Summary
Här presenterar vi en metod med permeabla membran stöd för att underlätta studiet av icke-kontakt parakrin signalering används av tumörceller för att undertrycka immunförsvaret. Systemet är mottaglig för att studera rollen av tumör-utsöndras faktorer i dämpande makrofagaktivering.
Abstract
Tumör-derived parakrin signalering är en förbisedd del av lokal immunsuppression och kan leda till en tillåtande miljö för fortsatt cancer tillväxt och metastaser. Paracrine signaler kan innebära cell-cell kontakt mellan olika celltyper, såsom PD-L1 uttrycks på ytan av tumörer interagerar direkt med PD-1 på ytan av T-celler, eller utsöndring av ligander av en tumör cell för att påverka en immun cell. Här beskriver vi en co-Culture metod för att förhöra effekterna av tumör-utsöndras ligander på immunceller (makrofage) aktivering. Detta enkla förfarande utnyttjar kommersiellt tillgängliga 0,4 μm polykarbonat membran permeabla stöd och standard vävnad kultur plattor. I den beskrivna processen är makrofager odlade i övre kammaren och tumörceller i nedre kammaren. Närvaron av 0,4 μm barriären möjliggör studiet av intercellulära signalering utan confounding variabeln av fysisk kontakt, eftersom de två celltyperna delar samma medium och exponering för parakrin ligands. Denna metod kan kombineras med andra, såsom genetiska förändringar av makrofagen (t. ex. isolering från genetiska knock-out möss) eller tumör (t. ex., CRISPR-medierade förändringar) för att studera rollen av specifika utsöndras faktorer och receptorer. Metoden lämpar sig också för standardiserade molekylära biologiska analyser som kvantitativ omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion (QRT-PCR) eller Western blot-analys, utan behov av flödes sortering för att separera de två cell populationerna. Enzymlänkade immunosorbent analyser (ELISAs) kan på samma sätt utnyttjas för att mäta utsöndras ligander för att bättre förstå den dynamiska interaktionen av cellsignalering i multipel celltyp kontext. Varaktigheten av medkulturen kan också varieras för studien av temporally reglerade händelser. Denna Co-Culture metod är ett robust verktyg som underlättar studiet av tumör-utsöndras signaler i immun sammanhang.
Introduction
Nyligen genomförda studier har fokuserat på förmågan hos cancerceller att undvika detektion av immunceller, undertrycka lokala immunförsvaret aktivering, eller att producera en tolerogena tumör-tillåtande miljö i tumören mikromiljö. Två breda klasser av tumör-och immun cells interaktioner har beskrivits som underlättar dessa effekter: kontaktmedierade interaktioner eller tumörutsöndras ligander. En av de mest välstuderade och kliniskt tractable mekanismerna för kontakt-medierad Immunhämning utnyttjas av tumörer är uttrycket av PD-L1, som interagerar med PD-1 på T-celler för att hämma deras aktivering och funktion1,2. Som svar på interferon-gamma (IFNγ), som uttrycks av ett antal aktiverade immunceller, tumörceller kan öka uttrycket av PD-L1 att inducera utmattning av PD-1 – uttrycker aktiverade T-celler, vilket hindrar dem från att effektivt utrota tumörceller3. Användning av antikroppar för att blockera interaktionen mellan PD-L1 och PD-1 används för närvarande för att behandla flera cancertyper hos människa4. Mot bakgrund av denna kliniska framgång och andra, identifiering och inriktning av tumör-derived immunsuppressiva mekanismer har fått ökad uppmärksamhet.
Bortom dämpning av adaptiv immunitet, tumörer är också kända för att utsöndra faktorer som undertrycka den pro-inflammatoriska reaktioner av medfödda immunceller. Tumör-derived eller tumör-inducerad sekret, inklusive Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, och kolonin stimulerande faktor (CSF-1), har visat sig hämma antitumöreffekt svar av naturliga mördare (NK) celler, granulocyter, och dendritiska celler i tumören mikromiljö5,6,7. Tumörceller kan också utsöndra faktorer som skeva rekrytering och differentiering av myeloida-härledda celler i tumören mikromiljö att främja dämpning av T-cells aktivering8,9.
En typ av medfödda immunceller som har en djupgående effekt på tumörprogression är makrofagen. Under många år har närvaron av tumörassocierade makrofager (TAMs) använts som en negativ prognostisk av patientens överlevnad10. Konceptet att immunsuppressiva TAMs dämpa immun Cell-medierad clearance av tumörer infördes mer än 40 år sedan11. På senare tid har det visats att makrofage pro-inflammatorisk reaktion kan vara nedreglerad medan en Pro-tumör fenotyp kan induceras i tumören mikromiljö. Dessa immunsuppressiva makrofager kan bidra till en tolerogena svar, drivande tumör progression och resistens mot kemo-och immunterapi12. Med tanke på att makrofager är ofta en av de mest rikliga leukocyter med tumören, restaurering av deras tumör-specifika immun aktivitet representerar ett potentiellt mål för cancer Therapeutics13.
Medan kontakt-medierade interaktioner mellan tumörceller och makrofager kan modelleras genom direkt coculture, användning av permeabla membran stöd kan belysa vilka tumörutsöndrande faktorer är immunmodulerande utan potentiellt störande inverkan av tumör-immun cell-cell kontakt. Med något liknande metoder, andra har visat potentialen att identifiera utsöndras faktorer i mikroglia/neuronala interaktioner14 samt tumörceller med mesothelial celler15. Vi har också framgångsrikt använt denna Co-Culture teknik för att karakterisera rollen av en tumör-utsöndras protein, Pros1, som en suppressor av pro-inflammatorisk genuttryck efter stimulering av peritoneala makrofager med LP-skivor och interferon-gamma16. Här beskriver vi en enkel metod som kan användas för att förhöra hur tumör-utsöndras faktorer kan påverka makrofagaktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden relaterade till skörd och användning av murin peritonealdialys makrofager genomfördes vid University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) och godkändes av UNC institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. macrophage kultur
Anmärkning: denna procedur kan använda primära peritoneala makrofager (beskrivs i detalj nedan), benmärg-härledda makrofager, eller makrofage cellinjer såsom J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).
- Harvest peritoneala makrofager som tidigare beskrivits16,17 och plattan direkt i den övre kammaren (s) av en 0,4 μm polyestermembran infoga Co-Culture 6 väl tallrik (figur 1a).
Anmärkning: den ungefärliga avkastningen av makrofager från varje isolering är 1 x 106 celler totalt, så det genomsnittliga antalet celler per brunn är ~ 1.5-1.6 x 105 celler i en 6 väl tallrik. - Kultur de skördade makrofager i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM)/F12, 10% foster bovint serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin, 20 ng/mL makrofage kolonistimulerande faktor (M-CSF) för 3 dagar vid 37 ° c, 5% CO2.
Anmärkning: den övre kammaren innehåller 1 ml odlingssubstrat medan den undre kammaren är fylld med 1,5 ml. Mediet måste läggas till varje kammare.
2. samodling av tumörceller med makrofager
- Före användning, kultur kommersiellt tillgängliga tumörceller i deras respektive medium efter ATCC-rekommenderade vävnadsodling metoder.
- Tvätta anhängare tumörceller en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 0,05% trypsin + etylendiamintetraättiksyra (EDTA), och inkubera vid 37 ° c tills cellerna lossnar. Omsuspendera cellerna i FBS som innehåller medel, kvantitera det totala antalet celler med hjälp av en hemocytometern eller cell räknare, och sedan Centrifugera för 5 min vid 220 x g till pellets.
- Under centrifugering, aspirera mediet från de övre och nedre kamrarna i makrofage-innehållande permeabla membran stödplattor och ersätta med färskt medium.
- För nedre kammare där tumörceller kommer att pläteras, fyll med 1 mL medium i stället för 1,5 mL för att möjliggöra tillräcklig volym för cell addition.
- Aspirera medel från pelleterade tumörceller och Omsuspendera celler i DMEM/F12 med 10% FBS, 1x penicillin/streptomycin och 20 ng/mL M-CSF vid en koncentration av 3 x 105 celler/ml.
- Tillsätt 0,5 mL 3 x 105 celler/ml tumörceller till den nedre kammaren av önskade brunnar (figur 1b).
ANMÄRKNINGAR: celler kan behandlas omedelbart.
3. behandling av co-odlade celler
- För att inducera makrofagpro-inflammatoriskt genuttryck, behandla ensamma eller co-odlade makrofager genom att tillsätta 100 ng/mL IFNγ och 50 ng/mL LPS.
- Variera varaktigheten av behandlingstider i kulturen efter behov. Makrofagaktivering sker inom 2 h och vissa tumör-medierad suppression sker genom 8 h. co-kultur för 24 h ger robust och konsekvent tumör-derived suppression.
Anm.: Alternativt kan makrofager induceras för att anta en Pro-sårläkning fenotyp genom tillsats av faktorer som interleukin-10 (IL10), och effekten av tumörutsöndras ligand bedömas.
- Variera varaktigheten av behandlingstider i kulturen efter behov. Makrofagaktivering sker inom 2 h och vissa tumör-medierad suppression sker genom 8 h. co-kultur för 24 h ger robust och konsekvent tumör-derived suppression.
- Som en negativ kontroll, kultur makrofager ensamma och lämna obehandlad. Som en positiv kontroll, behandla enstaka odlade makrofager med 100 ng/mL IFNγ och 50 ng/mL LPS.
4. nedströms analys av co-odlade celler
- Efter önskad inkubationstid har förflutit, isolera cellen lysate eller konditionerade odlingsmedium som önskas, beroende på testningsbehov.
- För att isolera cellen lysate för kvantitativ polymeras kedjereaktion (qPCR) analys, aspirera media från båda kamrarna i brunnen och tvätta en gång med 2 ml PBS. Använd RNA-lysis buffert till den övre kammaren som innehåller makrofager. Skrapa försiktigt upp membranet för att frigöra cellen lysate och överför till ett samlingsrör för vidare bearbetning enligt RNA isolation kit tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma effekten av tumör-utsöndras ligander på makrofagpolarisering, det förfarande som beskrivs utnyttjades. Peritoneala makrofager odlade i avsaknad av tumörceller användes som negativa (obehandlad = långt till vänster) och positiva (IFNγ och LPS stimuleras = 2nd från vänster) kontroller (figur 2A). Alternativt, peritonealdialys makrofager var Co-odlade med B16F10 melanomtumörceller (ATCC) (figur 1a). Omedelbart efter plätering, celler behandlades antingen med IFNγ och LPS eller lämnas obehandlade. Efter 24 h kultur, makrofager skördades, RNA förberett, och qRT-PCR utförs för att mäta uttrycket av pro-inflammatoriska gener. Med hjälp av co-Culture system som beskrivs här, visar vi att peritonealdialys makrofager Co-odlade i närvaro av B16F10 tumörceller, men utan att aktivera stimuli (LPS + IFNγ), inte öka uttrycket av pro-inflammatoriska – associerade gener (figur 2A, B16F10 membran/obehandlad). Detta innebär att tumör-utsöndras ligander är 1) inte tillräckligt av sig själva för att inducera pro-inflammatorisk genuttryck eller 2) om det finns immunförsvaret aktivering av tumör sekret, parakrin ligander är tillräckliga för att undertrycka den till naiva nivåer. Denna samkulturmetod illustrerar att när makrofager polariseras av IFNγ och LPS odlas i närvaro av tumörceller, dämpning av inflammation-associerade genuttryck reducerades med så mycket som 60% (figur 2A, B16F10 membran/ifnγ + LPS). En jämförbar nivå av makrofagpro-inflammatorisk gensuppression observerades när murin makrofage cellinjer J774 ersattes för peritonealmakro Fager (figur 2b).
Vårt tidigare arbete identifierade Pros1 som en tumörutsöndras faktor som kan hämma makrofagaktivering16. Med hjälp av permeabla membran stöd Co-Culture modell tillsammans med ELISA, vi analyseras koncentrationen av Pros1 i konditionerade medium efter 24 h. Vi observerade att i betingat medium från IFNγ och LPS behandlade B16F10 melanomceller Pros1 uttrycktes vid 475 ng/mL ± 120 ng/mL (figur 3). Peritonealmakrofager behandlade under samma betingelser uttryckt Pros1 vid 61 ng/mL ± 5 ng/mL (figur 3). Intressant, när Co-odlade, Pros1 inom IFNγ och LPS behandlade väl var 86 ng/mL ± 15 ng/mL. Detta tyder på att 1) makrofager konsumerar tumör-utsöndras Pros1 eller 2) mängden Pros1 utsöndras av B16F10 celler minskas avsevärt när i närvaro av makrofager. Resultat från både figur 2 och figur 3 Markera djupgående förändringar av makrofagaktivering och parakrin signalering när makrofager är co-odlade med tumörceller.
Figur 1. Schematisk för genomsläpplig membran stöd Co-kultur av tumörceller med makrofager. Positiva och negativa behandlings kontroller kan tillämpas på enstaka odlade makrofagbrunnar (a). För att bestämma effekterna av tumör-utsöndras signaler på makrofagaktivering, makrofager odlas i övre kammaren av permeabla membran stöd Co-kultur plattor och tumörceller odlade i nedre kammaren (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tumör parakrin signaler undertrycka makrofag pro-inflammatorisk polarisering. Makrofaguttryck av inflammationsassocierade gener har analyserats av qRT-PCR i obehandlad eller IFNγ och LPS stimulerade makrofager i närvaro eller frånvaro av tumörceller. Uttryck för pro-inflammatoriska gener minskade i peritoneala makrofager (a) eller J774 makrofage cellinjer (B) när odlade i närvaro av tumörceller åtskilda av ett genomsläpplig membran stöd så att effekten överfördes av en parakrin lösliga ligand. *p < 0,05 i förhållande till obehandlad, †p < 0,05 i förhållande till ifnγ och LPS stimulerad. Data är medelvärde ± SEM; p -värden som beräknats med tvåsidiga Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Samodling av tumörceller och makrofager leder till förändringar i mängden tumör-utsöndras parakrin ligander finns i konditionerade medium. Elisa användes för att bestämma koncentrationen av Pros1 i tumören ensam, makrofär ensam, eller co-odlade betingat medium efter 24 h. co-kulturen leder till en minskning av mängden Pros1 i förhållande till endast tumör cell kontroller. *p < 0,05 i förhållande till obehandlad. p -värden som beräknats med tvåsidiga Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Co-Culture assay presenteras här är en modifiering av tidigare etablerade analyser som gör det möjligt för studiet av tumör-utsöndras faktorer på immuncellernas aktivering. Medan cell-cell kontakt är känt för att framkalla förändringar i immunförsvaret, förmågan hos tumör-utsöndras ligander att modulera immunförsvaret aktiveringen är mindre väl förstått. Vi beskriver en metod som, till skillnad från direkt samodling, kan användas för att förhöra hur tumör-härledda utsöndrande faktorer påverkar immuncellernas aktivering utan den störande karaktären hos kontaktförmedlad signalering. Med tanke på den potentiella kliniska betydelsen av tumör-utsöndras ligander i immunsuppression, denna metod erbjuder ett lättanvänt verktyg för att studera dessa mekanismer på ett sätt som inte behandlas av direkt medkultur.
I huvudsak den Co-Culture metod som beskrivs här innebär kulturen av makrofager (primära celler: bosatt, benmärg-derived, eller en makrofagcellinjer) med tumörceller (cellinjer eller primära celler) utan fysisk kontakt. Det är viktigt att makrofager odlas på en 0,4 μm porstorlek polyestermembran infoga för att möjliggöra fri permeabilitet av tumör-utsöndras ligander samtidigt förhindra möjliga makrofage cell migration genom filtret. Det är också viktigt att lägga till den beskrivna mängden odlingssubstrat till de övre och nedre kamrarna för att säkerställa korrekt cell täckning. Experimentell design, såsom införande av endast en celltyp kontroller, är en annan viktig faktor när man planerar samodling experiment. Flera andra faktorer, som beskrivs i detalj senare, kan också ha effekter på resultaten av analysen och det är viktigt att hålla varje i åtanke under studiens utformning.
Två användbara ändringar av skisserat protokoll att överväga är varaktigheten av samkulturen eller den relativa kvoten av tumörceller till makrofager. I den beskrivna metoden är makrofager och tumörceller pläterade vid ungefär lika koncentrationer. En viktig punkt att tänka på är den relativa andelen makrofager till tumörceller som naturligt förekommer i tumören mikromiljö. För att bättre efterlikna tumören mikromiljö, den relativa andelen av makrofager kan ändras för att spegla vad som finns inom tumören in vivo, men preliminära arbete kan vara nödvändigt att fastställa rätt förhållande.
En annan kritisk punkt, och möjlig begränsning av systemet, är att behandlingar som tillämpas för att stimulera en celltyp i analysen kan ha oväntade eller oavsiktliga effekter på den andra celltypen. Som beskrivs här, tillsats av LPS och IFNγ är avsedd att stimulera pro-inflammatoriska genuttryck i makrofager. Men i Ubil et al. vi visade att IFNγ också inducerar uttrycket och utsöndringen av immunsuppressiv Pros116, och andra har visat effekterna av LPS på tumörceller18. Det är därför viktigt att inkludera lämpliga kontroller för att övervaka potentiella off-Target eller oavsiktliga effekter på den andra celltypen för att kontrollera experimentella resultat. En metod genom vilken detta kan uppnås är genom att behandla enskilda celltyper med agenter av intresse och övervakning effekter med hjälp av standard molekylär biologi analyser.
Vid utformningen av permeabla membran stöd experiment, är det också viktigt att överväga eventuella diffusions gradienter av utsöndras ligander. Den relativa hastigheten av ligand sekretion, varaktigheten av medkulturen och om kultur plattan bibehålls i en stationär position kan alla ha effekter på resultaten. Dessutom är det möjligt för vissa utsöndras ligander att hålla sig till ytan av kultur plattor.
Medan de representativa resultat som visas är kännetecknande för detta system, graden av pro-inflammatorisk gensuppression observeras när Co-culturing andra tumör linjer kan variera dramatiskt. I Ubil et al., vi visar att vissa mänskliga tumör linjer kan nästan helt undertrycka den pro-inflammatoriska genuttrycket av en mänsklig makrofage cell linje16. Omvänt, andra tumör celltyper eller cellinjer kan variera kraftigt i deras immunsuppressiva förmåga. Orsaken till dessa avvikelser är oklar men är ett område för vidare studier.
Permeable membran stöd Co-Culture är en robust metodik som enkelt kan modifieras för att ta itu med olika frågor och kan anpassas till en rad olika molekylärbiologiska avläsningar inklusive qRT-PCR, Western blot och ELISA. Systemet kan användas för att förhöra enskilda gen funktioner, såsom ligander eller receptorer, när genetiska förändringar som de från genborttagna möss eller CRISPR-redigeringar görs till antingen makrofager eller tumörcellerna. Systemet är också mottaglig för studiet av farmakologiska aktivatorer eller hämmare och deras effekter på parakrin signalering. Också, även om inte diskuteras här, systemet kan användas för att studera effekterna av immunförsvaret aktivering på tumör cell genuttryck.
Denna metod har använts framgångsrikt i upptäckten och karaktäriseringen av en ny funktion för en immunsuppressiv, tumörutsöndras ligand. Detta robusta verktyg kan utnyttjas för att förhöra den mycket bredare delmängd av icke-kontakt tumör/immun interaktioner i hopp om att upptäcka nya terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Eric Ubil finansierades delvis av American Cancer Society postdoktor Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Arbetet stöddes av ett bidrag från NIH (R01-CA205398) och en Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) till HSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
