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Cancer Research

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60453

Summary

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

Abstract

종양 유래 paracrine 신호는 국부적인 면역 억제의 간과된 분대이고 지속적인 암 성장 및 전이를 위한 관대한 환경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라크린 신호는 T 세포의 표면에 PD-1과 직접 상호 작용하는 종양의 표면에 발현된 PD-L1과 같은 상이한 세포 유형 간의 세포 접촉, 또는 면역 세포에 영향을 미치는 종양 세포에 의한 리간드의 분비를 포함할 수 있다. 여기서 우리는 면역 세포(대식세포) 활성화에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 심문하는 공동 배양 방법을 설명한다. 이 간단한 절차는 시판된 0.4 μm 폴리 카보네이트 멤브레인 투과성 지지대 및 표준 조직 배양 판을 이용합니다. 기재된 과정에서, 대식세포는 하부 챔버 내의 상부 챔버 및 종양 세포에서 배양된다. 0.4 μm 장벽의 존재는 두 세포 유형이 파라크린 리간드에 동일한 배지 및 노출을 공유하기 때문에 물리적 접촉의 혼란스러운 변수없이 세포 간 신호의 연구를 허용합니다. 이 접근법은 대식세포(예를 들어, 유전적 녹아웃 마우스로부터의 분리) 또는 종양(예를 들어, CRISPR 매개 변경)의 유전적 변경과 같은 다른 사람들과 결합되어 특정 분비 된 인자 및 수용체의 역할을 연구할 수 있다. 이 접근법은 또한 두 세포 집단을 분리하기 위한 유동 선별없이 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 분자 생물학적 분석에 적합합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)은 유사하게 분비 된 리간드를 측정하여 다중 세포 유형 컨텍스트에서 세포 신호의 동적 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있다. 동시 조절 된 사건의 연구를 위해 공동 배양 기간은 또한 다양 할 수 있습니다. 이 공동 배양 방법은 면역 문맥에서 종양 분비 된 신호의 연구를 용이하게하는 강력한 도구입니다.

Introduction

최근 연구는 면역 세포에 의한 검출을 피하고, 국소 면역 활성화를 억제하거나, 종양 미세 환경에서 내성 종양 허용 밀리를 생산하는 암세포의 능력에 초점을 맞추고 있다. 종양과 면역 세포 상호 작용의 2개의 넓은 종류는 이 효력을 촉진하는 기술되었습니다: 접촉 중재한 상호 작용 또는 종양 분비 한 리간드. 종양에 의해 이용되는 접촉 매개 면역 억제의 가장 잘 연구되고 임상적으로 견인가능한 메커니즘 중 하나는 그들의 활성화 및 기능을 억제하기 위해 T 세포에 PD-1과 상호 작용하는 PD-L1의 발현이다1,2. 다수의 활성화된 면역 세포에 의해 발현되는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여, 종양 세포는 PD-L1의 발현을 증가시켜 활성 T 세포를 발현하여, 이를 효과적으로 종양 세포를 근절하지 못하게 한다3. PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 차단하는 항체의 사용은 현재 인간4에서여러 암 유형을 치료하는 데 사용된다. 이러한 임상적 성공 및 기타에 비추어, 종양 유래 면역억제 메커니즘의 식별 및 표적화는 점점 더 주목을 받고 있다.

적응 면역의 억제를 넘어, 종양은 또한 선천적인 면역 세포의 프로 염증 반응을 억제 하는 요인을 분 비 하는 것으로 알려져 있습니다. IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 및 콜로니 자극 인자(CSF-1)를 포함하는 종양 유래 또는 종양 유도 분비물, 종양 미세환경5,6,7에서자연살인자(NK) 세포, 과립구 및 수지상 세포의 항종양 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 종양 세포는 또한 종양 미세환경에서 골수성 유래 세포의 모집 및 분화를 왜곡하는 인자를 분비하여 T 세포활성화의억제를 촉진할 수 있다8,9.

종양 진행에 깊은 영향을 미치는 선천적인 면역 세포의 한 종류는 대식 세포입니다. 수년 동안, 종양 관련 대식세포(TAM)의 존재는 환자생존도 10의음성 예후로서 사용되어 왔다. 면역 억제 TAM이 종양의 면역 세포 매개 클리어런스를 약화시키는 개념은 40 년 전에11년 이상 소개되었습니다. 보다 최근에는, 대식세포 프로-염증 반응이 종양 미세환경에서 유도될 수 있는 동안 프로-종양 표현형이 하향 조절될 수 있음을 보여주었다. 이러한 면역억제 대식세포는 내성 반응에 기여할 수 있고, 종양 진행 및 화학요법및면역요법에대한 내성을 유도한다. 대식세포가 종종 종양과 함께 가장 풍부한 백혈구 중 하나라는 점을 감안할 때, 그들의 종양 특이적 면역 활성의 회복은 항암치료제(13)에대한 잠재적인 표적을 나타낸다.

종양 세포와 대식세포 사이의 접촉 매개 상호 작용은 직접 적인 공동 배양을 통해 모델링될 수 있는 동안, 투과성 막 지지체의 사용은 종양 분비 요인이 종양 면역 세포 세포 접촉의 잠재적으로 혼란스러운 영향 없이 면역 조절인 것을 해명할 수 있습니다. 다소 유사한 방법을 사용하여, 그 외는 중피 세포와 종양 세포뿐만 아니라 microglia/neuronal 상호 작용14에서 분비 된 인자를 식별할 수있는 잠재력을 입증했다15. 우리는 또한 LPS 및 인터페론 감마16을이용한 복막 대식세포의 자극 후 염증성 유전자 발현의 억제자로서 종양 분비 단백질, Pros1의 역할을 특성화하기 위해 이 공동 배양 기술을 성공적으로 사용하였다. 여기에서 우리는 종양 분비 요인이 대식세포 활성화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 심문하기 위하여 이용될 수 있는 간단한 방법론을 기술합니다.

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Protocol

유린 복막 대식세포의 수확 및 사용과 관련된 모든 절차는 채플 힐 (UNC)의 노스 캐롤라이나 대학에서 실시되었으며 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 대식세포 문화

참고: 이 절차는 1 차적인 맥기 대식세포 (아래에 자세히 설명함), 골수 유래 대식세포, 또는 J774 (ATCC) 또는 RAW264 (ATCC)와 같은 대식세포 세포주를 이용할 수 있습니다.

  1. 앞서 설명한 바와 같이 배차 후막대식세포(16,17 및 플레이트는 0.4 μm 폴리에스테르 막 삽입의 상부 챔버(들)로 직접 플레이트-배양 6웰 플레이트(도1A).
    참고 : 각 격리에서 대식세포의 대략적인 수율은 총 1 x 106 셀이므로 웰 당 평균 세포 수는 6 개의 웰 플레이트에서 ~ 1.5 - 1.6 x 105 셀입니다.
  2. 37°C에서 3일간 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)/F12, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)에서 수확한대식세포배양.
    참고: 상부 챔버는 배양 배지 1 mL을 포함하고 하부 챔버는 1.5 mL로 채워집니다. 매개체를 각 챔버에 추가해야 합니다.

2. 대식세포가 있는 종양 세포의 공동 배양

  1. 사용하기 전에, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 그들의 각각 배지에서 시판가능한 종양 세포를 배양한다.
  2. 인산완충식염수(PBS)로 종양 세포를 한 번 세척하고, 0.05% 트립신 + 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양한다. 배지를 포함하는 FBS에 있는 세포를 다시 중단하고, 혈세포 계측기 또는 세포 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 정량화하고, 그 다음 펠릿에 220 x g에서 5 분 동안 원심분리기.
  3. 원심분리 동안, 대식세포 함유 투과막 지지판의 상부 및 하부 챔버로부터 배지를 흡인하고 신선한 배지로 대체한다.
    1. 종양 세포가 도금될 더 낮은 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 허용하기 위해 1.5 mL 대신 배지 1 mL로 채웁니다.
  4. 펠릿 된 종양 세포에서 배지를 흡인하고 DMEM / F12에서 10 % FBS, 1 x 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 3 x 105 세포 / mL의 농도로 20 ng / mL M-CSF로 세포를 재중단시냅니다.
  5. 원하는 웰의 하부 챔버에 3 x 105 세포 / mL 종양 세포의 0.5 mL을 추가하십시오(그림 1B).
    참고 : 세포는 즉시 치료 할 수 있습니다.

3. 공동 배양 세포의 치료

  1. 대식 세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도 하기 위해, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS를 추가 하 여 단일 또는 공동 배양 된 대 식 세포 치료.
    1. 필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하고 일부 종양 매개 억제는 8h. 24h에 대한 공동 배양에 의해 발생하며 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 산출한다.
      참고: 대안적으로, 대식세포는 인터류핀-10(IL10)과 같은 인자의 첨가를 통해 프로-상처 치유 표현형을 채택하도록 유도될 수 있고, 종양 분비 리간드의 효과 평가.
  2. 부정적인 통제로, 문화 대식세포는 개별적으로 처리되지 않은 둡니다. 긍정적인 대조군으로, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS로 싱어장배양된 대식세포를 치료하십시오.

4. 공동 배양 세포의 다운스트림 분석

  1. 원하는 배양 시간이 경과한 후, 검사 필요에 따라 세포 가해 또는 컨디셔닝된 배양 배지를 원하는 대로 분리합니다.
  2. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 세포 용해액을 분리하기 위해, 웰의 두 챔버에서 매질을 흡인하고 PBS의 2 mL로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 라해스 완충장치를 적용한다. 세포를 용해시키기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어 내고 RNA 절연 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 옮김을 전달합니다.

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Representative Results

대식세포 편광에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 확인하기 위해, 기재된 절차를 활용하였습니다. 종양 세포의 부재에서 배양된 맥막 대식세포는 음성(치료되지 않은 = 멀리 왼쪽) 및 양성(IFNγ 및 LPS 자극 = 왼쪽으로부터2nd) 대조군(도2A)으로사용하였다. 대안적으로, 맥막 대식세포는 B16F10 흑색종 종양 세포(ATCC)와 공동 배양하였다(도1A). 도금 직후, 세포는 IFNγ 및 LPS로 처리하거나 치료되지 않은 상태로 방치하였다. 배양 24시간 후, 대식세포를 수확하고, RNA를 제조하고, qRT-PCR을 수행하여 염증성 유전자의 발현을 측정하였다. 여기에 기재된 공동 배양 시스템을 사용하여, 우리는 B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양된 맥막 대식세포가 활성화되지 않았지만 자극(LPS + IFNγ)을 활성화시키지 않고, 염증성-관련 유전자의 발현을 증가시키지 않았다는 것을보여준다(도 2A,B16F10 막/치료되지 않음). 이는 종양 분비 리간드가 1) 자체적으로 프로-염증성 유전자 발현을 유도하기에 충분하지 않거나 2) 종양 분비에 의한 면역 활성화가 있는 경우, 파라크린 리간드가 순진한 수준으로 억제하기에 충분하다는 것을 의미한다. 이러한 공동 배양 방법은 IFNγ 및 LPS에 의해 편광된 대식세포가 종양 세포의 존재 속에서 배양될 때, 염증 관련 유전자 발현의 억제가 60%까지 감소하였다는 것을보여준다(도 2A,B16F10 멤브레인/IFNγ+LPS). 유사한 수준의 대식세포 프로-염증성 유전자 억제는 뮤린 대식세포주 J774가 후막 대식세포를 대체할 때 관찰되었다(도2B).

우리의 이전 일은 대식세포 활성화를 억제할 수 있는 종양 분비 인자로 Pros1을확인했습니다 16. ELISA와 함께 투과성 멤브레인 지지 공동 배양 모델을 사용하여, 우리는 24 시간 후에 컨디셔닝 된 배지에서 Pros1의 농도를 분석했습니다. IFNγ 및 LPS로부터의 컨디셔닝 배지에서 B16F10 흑색종 세포 Pros1이 475 ng/mL ±120 ng/mL에서 발현되었다는 것을 관찰하였다(도3). 동일한 조건에서 처리된 맥막 대식세포는 61 ng/mL ±5 ng/mL에서 Pros1을 발현하였다(도3). 흥미롭게도, 공동 배양될 때, IFNγ 및 LPS 내에서 Pros1이 잘 처리된 것은 86 ng/mL±15 ng/mL이었다. 이는 1) 대식세포가 종양 분비 Pros1 또는 2) B16F10 세포에 의해 분비되는 Pros1의 양이 대식세포의 존재 시 실질적으로 감소한다는 것을 시사한다. 그림 2와 그림 3의 결과는 대식세포가 종양 세포와 병용배될 때 대식세포 활성화 및 파라크린 신호의 심오한 변화를 강조한다.

Figure 1
그림 1. 투과성 멤브레인을 위한 회로도는 대식세포와 종양 세포의 공동 배양을 지원합니다. 양성 및 음성 치료 대조군은 단일배양 대식세포 웰(A)에적용될 수 있다. 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 신호의 효과를 확인하기 위해, 대식세포는 하부 챔버(B)에서배양된 투과막 지지판 및 종양 세포의 상부 챔버에서 배양된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 종양 paracrine 신호는 대식세포 프로 염증성 편광을 억압합니다. 염증 관련 유전자의 대식세포 발현은 종양 세포의 존재 또는 부재 에서 치료되지 않은 또는 IFNγ 및 LPS 자극 대식세포에서 qRT-PCR에 의해 분석되었다. 염증성 유전자의 발현은 투과막 지지체에 의해 분리된 종양 세포의 존재에서 배양될 때 후막 대식세포(A) 또는 J774 대식세포주(B)에서 감소하였고, 그 효과는 파라크수용성 리간드에 의해 전달되었다. * p< 처리되지 않은 경우 0.05, p < 0.05 IFNγ 및 LPS 자극에 상대. 데이터는 평균 ± SEM; p 값은 두 꼬리 학생의 t 시험에 의해 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 종양 세포 및 대식세포의 공동배양은 조절된 배지에서 발견되는 종양 분비 파라크린 리간드의 양에 변화를 유도한다. ELISA는 종양 단독, 대식세포 단독, 또는 공동 배양 된 후 24 시간 후에 공양된 조절 배지에서 Pros1의 농도를 결정하는 데 사용되었습니다. *p < 0.05 처리되지 않은 상대. p 값은 두 꼬리 학생의 t 시험에 의해 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에서 제시된 공동 문화 분석법은 면역 세포 활성화에 종양 분비 요인의 연구를 허용하는 이전에 확립된 분석법의 수정입니다. 세포-세포 접촉은 면역 활동에 있는 변경을 유도하기 위하여 알려지는 동안, 면역 성 활성화를 조절하는 종양 분비 리간드의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 우리는 직접적인 공동 배양과는 달리, 종양 유래 분비 요인이 접촉 매개 신호의 혼란스러운 특성 없이 면역 세포 활성화에 미치는 영향을 심문하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 면역 억제에 있는 종양 분비 된 리간드의 잠재적인 임상 중요성을 감안할 때, 이 방법은 직접적인 공동 문화에 의해 해결되지 않는 방법으로 이 기계장치를 공부하기 위하여 이용하기 쉬운 공구를 제안합니다.

본질적으로, 여기서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 종양 세포(세포주 또는 1차 세포)와 대식세포(1차 세포: 상주, 골수 유래 또는 대식세포 세포주)의 배양을 포함한다. 대식세포는 0.4 μm 크기의 폴리에스테르 멤브레인 삽입물에서 배양되어 종양 분비 리간드의 자유로운 투과성을 허용하면서 필터를 통한 대식세포 세포 이동을 방지하는 것이 중요합니다. 적절한 세포 커버리지를 보장하기 위해 상하 챔버에 설명된 배양 배지의 양을 추가하는 것도 중요합니다. 하나의 세포 유형만 을 포함하는 것과 같은 실험 설계는 공동 배양 실험을 계획할 때 또 다른 핵심 요소입니다. 나중에 더 자세히 설명된 몇 가지 다른 요인은 분석 결과에 영향을 미칠 수 있으며 연구 설계 중에 각 요인을 염두에 두는 것이 중요합니다.

고려하기 위하여 설명된 프로토콜에 2개의 유용한 수정은 대식세포에 대한 종양 세포의 공동 배양 또는 상대적인 비율의 기간입니다. 설명된 방법에서, 대식세포 및 종양 세포는 대략 동등한 농도로 도금된다. 고려해야 할 중요한 점은 종양 미세 환경에서 자연적으로 발생하는 종양 세포에 대한 대식세포의 상대적 비율입니다. 더 나은 종양 미세 환경을 모방하기 위하여는, 대식세포의 상대적인 비율은 생체내에서 종양 내의 발견되는 무슨을 미러하기 위하여 변경될 수 있었습니다, 예비 일은 정확한 비율을 설치하기 위하여 필요할지도 모르지만.

또 다른 중요한 점, 및 시스템의 가능한 제한은, 분석에서 하나의 세포 유형을 자극하기 위해 적용된 치료법이 다른 세포 유형에 예기치 않거나 의도하지 않은 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 여기서 설명된 바와 같이, LPS 및 IFNγ의 첨가는 대식세포에서 염증성 유전자 발현을 자극하기 위한 것이다. 그러나, Ubil 외. 우리는 IFNγ가 또한 면역억제제 Pros116의발현 및 분비를 유도하는 것으로 나타났으며, 다른 것들은 종양 세포에 대한 LPS의 효과를 나타내었다18. 따라서 실험 결과를 확인하기 위해 다른 세포 유형에 대한 잠재적인 오프 타겟 또는 의도하지 않은 효과를 모니터링하기 위해 적절한 제어를 포함하는 것이 필수적입니다. 이것이 달성될 수 있는 1개의 방법은 표준 분자 생물학 검법을 사용하여 관심있는 에이전트로 개별 적인 세포 모형을 취급하고 효력을 감시하입니다.

투과성 멤브레인 지원 실험을 설계할 때, 분비 된 리간드의 가능한 확산 그라데이션을 고려하는 것도 중요합니다. 리간드 분비물의 상대적 속도, 공동 배양 기간 및 배양 플레이트가 고정된 위치에서 유지되는지 여부는 모두 결과에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 일부 분비 된 리간드가 배양 판의 표면에 부착 될 수있다.

대표적인 결과가 이 시스템의 특징이지만, 다른 종양 라인을 공동 배양할 때 관찰되는 염증성 유전자 억제의 정도는 극적으로 다를 수 있다. Ubil 외.에서, 우리는 몇몇 인간 종양 라인이 인간 대식세포세포주(16)의염증성 유전자 발현을 거의 완전히 억제할 수 있음을 보여준다. 반대로, 그밖 종양 세포 모형 또는 세포주 그들의 면역 억제 기능에서 실질적으로 변화할 수 있습니다. 이러한 차이에 대 한 원인은 불분명 하지만 추가 연구에 대 한 영역.

투과성 멤브레인 지원 공동 배양은 다양한 질문을 쉽게 해결하기 위해 쉽게 수정할 수 있는 강력한 방법론이며 qRT-PCR, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 포함한 다양한 분자 생물학 판독에 적응할 수 있습니다. 시스템은 유전자 삭제된 마우스 또는 CRISPR 편집에서 그 같이 유전 변경이 대식세포 또는 종양 세포에 만들어질 때, 리간드 또는 수용체와 같은 개별적인 유전자 기능을 개체하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 시스템은 또한 약리활성제 또는 억제제의 연구와 파라크린 신호에 미치는 영향에 대한 의무입니다. 또한, 여기서 논의되지 는 않았지만, 시스템은 종양 세포 유전자 발현에 대한 면역 활성화의 효과를 연구하는데 사용될 수 있다.

이 방법은 면역 억제, 종양 분비 리간드에 대한 새로운 기능의 발견 및 특성화에 성공적으로 사용되어 왔다. 이 강력한 도구는 새로운 치료 표적을 발견하기 위해 비접촉 종양/면역 상호 작용의 훨씬 더 광범위한 하위 집합을 심문하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

에릭 우빌은 부분적으로 미국 암 학회 박사 후 펠로우십 (128770-PF-15-216-01-LIB)에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 NIH(R01-CA205398)의 보조금과 유방암 연구 재단 상(BCRF-18-041)에서 HSE에 수여되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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암 연구 문제 153 파라크린 신호 리간드 수용체 투과막 지원 공동 배양
투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구
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Cite this Article

Pittman, K., Earp, S., Ubil, E.More

Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

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