Summary
Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.
Abstract
La señalización paracrina derivada de tumores es un componente pasado por alto de la inmunosupresión local y puede conducir a un entorno permisivo para el crecimiento continuo del cáncer y la metástasis. Las señales paracrinas pueden implicar el contacto de células celulares entre diferentes tipos de células, como PD-L1 expresada en la superficie de los tumores que interactúan directamente con PD-1 en la superficie de las células T, o la secreción de ligandos por una célula tumoral para afectar a una célula inmune. Aquí describimos un método de cocultivo para interrogar los efectos de los ligandos secretados por tumores en la activación de células inmunitarias (macrofago). Este sencillo procedimiento utiliza soportes permeables a membrana de policarbonato de 0,4 m disponibles comercialmente y placas de cultivo de tejido estándar. En el proceso descrito, los macrófagos se cultivan en la cámara superior y las células tumorales de la cámara inferior. La presencia de la barrera de 0,4 m permite el estudio de la señalización intercelular sin la variable de contacto físico de confundente, ya que los dos tipos de células comparten el mismo medio y la exposición a ligandos paracrinos. Este enfoque puede combinarse con otros, como alteraciones genéticas del macrófago (por ejemplo, el aislamiento de ratones noqueadores genéticos) o tumores (por ejemplo, alteraciones mediadas por CRISPR) para estudiar el papel de factores y receptores secretos específicos. El enfoque también se presta a análisis biológicos moleculares estándar, como la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa (qRT-PCR) o el análisis de manchas occidentales, sin necesidad de clasificar el flujo para separar las dos poblaciones celulares. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) se pueden utilizar de manera similar para medir los ligandos secretados para comprender mejor la interacción dinámica de la señalización celular en el contexto de tipo de célula múltiple. La duración de la cocultura también puede variar para el estudio de eventos regulados temporalmente. Este método de cocultivo es una herramienta robusta que facilita el estudio de las señales secretadas por tumores en el contexto inmune.
Introduction
Estudios recientes se han centrado en la capacidad de las células cancerosas para evitar la detección por células inmunitarias, suprimir la activación inmune local o producir un ambiente tolerogénico tumor-permisivo en el microambiente tumoral. Se han descrito dos amplias clases de interacciones tumorales y de células inmunitarias que facilitan estos efectos: interacciones mediadas por contacto o ligandos secretados por tumores. Uno de los mecanismos más bien estudiados y clínicamente tractables de la inhibición inmune mediada por contacto utilizado por los tumores es la expresión de PD-L1, que interactúa con PD-1 en las células T para inhibir su activación y función1,2. En respuesta al interferón-gamma (IFN), que se expresa por una serie de células inmunitarias activadas, las células tumorales pueden aumentar la expresión de PD-L1 para inducir el agotamiento de las células T activadas con DP-1, lo que les impide erradicar eficazmente las células tumorales3. El uso de anticuerpos para bloquear la interacción entre PD-L1 y PD-1 se utiliza actualmente para tratar múltiples tipos de cáncer en humanos4. A la luz de este éxito clínico y otros, la identificación y focalización de los mecanismos inmunosupresores derivados de tumores ha recibido cada vez más atención.
Más allá de la supresión de la inmunidad adaptativa, los tumores también son conocidos por los factores secretos que suprimen las respuestas proinflamatorias de las células inmunitarias innatas. Secreciones derivadas de tumores o inducidas por tumores, incluyendo IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, y factor estimulante de colonias (CSF-1), se ha demostrado para inhibir las respuestas antitumorales de células asesinas naturales (NK), granulocitos, y células dendríticas en el microambiente tumoral5,6,7. Las células tumorales también pueden secretar factores que sesgan el reclutamiento y la diferenciación de células derivadas de mieloides en el microambiente tumoral para promover la supresión de la activación de células T8,9.
Un tipo de célula inmune innata que tiene un efecto profundo en la progresión tumoral es el macrófago. Durante muchos años, la presencia de macrófagos asociados a tumores (AMA) se ha utilizado como un pronóstico negativo de la supervivencia del paciente10. El concepto de que los TAM inmunosupresores amortiguan el aclaramiento de tumores mediados por células inmunes se introdujo hace más de 40 años11. Más recientemente, se ha demostrado que la respuesta proinflamatoria del macrófago puede ser regulada por desprecio mientras que un fenotipo protumoral puede ser inducido en el microambiente tumoral. Estos macrófagos inmunosupresores pueden contribuir a una respuesta tolerogénica, impulsando la progresión tumoral y la resistencia a la quimioterapia e inmunoterapia12. Dado que los macrófagos son a menudo uno de los leucocitos más abundantes con el tumor, la restauración de su actividad inmune específica del tumor representa un objetivo potencial para la terapia anticancerígena13.
Mientras que las interacciones mediadas por contacto entre las células tumorales y los macrófagos se pueden modelar a través de la cocultura directa, el uso de soportes de membrana permeables puede dilucidar qué factores secretados en tumores son inmunomoduladores sin la influencia potencialmente founding del contacto entre células tumorales y inmunes. Utilizando métodos algo similares, otros han demostrado el potencial de identificar factores secretos en las interacciones microglia/neuronal14, así como las células tumorales con las células mesoteliales15. También hemos utilizado con éxito esta técnica de cocultivo para caracterizar el papel de una proteína secretada por tumores, Pros1, como supresor de la expresión génica proinflamatoria después de la estimulación de los macrófagos peritoneales con LPS e interferón-gamma16. Aquí describimos una metodología sencilla que se puede utilizar para interrogar cómo los factores secretados por tumores pueden afectar la activación de los macrófagos.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con la cosecha y el uso de macrófagos peritoneales murinos se llevaron a cabo en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (UNC) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UNC (IACUC).
1. Cultura de los macrófagos
NOTA: Este procedimiento puede utilizar macrófagos peritoneales primarios (descritos en detalle a continuación), macrófagos derivados de la médula ósea o líneas celulares de macrófagos como J774 (ATCC) o RAW264 (ATCC).
- Cosecha de macrófagos peritoneales como se describió anteriormente16,17 y placa directamente en la cámara superior de una placa de cocultivo de inserción de membrana de poliéster de 0,4 m 6 placa de pozo(Figura 1A).
NOTA: El rendimiento aproximado de los macrófagos de cada aislamiento es de 1 x 106 celdas en total, por lo que el número medio de celdas por pozo es de 1,5 a 1,6 x 105 celdas en una placa de 6 pocillos. - Cultivo de los macrófagos cosechados en el medio de águila modificado (DMEM)/F12 de Dulbecco, 10% de suero bovino fetal (FBS), 1x penicilina/estreptomicina, factor estimulante de la colonia de macrófagos de 20 ng/ml (M-CSF) durante 37 días a 37 oC, 5% CO2.
NOTA: La cámara superior contiene 1 ml de medio de cultivo, mientras que la cámara inferior está llena de 1,5 ml. El medio debe añadirse a cada cámara.
2. Cocultura de células tumorales con macrófagos
- Antes de su uso, cultivar células tumorales disponibles comercialmente en sus respectivos métodos de cultivo de tejidos recomendados por ATCC.
- Lave las células tumorales adherentes una vez con solución salina tamponada de fosfato (PBS), agregue 0.05% trypsin + ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), e incubar a 37 oC hasta que las células se sequen. Resuspenda las células en FBS que contengan un medio, cuundas el número total de células usando un hemocitómetro o contador de células, y luego centrífuga durante 5 min a 220 x g a pellet.
- Durante la centrifugación, aspirar el medio de las cámaras superior e inferior de las placas de soporte de membrana permeable que contienen macrófagos y reemplazarlo por medio fresco.
- Para cámaras inferiores donde las células tumorales estarán chapadas, llene con 1 ml de medio en lugar de 1,5 ml para permitir un volumen suficiente para la adición celular.
- Aspirar el medio de células tumorales peletadas y resuspender células en DMEM/F12 con 10% DE FBS, 1x penicilina/estreptomicina y 20 ng/ml M-CSF a una concentración de 3 x 105 células/ml.
- Añadir 0,5 ml de 3 x 105 células/células tumorales a la cámara inferior de los pozos deseados(Figura 1B).
NOTA: Las células se pueden tratar inmediatamente.
3. Tratamiento de células cocultivadas
- Para inducir la expresión génica proinflamatoria de macrófagos, trate los macrófagos por separado o co-cultivos añadiendo 100 ng/ml de IFN y 50 ng/ml LPS.
- Variar la duración de los tiempos de tratamiento en el cultivo según sea necesario. La activación de los macrófagos se produce dentro de las 2 h y se produce una supresión mediada por tumores en 8 h. La cocultura durante 24 h produce una supresión sólida y consistente derivada de tumores.
NOTA: Alternativamente, los macrófagos pueden ser inducidos a adoptar un fenotipo curativo pro-herida a través de la adición de factores como la interleucina-10 (IL10), y el efecto del ligando secreto por tumores evaluado.
- Variar la duración de los tiempos de tratamiento en el cultivo según sea necesario. La activación de los macrófagos se produce dentro de las 2 h y se produce una supresión mediada por tumores en 8 h. La cocultura durante 24 h produce una supresión sólida y consistente derivada de tumores.
- Como control negativo, los macrófagos de cultivo por separado y no se tratan. Como control positivo, trate los macrófagos cultivados por separado con 100 ng/ml DE IFN y 50 ng/ml LPS.
4. Análisis posterior de células cocultivadas
- Una vez transcurrido el tiempo de incubación deseado, aísle el lisado celular o el medio de cultivo condicionado como se desee, dependiendo de las necesidades de prueba.
- Aislar el lisado celular para el análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR), aspirar los medios de ambas cámaras del pozo y lavar una vez con 2 ml de PBS. Aplique el tampón de lisis de ARN a la cámara superior que contiene los macrófagos. Raspar suavemente la membrana para liberar el lisado celular y transferirla a un tubo de recogida para su posterior procesamiento de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de aislamiento de ARN.
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Representative Results
Para determinar el efecto de los ligandos secretos por tumores en la polarización de los macrófagos, se utilizó el procedimiento descrito. Los macrófagos peritoneales cultivados en ausencia de células tumorales se utilizaron como controles negativos (sin tratar ) y positivos (IFN y LPS estimulados a 2o desde la izquierda)(Figura 2A). Alternativamente, los macrófagos peritoneales fueron co-cultivados con células tumorales de melanoma B16F10 (ATCC)(Figura 1A). Inmediatamente después del revestimiento, las células fueron tratadas con IFN y LPS o no se trataron. Después de 24 h de cultivo, se cosecharon macrófagos, se preparó ARN y se realizó qRT-PCR para medir la expresión de genes proinflamatorios. Utilizando el sistema de cocultivo descrito aquí, mostramos que los macrófagos peritoneales co-cultivados en presencia de células tumorales B16F10, pero sin activar estímulos (LPS + IFN), no aumentaron la expresión de genes asociados a proinflamatorios(Figura 2A,Membrana B16F10/no tratada). Esto implica que los ligandos secretos por tumores 1) no son suficientes por sí mismos para inducir la expresión génica proinflamatoria o 2) si hay activación inmune por secreciones tumorales, los ligandos paracrinos son suficientes para suprimirlo a niveles ingenuos. Este método de co-cultivo ilustra que cuando los macrófagos polarizados por IFN y LPS se cultivan en presencia de células tumorales, la supresión de la expresión génica asociada a la inflamación se redujo hasta en un 60%(Figura 2A,Membrana B16F10/IFN+LPS). Se observó un nivel comparable de supresión del gen proinflamatorio de macrófagos cuando la línea de células macróveres murinas J774 fue sustituida por macrófagos peritoneales(Figura 2B).
Nuestro trabajo anterior identificó Pros1 como un factor secreto por tumores que puede inhibir la activación de macrófagos16. Utilizando el modelo de cocultivo de soporte de membrana permeable en conjunto con ELISA, analizamos la concentración de Pros1 en medio acondicionado después de 24 h. Observamos que en el medio acondicionado de las células de melanoma B16F10 tratadas con IFN y LPS Pros1 se expresaba a 475 ng/ml a 120 ng/mL(Figura 3). Macrófagos peritoneales tratados en las mismas condiciones expresadas Pros1 a 61 ng/ml a 5 ng/mL(Figura 3). Curiosamente, cuando se co-cultiva, el Pros1 dentro del IFN y LPS tratado bien era 86 ng/mL a 15 ng/ml. Esto sugiere que 1) los macrófagos consumen Pros1 o 2 secretados por tumores la cantidad de Pros1 secretada por las células B16F10 disminuye sustancialmente cuando está en presencia de macrófagos. Los resultados de la Figura 2 y la Figura 3 resaltan cambios profundos en la activación de los macrófagos y la señalización paracrina cuando los macrófagos se cocultivan con las células tumorales.
Figura 1. El esquema para la membrana permeable apoya el cocultivo de células tumorales con macrófagos. Los controles de tratamiento positivos y negativos se pueden aplicar a pozos macrófagos con cultivo sin cultivo (A). Para determinar los efectos de las señales secretadas por tumores en la activación de los macrófagos, los macrófagos se cultivan en la cámara superior de las placas de cocultivo de soporte de membrana permeable y células tumorales cultivadas en la cámara inferior (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las señales paracrinas tumorales suprimen la polarización proinflamatoria de los macrófagos. La expresión de macrófagos de genes asociados a la inflamación fue analizada por qRT-PCR en macrófagos no tratados o estimulados por IFN y LPS en presencia o ausencia de células tumorales. La expresión de genes proinflamatorios disminuyó en los macrófagos peritoneales (A) o en la línea celular de los macrófagos J774 (B) cuando se cultivaen en presencia de células tumorales separadas por un soporte de membrana permeable de modo que el efecto fue transmitido por un ligando soluble en paracrina. *p < 0,05 en relación con los no tratados, p < 0,05 en relación con IFN y LPS estimulado. Los datos son medios: SEM; valores p calculados por la prueba t del estudiante de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La cocultura de células tumorales y macrófagos conduce a cambios en la cantidad de ligandos paracrinos secretados por tumores que se encuentran en un medio acondicionado. ELISA se utilizó para determinar la concentración de Pros1 solo en tumores, macrófagos solos o medios condicionados co-cultivados después de 24 h. La cocultura conduce a una disminución en la cantidad de Pros1 en relación con los controles de células tumorales solamente. *p < 0.05 en relación con no tratado. valores p calculados por la prueba t del estudiante de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo de cocultivo presentado aquí es una modificación de los ensayos previamente establecidos que permite el estudio de factores secretos por tumores en la activación de células inmunitarias. Mientras que el contacto con células celulares es conocido por inducir cambios en la actividad inmune, la capacidad de los ligandos secretados por tumores para modular la activación inmune es menos bien entendida. Describimos un método que, a diferencia del cocultivo directo, se puede utilizar para interrogar cómo los factores secretos derivados de tumores afectan la activación de células inmunitarias sin la naturaleza fundífera de la señalización mediada por contacto. Dada la importancia clínica potencial de los ligandos secretos por tumores en la inmunosupresión, este método ofrece una herramienta fácil de usar para estudiar estos mecanismos de maneras no abordadas por el cocultivo directo.
Esencialmente, el método de cocultivo descrito aquí implica el cultivo de macrófagos (células primarias: residentes, derivados de la médula ósea o una línea celular de macrófagos) con células tumorales (línea celular o células primarias) sin contacto físico. Es fundamental que los macrófagos se cultiquen en una plaquita de membrana de poliéster de tamaño de poro de 0,4 m para permitir la permeabilidad libre de los ligandos secretados por tumores, evitando al mismo tiempo la posible migración de células macrófagos a través del filtro. También es importante agregar la cantidad descrita de medio de cultivo a las cámaras superior e inferior para asegurar una cobertura celular adecuada. El diseño experimental, como la inclusión de controles de un solo tipo de celda, es otro factor clave a la hora de planificar experimentos de cocultura. Varios otros factores, descritos con más detalle más adelante, también pueden tener efectos en los resultados del ensayo y es importante tener cada uno en mente durante el diseño del estudio.
Dos modificaciones útiles en el protocolo descrito a tener en cuenta son la duración del cocultivo o la relación relativa de las células tumorales con los macrófagos. En el método descrito, los macrófagos y las células tumorales se chapan a concentraciones aproximadamente iguales. Un punto importante a considerar es la proporción relativa de macrófagos a las células tumorales que ocurre naturalmente en el microambiente tumoral. Para imitar mejor el microambiente tumoral, la proporción relativa de macrófagos podría modificarse para reflejar lo que se encuentra dentro del tumor in vivo, aunque puede ser necesario un trabajo preliminar para establecer la proporción correcta.
Otro punto crítico, y la posible limitación del sistema, es que los tratamientos aplicados para estimular un tipo de célula en el ensayo pueden tener efectos inesperados o no intencionales en el otro tipo de célula. Como se describe aquí, la adición de LPS y IFN está destinada a estimular la expresión génica proinflamatoria en los macrófagos. Sin embargo, en Ubil et al. mostramos que el IFN también induce la expresión y secreción de Pros116inmunosupresor, y otros han demostrado los efectos de LPS en las células tumorales18. Por lo tanto, es esencial incluir los controles adecuados para monitorear posibles efectos fuera de destino o no intencionales en el otro tipo de célula para verificar los resultados experimentales. Un método por el cual esto puede lograrse es mediante el tratamiento de tipos de células individuales con los agentes de interés y el monitoreo de efectos utilizando ensayos de biología molecular estándar.
Al diseñar experimentos de soporte de membrana permeables, también es importante considerar posibles gradientes de difusión de ligandos secretados. La tasa relativa de secreción de ligandos, la duración del cocultivo y si la placa de cultivo se mantiene en una posición estacionaria pueden tener efectos en los resultados. Además, es posible que algunos ligandos secretos se adhieran a la superficie de las placas de cultivo.
Si bien los resultados representativos mostrados son característicos de este sistema, el grado de supresión del gen proinflamatorio observado al co-cultivar otras líneas tumorales puede variar drásticamente. En Ubil et al., mostramos que algunas líneas tumorales humanas pueden suprimir casi por completo la expresión génica proinflamatoria de una línea16de células de macrófagos humanos. Por el contrario, otros tipos de células tumorales o líneas celulares pueden variar sustancialmente en sus capacidades inmunosupresoras. La causa de estas varianzas no está clara, pero es un área para un estudio adicional.
La cocultura de soporte de membrana permeable es una metodología robusta que se puede modificar fácilmente para abordar una variedad de preguntas y se puede adaptar a una gama de lecturas de biología molecular, incluyendo qRT-PCR, Western blot y ELISA. El sistema se puede utilizar para interrogar funciones genéticas individuales, como ligandos o receptores, cuando se realizan alteraciones genéticas como las de ratones eliminados por genes o ediciones CRISPR a macrófagos o a las células tumorales. El sistema también es susceptible al estudio de activadores o inhibidores farmacológicos y sus efectos sobre la señalización paracrina. Además, aunque no se discute aquí, el sistema se puede utilizar para estudiar los efectos de la activación inmune en la expresión génica de células tumorales.
Este método se ha utilizado con éxito en el descubrimiento y caracterización de una función novedosa para un ligando inmunosupresor, secretado por tumores. Esta robusta herramienta se puede utilizar para interrogar el subconjunto mucho más amplio de interacciones tumorales/inmunes sin contacto con la esperanza de descubrir nuevas dianas terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Eric Ubil fue financiado, en parte, por la American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). El trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (R01-CA205398) y un premio de la Fundación de Investigación del Cáncer de Mama (BCRF-18-041) a HSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
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