י ה-PCR השתמש בתוכנית המורכבת מצעד התחלתי הראשוני של 95 ° c עבור 60 s, 30 סיבובים של 95 ° צ' עבור 15 s, 58 ° צלזיוס עבור 15 s (מספר מעלות מתחת לערכי Tm של התחל), 72 ° צ' עבור 30 s (30 s/kb של הוספה) , ואחריו צעד הארכה הסופי של 72 ° c עבור 5 דקות.
8. הכנת בינוני וצלחות BG11
- הכנת פתרונות מניות של 100x BG11 בינוני, ברזל (אמוניום מלאה, מעקב), אלמנטים קורט, פוספט (K2hpo4), Na2CO3 ו-TES מאגר לפי לאה-סמית et al.11. לאוטוקלב פוספט Na2CO3 מניות. השימוש 0.2 יקרומטר מסננים כדי לסנן לעקר את מאגר TES (pH 8.2) ו נחקו3 פתרונות מניות.
- להכין 1 L של BG11 בינוני. מערבבים 10 מ ל של 100x BG11, 1 מ ל של אלמנטים קורט 1 מ ל של מלאי ברזל והוא הפתרון עם 976 mL של מים. לאחר הפתרון התקרר עד RT, להוסיף 1 מ"ל של מלאי פוספט, 1 מ ל של Na2CO3 מלאי ו 10 מ ל של נחקו3, ולהתאים ל-pH 7.6-7.8 עם HCl 1 M.
- LB-BG11 אגר צלחות (1.5% [w/v])
- שילוב 700 mL של מים מוכי 15 גרם של אגר בבקבוקון זכוכית. בבקבוקון שני, להוסיף 186 mL של מים, 10 מ ל של 100x BG11, 1 מ ל של יסודות קורט 1 מ ל של מלאי ברזל. אוטוקלב הן פתרונות.
- לאחר הפתרונות יש לקרר בסביבות 60 ° c, לשלב אותם ולהוסיף 1 מ ל של מלאי פוספט, 1 מ ל של Na2CO3 מלאי, 10 מ ל של נחקו3 מניות ו 50 ML של מדיום סטרילי ליברות, אשר אמור לתת נפח סופי של 1 L. מנות פטרי עם 25 mL של LB-BG11 אגר בינונית.
- לוחות BG11 + Kan50 אגר (1.5% [w/v])
- שילוב 700 mL של מים מוכי 15 גרם של אגר בבקבוקון זכוכית. בבקבוקון שני, להוסיף 3 גרם של נתרן thiosulphate (Na2S2O3), 226 mL של מים, 10 מ ל של 100x BG11 מניות, 1 מ ל של יסודות קורט 1 מ ל של מלאי ברזל. אוטוקלב הן פתרונות.
- לאחר הפתרונות התקרר בסביבות 60 ° c, לשלב אותם ולהוסיף 1 מ ל של מניות פוספט, 1 מ ל של Na2CO3 מלאי, 10 מ ל של מניות מאגר TES, ו 10 מ ל של נחקו3 מניות, אשר צריך לתת נפח הסופי של 1 L. הוספת כמות מסחרית לריכוז הסופי של 50 μg/mL ולהטיל מנות פטרי עם 35 mL של בינוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את זרימת העבודה של ההרכבה של שער הזהב, קלטת ביטוי הורכבה במיקום רמה 1 (קדימה) וקטור (pICH47732) המכיל את החלקים הבאים ברמה 0: המקדם של C-phycocyanin אופרון Pcpc560 (pc 0.005), רצף קידוד עבור eYFP (pC 0.008) ו שליחות קטלנית TRrnb (pc 0.082)12. בעקבות טרנספורמציה של תגובת ההרכבה, זוהו מכלולים מוצלחים באמצעות הקרנת כחול-לבן רגיל של מושבות E. coli (איור 3). הקלטת הביטוי eYFP בווקטור ברמה 1 ובווקטור הקצה-קישור 1 (pICH50872) התאספו לאחר מכן לתוך וקטור מרמה (pPMQAK1-T) כדי להעניק את הווקטור Cpcba-Eyfp (איור 4א). וקטור Cpcba-eyfp שנאסף אומת על ידי עיכול הגבלה (איור 4ב).
העברת התייחדות מוצלחת של Cpcba-eyfp או ריק PPMQAK1-T וקטור (כלומר, שליטה שלילית חסר את הקלטת ביטוי eyfp) הביא לצמיחה של עד כמה מאות מושבות על הקרום עבור Sy לוצילף pcc 6803 ו S. elongatus utex 2973 לאחר 7-14 ימים ו-3-7 ימים, בהתאמה (איור 5). מושבות בודדות נלקחו וברותחו על לוחות טריים BG11 + Kan50 אגר; 2-3 פסים מחדש נדרשו כדי ליצור תרבויות axenic.
ככל הצפוי של Pcpc560 יזם51, הערכים עבור הקרינה הפלואורסצנטית eyfp מן הקורא לוחית הקרינה eyfp לכל תא מן cytometer הזרימה היו גבוהים בהשוואה לשליטה שלילית (איור 6 ו איור 7). ערכי הקרינה הפלואורסצנטית היו גבוהים יותר ב -S. elongatus utex 2973 מאשר ב- Synechocystis pcc 680312.
איור 1: סקירה של תהליך ההרכבה של שער הזהב בציאנוגייט. הרכבה של קלטת ביטוי גנים מוצגת, החל מהגברה של רצף עניין מ-DNA של תבנית להרכבה בווקטור ברמה T (חלקים אינם נמשכים לקנה מידה). (א) העיצוב של קדימה והפוך התחל עבור הגברה של חלק CDS1 מ-dna תבנית (g., גנומית או פלמיד DNA). המיקומים של אתרי ההגבלה BpiI והיתר הנדרש עבור ההכנסה לתוך וקטור הקבלה (כלומר, 5 ′ ו 3 ′ של רצף התבנית) מודגשים באדום ובכחול, בהתאמה. האות "n" מציינת שכל NT יכול לשמש במיקום זה. אזורי הריפוי של התחל עם תבנית ה-DNA וטמפרטורות ההיתוך המומלצות שלהם (Tm) מצוינים. (ב) רמה 0 הרכבה של מוצר ה-PCR לתוך CDS1 וקטור רמה 0 של pICH41308. הרצף שיגורש על ידי BpiI וליגור לתוך וקטור הקבלה מודגש בכחול. (ג) הרכבה ברמה 1 של קלטת ביטוי גנים המכילה שלושה חלקים ברמה 0 (Pro + 5u, CDS1 ו-3u + Ter) למיקום ברמה 1 1 (קדימה) וקטור pICH47732 באמצעות bsai. (ד) רמת t ההרכבה של ההרכבה רמה 1 וקישור הקצה 1 (pICH50872, הנקרא "רמה M קצה-קישור 1" ב-engler ואח '15) לתוך וקטור ברמה (למשל, pPMQAK1-T) באמצעות bpii. (ה) האחרון התאספו וקטור רמת T. קיצורים: AmpR, קלטת התנגדות אמפיצילין; CarbR, קלטת התנגדות carbenicillin; CDS1, רצף קידוד בתחביר רמה 015; EL1, חלק קצה-קישור 1; קנאר, קלטת התנגדות קאנאמיצין; לקטα, β-גלטוסידאז, קלטת ביטוי; . מspectinomycin, קלטת התנגדות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית ביות מבוססת-PCR להסרת אתר הגבלת סוג לא חוקי של IIS. (א) תרשים סכמטי המראה שני זוגות פריימר (בירוק וכתום, בהתאמה) לשינוי אתר BPII (GAAGAC) ל-gaggac ברצף החלבון קוד DNA המיועד להרכבה לתוך CDS1 Level 0 אישור וקטור (pICH41308). שימו לב שהשינוי משמר את הקודון לחומצה גלוטמית (לגלו) (כלומר, גה למחסום-על). למרות שהאתר BpiI מוצג במסגרת עם ההתחלה codon, גישה זו תפעל גם אם האתר אינו במסגרת (כלומר, כל עוד האתר משתבש, ואת רצף החלבון נשמר). מיקומם של אתרי ההגבלה BpiI והיתר בצבעי היסוד מודגשים באדום ובכחול, בהתאמה. תבנית הדנ א ורצף החלבונים המתורגם מודגשים בצהוב. אזורי הריפוי של התחל עם תבנית ה-DNA וטמפרטורות ההיתוך המומלצות שלהם (Tm) מצוינים. הזוג הכתום משמש כדי להגביר את הקצה של 5 ′ של הרצף עם overatg ו TGAA (קטע 1), בעוד הזוג הירוק משמש כדי להגביר את הקצה של 3 ′ עם מTGAA ו GCTT (רסיס 2). לפני הזמנת התחל, הנאמנות של TGAA פיוז מוגזם עבור קטע 1 ו-2 נבדק בקפידה52. היתוך מעוצב בצורה גרועה עלול להוביל לכשל הרכבה (כלומר, אין מושבות הבאות בעקבות טרנספורמציה; איור 5) או תוצאות חיוביות שגויות (לדוגמה, מכלולים מעוגלים או שגויים). ניתן לפתור את האפשרות האחרונה לסינון מספר גדול יותר של מושבות לבנות כדי לזהות את המבנה הנכון. (ב) הגברה של קטעים 1 ו-2 לאחר ההגבלה עם bpii במהלך האסיפה שער הזהב. (ג) הרצף התרבותי שנאסף לתוך וקטור הרמה 0 CDS1 מאשר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקרנת המושבה הכחול-לבן של E. coli transformants בעקבות הרכבת שער הזהב. הצלחות המוצגות מכילות LB אגר (1% [w/v]) שיושלם עם X-גל, IPTG ואנטיביוטיקה בריכוזים המתאימים. (א) אין מושבות, מציע תגובת הרכבה כושלת ו/או התמרת אי-קולי . (ב) בעיקר מושבות כחולות, המציינות הרכבה מוצלחת, אך היעילות של אנזים ההגבלה המשמשת בתגובת ההרכבה הייתה נמוכה. (ג) בעיקר מושבות לבנות, מעיד על תגובת הרכבה טיפוסית ומוצלחת. (ד) אין מושבות כחולות, המצביעות על הרכבה יעילה מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אימות של וקטור רמת T מורכב על-ידי עיכול הגבלה. הווקטורים התעכלו. בידי האינדישני ובבהי (א) מפת רצף של PPMQAK1-t (CT. 0) וקטור הרמה t (cpcba-eyfp) מציג רכיבים של קלטת הביטוי eyfp (PCpc560-eyfp-Trrnb). המיקומים של אתרי ההגבלה עבור HindIII ו-BamHI מצוינים. לאחר העיכול הכפול, הגדלים החזויים של קטעי ה-DNA מצוינים: (1) 5,847 bp, (2) 2,004 bp, (3) 30 bp, (4) 374 bp, (5) 1,820 bp, (6) 1,289 bp, ו-(7) 156 bp. (ב) ג'ל agarose (0.8% [w/v]) לרוץ ב 125 v עבור 60 min טעון עם הרמה מתעכל T הרכבה (Cpcba-eyfp) מציג להקות 1, 5 ו-6, PPMQAK1-T הריק מתעכל וקטור (CT. 0) מציג להקות 1 ו 2 ו-DNA סולם (טבלת חומרים). שימו לב כי להקות 3, 4 ו -7 היו קטנות מכדי להמחיש על הג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צמיחת הטרנסגניים מ6803 מושבות בעקבות הקוניוגציה מוצלחת. דוגמאות לממברנות בעקבות דגירה של BG11 + Kan50 אגר לוחות מוצגים. (א) גידול יתר בעקבות הקוניוגציה היעילה ביותר -מושבות 6803 התפתחו למדשאה ללא מושבות נפרדות. (ב) יעילות הקוניוגציה טובה המציגה כמה מאות מושבות בודדות אחרי 12 ימים. (ג) הצמיחה של זן axenic לאחר 14 ימים בעקבות מספר סיבובים של מחדש החוצה על לוחית BG11 + Kan50 אגר טריים. העדר זיהום חיידקי הצביע על כך ש6803. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נתוני הצמיחה הנציג וערכי הזריחה של eYFP מנורמלת באמצעות קורא לוחית. (א) צמיחה השוואה של זנים הנושאים cpcba-eyfp או pPMQAK1-T ריק וקטור (CT. 0, שלילי בקרה) ב sy, 6803 ו S. elongatus utex 2973. ערכים הם האמצעים ± SE מ -4 משכפל ביולוגי. סינכלף PCC 6803 ו -S. elongatus utex 2973 היו מתורבתים עבור 72 h ב 30 ° צ' עם אור רציף (100μpפוטונים m-2s-1) ו-40 ° c עם 300 ממול פוטונים m-2s-1, בהתאמה. (ב) ערכי הזריחה המנורמבים של sy, 6803 או S. elongatus Utex 2973 בעלה עם cpcba-eyfp ב 72 h. ערכים הם האמצעים ± SE מתוך ארבעה משכפל ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הנציג eYFP ערכי זריחה באמצעות cytometer זרימה. (א) לפזר מזימה (A) קדימה (FSC-H) ומצד שני (למעלה) מהפתרון הבינוני "הריק" (BG11 ו-PBS). (ב) פיזור מגרש עבור מדגם 6803 ( מימין). המעגל מעיד על האזור הנבחר החוצה את אוכלוסיית הקיאנקטריה משאר האות לדוגמה. (ג) היסטוגרמה של האזור הסגור לנבג הנושא את הווקטור הריק PPMQAK1-T (CT. 0, שליטה שלילית). (ד) היסטוגרמה של האזור מגודרת עבור זן נושאת cpcba-eyfp. (ה) ערכי הקרינה הפלואורסצנטית לכל תא ב- sy, 6803 ו- S. elongatus utex 2973 ב 72 h.. קרינה מהפקד השלילי הוטלה ערכים הם האמצעים ± SE מ -4 משכפל ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| לא. | מזהה וקטורי | שם | תיאור/ | 5 ' להיתלות | 3 ' להיתלות |
| 1 | pICH41233 | Pro | קדם | מיכל מגניל | טקט |
| 2 | pICH41295 | Pro + 5U | יזם ו 5 טף באזור שלא תורגם | מיכל מגניל | מיכל כהן |
| 3 | pAGM1251 | Pro + 5U (f) | יזם ו 5 טף מתורגם רצף עבור N מסוף fusions | מיכל מגניל | מיכל כנעני |
| 4 | pICH41246 | 5U | 5 טף האזור הבלתי מתורגם | טקט | מיכל כנעני |
| מיכל 5 | pAGM1263 | 5U (נ) | 5 ′ רצף מתורגם עבור N מסוף fusions | טקט | מיכל כנעני |
| 6 | pICH41246 | 5U + NT1 | 5 טף אזור מתורגם ו-N מסוף באזור קידוד | טקט | מיכל כנעני |
| 7 | pAGM1276 | NT1 | תגית מסוף N או אות לוקליזציה | מיכל כנעני | מיכל כהן |
| 8 | pICH41258 | SP | פפטיד איתות | מיכל כהן | מיכל מאיול |
| 9 | pICH41258 | NT2 | תגית מסוף N או אות לוקליזציה | מיכל כהן | מיכל מאיול |
| 10 | pAGM1287 | CDS1 ns | אזור הקידוד ללא הפסקת מסור | מיכל כהן | מיכל הגנה |
| 11 | pICH41308 | CDS1 לעצור | אזור קידוד עם הפסקת מסור | מיכל כהן | מיכל המלט |
| 12 | pAGM1299 | CDS2 ns | אזור קידוד-ללא התחלה ולעצור קודון | מיכל מאיול | מיכל הגנה |
| 13 | pICH41264 | CDS2 לעצור | אזור הקידוד-ללא התחלה ובלי לעצור מסור | מיכל מאיול | מיכל המלט |
| 14 | pAGM1301 | CT | C תג מסוף או אות לוקליזציה | מיכל הגנה | מיכל המלט |
| 15 | pICH53388 | גודל 3u | 3 טף האזור הבלתי מתורגם | מיכל המלט | היכל ה, GGTA |
| 16 | pICH53399 | Ter | שליחות קטלנית | היכל ה, GGTA | CGCT |
| 17 | pICH41276 | 3U + מנטר | 3 טף באזור ללא תרגום ושליחות קטלנית | מיכל המלט | CGCT |
| 18 | pICH41331 | CGM | קבלת עבור קלטות גן מלאות | מיכל מגניל | CGCT |
| 19 | 0.002 | Pro (עותק נמוך) | יזם, קבלה מספר עותק נמוך (pSC101 ori) | מיכל מגניל | טקט |
| 20 | 0.001 | מקצוען | יזם מעוגל לאתר תחילת התמלול | מיכל מגניל | מיכל הג |
| 21 | ישיר לרמה 1 | מאיר שלמה | רנ א קטן (למען השתקה) | מיכל הג | GTTT |
| 22 | ישיר לרמה 1 | שרונה | מדריך ליחיד RNA (עבור CRISPRi) | מיכל הג | GTTT |
| 23 | pICH41295 | האגף | האגף החוצה במעלה הזרם של שילוב מטרה הומולוגי באתר | מיכל מגניל | מיכל כהן |
| 24 | pICH41276 | למטה האגף | האגף החוצה במורד הזרם של שילוב מטרה הומולוגי מחדש | מיכל המלט | CGCT |
טבלה 1: רשימה של וקטורים זמינים מרמה 0 אשר והיתקעות יתר. ווקטורים 1-18 הם מערכת. הציוד של המפעל15 ווקטורים 19-22 הם. מערכת הציאנושער12 עבור החלקים srRNA ו sgRNA, רצפים מסונתז או מוצרי PCR מורכבים ישירות לתוך וקטורים ברמה 1. וקטורים 23-24 הם מערכת MoClo הצמח שכבר מחדש לטרנספורמציה על ידי שילוב הומוולוגי באמצעות ערכת ציאנוגייט.
| רכיבי הרכבה של BpiI (רמה 0, T) | רכיבי הרכבה של BsaI (רמה 1) | ||
| 50-100 וקטור קבלה | 50-100 וקטור קבלה | ||
| עבור כל וקטור/חלק להוסיף, השתמש ביחס 2:1 של הוספה: קבלה של קבלה. | עבור כל וקטור/חלק להוסיף, השתמש ביחס 2:1 של הוספה: קבלה של קבלה. | ||
| 2 μL 10 מ"מ (טבלת חומרים) | 2 μL 10 מ"מ (טבלת חומרים) | ||
| מאגר 2 μL (מאגר עבור BpiI/Bpii) | מאגר 2 μL (מאגר עבור BpiI/Bpii) | ||
| 2 μL BSA (10x) (טבלת חומרים) | 2 μL BSA (10x) (טבלת חומרים) | ||
| 10 יחידות BpiI (1 μL10 U/μL BpiI, טבלת חומרים) | 10 יחידות BsaI (1 μL 10 U/μL BsaI, טבלת חומרים) | ||
| . הבא ל -20 Μ$ עם dH2או | . הבא ל -20 Μ$ עם dH2או | ||
| 200 יחידות של T4 לימוד DNA (1 μL 200 U/μL, טבלת חומרים) | 200 יחידות של T4 לימוד DNA (1 μL 200 U/μL, טבלת חומרים) | ||
| פרוטוקול הציקלט (רמה 0, T) | פרוטוקול הציקלטרנר (רמה 1) | ||
| 37 ° c במשך 10 דקות | מחזור x 5 | 37 ° c במשך 10 דקות | מחזור x 5 |
| 16 ° צ' במשך 10 דקות | 16 ° צ' במשך 10 דקות | ||
| 37 ° c עבור 20 דקות | 37 ° c עבור 20 דקות | ||
| 65 ° c במשך 10 דקות | 65 ° c במשך 10 דקות | ||
| 16 ° צ' (החזיקו) | 16 ° צ' (החזיקו) |
טבלה 2: פרוטוקולים עבור הרכבות של שער הזהב ברמות 0, 1 ו-T. בהרכבה ברמה 0 ובאמצעות וקטורים מסוימים של האפשרות משתמש באנזים הגבלה BpiI (משמאל). הרכבה ב-Level 1 מאשר וקטורים משתמש באנזים הגבלה BsaI (מימין). שולחן זה הותאם מ Vasudevan et al.12.
| פריימר לא. | רצף (5 '-3 ') | אורך (bp) | תיאור/ |
| L0T קדימה | מוזיאון התיירות הגנה מפני משחק |
28 | הגברה מרמה 0 ומרמת T |
| L1 הפוכה | מיכאל לונוב מיכל שגיא |
26 | עבור הגברה מרמה 1 |
| L1 קדימה | מוזיאון התיירות היכל הג |
24 | עבור הגברה מרמה 1 |
| L0T הפוכה | מיכל הגנה | 20 | הגברה מרמה 0 ומרמת T |
שולחן 3: רשימת התחל של אימות PCR או רצף של רמה 0, 1 ו-T וקטורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להרכבת שער הזהב יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה וקטוריות אחרות, במיוחד במונחים של מדרגיות של20,21. עם זאת, הקמת מערכת שער הזהב במעבדה דורשת זמן לפתח היכרות עם החלקים השונים ולקבלה של ספריות וקטוריות ותהליכי הרכבה כוללים. תכנון קפדני נדרש לעתים קרובות עבור הרכבות מורכבות יותר או בעת ביצוע מספר רב של הרכבות מורכבות במקביל (למשל, ביצוע חבילה של וקטורים ברמה המכילה הקלטות מרובות גנים ביטוי). אנו ממליצים לרשום תחילה את כל שילובי הקלטת ביטוי הגנים הדרושים ולאחר מכן מיפוי של זרימת העבודה מרמה 0 עד רמה T ב סיליקו. במהלך תהליך זה, משתמשים צריכים לשקול את רמה 1 "דמה" החלקים הזמינים בערכת MoClo המפעל המאפשרים הרכבה של וקטורים ברמה 1 לא רציפים ברמה T (למשל, רמה 1 מיקום 1 ומיקום 3 וקטורים ניתן להרכיב יחד עם "דמה" חלק רמה 1 מיקום 2), אשר יכול להפחית את המספר הכולל של תגובות ההרכבה ושיבוט שלבי הנדרש15.
סינתזה של דנ א היא בדרך כלל השיטה הפשוטה ביותר לבניית חלקים ברמה החדשה 0. עם זאת, כאשר נדרש שיבוט (למשל, מ פלמידים או DNA גנומית), אופטימיזציה העיצוב של התחל המשמש הגברה הוא חשוב למקסם את היעילות של הרכבה ברמה 0 וקטורית הבאים. שני השלבים הקריטיים ביותר בעיצוב התחל הם: 1) בודקים כי היתר המותחים הנכונים נכללים ונמצאים בכיוון המתאים של התחל הקדמי והאחורי (איור 1 ושולחן 1) ו-2) מבטיחים שאורך הפריימר רצף המספח לתבנית ארוך מספיק (18-30 bp) ושערך ה-Tm עבור רצף זה (באופןאידיאלי 58 עד 62 ° c) דומה לצמד התחל (איור 1א). אם רצף דורש ביות, מספר אסטרטגיות זמינות. עבור רצפים קצרים (למשל, < 200 bp), זוג הרבה קדימה והפוך התחל יכול להיות מעוצב שבו 3 ′ מסתיים לאחד את השני (כלומר, חפיפה של > 20 bp) וטופס רצף תקוע כפול אחרי הגברה. לרצפים ארוכים יותר, ניתן לחשב שברים נפרדים של הרצף שיסירו אתרי הגבלה בלתי חוקיים ולאחר מכן התאספו באמצעות גישת הרכבה של שער הזהב (איור 2). אם יעילות ההרכבה עם מוצרי ה-PCR היא ירודה, ניתן לשכפל שברים בודדים ברצף של רמה 0 לתוך הווקטור של הקבלה האוניברסלית ברמה 1 (pAGM1311), לאימות ולאחר מכן להרכבה ביחד לתוך הווקטור המתאים של הרמה 0 וקטור15. הוספה 2:1: קבלה וקטור טוחנת היחס מומלץ להרכבה יעילה שער הזהב. עם זאת, עבור הרכבות של 2-3 וקטורים בלבד (g., שני חלקים ברמה 0 ו-וקטור ברמה 1), שילוב ~ 100 ng של כל אחד בדרך כלל באופן קבוע בהרכבות מוצלחות. היעילות של ההרכבות נוטה להצטמצם כמו מספר וקטורים המשמשים להגברת התגובה, וכתוצאה מכך ירידה במספר הכולל של מושבות לבנות לאחר ההמרה (איור 3).
לפני הקוניוגציה, מומלץ לעבור בדיקת וקטורים מדרגה שלמה באמצעות תקציר הגבלה ו-PCR. העברת DNA הזוגיות היא טכניקה מאוד בלתי ניתנת להעברה עבור זנים cyanobacterial, כולל אלה שאינם ודולרי באופן טבעי41,45. הצעדים החשובים בפרוטוקול הקוניוגציה כוללים: 1) טיפול זהיר של העוזר E. coli להתאמץ בעקבות הצמיחה לילה (g., להימנע vortexing)35, 2) דואג לחלוטין להסיר עקבות של אנטיביוטיקה המשמשים לגדול עוזר ו המטען E. coli זנים, 3) תקופת הדגירה המתאימה לתערובת של מטענים וזנים מסייע ו כחוליות (למשל, תקופת דגירה ארוכה יותר היה קריטי עבור S. elongatus utex 2973), ו 4) את תקופת ההעברה הראשונית של התא תערובת על ממברנות ליברות-BG11 אגר לוחות חסר אנטיביוטיקה עבור 24 שעות.
מושבות cyanobacterial מבודדות צריכות להתפתח על הקרום בתוך שבועיים עבור Syelongatus לוצילף pcc 6803 ו -S. utex 2973, אחרת סביר להניח כי הקוניוגציה נכשלה. לאחר מכן ניתן היה לבחון מספר שינויים בפרוטוקול, כולל 1) באמצעות תרבות ציקובלאלית עם צפיפות גבוהה יותר (למשל, OD750 = 1.5-2); 2) הגדלת תקופת הדגירה לפני המעבר לקרום; ו 3) הארכת תקופת הדגירה הראשונית על הקרום מ 24 h כדי 48 h (כלומר, כדי לאפשר זמן נוסף עבור הביטוי של הגן עמידות לאנטיביוטיקה על וקטור הועברו). אם הקוניוגציה עדיין נכשלת, ניתן לנסות שיטות אלטרנטיביות כגון אלקטרופורציה53. מאשרת זן הטרנסקובאנאלי מעבר לחומר הוא axenic חשוב לפני ניסויים נוספים. לבסוף, זה אימון טוב כדי לאשר את הגודל של וקטור הטרוולוגי בתוך זן cyanקובאל הטרנסגניים. האחרון דורש מיצוי ה-DNA (סעיף 5), טרנספורמציה אל החיידק והבחירה (סעיף 2.1), ואימות וקטורי (סעיף 2.4).
פרוטוקול אפיון המקדם המחולק לרמה משתמש בנפחים תרבותיים קטנים (כלומר 2 מ ל) כאמצעי להשגת מתודולוגיה לסינון תפוקה גבוהה. ניתן להשתמש באמצעי אחסון גדולים יותר בהתאם לשטח הפוטוביריאקטור הזמין, שיסייע בהפחתת בעיות האידוי בתרבות. אם יש צורך בסינון תפוקה גבוהה עם אמצעי אחסון קטנים לתרבות, חיוני לקבל לחות גבוהה בתוך חדר הגידול כדי לעכב את האידוי. אידוי במהלך ניסוי הצמיחה יכול להיות מזיק לדיוק ולחוקיות של מדידות לדוגמה. האם לבדוק אמצעי התרבות במהלך ואחרי הניסוי כדי לאשר כמה התאיידות התרחשה.
עבור מדידות קורא לוחית, חשוב למדוד תרבויות בצפיפויות נמוכות, באופן אידיאלי OD750 < 1, כדי להבטיח את הרכישה של צמיחה אמינה ונתונים פלואורסצנטית. קשר ליניארי בין מספר התאים ו-OD750 הוא נצפה רק בתוך טווח מסוים54. כדי לבסס את הטווח הזה, אנו ממליצים לבצע דילול טורי (למשל, מ OD750 = 0.1-1.0) באמצעות טרנספורנט ידוע שבו הקרינה הפלואורסצנטית eyfp אושרה. התוויית קרינה פלואורסצנטית מוחלטת מפני קרינה פלואורסצנטית מנורמלת (הקרינה הפלואורסצנטית/OD750) תסייע לזהות את טווח העבודה הליניארי של צפיפות התרבות. מספר קוראי צלחות כוללים תכונה "רווח" כדי לשנות את הרגישות של גלאי הקרינה הפלואורסצנטית. במקרה זה, ערך הרווח צריך להיות מוגדר לרמה המתאימה לפני תחילת הניסוי ולא השתנה בין מסלולים ניסיוניים שונים, או שהנתונים לא יהיו מקבילים באופן ישיר.
למרות הפעולה של cytomטומטריים שונים יהיה שונה בין יצרנים, חשוב לקחת קריאה ריקה של הפתרון הבינוני כדי להקל על זיהוי וביצוע של אוכלוסיית היעד cyanקובאיאלית מכל אות ברקע המדיום (איור 7א, ב). לאחר מכן, חיסור של ערך הזריחה של דגימת שליטה שלילית (למשל, זן סוג פראי) יסייע להסיר את המקור המקורי (איור 7C, D). הצינור החשמלי (PMT) לפרמטר המתח ב-cytometer מכיל פונקציה דומה לרווח בקורא צלחות, כלומר, הגדלה או הקטנה של הרגישות של הגלאי לעוצמת האות הפלואורסצנטית. בדומה לקורא הצלחות, יש להגדיר את המתח המתאים לרמה המתאימה לפני תחילת הניסוי55. לאחר ההגדרה, יש לשמור על ערך המתח של PMT בין הרצפים הניסיוניים השונים או שהנתונים לא יהיו מקבילים באופן ישיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה על מועצת המחקר של הביוטכנולוגיה PHYCONET ומדעי הביולוגיה (BBSRC) רשת ביוטכנולוגיה תעשייתית, Bioenergy (NIBB) ומרכז החדשנות ביוטכנולוגיה (IBioIC) לתמיכה כספית. GARG, AASO ו AP הענקת מימון תמיכה מן התוכנית המקצועית של ה-BBSRC מקרה PhD (הענק מספר BB/M010996/1), Consejo הלאומי דה Ciencia y Tecnología (CONSEJO) PhD תוכנית, ואת IBioIC-BBSRC שותפות הדרכה (CTP) התוכנית PhD, בהתאמה. אנו מודים לקונרד מולקו (המלכה מרי אוניברסיטת לונדון) ו פול אריק ג'נסן וג אנמרי זיטה זדלר (אוניברסיטת קופנהגן) לתרומות וקטורים בפרוטוקולים וקטוריים וייעוץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | - | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | - | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | - | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
References
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , Wiley Blackwell. New York. 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
