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Biology

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

doi: 10.3791/60451 Published: October 31, 2019
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、i)CyanoGateモジュラークローニングツールキットを用いて自己複製ベクターを組み立てる方法を記述するプロトコルを提示し、ii)結合によりシアノバクテリア宿主にベクターを導入し、iii)を用いてトランスジェニックシアノバクテリア株を特徴付ける。プレートリーダーまたはフローサイトメトリー。

Abstract

シアノバクテリアは、有用な工業製品の再生可能な生産のために遺伝子組み換えすることができる原核生物の多様なグループです。合成生物学の最近の進歩は、シアノバクテリアへのその後の形質転換または共役転移のためのプラスミドベクターを構築するための標準化されたモジュラークローニングシステムであるCyanoGateなどのいくつかのクローニングツールキットの開発につながっています。ここでは、自己複製ベクター(例えば、蛍光マーカー発現カセットを運ぶ)を組み立てるための詳細な方法と、シアノバクテリア株シネキスシスプスPCC 6803またはシネココッカスへのベクターの共役移動の概要を説明します。エロンゲトゥスUTEX 2973。さらに、プレートリーダーまたはフローサイトメトリーを用いて遺伝的部分(例えばプロモーター)の性能を特徴付ける方法を概説する。

Introduction

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シアノバクテリアは、多種多様な天然および異種値の代謝産物1、2、3、4、5の生合成に使用できる自己栄養性細菌である。 6.いくつかのハードルは、商業的生存率を拡大するためにまだ克服する必要があり、特に、異栄養性バイオプラットフォーム(例えば、大腸菌および酵母)に比べて比較的低い収率は7である。シアン細菌研究における利用可能な遺伝子工学ツールの最近の拡大と合成生物学パラダイムの取り込みは、このような課題を克服し、効率的なバイオファクトリーとしてシアノバクテリアをさらに開発するのに役立っています8,9、10

シアノバクテリアにDNAを導入する主なアプローチは、形質転換、結合およびエレクトロポレーションである。形質転換またはエレクトロポレーションによってシアノバクテリアに移されるベクターは「自殺」ベクター(すなわち、相同組換えを促進する統合ベクター)であるのに対し、自己複製ベクターはシアノバクテリアに移すことができる。変換、結合またはエレクトロポレーション。前者の場合、自然変換11に適した工学モデル種に対してプロトコルが利用可能である。さらに最近では、CyanoGateと呼ばれるシアノバクテリア用モジュラークローニング(MoClo)ツールキットが開発されており、自然変換、エレクトロポレーションまたはコンジュゲーション12を用いたエンジニアリング用の標準化されたゴールデンゲートベクトル組み立て方法を採用している。

ゴールデンゲート型組み立て技術は近年ますます普及しており、組み立て規格や部品図書館は様々な生物に対して利用可能になりました13,14,15,1617.ゴールデンゲートは、IIS制限酵素(例えば、BsaI、Bpi、BsmBI、BtgZIおよびAarI)とアクセプタとユニークなオーバーハングのスーツを使用して、「1つのポット」アセンブリ反応における複数の配列の方向性階層アセンブリを容易にします。IIS制限酵素は、一意の非対称配列を認識し、その認識部位から定義された距離を切断して、驚異的な「粘着性の端」カット(通常は4ヌクレオチド[NT]オーバーハング)を生成し、その後、順序付けられたDNAを駆動するために利用することができます組み立て反応15,18.これにより、PhytoBricks標準19のような一般的な構文によって定義されるモジュラーレベル0部品(例えば、プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネータ)の大規模なライブラリの開発が容易になった。レベル0の部品は、レベル1式カセットに容易に組み立てることができ、その後、より複雑な高次アセンブリ(例えば、多遺伝子発現構造体)を選択12、15のアクセプタベクトルに組み込むことができる。ゴールデンゲート型組み立て技術の主な利点は、DNAファウンドリ20、21などの高スループット施設で自動化を行うことができるため、複雑な実験設計のテストが可能です。肉体労働では容易に達成できない。

シアノゲートは、確立されたプラントモクロシステム12、15に構築します。CyanoGateに新しい部品を組み込むには、まず部品シーケンスを家畜化する必要があります。オープンリーディングフレーム(すなわち、コード配列、CDS)の部品コードの場合、認識部位は、配列中の同義変異を生成することによって破壊され得る(すなわち、同じアミノ酸残基に対してコード化する代替にコドンを変更する)。これは、DNA合成からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅ベースの戦略(ギブソンアセンブリ22など)に至るまで、様々なアプローチによって達成することができる。使用される発現ホストに応じて、翻訳23の効率を阻害する可能性のある希少なコドンの導入を避けるように注意する必要があります。プロモーターおよびターミネータシーケンスの認識部位を削除することは、通常、変更が機能に影響を与える可能性があり、部品が期待どおりに動作しない可能性があるため、リスクの高い作業です。例えば、プロモーター内のプットアトリプション因子結合部位またはリボソーム結合部位への変更は、誘導/抑圧に対する強度および応答性を変化させ得る。同様に、主要なターミネータ構造特徴(例えば、GCリッチステム、ループおよびポリUテール)に対する改変は、終端効率および効果遺伝子発現24、25を変化させ得る。プロモーターおよびターミネータ配列の活性を予測し、提案された突然変異がパフォーマンス26、27に影響を与えるかどうかを通知するために、いくつかのオンラインリソースが利用可能ですが、これらのツールは、多くの場合、不十分な予測変数ですシアノバクテリアでの性能28,29,30.そのため、改変部品の生体内特性評価は、依然として活性を確認することをお勧めします。再計算配列のクローニングを支援するために、CyanoGateは、BioBrickベクターpSB4K512、16、31に基づく低コピークローニングアクセプタベクターを含む。さらに、エディンバラゲノムファウンドリーを通じて「デザインとビルド」ポータルを利用して、ベクターデザイン(dab.genomefoundry.org)を支援します。最後に、最も重要なのは、CyanoGateには、自殺ベクターを用いてシアノバクテリアにDNAを導入するための2つのレベルTアクセプタベクター設計(レベル2アクセプタベクターに相当)15、または自己複製が可能な広範な宿主範囲ベクターが含まれています。いくつかのシアノバクテリア種で 32,33,34.

ここでは、レベルT自己複製ベクターを生成するためのプロトコルとシネコシスティスPCC 6803とシネココッカス・エロンガトゥスUTEX 2973(シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥス)の遺伝子改変を記述することに焦点を当てます。UTEX 2973以下)により、活用(トライペアレンタル交配とも呼ばれる)。細菌細胞間のDNAの共役移動は、よく記述されたプロセスであり、以前にシアノバクテリア種の工学に使用されてきましたが、特にS.エロンガトゥスUTEX 297335のような自然に有能でないもの、 36、37、38、39、40、41 .簡単に言えば、シアノバクテリア培養物は、移送されるベクター(「貨物」ベクター)とベクター(同じ大腸菌株または追加株のいずれか)を運ぶ大腸菌株をインキュベートして、コンジュゲーション(「モビライザー」)を可能にします。および "ヘルパー" ベクター)。共役転移が起こるためには4つの重要な条件が必要である:1)DNA移動に関与する細胞間の直接接触、2)貨物ベクターはコンジュゲーションシステムと互換性がなければならない(すなわち、適切な伝達起源(oriT)が含まれている必要があります。また、BOM(移動度の基礎)部位として知られ、3)DNAニッキングタンパク質(例えば、暴徒遺伝子によってコードされる)は、DNAをシアノバクテリウムへの一本鎖移動を開始するためにオリットでDNAをニックし、発現しなければならない貨物またはヘルパーベクターのいずれかから、および4)転写されたDNAは、レシピエントシアノバクテリウム内で破壊されてはならない(すなわち、例えば、制限エンドヌクレアーゼ活性によって分解に対して耐性でなければならない)35、42。貨物ベクターが持続するためには、複製の起源がレシピエントシアノバクテリウムと互換性があり、自己複製および後の分裂後の娘細胞への増殖を可能にする必要があります。条件3および4を支援するために、いくつかのヘルパーベクターは、ホストシアノバクテリウム43内の天然のエンドヌクレアーゼから保護するために、暴徒のためにコードするAddgeneおよび他の商業ソースおよびいくつかのメチルアーゼを介して利用可能である。このプロトコルでは、コビライザーおよびヘルパーベクターpRK24(www.addgeneorg/51950)およびpRL528(www.addgene.org/58495)をそれぞれ運ぶMC1061大腸菌株によって結合が促進された。共役転写に使用するベクターを選択する際には注意が必要です。例えば、CyanoGateキットでは、自己複製貨物ベクトルpPMQAK1-Tがモブタンパク質12に対してコード化される。ただし、pSEVA421-Tは44ではなく、そのため、mobは適切なヘルパーベクトルから発現されなければならない。使用されるベクターは、標的生物にも適している必要があります。例えば、Anabaena sp. PCC 7120における効率的な共役伝達は、消化からモビライザーベクトルを保護するヘルパーベクターを必要とします(例えば、pRL623は、3つのメチルアベイム、Eco47iiMおよびEcot22iM)45のためにコードする、 46.

このプロトコルでは、プレートリーダーまたはフローサイトメーターを使用して蛍光マーカーを使用して部品(すなわちプロモーター)の性能を特徴付ける方法をさらに概説します。フローサイトメーターは、大規模な集団に対して単一の細胞ベースで蛍光を測定することができます。さらに、フローサイトメーターは、ユーザーが取得したデータを「ゲート」し、バックグラウンドノイズ(例えば、培養または汚染中の粒子状物質から)を除去することを可能にします。対照的に、プレートリーダーは、所定の培養量の凝集蛍光測定を取得し、典型的には複数の複製井戸で得る。キロメートル計を超えるプレートリーダーの主な利点は、低コスト、高可用性、通常はダウンストリームデータ分析のためのスペシャリストソフトウェアの必要性がないことです。プレートリーダーの主な欠点は、細胞計に比べて感度が比較的低く、測定された培養物の光学密度に関する潜在的な問題です。比較分析では、プレートリーダーサンプルを各ウェル(例えば、培養密度の測定に、通常750nm[OD750]の光学密度での吸光度として取られる)を正規化する必要があり、これはあまりにも不正確なサンプルの不正確さにつながる可能性があります。高密度および/または十分に混合されていない(例えば、凝集または凝集が起こりやすい場合)。

概要として、ここではレベル0部品を生成し、続いてCyanoGateキットを使用して階層アセンブリを作成し、共役転送に適したベクトルにクローニングするという原則を詳細に示します。次に、共役伝達プロセス、蛍光マーカーを発現する軸経共役株の選択、およびフローサイトメーターまたはプレートリーダーを用いた蛍光データの取得について説明します。

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Protocol

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1. プラントモクロおよびシアノゲートツールキットを使用したベクトルアセンブリ

注:ベクターアセンブリを進める前に、プラントおよびCyanoGate MoCloシステム12、15のベクトルレベル構造に精通することを強くお勧めします。

  1. レベル0部品の建設
    注: レベル 0 のパーツは、完全なベクトルとして合成することも、レベル 0 アクセプタを持つアセンブリの線形シーケンスとして合成することもできます(例: gBlocks、IDT)。あるいは、配列は、ソーステンプレート(例えば、ベクターまたは精製ゲノムDNA)から増幅することができる。ここでは、増幅された製品から新しいレベル0部品を生成する方法について説明する。レベル 0 からレベル T までのゴールデン ゲート アセンブリ プロセスの概要は、図 1.
    1. プライマーを設計します。
      1. どのレベル 0 モジュールを組み立てるかを決定し、適切な 5′ および 3′ のオーバーハングを識別します (表 1)12,15。BpiIまたはBsaI制限部位の存在を複製するDNA配列を確認してください。
        注: これらのサイトのいずれかを含むシーケンスは、制限サイト シーケンス内の 1 つ以上の登録を変更して、家畜化する必要があります。ゴールデン ゲート アセンブリを使用してこれを行う方法を図 2に示します。
      2. DNA配列を増幅するには、適切な前方および逆プライマーのペアを設計します。フォワードプライマーの場合は、DNAテンプレート配列の5′末端に相補的な18−30 bpを選択します。逆プライマーの場合は、DNAテンプレート配列の3′末端を相補的に18−30 bp逆を選択します。
        注: 融解温度(Tm)が 58~62 °C のプライマーは、通常、最も一貫した増幅結果を得ます(図 1A)。
      3. フォワードプライマーの5′端部に次の値を追加します: 1)BpiIサイトの5′末端に4-6のNTのランダムストリング、2)BpiI制限部位(GAAGAC)、3)2つのランダムNT、および4)ステップ1.1.1.1で選択した5′オーバーハング。逆プライマーの5′端部に以下を追加します: 1)BpiIサイトの5′末端に4-6のNTのランダムストリング、2)BpiI制限部位(GAAGAC)、3)2つのランダムNT、および4)ステップ1.1.1.1で選択した3′オーバーハング。ファイナライズしたら、プライマーペアを注文します。
        メモ:フォワードプライマーとリバースプライマーのペアの例については、図 1Aを参照してください。
    2. ゲノムDNAからDNA配列を増幅する。
      1. セクション5に記載のゲノムDNAを抽出する。高忠実度DNAポリメラーゼを用いてPCRにより製品を増幅する (材料表)。
        メモ:例として、製造元の指示に従ってPCR反応(20-50°L)を設定します。反応ごとに約100ngのゲノムDNAを使用します。30sの98°Cの初期変性ステップからなるサーマルサイクリングプログラムを使用し、その後、10sの98°Cで25サイクル以下の変性、15°Cの58°Cでプライマーアニーリング、30sの72°Cで製品拡張(後者に応じて変更する)使用されるDNAポリメラーゼの製品/タイプのサイズ)、続いて2分間72°Cの最終延長工程を行う。
      2. PCR産物をゲル化させる場合は、セクション6に記載されているように、アガロースゲル上でPCR反応全体を実行します。目的のバンドをアガロースゲルから切り取り、ゲル抽出キット(材料の表)を使用して精製します。
      3. ステップ1.1.2.2の代わりに、PCR産物をゲル精製せずに使用する場合は、アガロースゲル上でPCR反応試料(〜5μL)のアリコートを実行してバンドサイズを確認する。ゲルに適切なバンドのみが表示され、プライマーダイマーの証拠がない場合は、DNA精製キット(材料表)を使用してPCR製品を精製します。
      4. 少量の脱イオン水(例えば10μL)で精製されたDNAを溶出し、高いDNA濃度を得た(>20ng/μLで十分)。
    3. 増幅されたDNA製品(または製品、図2を参照)をレベル0で組み立てます。BpiI (図 1B)を使用して 20 μL の反応ミックスを準備し、表 2に示すようにサーマル サイクラー プログラムをセットアップします。組み立てられたレベル0反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。
  2. レベル 1 アセンブリの構築
    1. 組み立てるレベル 0 パーツを決定します (図 1C表 1)。適切なレベル 1 アクテクタ ベクトル15を選択します。
      注: この段階では、レベル 1 アクセプタ ベクトルの選択に影響を与えるため、最終的なベクトル設計がレベル T に何になるかを知ることが重要です。レベル 1 (前方) アクセプタ ベクター (pICH47732) は、レベル T に単一のレベル 1 アセンブリ (例えば、遺伝子発現カセット) を持つことを目標とする場合に、デフォルトとして使用できます。ただし、2 つ以上のレベル 1 アセンブリをレベル T でアセンブルする場合は、各レベル 1 アセンブリの位置と方向を考慮する必要があります。レベル 1 アクセプタ ベクトルを適切な位置12に使用すると、レベル T のアクセプタ ベクトルに最大 7 つのレベル 1 アセンブリをアセンブルできます。
    2. レベル 0 のパーツをレベル 1 で組み立てます。BsaIを用いて20μLの反応ミックスを準備し、表2に示すようにサーマルサイクラープログラムを設定する。組み立てられたレベル1反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。
  3. レベル T アセンブリの構築
    1. アセンブルするレベル 1 アセンブリを決定します (図 1D)。適切なレベル T アクセレクタ ベクトルを選択します。
      注:pUC19A-T(アンピシリン耐性)およびpUC19S-T(スペクチノマイシン耐性)は、シアノバクテリアでは複製できず、主にゲノム統合(すなわち、遺伝子のノックインまたはノックアウト)に使用される高コピー数の統合ベクターです。相同組換え12.集積ベクターの送達は、アミシブルシアノバクテリア種11における自然な形質転換によって進行することができる。pPMQAK1-Tは、共役転送によって提供される広いホスト範囲、複製ベクトルである(セクション3)。
    2. 適切なエンドリンクを選択して、最終レベル1アセンブリの3′エンドをレベルTバックボーン15にリゲートします。
      注: 必要なエンドリンクは、最終部品の位置と同じ番号です。たとえば、レベル 1 の位置 1 (前方または逆方向) のパーツが 1 つだけのレベル T ベクトルでは、レベル T バックボーンへのライゲーションにエンド リンク 1 (pICH50872) が必要です。
    3. レベル T で 1 つ以上のレベル 1 アセンブリを組み立てる. BpiI および必要な End-Link ベクトルを使用して反応ミックスを準備し、表 2に示すようにサーマル サイクラー プログラムを設定します。組み立てられたレベルT反応ミックスの5μLを用いて大腸菌変換に進む(セクション2で説明)。

2.大腸菌変換とベクター精製

  1. 大腸菌変換(1日目)
    1. 化学的に有能な大腸菌細胞(材料表)のアリコート(〜25°L)を解凍し、氷上の1.5 mLチューブにやさしくピペットを入れます。5°Lの組み立てミックス(レベル0、1またはT)を加え、さらに30~60分間氷上でチューブをインキュベートします。
    2. ヒートショックセルは、チューブを42°Cの水浴で30sでインキュベートし、その後2分間氷の上にチューブを戻し、カタボライトリプレス(S.O.C.)培地(250°L)を用いて室温(RT)最適なスープを加えます。振とうインキュベーターで225rpmで1時間37°Cでチューブをインキュベートします。
    3. 適切な最終濃度の抗生物質を含むLB寒天プレート上の培養プレート40μL(スペクチノマイシン二塩酸塩ペンタ水和物に対して100μg/mL、カルベニシリン二ナトリウムの100μg/mL[レベル1]、またはカナマイシン硫酸カナマイシンの50μg/mLレベルT])、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)の40μg/mLをブルーホワイトスクリーニング用に示す。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      注:めっきされた培養量は、大腸菌能細胞の効率およびライゲーション反応に応じて変化させることができる。一晩インキュベーション後に<10コロニーが観察される場合は、より大きなボリュームをプレートします。
  2. 白色コロニーの選択と液体培養の調製(2日目)
    注:組み立て反応とその後の変換の効率に応じて、LB寒天プレートにはコロニー、青いコロニーまたは白いコロニーが含まれていない場合があります(図3)。青色のコロニーは、制限を受けていないアクセプタベクターを示す(すなわち、lacZの機能コピーがまだ存在する)。白いコロニーは、lacZ発現カセットが失われ、部品/アセンブリに置き換えられたことを示します。
    1. 必要に応じて、セクション 7 で説明されているように PCR を実行して、白いコロニーに期待されるベクターが含まれることを検証します。
    2. 10°Lの先端を持つ単一の白いコロニー(またはPCR検証コロニー)を選択し、LB培地(5 mL)と適切な抗生物質濃度を含む15 mL遠心管に移します(ステップ2.1.3)。振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cでチューブをインキュベートします。
  3. プラスミドベクター精製(3日目)
    1. 場合によっては、ベクターの長期凍結保存のための一晩大腸菌培養物のグリセロールストックを調製する。500 μLの細菌培養物を500μLの500°Lに加えて、-80°Cでの凍結保存用の適切な1.5−2.0 mLチューブに500°L(v/v)グリセロールを加えます。5-10xを反転して軽く混ぜます。液体窒素中のフラッシュ凍結サンプルを-80°Cの冷凍庫に保存します。
    2. 15 mL遠心管の培養物を3,000 x gで5−10分間スピンダウンします。プラスミド精製キット(材料表)を用いてベクターを精製する。脱イオン水の35μLで精製ベクターを溶出する。
      注: より低い溶出量を使用して、ベクトル濃度をさらに増加させます。同じ溶質は、収率を高めるための精製カラムを2回通すことができます。
    3. 分光光度計(材料表)を用いて溶出物中のベクトルの濃度を測定する。
      注: pUC19 などの大腸菌の高いコピー番号ベクトルは、通常、pPMQAK1-T のような低いコピー番号ベクトルで収率が 50-300 ng/μL になりますが、通常は 15-60 ng/μL の収率を与えます。
  4. ベクター検証
    注: ベクトルは、制限ダイジェスト(ステップ 2.4.1)および/またはシーケンス(ステップ 2.4.2)によって検証できます。
    1. 適切な制限酵素を使用してベクトルの 0.5-1 μg を制限し、セクション 6 (図 4)で説明されているように、予想されるバンド サイズを確認します。
      注: 通常、不適切なバンド サイズは誤ったアセンブリを示し、その場合、より多くの白いコロニーをスクリーニングしたり、アセンブリを繰り返すことができます。BsaI および BpiI を使用すると、それぞれレベル 0 アセンブリとレベル 1 アセンブリの挿入の正しいサイズを検証できます。BsaIまたはBpiは、挿入および/またはベクターバックボーン内で切断する追加の互換性のある制限酵素と組み合わせて使用して、消化後によく分離されたバンドの明確なセットを生成することができる。
    2. 商業シーケンシング機能を用いて、組み立てられた領域の上流の適切なプライマーを用いてサンガーシーケンシングによってベクトルを配列する(表3)。
      注: すべての新しいレベル 0 パーツは、予期されるシーケンス ID を確認するためにシーケンス化する必要があります。レベル 1 および T ベクトルのシーケンス検証は、通常、以前にシーケンスされたレベル 0 のパーツから組み立てられる場合は必要ありません。

3. 活用による変異体の生成

注:ここで、シネコシスティスPCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973 11、47への自己複製貨物ベクトルの共役転送のためのプロトコルが記載されている。このプロトコルは、他のモデル種(例えば、S.エロンガトゥスPCC 7942およびシネココッカスsp.PCC 7002)に適用可能である。シアノバクテリア(および関連する緩衝剤製剤)とのすべての作業は、層流フード内の滅菌条件下で行われるべきである。

  1. シアノバクテリア培養の成長(1日目)
    1. Lea-Smith et al.11に従ってBG11培地を調製し、LB-BG11およびBG11+Kan50を有する寒天プレート(セクション8)を用いて調製する。
    2. アックスシスティスPCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973の新鮮な培養を設定し、斧BG11寒天板から供給された細胞で新鮮なBG11培地(50mL)の100 mL円錐フラスコを接種します。シネコシスティスPCC 6803培養物を30°Cで成長させ、100μmol光子m-2 s-1を100rpmで成長させ、S.エロンゲタスUTEX 2973を40°Cで成長させ、300μmol光子m-2 s-1を100rpmで成長させる。OD750 = 0.5−1.5(通常は1−2日)まで培養を成長させる。
      注:S.エロンガトゥスUTEX 2973培養物は、高い光強度で40°Cで成長させることができる(例えば、2000μmol光子m-2s-1)48。
  2. ヘルパーおよび貨物大腸菌株の成長(2日目)
    1. アンピシリン(最終濃度100μg/mL)とクロラムフェニコール(最終濃度25μg/mL)を含むMC1061大腸菌株を含むベクターpRK24およびpRL528(すなわち、ヘルパー株)を含むLB培地を接種し、225rpmで一晩37°Cで成長する揺れるインキュベーターで。1 mL の培養が必要であると仮定して、ヘルパー株培養の十分な量を育てる。
    2. 貨物ベクター(すなわち、レベルTベクター)を運ぶ大腸菌培養と適切な抗生物質を含有するLB培地(5mL)を接種する。振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cで培養を成長させる。
  3. 共役転移(三親交配)(3日目)
    1. 大腸菌ヘルパーと貨物株を準備します。ヘルパーと貨物大腸菌を室温で10分間3,000 x gで遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を捨てる。
    2. 抗生物質なしで新鮮なLB培地を加えてペレットを洗浄します。初期カルチャと同じボリュームを使用します。ペレットをゆっくりと上下にピペットで再差し込みます。文化を渦に入ないでください。このステップ3xを繰り返して、一晩培養物から残留抗生物質を除去する。
    3. 再懸濁培養物を遠心分離し(ステップ3.3.1のように)、上清を廃棄し、初期培養量のLB培地の半分の体積(例えば、一晩培養が5mLであった場合は2.5mL)に再懸濁する。ヘルパーひずみの450°Lと2mLチューブ内の貨物株の450°Lを組み合わせ、ステップ3.3.6まで脇に置きます(RTで残します)。
    4. シアノバクテリア培養を準備する。各コンジュゲーション反応には、1 mLのシアノバクテリア培養物(OD750 = 0.5−1.5)を使用する。
    5. RTで10分間1,500xgでシアン化培養の必要な総体積を遠心分離し、その後、細胞ペレットを乱すことなく慎重に上清を廃棄する。同じ初期容積の新鮮なBG11培地を加えてペレットを洗浄する。ペレットを上下に軽くピペットして再サスペンドし、培養物を渦巻きさせないでください。この手順3xを繰り返し、洗浄した培養物を脇に置きます。
    6. 2mLチューブに大腸菌株(ヘルパーと貨物)(900°L)を合わせた大腸菌培養物(900°L)に洗浄したシアノバクテリア培養物(900°L)のアリコートを加えます。ゆっくりと上下にピペットで培養物を混ぜます。渦をしないでください。シネコシスティスPCC 6803の場合はRTで混合物を30分間インキュベートするか、S.エロンガルタスUTEX 2973の場合は2時間インキュベートする。
    7. 混合物をRTで10分間1,500 x gで遠心分離し、上清の1.6 mLを除去する。残りの~200μLの上清でペレットを再サスペンドします。抗生物質を欠いているLB-BG11寒天プレートに0.45μmの膜フィルターを1つ置きます(セクション8)。大腸菌/シアノバクテリア培養ミックスの200μLを無菌スプレッダーまたは滅菌曲げ先端で膜に慎重に広げ、パラフィンフィルムでプレートを密封します。
    8. LB-BG11プレートを24時間膜でインキュベートし、シネコシスティスPCC 6803培養物で膜を30°C、100μmol光子m-2 s-1に維持する。S. エロンガルトゥスUTEX 2973 培養物を用いた膜を40°Cで150μmol光子m-2s-1で維持する。
  4. 膜移動
    1. 24時間後、適切な抗生物質を含む新鮮なBG11寒天プレート(セクション8)に炎殺菌鉗子を用いて膜を慎重に移し、貨物ベクターを選択する。パラフィンフィルムでプレートを密封します。
    2. シナ響菌PCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973については、コロニーが現れるまで、適切な成長条件下でBG11寒天プレートをインキュベートする。
      注: コロニーは通常、シネコシスティスPCC 6803 の場合は 7~14日後、S. elongatus UTEX 2973 の場合は 3-7 日後に表示されます。
  5. 共役の選択
    注:貨物ベクターを運ぶシアノバクテリアコロニーのみが膜上で成長することができます(図5)。
    1. 熱滅菌ループを用いて、膜から少なくとも2つの個々のコロニーを選択し、適切な抗生物質を含む新しいBG11寒天プレートにストリークする(図5C)。
      注:新鮮な縞模様のコロニーは、コンジュゲーションから持ち越された大腸菌で汚染されている可能性があるため(つまり、小さな白いコロニーがプレート上に明らかな場合)、新鮮なBG11寒天プレートに再ストリークする2~3ラウンドが通常あります。斧チアノバクテリア培養を得るために必要とされる。
    2. シアン化培養物のストリークをLB培地5mLを含む15mL遠心管に接種し、振とうインキュベーターで225rpmで一晩37°Cでインキュベートすることにより、大腸菌汚染がないことを確認します。十分な成長期間(〜7日)の後、個々の軸系コロニーを選んで、長期凍結保存またはその後の実験のための液体培養物を設定する。
  6. シアノバクテリア株の凍結貯蔵
    1. BG11(セクション3.1で説明)でシアノバクテリア液体培養物をOD750 = 1.5−3.0まで成長させる。1,500 x gで10分間10mLの培養を遠心分離し、上清を除去し、新鮮なBG11培地の5mLで細胞を再中断する。
    2. 最終的なグリセロール濃度〜20%(v/v)49に対してオートクレーブ滅菌50%(v/v)グリセロールの3.5mLを添加する。このアプローチは、シネコシスティスPCC 6803に適しています。あるいは、16%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むフィルター滅菌BG11を5mL添加し、最終的なDMSO濃度〜8%(v/v)50を得た。このアプローチは、S. エロンゲタスUTEX 2973 を含むほとんどの株に推奨されます。
      注意: DMSO は有毒であり、適切な保護で処理する必要があります。
    3. 5-10xを反転して軽く混ぜます。サブアリコート~1 mLの培養を別々のクライオストレージ互換1.5 mLスクリューキャップチューブ(材料表)に凍結保存用の-80°C冷凍庫にチューブを入れます。液体窒素中で凍結をフラッシュしないでください。
      注:ひずみごとに少なくとも3つのストックをお勧めします。
    4. 回収には-80°冷凍庫からチューブを取り出し、35°水浴でゆっくりと混ぜながら解凍します。解凍した培養物を新鮮なBG11培地の50mLに加え、液体培養として成長させる(セクション3.1で説明)。
      注:または、培養は、新鮮なBG11寒天プレート上でストリークと成長することができます。選択マーカーを運ぶトランスジェニック培養物は、最初は抗生物質を使わずにBG11寒天プレート上で復活させ、その後、適切な抗生物質でBG11寒天プレートに引き込む必要があります。

4. プロモーターの特性評価

注:ここでは、プレートリーダーまたはフローサイトメーター12のいずれかを用いて72時間成長期間に続く蛍光マーカー(eYFP)の発現量を測定することによりプロモーター部分の強度を分析するための標準的なアプローチについて説明する。

  1. 文化の成長
    1. 蛍光マーカー発現カセットを運ぶトランスジェニックシアノバクテリア株の単一コロニーを含む適切な抗生物質を含むBG11培地の10mLを接種して種子培養を設定する。また、適切な負のコントロール株(例えば、野生型株および/または同じベクターバックボーンを運ぶが、蛍光マーカー発現カセットを欠いているトランスジェニック株)のための種子培養を準備する。
      注:少なくとも4つの生物学的複製が推奨される。
    2. 種株に適した成長条件下で48時間またはOD750 = 1−1.5まで種子培養物を成長させます。
    3. プロモーター発現を経時間の経過とともに追跡するには、まず各種子培養物のOD750を測定する。各カルチャを開始 OD750 = 0.2 にするための希釈要件を計算します。薄化実験培養サンプル(総体積2mL)をフラットボトム24ウェルプレート(材料表)に設定します。
    4. 適切な成長条件下で、白色LEDライト(材料テーブル)で揺れるインキュベーターでプレートをインキュベートします。プレートリーダー(セクション4.2)またはフローサイトメーター(セクション4.3)のいずれかを使用して、培養成長密度(OD750)と強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)蛍光を測定します。
      注:シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンゲタスUTEX 2973培養は、ステップ3.1.2のように成長させることができる。プレートは高湿度(95%)培養試料の蒸発を避けるため。
  2. プレートリーダー
    1. 24ウェルプレート(ステップ4.1.4)の培養物を穏やかなピペットと簡単に混ぜます。各培養物のサブサンプルを黒いフラットボトム96ウェルプレート(材料の表)に転送します。必要に応じて希釈します(最終ボリュームは100°L)。これは測定精度を妨げる可能性があるので、気泡の形成を避けてください。
      注: すべての測定は、0.2−1.0のOD750範囲のサンプルに対して行われることをお勧めします。24ウェルの培養物の密度は時間の経過とともに増加するので、標準的な成長条件の予想される増加に基づいて、次の希釈が推奨されます:0 hで希釈なし、24時間で1:4、48時間で1:10、72時間で1:10。そこで例えば、24時間で25μLの培養物を収穫し、BG11培地の75μLと混合する。
    2. 96ウェルプレートに2つのブランクウェル(すなわち、BG11培地の100 μL)を含めます。96ウェルプレートをプレートリーダー(材料の表)に入れます。プレートリーダーの軌道シェーカーを使用して、500 rpmで60sのプレートを振り、井戸を混ぜます。
      注:シアノバクテリア培養物は凝集および/または凝集することができるので、正確な測定のために読み取る前に良好な混合が重要です。
    3. 485 nm/520 nmで励起/発光波長でOD750およびeYFP蛍光を測定します。
    4. シアノバクテリア培養を含む各サンプルウェルのOD750測定値から、2つのブランクウェルのOD750測定値の平均を差し引きます。
    5. 各培養試料の蛍光値を、eYFP蛍光測定(ステップ4.2.3)を調整されたOD750で培養物で割ることによって正規化する(ステップ4.2.4)。次いで、eYFP発現カセットを運ぶトランスジェニック株から適切な陰性対照株の生物学的複製の平均正規化eYFP蛍光値(eYFP蛍光/OD750)を差し引く。
      注:シアノバクテリアは、クロロフィルやフィコビリタンパク質などの顔料の存在により自然に蛍光を与えます。
    6. 時間の経過に伴うプロット培養の成長(図6A)と、所望の時点における各実験培養物の平均正規化eYFP蛍光値(例えば、72時間;図 6B) を図 6 に示します。
  3. フローサイトメーター
    1. フローサイトメーター液体ハンドリングシステムに対応したプレートを選択します。たとえば、このプロトコルで使用されるフローサイトメーター (材料のテーブル)と丸底の 96 ウェル プレート (材料のテーブル) を使用します。
    2. 24ウェルプレート(ステップ4.1.4)の培養物を穏やかなピペットと簡単に混ぜます。OD750 = 0.1−0.2に培養液を希釈し、液体ハンドリングシステムのノズル閉塞を回避します。適切な量の培養サンプルを96ウェルプレートに加え、フィルター殺菌された1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で250μLの最終容積にします。BG11の60°Lと1x PBSの190°Lを含むプレート上の媒体溶液用のブランクウェルを含めます。
      注: サンプルを再実行する必要がある場合は、このボリュームをお勧めします。各ウェルの最大体積は300°Lであるため、250μLを超える体積はお勧めしません。
    3. フローサイトメーターを使用する準備ができたら、液体ハンドリングステーションに培養サンプルを含む96ウェルプレートを置きます。フローサイトメーターのソフトウェアプロトコルを設定して、10,000個の個々のイベント(例えば、細胞)の測定値を収集します。励起/発光波長488 nm/515-545 nmでeYFP蛍光を測定します。まず、空白の井戸からの読み取り値を測定し、確認してから(図7A)、サンプルを実行します。
    4. 空の読み取りと共通の領域を除く、前方および側面の散乱データセット内のシアノバクテリア細胞の集団をゲートする(図7B)。eYFP発現カセットを運ぶトランスジェニック株から適切な陰性対照株の生物学的複製の平均eYFP蛍光値を減算する(図7C,D)。所望の時間時点における各実験培養の細胞当たりの中央値蛍光値の平均をプロットする(例えば、72時間;図 7E) を図 7 に示します。

5. シアノバクテリアからのゲノムDNA抽出

注: 以下のプロトコルは、市販の DNA 抽出キット (材料表) を使用しています。

  1. BG11(セクション3.1で説明)でシアノバクテリア液体培養物をOD750 = 1.5−3.0まで成長させる。3,000 x gで10mLの培養物を10分間スピンダウンし、上清を廃棄する。30分間-20°Cでチューブをインキュベートしてペレットを凍結します。
  2. 400 μL の溶解バッファー (バッファー AP1) と 400 μL のリボヌクレアーゼ溶液 (RNase A) とガラスビーズの 50% (w/v) (直径 0.5 mm) を加えます。30 Hz (つまり、1,800 発/分に相当) のビードミル (材料の表)を使用してサンプルを 6 分間中断します。
  3. 17,000 x gで5分間スピンし、新しいチューブに上清を慎重に移し、ペレットを廃棄します。製造元の指示に従って進みます (資料資料の表)。

6. アガロースゲル電気泳動

  1. 0.02%(v/v)臭化エチジウムを含む1%(w/v)アガロースゲルを鋳造する。サンプルと適切なDNAラダーリファレンスをロードします。
  2. 125 V で 50 分間サンプルを実行し、紫外線(UV)トランスイルミナタのバンド分離を確認します。
    注:実行時間とアガロースゲルのパーセンテージは、予想されるバンドサイズに合わせて変更できます。例えば、アガロースゲルの割合が高く、実行時間が長いと、DNA産物のバンド分解能と分離が改善され、<500 bpが得られます。

7. コロニーPCR

  1. 標準キット(材料表)とプライマーの適切な組み合わせ(例えば、アセンブリ領域を横切るプライマー、またはアセンブリ領域内のシーケンスに固有のプライマー)を使用してPCR反応ミックスを設定する(表3)。ピペット10μLをPCRチューブに入れます。
  2. 滅菌爪楊枝または10°Lピペットチップで単一の白いコロニーの上部に穏やかに触れ、PCR反応ミックスを含むPCRチューブを接種します。コロニーをマークし、特定のPCRチューブと一致するように注意してください。反応ミックスを軽くかき混ぜて、大腸菌細胞が溶液中に流されることを確認します。
  3. PCRによって製品を増幅します。60sの場合は95°C、15sでは95°Cの30ラウンド、15sの場合は58°C(プライマーのTm値より少ない度数)、30s(挿入の30 s/kb)の72°Cからなるプログラムを使用してください。、続いて72°Cの最終延長ステップを5分間行う。

8. BG11媒体及び版の調製

  1. 100x BG11培地のストック溶液を調製し、鉄(クエン酸アンモニウム)、微量元素、リン酸塩(K2HPO4)、Na2CO3およびTES緩衝液をLea-Smith et al.11に記載する。オートクレーブリン酸塩およびNa2CO3ストック。TESバッファ(pH 8.2)およびNaHCO3ストックソリューションをフィルタリングするには、0.2μmフィルタを使用します。
  2. BG11培地の1Lを用意します。100x BG11の10 mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを混ぜ、976 mLの水で溶液をオートクレーブします。溶液がRTに冷却されたら、リン酸ストック1mL、Na2CO3ストック1mL、NaHCO3の10 mLを加え、1 M HClでpH 7.6−7.8に調整します。
  3. LB-BG11寒天プレート (1.5% [w/v])
    1. 700mLの脱イオン水と15gの寒天をガラスフラスコに入れます。2番目のフラスコに、186 mLの水、100x BG11の10 mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを加えます。両方のソリューションをオートクレーブします。
    2. 溶液が約60°Cに冷却されたら、それらを組み合わせて、リン酸ストック1 mL、Na2CO3ストックの1 mL、NaHCO3ストックの10 mL、LB滅菌培地の50 mLを加え、25で1 L.キャストペトリ料理の最終量を与える必要があります LB-BG11寒天培地のmL。
  4. BG11+Kan50寒天プレート (1.5% [w/v])
    1. 700mLの脱イオン水と15gの寒天をガラスフラスコに入れます。2番目のフラスコに、チオ硫酸ナトリウム3g(Na2S2O3)、226mLの水、100x BG11ストックの10mL、微量元素1mL、鉄ストック1mLを加えます。両方のソリューションをオートクレーブします。
    2. 溶液が約60°Cまで冷却されたら、それらを組み合わせて、リン酸ストック1 mL、Na2CO3ストックの1 mL、TESバッファストックの10 mL、NaHCO3ストックの10 mLを追加し、最終的な体積を1 L.加えるカナマイシン硫酸塩を与える必要があります50 μg/mLの最終濃度にし、35 mLの媒体でペトリ料理を鋳造する。

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Representative Results

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ゴールデンゲートアセンブリワークフローを実証するために、次のレベル0の部分を含むレベル1(前方)アクセプタベクトル(pICH47732)に発現カセットを組み立て、C-フィコシアニンオペロンP cpc560(pC0.005)のプロモーターを、eYFP (pC0.008) およびダブルターミネータ TrrnB (pC0.082)12のコーディングシーケンス。組み立て反応の変換後、大腸菌コロニーの標準的な青白色スクリーニングを用いて成功したアセンブリを同定した(図3)。次いで、レベル 1 ベクトルとエンド リンク 1 ベクトル (pICH50872) の eYFP 発現カセットをレベル T アクセプタ ベクトル (pPMQAK1-T) に組み立てて、ベクトルcpcBA-eYFP (図 4A)を得た。組み立てられたcpcBA-eYFPベクターを制限消化により検証した(図4B)。

cpcBA-eYFPまたは空のpPMQAK1-Tベクター(すなわち、eYFP発現カセットを欠く負のコントロール)の共役転移に成功し、シネコシスティスPCC 6803の膜上に最大数百コロニーの増殖をもたらしたS. elongatus UTEX 2973 7-14日後と3-7日後にそれぞれ(図5)。個々のコロニーを選び、新鮮なBG11+Kan50寒天プレートに縞模様。2-3再ストリークは、斧培養を生成するために必要とされた。

強いPcpc560プロモーター51に対して予想したように、プレートリーダーからの正規化されたeYFP蛍光の値と、フローサイトメーターからの細胞当たりのeYFP蛍光の値は、負の対照と比較して高かった(図6および図6および図 7)。蛍光値は、シネコシスティスPCC 680312よりもS.エロンガルタスUTEX 2973で高かった。

Figure 1
図 1: シアノゲートのゴールデン ゲート アセンブリ プロセスの概要遺伝子発現カセットの組み立ては、テンプレートDNAからレベルTベクター内のアセンブリまでの目的の配列の増幅から始めて示されています(部品はスケールに描画されません)。(A)鋳型DNAからのCDS1部分の増幅のためのフォワードプライマーと逆プライマーの設計(例えば、ゲノムまたはプラスミドDNA)。アクセプタベクトルへの挿入に必要なBpiI制限部位とオーバーハング(テンプレートシーケンスの5′と3′)の位置は、それぞれ赤と青で強調表示されます。文字 "n" は、任意の NT がこの位置で使用できることを示します。DNAテンプレートを用いてプライマーのアニーリング領域とその推奨溶融温度(Tm)が示されます。(B) PCR 製品のレベル 0 アセンブリーをレベル 0 CDS1 アクセプター・ベクトル pICH41308 に組み込みます。BpiI によって取り出され、アクセプタ ベクトルに連結されるシーケンスは青色で強調表示されます。(C)レベル0部分(Pro+5U、CDS1及び3U+Ter)を含む遺伝子発現カセットのレベル1組立て物は、BsaIを用いてレベル1位(前方)アクセプタベクターpICH47732に入れる。(D)レベル 1 アセンブリおよびエンド リンク 1 のレベル T アセンブリ (pICH50872, Engler et al.15では "レベル M エンドリンク 1" と呼ばれる) を BpiI を使用してレベル T アクセプタ ベクトル (例えば、 pPMQAK1-T) にする。(E) 最終的に組み立てられたレベル T ベクトル。略語:AmpR、アンピシリン抵抗カセット。炭水化物, カルベニシリン抵抗カセット;CDS1、レベル 0 構文15のコーディングシーケンス;EL1、エンドリンク1部;KanR, カナマイシン耐性カセット;lacZα,β-ガラクトシダーゼ発現カセット;スペクター、スペクチノマイシン抵抗カセット。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 違法な IIS 制限サイトを削除するための PCR ベースの家畜化戦略(A)CDS1レベル0アクセプタベクター(pICH41308)への組み立てを目的としたタンパク質コードDNA配列において、BPI部位(GAAGAC)をGAGGACに改変するための2つのプライマー対(それぞれ緑色とオレンジ色)を示す模式図。なお、修飾はグルタミン酸(Glu)(すなわち、GAA〜GAG)のコドンを保存する。BpiI部位は開始コドンと共にフレームで示されていますが、このアプローチは、部位がフレーム内にない場合(すなわち、部位が破壊され、タンパク質配列が保持されている限り)でも機能します。BpiI制限サイトの場所とプライマーのオーバーハングは、それぞれ赤と青で強調表示されます。DNAテンプレートと翻訳されたタンパク質配列は黄色で強調表示されます。DNAテンプレートを用いてプライマーのアニーリング領域とその推奨溶融温度(Tm)が示されます。オレンジ色のペアは、AATG と TGAA (フラグメント 1) をオーバーハングでシーケンスの 5′ の端部を増幅するために使用され、緑色のペアはオーバーハング TGAA と GCTT (フラグメント 2) で 3′ の端を増幅するために使用されます。プライマーを注文する前に、フラグメント1および2のTGAA融合オーバーハングの忠実性を慎重にチェックした52.適切に設計されていない融合オーバーハングは、アセンブリの障害につながる可能性があります(つまり、変換後のコロニーはありません。図 5)または誤検知 (切り捨てられたアセンブリや誤ったアセンブリなど)。後者は、正しく組み立てられた構造を識別するために、より多くの白いコロニーをスクリーニングして解決することができる。(B) ゴールデンゲートアセンブリ中のBpiIとの制限後のフラグメント1および2のアンプリコン。(C) レベル 0 CDS1 アクセプタ ベクトルに組み立てられた家畜シーケンス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ゴールデンゲートアセンブリに続く大腸菌形質転換体の青白色コロニースクリーニング表示されるプレートには、適切な濃度でX-Gal、IPTGおよび抗生物質を補充したLB寒天(1%[w/v])が含まれています。(A)コロニーがなく、組み立て反応および/または大腸菌変換の失敗を示唆する。(B)主に青色のコロニーは、組み立てが成功したことを示すが、組み立て反応に用いられる制限酵素の効率が低かった。(C)主に白いコロニーは、典型的な、成功した組み立て反応を示す。(D) 青いコロニーがなく、非常に効率的なアセンブリを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:制限消化による組み立てられたレベルTベクトルの検証ベクターをヒンドIIIとBamHIで消化した。(A) 空の pPMQAK1-T アクセプタ ベクトル (CT.0) およびレベル T アセンブリ(cpcBA-eYFP) のシーケンス マップ eYFP 式カセットの成分を示す (Pcpc560-eYFP-TrrnB)。ヒンドIIIとBamHIの制限サイトの位置が示されています。二重消化の後、DNA断片の予測サイズが示されます: (1) 5,847 bp, (2) 2,004 bp, (3) 30 bp, (4) 374 bp, (5) 1,820 bp, (6) 1,289 bp, (7) 156 bp. (B)アガロースゲル (0.8% [w/v]) は、消化されたレベルでロードされた 60 分間 125 V で実行されます。バンド1、5および6を示すTアセンブリ(cpcBA−eYFP)、バンド1および2およびDNAラダー(材料の表)を示す消化空のpPMQAK1-Tアクセプタベクター(CT.0)。バンド 3、4、および 7 は、ゲル上で視覚化するには小さすぎたことに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:トランスジェニック・シネコシスティスPCC 6803コロニーの増殖が成功した後の結合。BG11+Kan50寒天プレート上でのインキュベーション後の膜の例を示す。(A)非常に効率的な共役に続く過剰増殖-シネコシスティスPCC 6803コロニーは、個々のコロニーのない芝生に発展した。(B)12日後に数百個の個々のコロニーを示す良好な結合効率。(C) 新鮮なBG11+Kan50寒天板に再ストリークの数ラウンド後の14日後の斧株の成長。細菌汚染の欠如は、シネコシスティスPCC 6803経コンジュジェントが斧であることを示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:プレートリーダーを用いた代表的な成長データと正規化されたeYFP蛍光値。(A)シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥスUTEX 2973におけるcpcBA-eYFPまたは空のpPMQAK1-Tベクター(CT.0、負対照)を運ぶ株の増殖比較。値は、4つの生物学的反復からの平均±SEである。シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンゲタスUTEX 2973を連続光(100μmolフォトンm-2s-1)で30°Cで72時間培養し、40°Cをそれぞれ300μmolフォトンm-2s-1で培養した。(B)シネコシスティスPCC 6803またはS.エロンガトゥスUTEX 2973に対する正規化されたeYFP蛍光値は、72時間でcpcBA-eYFPと共役し、4つの生物学的複製物からの平均±SEである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:フローサイトメーターを用いた代表的なeYFP蛍光値。(A)前方(FSC-H)および側(SSC-H)散乱プロットを「ブランク」媒体溶液(BG11およびPBS)から示す。(B)シネコシスティスPCC 6803試料の散布図(右)。円は、サンプルシグナルの残りの部分からシアノバクテリア集団をゲーティングする選択された領域を示す。(C)空のpPMQAK1-Tベクター(CT.0、負対照)を運ぶひずみのためのゲート領域のヒストグラム。(D)cpcBA-eYFPを運ぶ株のためのゲート領域のヒストグラム。(E)シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥスUTEX 2973における細胞当たりのeYFP蛍光値は、72時間で、陰性対照からの蛍光を差し引いた。値は、4つの生物学的反復からの平均±SEである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

いいえ。 ベクトル ID 名前 説明 5' オーバーハング 3'オーバーハング
1 pICH41233 プロ プロモーター GGAG タクト
2 pICH41295 プロ + 5U プロモーターと5・未翻訳領域 GGAG AATG
3 pAGM1251 プロ + 5U (f) N末端融合のためのプロモーターと5・未翻訳配列 GGAG CCAT
4 pICH41246 5u 5・未翻訳領域 タクト CCAT
5 pAGM1263 5U (f) N末端融合のための5′未翻訳シーケンス タクト CCAT
6 pICH41246 5U + NT1 5・非翻訳領域とN末端符号化領域 タクト CCAT
7 pAGM1276 NT1 N 端子タグまたはローカリゼーション信号 CCAT AATG
8 pICH41258 Sp シグナルペプチド AATG AGGT
9 pICH41258 NT2 N 端子タグまたはローカリゼーション信号 AATG AGGT
10 pAGM1287 CDS1 ns 停止コドンのないコーディング領域 AATG TTCG
11 pICH41308 CDS1 停止 ストップコドンを使用したコーディング領域 AATG GCTT
12 pAGM1299 CDS2 ns コーディング領域 - 開始と停止コドンなし AGGT TTCG
13 pICH41264 CDS2 停止 コーディング領域 - 開始なし、ストップコドン付き AGGT GCTT
14 pAGM1301 Ct C端子タグまたはローカリゼーション信号 TTCG GCTT
15 pICH53388 3u 3・非翻訳領域 GCTT GGTA
16 pICH53399 テル ターミネータ GGTA CGCT
17 pICH41276 3U + Ter 3・非翻訳領域とターミネータ GCTT CGCT
18 pICH41331 Cgm 完全な遺伝子カセット用アクセプタ GGAG CGCT
19 pCA0.002 プロ (ローコピー) プロモーター、低コピー数アクセプター(pSC101オリ) GGAG タクト
20 pCA0.001 プロTSS トランスクリプション開始部位に切り捨てられたプロモーター GGAG TAGC
21 レベル 1 に直接移動 srRNA 小型規制RNA(翻訳サイレンシング用) TAGC GTTT
22 レベル 1 に直接移動 sgRNA シングルガイドRNA(CRISPRi用) TAGC GTTT
23 pICH41295 アップ・フランク 標的相同組換え部位の上流のフランキング配列 GGAG AATG
24 pICH41276 ダウン・フランク 標的相同組換え部位の下流のフランキング配列 GCTT CGCT

表 1: 使用可能なレベル 0 アクセプタ ベクトルとオーバーハングのリスト。ベクトル 1-18 はプラント MoClo キット15からです。ベクトル19−22はシアノゲートキット12からである。srRNAおよびsgRNA部品の場合、合成された配列またはPCR産物はレベル1アクセプタベクターに直接組み立てられます。ベクトル23-24は、CyanoGateキットを使用した相同組換えによる変換のために再使用されたプラントMoCloキットからのものである。

BpiI アセンブリ コンポーネント(レベル 0、T) BsaI アセンブリ コンポーネント(レベル 1)
アクエプターベクトルの50−100ng アクエプターベクトルの50−100ng
挿入するベクトル/部品ごとに、挿入の 2:1 の比率であるアクセプタ ベクトルを使用します。 挿入するベクトル/部品ごとに、挿入の 2:1 の比率であるアクセプタ ベクトルを使用します。
2°L 10 mM ATP (材料一覧) 2°L 10 mM ATP (材料一覧)
2 μL バッファ G (BpiI/BsaI 用バッファ) 2 μL バッファ G (BpiI/BsaI 用バッファ)
2°L BSA (10x) (材料表) 2°L BSA (10x) (材料表)
10単位 BpiI (1 μL10 U/μL BpiI,材料表) 10単位 BsaI (1 μL 10 U/μL BsaI,材料表)
dH2Oで20°Lに持ち込む。 dH2Oで20°Lに持ち込む。
200単位 T4 DNA リガーゼ (1°L 200 U/μL,材料テーブル) 200単位 T4 DNA リガーゼ (1°L 200 U/μL,材料テーブル)
サーモサイカープロトコル(レベル0、T) サーモサイカープロトコル(レベル1)
37 °C 10分 サイクル x 5 37 °C 10分 サイクル x 5
16 °C 10分 16 °C 10分
37 °C 20分 37 °C 20分
65 °C 10分 65 °C 10分
16 °C (ホールド) 16 °C (ホールド)

表 2: レベル 0、1、および T のゴールデン ゲート アセンブリのプロトコルレベル0およびレベルTアクセプタベクターのアセンブリは、制限酵素BpiI(左)を使用します。レベル1アクセプタベクターの組み立ては、制限酵素BsaI(右)を使用します。この表はヴァスデヴァンら12から適応された。

プライマー番号 シーケンス (5'-3') 長さ (bp) 説明
L0T フォワード GTCTCATGAGCGGATCATCATACATA
TTGAATG
28 レベル 0 およびレベル T からの増幅の場合
L1リバース GAACCCTGTGTTGGCATGC
ACATAC
26 レベル1からの増幅用
L1 フォワード CTGGGGCAGGATGT
GGTG
24 レベル1からの増幅用
L0Tリバース TTGAGTGAGCTGATACCGCT 20 レベル 0 およびレベル T からの増幅の場合

表 3: レベル 0、1、および T ベクターの PCR 検証またはシーケンスのプライマーのリスト。

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ゴールデンゲートアセンブリは、他のベクトルアセンブリメソッドと比較して、特にスケーラビリティ20、21の点でいくつかの利点があります。それにもかかわらず、ラボでゴールデンゲートシステムを設定するには、さまざまな部品とアクセプタベクトルライブラリと全体的なアセンブリプロセスに精通する時間が必要です。多くの場合、より複雑なアセンブリや多数の複雑なアセンブリを並行して実行する場合 (たとえば、複数の遺伝子発現カセットを含むレベル T ベクターのスイートを作成する場合) には、慎重な計画が必要です。最初に必要なすべての遺伝子発現カセットの組み合わせをリストしてから、ワークフローをレベル 0 からレジコのレベル T にマッピングすることをお勧めします。このプロセスの間、ユーザーはレベルTの非シーケンシャルレベル1ベクトルの組み立てを可能にするPlant MoCloキットで利用可能なレベル1の「ダミー」部品を考慮する必要があります(例えば、レベル1の位置1と位置3のベクトルは「ダミー」部分と一緒に組み立てることができますレベル1の位置2)、アセンブリ反応の全体的な数を減らすことができるとクローニングステップ15。

DNA 合成は、通常、新しいレベル 0 のパーツを構築する最も簡単な方法です。しかし、クローニングが必要な場合(例えば、プラスミドまたはゲノムDNAから)、増幅に使用されるプライマーの設計を最適化することは、その後のレベル0ベクターアセンブリの効率を最大化するために重要である。プライマー設計の最も重要な 2 つのステップは、1) 正しいオーバーハングが含まれており、前方および逆プライマーの適切な向きにあることを確認すること(図 1および表 1)、および 2) プライマーの長さを確認することです。テンプレートに対するアニールが十分に長く(18−30 bp)、このシーケンスのTm値(理想的には58-62°)がプライマーペアに対して類似しているシーケンス(図1A)。シーケンスで家畜化が必要な場合は、いくつかの戦略を使用できます。短いシーケンス(<200 bp)の場合、3′が互いにアニールを終了する長い前方プライマーと逆プライマーのペア(すなわち、>20 bpの重なり)を設計し、増幅後に二本鎖配列を形成することができます。長いシーケンスの場合、シーケンスの個別のフラグメントを増幅して不正な制限サイトを削除し、ゴールデン ゲート アセンブリ アプローチを使用して組み立てることができます (図 2)。PCR産物の組み立て効率が悪い場合、レベル0配列の個々の断片をレベル1ユニバーサルアクセプタベクトル(pAGM1311)にクローニングし、検証し、適切なレベル0アクセプタベクトル15にまとめることができる。効率的なゴールデンゲートアセンブリには、2:1の挿入:アクエクタベクトルモル比をお勧めします。ただし、2 ~ 3 個のベクトル (レベル 0 の 2 つのパーツとレベル 1 のアクセプタ ベクトルなど) のみのアセンブリの場合、各コンサルタの ~100 ng を定期的に組み合わせると、通常はアセンブリが正常に実行されます。アセンブリの効率は、反応ごとに使用されるベクターの数が増えるにつれて減少する傾向にあり、その結果、変換後の白いコロニーの総数が減少します(図3)。

活用する前に、制限ダイジェストおよびPCRによる確定レベルTベクトルの検証をお勧めします。共役DNA転写は、自然に変換可能でないものを含むシアノバクテリア株に対する十分に刺された技術である。コンジュゲーションプロトコルの重要なステップは次のとおりです: 1)一晩の成長に続くヘルパー大腸菌株の慎重な取り扱い(例えば、ボルテックスを避ける)35、2)ヘルパーの成長に使用される抗生物質の痕跡を完全に除去するように注意し、貨物大腸菌株、3)貨物株とヘルパー株とシアノバクテリアの混合物に対する適切な潜伏期間(例えば、S.エロンガトゥスUTEX 2973にとってより長いインキュベーション期間が重要であった)、および4)細胞の初期移動期間24時間の抗生物質を欠くLB-BG11寒天プレートの膜上の混合物。

単離されたシアノバクテリアコロニーは、シネコシスティスPCC 6803およびS.エロンガトゥスUTEX 2973のために2週間以内に膜上に発症する必要があり、そうでなければ、結合が失敗した可能性が高い。プロトコルに対するいくつかの変更は、1)より高い開始密度(例えば、OD750 = 1.5−2)を有するシアノバクテリア培養を使用してテストすることができる。2)膜に移る前に潜伏期間を増やす;および3)膜上の初期潜伏期間を24時間から48時間に延長する(すなわち、転写ベクター上の抗生物質耐性遺伝子の発現のためのより多くの時間を可能にする)。それでも活用に失敗する場合は、エレクトロポレーションなどの代替方法を53.トランスジェニックシアノバクテリア株の確認は、さらなる実験の前に軸系が重要である。最後に、トランスジェニックシアノバクテリア株における異種ベクターの大きさを確認することをお勧めします。後者は、DNA抽出(セクション5)、大腸菌および選択への変換(セクション2.1)、およびベクター検証(セクション2.4)を必要とします。

概説されたプロモーター特性評価プロトコルは、高スループットスクリーニング方法論を達成する手段として、小さな培養量(すなわち2mL)を使用する。利用可能な光バイオリアクターのスペースに応じて、より大きなボリュームを使用することができ、これは、文化蒸発の問題を軽減するのに役立ちます。少量の高スループットスクリーニングが必要な場合は、蒸発を抑制するために成長室内に高湿度を有することが不可欠である。成長実験中の蒸発は、サンプル測定の精度と妥当性に悪影響を及ぼす可能性があります。実験中および実験後の培養量を調べて、蒸発が発生した量を確認します。

プレートリーダー測定では、信頼性が高く再現性の高い成長および蛍光データを確実に取得するために、低密度(理想的にはOD750 <1)で培養物を測定することが重要です。セル番号とOD750との間の線形関係は、特定の範囲54内でのみ観察される。この範囲を確立するには、eYFP蛍光が確認された既知の形質転換体を使用して、シリアル希釈(例えば、OD750 = 0.1−1.0から)を行うことをお勧めします。正規化された蛍光に対する絶対蛍光(eYFP蛍光/OD750)をプロットすることは、培養密度の線形作業範囲を同定するのに役立ちます。いくつかのプレートリーダーは、蛍光検出器の感度を変更する「ゲイン」機能を含む。この場合、ゲイン値は実験を開始する前に適切なレベルに設定する必要があり、異なる実験実行間で変更されないか、データが直接比較されません。

異なる流量サイトメーターの動作はメーカーによって異なりますが、任意のバックグラウンド信号から標的シアノバクテリア集団の同定とゲーティングを容易にするために、培地溶液の空白の読み取りを行することが重要です。メディア (図 7A,B))これに続いて、負の対照試料の蛍光値(例えば、野生型株)の減算は、天然の自己蛍光を除去するのに役立つ(図7C,D)。フローサイトメーターにおける光電子増倍管(PMT)電圧パラメータは、プレートリーダーにおけるゲインと同様の機能を有し、すなわち、蛍光信号の強度に対する検出器の感度を増減させる。プレートリーダーと同様に、PMT電圧は実験55を開始する前に適切なレベルに設定する必要があります。一度設定すると、PMT電圧値は異なる実験実行間で維持されるべきか、データは直接比較されません。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

著者らは、産業バイオテクノロジー・バイオエネルギー研究評議会(BBSRC)ネットワークと産業バイオテクノロジーイノベーションセンター(IBioIC)の資金援助に感謝しています。GARG、AASO、APは、BBSRC EASTBIO CASE PhDプログラム(助成金番号BB/M010996/1)、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT)博士課程、およびIBioIC-BBSRC共同トレーニングパートナーシップ(CTP)博士プログラムからの資金援助を認め、それぞれ。コンラッド・ムリノー(ロンドンのクイーン・メアリー大学)とポール・エリック・ジェンセンとジュリー・アンネマリー・ゼドラー(コペンハーゲン大学)は、プラスミドベクターとプロトコルの貢献とアドバイスに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Thermo Fisher Scientific R0404 Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt Sigma-Aldrich A2383 Used in Table 2.
Agar (microbiology tested) Sigma-Aldrich A1296-500g Used in 8.3.
Agarose Bioline BIO-41026 Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific - Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Used in Table 2.
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011 Used in Table 2.
BsaI (Eco31I) Thermo Fisher Scientific ER0291 Used in Table 2.
Carbenicillin disodium VWR International A1491.0005 Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates Sigma-Aldrich CLS3527 Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader BMG Labtech - Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter) BioSpec Products 11079105 Used in 5.2.
Glycerol Thermo Fisher Scientific 10021083 Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific 10356553 Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11815-024 Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm) MF-Millipore HAWP02500 Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR Greiner Bio-One 655096 Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020S Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030 DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs Infors HT - Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21108 Used in 7.1.
NanoDrop One Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli Thermo Fisher Scientific C404010 Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) VWR International K813 Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491S Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder New England Biolabs N0468S Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml) Starstedt 72.692.210 Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate VWR International J61820.06 Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates Thermo Fisher Scientific 612U96 Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase Thermo Fisher Scientific EL0011 Used in Table 2.
TissueLyser II Qiagen 85300 Bead mill. Used in 5.2.

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シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変
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Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).More

Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).

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