Summary
Здесь мы представляем метод с использованием проницаемых мембранных опор для облегчения изучения бесконтактной паракриной сигнализации, используемой опухолевыми клетками для подавления иммунного ответа. Система поддается изучению роли опухолевых факторов в увлажнении активации макрофагов.
Abstract
Сигнализация паракрина, полученная из опухолей, является упускаемым из виду компонентом местного иммуносупрессии и может привести к разрешительной среде для дальнейшего роста рака и метастазирования. Паракриновые сигналы могут включать контакт клеток между различными типами клеток, таких как PD-L1, выраженный на поверхности опухолей, взаимодействующих непосредственно с PD-1 на поверхности Т-клеток, или секреция лигандов опухолевой клеткой, чтобы возразить иммунную клетку. Здесь мы описываем метод совместной культуры для того чтобы допросить влияния тумор-секретированных ligands на активации иммунных клеток (макрофага). Эта простая процедура использует коммерчески доступные 0,4 мкм поликарбонатной мембраны проницаемые опоры и стандартные пластины культуры тканей. В описанном процессе макрофаги культивируются в верхней камере и опухолевых клетках в нижней палате. Наличие барьера 0,4 мкм позволяет изучать межклеточную сигнализацию без запутанной переменной физического контакта, поскольку эти два типа клеток имеют одинаковую среду и подвержены паракринным лиганам. Этот подход можно сочетать с другими, такими как генетические изменения макрофага (например, изоляция от генетических вырубки мышей) или опухоли (например, CRISPR-опосредованные изменения) для изучения роли конкретных секретных факторов и рецепторов. Этот подход также поддается стандартному молекулярному биологическому анализу, такому как количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) или западный анализ помарки, без необходимости сортировки потока для разделения двух популяций клеток. Фермент-связанные иммуносорбентные анализы (ELISAs) могут также быть использованы для измерения выделяется лиганды, чтобы лучше понять динамическое взаимодействие клеточной сигнализации в контексте нескольких типов клеток. Длительность совместной культуры также может быть различной для изучения временно регулируемых событий. Этот метод совместной культуры является надежным инструментом, который облегчает изучение опухолевых сигналов в иммунном контексте.
Introduction
Недавние исследования были сосредоточены на способности раковых клеток, чтобы избежать обнаружения иммунными клетками, подавить местную иммунную активацию, или производить толерантность опухоли вседозволенной среде в микроокружении опухоли. Были описаны два широких класса опухолевых и иммунных клеточных взаимодействий, которые облегчают эти эффекты: контактно-опосредованные взаимодействия или опухолевые лиганды. Одним из наиболее хорошо изученных и клинически tractable механизмов контактно-опосредованного иммунного ингибирования, используемых опухолями является выражение PD-L1, который взаимодействует с PD-1 на Т-клетки, чтобы ингибировать их активацию и функцию1,2. В ответ на интерферон-гамма (ИФНЗ), который выражается рядом активированных иммунных клеток, опухолевые клетки могут увеличить экспрессию PD-L1, чтобы вызвать истощение PD-1-выражения активированных Т-клеток, тем самым предотвращая их от эффективного искоренения опухолевых клеток3. Использование антител, чтобы блокировать взаимодействие между PD-L1 и PD-1 в настоящее время используется для лечения нескольких типов рака у людей4. В свете этого клинического успеха и других, выявление и таргетинг опухолевых иммуносупрессивных механизмов получил все большее внимание.
Помимо подавления адаптивного иммунитета, опухоли также известны выделять факторы, которые подавляют провоспалительные реакции врожденных иммунных клеток. Опухолевые или опухолевые выделения, в том числе IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, и колонии стимулирующий фактор (CSF-1), было показано, ингибировать противоопухолевые реакции естественных клеток убийцы (НК), гранулоцитов и дендритных клеток в микросреде опухоли5,6,7. Опухолевые клетки могут также выделять факторы, которые искажают набор и дифференциацию миелоидных клеток в микроокружении опухоли для содействия подавлению активации Т-клеток8,9.
Один из видов врожденных иммунных клеток, который имеет глубокое влияние на прогрессирование опухоли является макрофаг. На протяжении многих лет, наличие опухолевых макрофагов (TAMs) был использован в качестве отрицательного прогноза выживания пациента10. Концепция, что иммуносупрессивные TAMs ослабить иммунных клеток опосредованного очистки опухолей была введена более 40 лет назад11. Совсем недавно было показано, что макрофаг провоспалительных ответ может быть downregulated в то время как про-опухоли фенотип может быть индуцирован в микросреде опухоли. Эти иммуносупрессивные макрофаги могут способствовать толерантности, приводя к прогрессированию опухоли и устойчивости к химио- и иммунотерапии12. Учитывая, что макрофаги часто являются одним из наиболее распространенных лейкоцитов с опухолью, восстановление их опухоли специфической иммунной активности представляет собой потенциальную цель для противоопухолевых терапии13.
В то время как контактно-опосредованные взаимодействия между опухолевыми клетками и макрофагами могут быть смоделированы с помощью прямой кокультуры, использование проницаемых мембранных опор может выяснить, какие опухолевые факторы являются иммуномодулирующими без потенциально запутанного влияния опухолево-иммунного клеточного контакта. Используя несколько аналогичные методы, другие продемонстрировали потенциал выявления секретных факторов в микроглии / нейрональных взаимодействий14, а также опухолевые клетки с мезотелиальными клетками15. Мы также успешно использовали этот метод совместной культуры, чтобы охарактеризовать роль опухолевого белка, Pros1, как супрессор провоспалительного экспрессии генов после стимуляции перитонеальных макрофагов с LPS и интерферон-гамма16. Здесь мы описываем простую методологию, которая может быть использована для допроса, как опухолевые факторы могут повлиять на активацию макрофагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с сбором и использованием макрофагов перитонеального перитонеала, были проведены в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл (КООН) и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных КООН (IACUC).
1. Культура макрофагов
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может использовать первичные перитонеальные макрофаги (описанные подробно ниже), макрофаги костного мозга, или макрофаг клеточные линии, такие как J774 (ATCC) или RAW264 (ATCC).
- Урожай перитонеальных макрофагов, как ранее описано16,17 и пластины непосредственно в верхней камере (ы) 0,4 мкм полиэстермбраны вставить ко-культуры 6 хорошо пластины(рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительная урожайность макрофагов из каждой изоляции составляет 1 х 106 клеток, так что среднее количество клеток на скважину составляет 1,5-1,6 х 105 клеток в 6 хорошо пластины. - Культура собраны макрофаги в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) / F12, 10% Плодовий Сыворотка крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллин / стрептомицин, 20 нг / мл макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF) в течение 3 дней при 37 C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя камера содержит 1 мл культуры среды в то время как нижняя палата заполнена 1,5 мл. Среда должна быть добавлена к каждой камере.
2. Кокультура опухолевых клеток с макрофагами
- До использования, культура коммерчески доступны опухолевых клеток в их соответствующей среде следующие ATCC-рекомендуемых методов культуры тканей.
- Вымойте клетки опухоли адепта один раз с фосфатами буферного солей (PBS), добавить 0,05% трипсина и этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока клетки не отсоединиться. Resuspend клетки в FBS, содержащие среды, количественнообщее общее количество клеток с помощью гемоситометра или счетчика клеток, а затем центрифуга в течение 5 минут на 220 х г гранулы.
- Во время центрифугации, аспирировать среду из верхней и нижней камер макрофаговосодержащих проницаемых мембранных опорных пластин и заменить свежей средой.
- Для нижних камер, где опухолевые клетки будут покрыты, заполнить с 1 мл среднего вместо 1,5 мл, чтобы обеспечить достаточный объем для добавления клеток.
- Аспирная среда из гранулированных опухолевых клеток и повторное присоединение клеток в DMEM/F12 с 10% FBS, 1x пенициллином/стрептомицином и 20 нг/мл М-CSF в концентрации 3 х 105 клеток/мл.
- Добавьте 0,5 мл из 3 х 105 клеток/мл опухолевых клеток в нижнюю камеру желаемых скважин(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно лечить немедленно.
3. Лечение кокультурных клеток
- Чтобы вызвать макрофаг провоспалительные экспрессии генов, лечить покорно или совместно культурные макрофаги, добавив 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.
- Изменять продолжительность лечения раз в культуре по мере необходимости. Активация макрофага происходит в течение 2 ч, и некоторые опухолевые подавления происходит на 8 ч. Ко-культура для 24 ч дает надежные и последовательные опухоли полученных подавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, макрофаги могут быть вызваны принять про-рана исцеления фенотипа путем добавления таких факторов, как интерлейкин-10 (IL10), и эффект опухоли секретированных лиганд оценивается.
- Изменять продолжительность лечения раз в культуре по мере необходимости. Активация макрофага происходит в течение 2 ч, и некоторые опухолевые подавления происходит на 8 ч. Ко-культура для 24 ч дает надежные и последовательные опухоли полученных подавления.
- Как отрицательный контроль, культура макрофагов поетиво и оставить без лечения. В качестве положительного контроля, лечить познавательно культурные макрофаги с 100 нг / мл IFN и 50 нг / мл LPS.
4. Анализ сокультурных ячеек в низке
- После желаемого времени инкубации прошло, изолировать лизат клетки или условных среды культуры по желанию, в зависимости от потребностей тестирования.
- Чтобы изолировать лизат клетки для количественной полимеразы цепной реакции (qPCR) анализа, аспирировать средства массовой информации из обеих камер скважины и мыть один раз с 2 мл PBS. Нанесите буфер RNA lysis на верхнюю камеру, содержащую макрофаги. Аккуратно соскребите мембрану, чтобы выпустить клеточный лизат, и перенесите в трубку для дальнейшей обработки в соответствии с протоколом производителя изоляционных комплектов РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для определения влияния опухолевых лигандов на поляризацию макрофагов была использована описанная процедура. Перитональные макрофаги, культивируемые при отсутствии опухолевых клеток, использовались в качестве отрицательных (необработанные и крайне левые) и положительные (IFN и LPS стимулировали2-й слева) элементы управления(рисунок 2A). Кроме того, перитонеальные макрофаги были совместно культивированы с B16F10 клеток опухоли меланомы (ATCC) (Рисунок 1A). Сразу же после покрытия клетки либо лечились ИФНЗ и ЛПС, либо не получали лечения. После 24 ч культуры, макрофаги были собраны, РНК подготовлены, и qRT-PCR выполняется для измерения экспрессии провоспалительных генов. Используя систему совместной культуры, описанную здесь, мы показываем, что перитонеальные макрофаги совместно культивируются в присутствии опухолевых клеток B16F10, но без активации стимулов (LPS и IFN) не увеличивали экспрессию провоспалительных генов(Рисунок 2A,B16F10 мембраны/необработанные). Это означает, что опухолевые лиганды 1) не достаточно сами по себе, чтобы вызвать провоспалительные экспрессии генов или 2), если есть иммунная активация опухолевых выделений, паракринные лиганды достаточно, чтобы подавить его до наивных уровней. Этот метод совместной культуры иллюстрирует, что, когда макрофаги, поляризованные ИФНЗ и LpS, культивируются в присутствии опухолевых клеток, подавление связанного с воспалением экспрессии генов было уменьшено на целых 60%(рисунок 2A, B16F10 Membrane/IFN-LPS). Сопоставимый уровень макрофагов про-воспалительных подавления генов наблюдался, когда линии макрофагов murine макрофаг овой линии J774 был заменен на перитонеальные макрофаги(рисунок 2B).
Наша предыдущая работа определила Pros1 как опухолевый фактор, который может ингибировать активацию макрофагов16. Используя проницаемую модель поддержки мембраны в сочетании с ELISA, мы проанализаировали концентрацию Pros1 в условной среде после 24 ч. Мы заметили, что в условной среде от IfN и LPS лечение B16F10 меланомы клеток Pros1 был выражен на 475 нг/мл 120 нг/мл (Рисунок 3). Перитональные макрофаги, обработанные в тех же условиях, выраженные Pros1 на 61 нг/мл , 5 нг/мл(рисунок 3). Интересно, что при совместной культуре, Pros1 в рамках IFN и LPS хорошо относились было 86 нг /мл 15 нг/мл. Это говорит о том, что 1) макрофаги потребляют опухолевые Pros1 или 2) количество Pros1 выделяется B16F10 клеток существенно снижается, когда в присутствии макрофагов. Результаты как на рисунке 2, так и на рисунке 3 подчеркивают глубокие изменения активации макрофагов и сигнализации паракрина, когда макрофаги совместно культивируются с опухолевыми клетками.
Рисунок 1. Схема для проницаемой мембраны поддерживает кокультуру опухолевых клеток с макрофагами. Положительные и отрицательные элементы контроля лечения могут быть применены к познавательно культивированных скважин макрофага (A). Для определения влияния опухолевых сигналов на активацию макрофагов, макрофаги культивируются в верхней камере проницаемой мембранной поддержки кокультурных пластин и опухолевых клеток, культивируемых в нижней палате (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Опухолевые парокриновые сигналы подавляют макрофаг провоспалительную поляризацию. Макрофаг выражение связанных с воспалением генов было оценено qRT-PCR в необработанных или ИФНЗ и LPS стимулировали макрофаги при наличии или отсутствии опухолевых клеток. Выражение провоспалительных генов было уменьшено в перитонеальных макрофагах (A) или J774 линии макрофаг клеток (B) когда культивируется в присутствии опухолевых клеток, разделенных проницаемой мембранной поддержкой, так что эффект был передан паракринной растворимой лиганд. p slt; 0,05 по отношению к необработанным, p s lt; 0,05 по отношению к IFN и LPS стимулировали. Данные являются средними и SEM; p значения, рассчитанные по двуххвостому тесту студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Кокультура опухолевых клеток и макрофагов приводит к изменениям в количестве опухолевых паракринных лигандов, обнаруженных в условной среде. ELISA был использован для определения концентрации Pros1 только в опухоли, макрофаг в одиночку, или совместной культуры кондиционированных среды после 24 ч. Co-культура приводит к уменьшению количества Pros1 по отношению к опухолевых клеток только контролирует. р-р злт; 0,05 по отношению к необработанным. p значения, рассчитанные по двуххвостому тесту студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ сокультуры, представленный здесь, представляет собой модификацию ранее установленных анализов, которая позволяет изучать опухолевые факторы активации иммунных клеток. В то время как контакт клеток, как известно, вызывают изменения в иммунной активности, способность опухолевых лигандов модулировать иммунную активацию менее хорошо понимается. Мы описываем метод, который, в отличие от прямой совместной культуры, может быть использован для допроса, как выдержанные опухолями выделяемые секретные факторы влияют на активацию иммунных клеток без путаницы характер контактно-опосредоченной сигнализации. Учитывая потенциальную клиническую важность опухолевых лигандов в иммуносупрессии, этот метод предлагает простой в использовании инструмент для изучения этих механизмов способами, не решенными прямой совместной культурой.
По существу, метод совместной культуры, описанный здесь, включает в себя культуру макрофагов (первичных клеток: резидентов, костного мозга, полученных, или макрофаг клеточной линии) с опухолевыми клетками (клеточная линия или первичные клетки) без физического контакта. Очень важно, чтобы макрофаги культивировались на 0,4 мкм пор размер полиэфирной мембраны вставить, чтобы позволить свободную проницаемость опухолевых лигандов, предотвращая возможность миграции макрофагов ных клеток через фильтр. Важно также добавить описанное количество среды культуры к верхней и нижней камерам для обеспечения надлежащего покрытия клеток. Экспериментальный дизайн, такой как включение только одного типа клеток, является еще одним ключевым фактором при планировании экспериментов по совместной культуре. Несколько других факторов, описанных более подробно позже, также может иметь влияние на результаты исследования, и важно иметь в виду, каждый во время исследования дизайна.
Два полезных изменения в изложенном протоколе для рассмотрения являются продолжительность совместной культуры или относительное соотношение опухолевых клеток к макрофаг. В описанном методе макрофаги и опухолевые клетки покрыты примерно равными концентрациями. Важным моментом для рассмотрения является относительная доля макрофагов к опухолевым клеткам, что естественным образом происходит в микроокружении опухоли. Чтобы лучше имитировать микроокружение опухоли, относительная доля макрофагов может быть изменена, чтобы отразить то, что находится в опухоли in vivo, хотя предварительная работа может быть необходима для установления правильного соотношения.
Другой критический момент, и возможное ограничение системы, является то, что лечение применяется для стимулирования одного типа клеток в ходе ассе может иметь неожиданные или непреднамеренные последствия для другого типа клеток. Как описано здесь, добавление LPS и IFN предназначено для стимулирования провоспалительных экспрессии генов в макрофагах. Тем не менее, в Ubil и др. мы показали, что IFN' также вызывает выражение и секрецию иммуносупрессивных Pros116, и другие показали влияние LPS на опухолевые клетки18. Поэтому крайне важно включить надлежащие меры контроля для мониторинга потенциального внецелевого или непреднамеренного воздействия на другой тип клеток для проверки экспериментальных результатов. Один из методов, с помощью которых это может быть достигнуто путем лечения отдельных типов клеток с агентами интереса и мониторинга эффектов с помощью стандартных молекулярной биологии анализы.
При проектировании проницаемых мембранных экспериментов поддержки, важно также рассмотреть возможные градиенты диффузии выделяется лиганды. Относительная скорость секреции лиганда, продолжительность совместной культуры и сохранение культурной плиты в стационарном положении могут оказать влияние на результаты. Кроме того, некоторые засекреченные лиганды могут прилипать к поверхности культурных плит.
В то время как представленные репрезентативные результаты характерны для этой системы, степень провоспалительного подавления генов наблюдается при сокультивации других опухолевых линий, может резко различаться. В Ubil et al., мы показываем что некоторые людские линии тумора могут почти вполне подавить провоспалительное выражение гена людской линии клетки макрофага16. И наоборот, другие типы опухолевых клеток или клеточные линии могут существенно варьироваться в их иммуносупрессивных возможностей. Причина этих отклонений неясна, но является областью для дальнейшего изучения.
Проницаемая мембранная поддержка совместной культуры является надежной методологией, которая может быть легко изменена для решения различных вопросов и может быть адаптирована к целому ряду молекулярной биологии считываний, включая qRT-PCR, Западный пятно, и ELISA. Система может быть использована для допроса отдельных функций генов, таких как лиганды или рецепторы, когда генетические изменения, как те, от генных удаленных мышей или CRISPR правки сделаны либо макрофагов или опухолевых клеток. Система также поддается изучению фармакологических активаторов или ингибиторов и их воздействию на сигнализацию паракринных. Кроме того, хотя не обсуждается здесь, система может быть использована для изучения влияния иммунной активации на экспрессию генов опухолевых клеток.
Этот метод успешно используется в открытии и характеристике новой функции для иммуносупрессивного, опухолевого лиганда. Этот надежный инструмент может быть использован для допроса гораздо более широкое подмножество бесконтактных опухолей / иммунных взаимодействий в надежде на открытие новых терапевтических целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эрик Ubil был профинансирован, в частности, Американское онкологическое общество постдокторской стипендий (128770-PF-15-216-01-LIB). Работа была поддержана грантом от NIH (R01-CA205398) и наградой Фонда исследований рака молочной железы (BCRF-18-041) в ВШЭ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
