Summary
Neurale Stem/stamceller udviser forskellige udtryks dynamik af notch signalerings komponenter, der fører til forskellige udfald af cellulære hændelser. Et sådant dynamisk udtryk kan afsløres ved realtidsovervågning, ikke ved statisk analyse, ved hjælp af et meget følsomt bioluminescens billedbehandlingssystem, der muliggør visualisering af hurtige ændringer i genudtryk.
Abstract
Notch signalering regulerer vedligeholdelsen af neurale stamme-/progenitorceller ved celle celle interaktioner. Komponenterne i notch signalering udviser dynamisk udtryk. Notch signalering Effector Hes1 og indhak ligand Delta-like1 (filen dll1) udtrykkes i en oscillerende måde i neurale stamceller/progenitorcellerne. Da perioden med det oscillatoriske udtryk for disse gener er meget kort (2 timer), er det vanskeligt at overvåge deres cykliske udtryk. For at undersøge sådanne hurtige ændringer i genekspression eller protein dynamik, er hurtige respons reportere påkrævet. På grund af sin hurtige modning kinetik og høj følsomhed, den bioluminescens reporter der er egnet til at overvåge hurtige genekspression ændringer i levende celler. Vi brugte en destabiliseret der Reporter til overvågning af arrangøren aktivitet og en der-smeltet reporter for visualisering af protein dynamik ved enkelt celle opløsning. Disse bioluminescens reportere viser hurtig omsætning og genererer meget svage signaler; Derfor har vi udviklet en meget følsom bioluminescens Imaging system til at detektere sådanne svage signaler. Disse metoder giver os mulighed for at overvåge forskellige genekspressions dynamik i levende celler og væv, som er vigtige oplysninger til at hjælpe med at forstå de faktiske cellulære stater.
Introduction
Den pattedyr hjerne består af et stort antal forskellige typer af neuroner og gliale celler. Alle celler genereres fra neurale stamme/stamceller (NPCs), som først formere sig for at udvide deres tal, derefter begynde at differentiere sig til neuroner, og endelig give anledning til gliaceller celler1,2,3,4,5. Når cellerne har differentieret i neuroner, kan de ikke formere sig eller øge deres antal, og derfor er vedligeholdelsen af NPC'erne indtil senere stadier vigtig. Notch signalering via celle-celle interaktioner spiller en vigtig rolle i at opretholde NPCs6,7. Notch ligander interagere med membran protein, hak, på overfladen af tilstødende celler og aktiverer hakket protein. Efter aktivering opstår proteolyse af hakket protein, hvorved det intracellulære domæne af hak (NiCd) frigives fra cellemembranen ind i kernen8,9,10. I kernen binder NICD sig til arrangøren regioner Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer ekspression af disse gener. Hes1/5 Tryk igen på ekspression af de proneurale gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneurale gener inducerer neuronal differentiering, Hes1/5 spille væsentlige roller i at opretholde NPCs. Desuden, som proneurale gener kan aktivere ekspression af hak ligand Delta-like1 (filen dll1), Hes1/5 også undertrykke udtrykket af filen dll1. Derfor, udtrykket af filen dll1 fører til tilstødende celler er negativ for filen dll1 via notch signalering. På denne måde, celler hæmmer tilstødende celler fra at følge deres samme skæbne, et fænomen kendt som den laterale hæmning8. I den udviklende hjerne, lateral hæmning spiller en rolle i at generere forskellige forskellige celletyper.
Real-time Imaging på enkelt celleniveau afslører dynamiske udtryk af komponenterne i notch signalering i NPCs15,16,17. Notch signalering aktiverer ekspression af Hes1, men Hes1 protein binder sig til sin egen promotor og undertrykker sit eget udtryk. Desuden er Hes1 et ekstremt ustabilt protein, der nedbrydes af den ubiquitin-proteasome pathway; Derfor er undertrykkelsen af sin egen promotor kun kortvarig og derefter transskription starter igen. På denne måde, udtrykket af Hes1 svinger på både transskription og translationelle niveauer i en 2 h cyklus18. Den oscillatoriske udtryk for Hes1, til gengæld, inducerer den oscillatoriske udtryk for downstream Target gener, såsom Ascl1, Neurog2, og filen dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneurale gener kan inducere neuronal differentiering, deres oscillerende udtryk er ikke tilstrækkelig for neuronal differentiering; snarere deres vedvarende udtryk er afgørende for neuronal differentiering. Den oscillatoriske ekspression af proneurale gener er vigtig for at opretholde NPCs snarere end for inducerende neuronal differentiering14,15,16. Udtrykket af filen dll1 svinger ved både transkriptionen og translationelle niveauer under forskellige morfogenesis, såsom neurogenese og somitogenesis. Det dynamiske udtryk for filen dll1 er vigtigt for den normale morfogenesis og Steady Expression af filen dll1 inducerer defekter i neurogenese og somitogenesen17. Disse resultater viser den vigtige funktion, som dynamikken i genekspression og protein kinetik har på reguleringen af forskellige udviklingsmæssige hændelser (dvs. forskellige udtryks dynamikker producerer forskellige udgange i cellulær adfærd).
For at analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse af væv og celler er utilstrækkelige, fordi de er i konstant forandring. Realtidsbilleder af enkeltceller er et effektivt værktøj til at afsløre dynamikken i genekspression. Det dynamiske udtryk for notch signalering molekyler gennemgår hurtige cykliske reaktioner i perioden 2-3 h. Denne hurtige periodiske udtryk præsenterer to vanskelige problemer for real-time overvågning: (1) udtrykket af molekyler er undertrykt til lave niveauer, og (2) hurtig omsætning kræver hurtig-respons journalister. For at overvinde disse problemer, har vi tidligere udviklet en bioluminescens real-time Imaging metode20. Fordi bioluminescens reporter har en højere følsomhed og kortere modningstid end fluorescerende journalister, denne strategi giver os mulighed for at overvåge den hurtige dynamik i levende celler. Ved hjælp af real-time visualisering, vi fandt, at flere gener udstillet dynamisk udtryk, end vi tidligere havde troet. Desuden er antallet af rapporter, der viser udtryk og protein dynamik i levende celler og betydningen af denne dynamik i forskellige biologiske begivenheder steget, hvilket tyder på en grundlæggende rolle i dynamikken i gene udtryk21,22.
I denne rapport beskriver vi en måde at visualisere udtrykket af den notch ligand filen dll1 i NPCs i både dissocierede kulturer og i kortikale skive kulturer. For at overvåge dynamikken i filen dll1 transskription på enkelt celle niveauer, genererede vi dissocierede kulturer af NPC'er afledt af embryonale telencephalon af Transgene mus transporterer pDll1-UB-fluc reporter, en filen dll1 promotor-drevet destabiliseret der reporter. For at overvåge filen dll1 protein dynamik in vivo introducerede vi filen dll1-Fluc fusion reporter i NPCs i cortex og visualiserede ekspression af journalisten i NPC'ere i kortikale skive kulturer. Real-time Imaging gjort det muligt for os at fange de forskellige funktioner i genekspression og protein dynamik i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele proceduren, herunder dyremotiver, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse på instituttet for grænse livet og lægevidenskaben, Kyoto Universitet.
1. bioluminescens journalister
Bemærk: der reporter er egnet til at måle den hurtige dynamik i promotoren aktivitet ved at fusing nedbrydnings signalet. Desuden gør der fusion reporter det muligt at overvåge protein dynamikken i den enkelte celle. Begge typer af journalister er tilgængelige for mono-Layer kultur (dissociation kultur) og vævskultur (Skive kultur) eksperiment.
- Reporter til overvågning filen dll1 Promoter Activity17
Bemærk: for at overvåge de hurtige ændringer i genekspression er hurtig respons og ustabil reporter afgørende. Firefly der (fluc) viser hurtig modning sammenlignet med fluorescein journalister. Fordi ubiquitin smeltet der reporter (UB-fluc) viser hurtig nedbrydning og hurtig omsætning, er det meget nyttigt at overvåge det dynamiske genekspression i levende celler20.- Brug filen dll1 promotor-drevet destabiliseret der reporter, allestedsnærværende der (pDll1-UB-fluc, figur 1A Upper panel), til at overvåge hurtige ændringer i filen dll1 udtryk på et transkriptional niveau17.
- Generer en transgene muse linje transporterer pDll1-UB-Fluc for det stabile udtryk for denne reporter.
- Reporter for overvågning filen dll1 protein Dynamics17.
- For generering af Knock-in-mus, Indsæt der cDNA i 3 ́ Termini i filen dll1 Coding-regionen, så filen dll1-der fusion protein udtrykkes (filen dll1-fluc reporter, figur 1A, nederste panel)17.
- Overvåg udtryks dynamikken i filen dll1 ved protein niveauer ved at måle luciferaseaktiviteten.
- Til overvågning filen dll1 protein dynamik på vævs niveauer, introducere filen dll1-Fluc reporter i NPCs i embryonale telencephalon af i utero elektro poration.
2. bioluminescens billedbehandlingssystem
- Konstruere et bioluminescens Live-imaging system ved hjælp af et inverteret mikroskop installeret med et meget følsom, vandkølet CCD-kamera. For at reducere støjen og opnå høj følsomhed, afkøles kameraet med kølet vand, der leveres af vand cirkulatoren ved en optimeret temperatur på-90 °C.
- For levende celle/væv Imaging, installere inkubations systemet, kontrollere temperaturen og blandet gas, til mikroskopet fase.
- Til billeddannelse udtryk for destabiliseret der reporter, bruge høj numerisk vinkel (na: 1,30) 40x olie-Immersion objektiv linse. Arbejdsafstanden af denne linse er 0,2 mm, den er tilgængelig for ikke kun mono-Layer cellekultur, men også skive kultur.
- For dobbeltovervågning af der og fluorescein reporter udtryk, skal du installere led-belysnings enheden til lysbanen af mikroskopet.
- Styre time-lapse Imaging med en software, der er forbundet med mikroskopet (f. eks flerdimensionelle erhvervelse program af MetaMorph software).
- Forbered hele systemet i et mørkt rum, fordi signalet fra den destabiliserede der reporter er meget svag, og for at undgå fremmede lys forhindre erhvervelse.
3. Neural Stem/Progenitorcelle (NPC) dissociations kulturer
- Forberedelse af kultur medier, fade og reagenser til NPC dissociations kultur
- Forbered N2/B27-medier til dyrkning af neurale stamceller/progenitorcellerne med en slutkoncentration på 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein, 10 ng/mL bFGF og 50 U/mL penicillin/streptomycin i DMEM/F12-medier.
- Forbered papain opløsning til dissociation indeholdende 7 U/mL papain, 0,006% DNase og 1 mM N-acetylcystein i EBSS medier.
- Forbered 100 mM luciferin natrium opløsning til luminescens Imaging. Fortyndet 100 mM luciferin opløsning i N2/B27 medier til en slutkoncentration på 1 mM.
Bemærk: Luciferin viser Auto-fluorescei sig selv. I tilfælde af luciferase-fluorescens Dual Imaging, især EGFP, er det bedre at sænke koncentrationen af luciferin til 0,5 mM. - Coat en 35-mm glasbund retter (glas diameter 27-mm) med 40 μg/mL poly-L-lysin (PLL) opløsning til 1 h ved stuetemperatur. Efter inkubation vaskes pladerne 3x med PBS, og lad det tørre.
- Dissektion af embryoner og dissociation af NPC'er
- Efter euthanizing en gravid pDll1-UB-Luc Transgene mus (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) ved CO2 kvælning og cervikal dislokation, skåret gennem maven og tage ud livmoderen.
Bemærk: forskerne skal følge de regler og retningslinjer for animalsk forskning udvalg af deres institution. Hvis anæstesi eller smertelindring narkotika anvendes, bruge dem ordentligt. - Overføre livmoderen i en 10 cm Petri skål indeholdende 25 mL iskold PBS. Tag embryonerne ud af livmoderen i iskold PBS, ved hjælp af mikro saks og fine pincet.
- Skær hovedet af hvert embryo ved hjælp af en saks og overfør det til 10 cm Petri skåle, der indeholder iskold DMEM/F12. Fjern epidermis og brusk omkring hjernen og Overfør hjernen til 35 mm Petri skål indeholdende iskold 3 mL N2/B27-medier.
- Afskårne højre og venstre telencephalon fra diencephalon (figur 1BA-f, C, D). Fjerne meninges dækker overfladen af telencephalon ved hjælp af fine pincet (figur 1bi). Brug fine pincet igen, tag den dorso-laterale del af cortex fra telencephalon (figur 1BG, h, j-l E).
- Vævene overføres til nye 1,5 mL-rør ved hjælp af en P1000-pipette, og eventuelle ekstra medier fjernes med en P200-pipette. Tilsæt 0,1 mL papain opløsning per hjernevæv (et par af cortex). Efter 15 min inkubation ved 24 °C, pipetten forsigtigt prøverne 10 gange med P1000-pipette. Prøverne inkubates igen i 15 minutter ved 24 °C.
- Pipetten forsigtigt prøverne 10 gange med P1000 pipette. Prøverne centrifugeres i 3 minutter ved 400 x g og rumtemperatur (RT). Kassér supernatanten.
- Tilsæt 1 mL DMEM/F12-medie til pellet. Pipetten forsigtigt 10 gange med P1000-pipette. Prøverne centrifugeres i 3 min. ved 400 x g og rt. kassér supernatanten. Gentag dette mindst 2 gange mere.
- Til pellet tilsættes 0,5 mL N2/B27-medier indeholdende 1 mM luciferin og blandes godt. Frø cellerne (1 x 106 celler) til en PLL-belagt glasbund skål. Kultur cellerne i CO2 inkubator i 1 time. Når cellerne overholder skålen, tilsættes der 2 mL N2/B27-medier, som indeholder 1 mM luciferin.
- Efter euthanizing en gravid pDll1-UB-Luc Transgene mus (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) ved CO2 kvælning og cervikal dislokation, skåret gennem maven og tage ud livmoderen.
- Visualisering af der reporter udtryk i NPC dissociation kultur
- Start luminescens Live-imaging system, før du udfører dissektion. For NPC-kulturen indstilles temperaturen i scene inkubator ved 37 °C, og indstillingen af gasblandingen indstilles til 20% O2,5% Co2.
- Sæt nedsænknings olien på objektivlinsen. Placer prøveskålen på mikroskop stadiet. Få vist feltet manuelt, og vælg den bedste placering og fokus for de celler, som interesserer sig. Klik på Live for at hente test billedet.
- Køretids forskudt erhvervelse af 2-dimensionelle (luminescens og lyse felt) erhvervelser for 24 h med multi-dimensionelle erhvervelse program. Vælg flerdimensionel anskaffelses program, og Indstil anskaffelses indstillingen som følger (trin 3.3.6).
- For luminescens afbildning skal du bruge følgende kameraindstillinger: lav overførselshastighed (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 Binning, 10 min/5 min eksponeringstid. Brug følgende indstillinger til at købe lys-feltbilleder: mellemliggende-overførselshastighed (1 MHz), 1 x 1 Binning og 100 MS eksponeringstid.
4. i utero elektroporation
Bemærk: Dette udføres for introduktionen af filen dll1-Fluc reporter i neurale stamceller.
- Fremstilling af værktøj og reagenser til elektro portering
- Forbered mikro kapillærer til injektion af DNA i ventriklen af embryonale telencephalon. Stræk et græs kapillær med varme og skær og polere spidsen af det med polering maskine.
- Forbered en blanding af DNA med farvestof (f. eks Trypan blå). Koncentrationen af hvert DNA er 1 μg/μL i PBS og tilsættes farvestoffet til en endelig koncentration på 10%.
Bemærk: Brug blandingen af DNA til visualisering af filen dll1 protein dynamik som følger: filen dll1-fluc (filen dll1 protein reporter, figur 2e øvre) og PEF-egfp (EF-promotor drevet egfp-ekspressions vektor, figur 2E lavere), overvågning af placeringen og morfologien af transficeret celler. - Forbered to typer af anæstetika: 3,88 mg/mL pentobarbital og 0,12% af xylazine, i steril 1x PBS.
- Brug de sterile instrumenter og kirurgiske handsker under drift.
- I utero elektroporation
- Anesthetize en tid gravid ICR mus (E 12.5) af intraperitoneal administration af anæstetika med 500 μL af 3,88 mg/mL pentobarbital og 500 μL af 0,12% xylazin.
Bemærk: forskerne skal følge reguleringen af dyreforsøg. Hvis man skal bruge anæstesi eller smertelindring narkotika, bruge dem ordentligt. - Klip håret og Desinficer huden med kirurgisk krat.
- Check for manglen på tå knivspids respons. Når pedal refleks ikke er observeret, gøre en 2-3 cm skåret gennem maven langs midterlinjen. Put gauzes omkring den dissekeret del og våd gauzes med varm PBS ikke at tørre op snittet. Tag det højre livmoder horn forsigtigt med ringformede pincet og Tæl antallet af embryoner.
- Injicer 1-2 μL af den blandede DNA i ventrikel af telencephalon af embryoner forsigtigt med mikro kapillar.
Bemærk: når injektionen er vellykket, kan man se den blå farve af farvestoffet over overfladen af livmoderen. - Våd livmoderen og elektroden før levering af spændings pulser, og derefter holde lederen af et embryo forsigtigt. Indstil den positivt ladede elektrode til den side af halvkugle, hvor DNA'ET blev injiceret. Sørg for, at tilstanden af pulsen af elektro portering er 30-50 V for 50 MS, intervallet af pulser er 1 s (50 MS Charge og 950 MS ikke-Charge). Giv 5 impulser til ét embryon, og kontrollér, at der genereres bobler fra den negativt ladede elektrode.
Bemærk: Sørg for, at elektrodens retning: DNA er indarbejdet i cellerne på siden af den positive elektrode. Flyt ikke elektrodens position under denne procedure. - Gentag trinene 4.2.3-4.2.4 for andre embryoner, og returner livmoder hornet til bughulen. Udfør den samme procedure for embryonerne i det venstre livmoder horn.
- Efter at have sat tilbage i venstre side, sutur snittet af en silke sutur (4-0) med en nål (17 mm). Før du lukker snittet helt, sætte varm PBS i bughulen
Bemærk: intervallet mellem suturer er ca. 2 mm. - Efter endt kirurgi, placere musen på en varmepude til post anæstesi opsving. Hus musen individuelt.
Bemærk: forskerne skal følge deres lokale, instiutionelle regulering af dyreforsøg. Hvis man har brug for at bruge smertelindring narkotika, bruge dem ordentligt.
- Anesthetize en tid gravid ICR mus (E 12.5) af intraperitoneal administration af anæstetika med 500 μL af 3,88 mg/mL pentobarbital og 500 μL af 0,12% xylazin.
5. forberedelse af skive kulturer af den udviklende cortex og visualisering af der reporter udtryk i de kortikale skiver
- Forberedelse af kultur medier og reagenser til skive kulturer i cortex
- Forbered beriget medie til dyrkning af kortikale skiver, der indeholder 5% føtal kvægserum og 5% heste serum i N2/B27-medier.
- Bubble 100% O2 gas gennem DMEM/F12 medier til dissektion og gør kortikale skiver.
Bemærk: Hvis du vil bruge iltgas sikkert, skal du opbevare O2 cylinderen i cylinder kabinettet og overvåge iltkoncentrationen i luften ved hjælp af en oxygen koncentrations måler. - Fortyndet 100 mM luciferin natrium opløsning i beriget medie til en slutkoncentration på 1 mM.
Bemærk: Luciferin viser Auto-fluorescei sig selv. I tilfælde af luciferase-fluorescens Dual Imaging, især EGFP, er lavere koncentration af luciferin (0,5 mM) bedre. - Sæt multi-gas inkubator ved 37 °C af 40% O2 og 5% Co2.
- Dissektion af embryoner og undersøgelse af ekspression af fluorescerende reporter
- Efter euthanizing den gravide mus, som reportere (E 13.5) introduceres ved in utero elektro poration (trin 4,2), skåret gennem maven og tage ud livmoderen.
Bemærk: forskerne skal følge reguleringen af dyreforsøg. Hvis du bruger anæstesi eller smertelindring narkotika, bruge dem ordentligt. - Overføre livmoderen til en 10 cm Petri skål indeholdende PBS. Tag embryonerne ud af livmoderen i PBS ved hjælp af mikro saks og fine pincet. Afskårne hovedet af hvert embryo og overføres til en 10 cm Petri skål indeholdende DMEM/F12-medier bukkede med 100% O2 gas. Fjern epidermis og brusk omkring hjernen i DMEM/F12-medier.
- Sæt hjernen på låget på Petri skålen med ringformede pincet, og Sæt låget på fluorescens stereoskopiske mikroskop fase. Kontroller området af cortex, der udtrykker fluorescerende protein under excitation Light (figur 2A, B).
- Overfør hjernen til et silikone gummi skærebræt fyldt med 30 mL DMEM/F12-medie bukkede med 100% O2 gas. Fjern meninges dækker overfladen af telencephalon af fine pincet.
- Skær grænsen mellem mediale og lateral del af rygtelencepon og adskille i to halvkugler ved hjælp af mikro kirurgisk kniv eller fine pincet. Ved hjælp af en mikro kirurgisk kniv, skære cortex som striber og gøre kortikale skiver (figur 2C, D). Pipette skiver med medium ved hjælp af pipette og overfør dem til beriget medie i en 35 mm skål.
- Sæt skiver på kulturen indsætter i glasbund retter med beriget medier. Ret retningen af skiver ved hjælp af fine pincet. Indstil snit overfladen af skiver til overfladen af kultur skær. Fjern de ekstra medier med en pipette. Der inkubates i udsnittene i multi-gas inkubator med 40% O2 og 5% Co2 ved 37 °c i 30 min.
- Tilsæt 300 μL beriget medie, der indeholder 1 mM luciferin, til ydersiden af kultur indsatsen i glasbunden.
- Efter euthanizing den gravide mus, som reportere (E 13.5) introduceres ved in utero elektro poration (trin 4,2), skåret gennem maven og tage ud livmoderen.
- Visualisering af der reporter udtryk i Skive kulturer
- Start luminescens Live-imaging system, før du starter dissektion. Brug følgende tilstand af kortikale skive kulturer: 40% O2,5% Co2 og 37 °c.
- Sæt nedsænknings olien til 40x objektiv linse. Sæt prøven skålen til fase af mikroskopet. Erhverve test billede af fluorescerende og indstille positionen og fokus flyet til den region af interesse under belysningen af excitation lys.
- Kør tidsforskudt erhvervelse med 3-dimensionelle (luminescens, fluorescens og Bright felt) anskaffelser for 24 timer (figur 2F-h). For luminescens afbildning skal du bruge følgende kameraindstillinger: lav overførselshastighed (50 kHz), 2x2/4x4 Binning, 10 min/5 min eksponeringstid. For fluorescens og lyse felt billede erhvervelse, skal du bruge følgende indstillinger: mellemliggende-overførselshastighed (1 MHz), 1x1 Binning og 100 MS eksponeringstid.
6. billedbehandling og analyse
- Forbind hvert billede og gøre stakken billeder. Klik på Importer billedsekvens i menuen filer (fil | Import | Billedsekvens), og vælg den mappe, hvor de erhvervede billeder gemmes. Put nogle ord indeholdt i filnavnet til kolonnen af FIle navn indeholder.
- For at fjerne støjen fra Cosmic ray på de bioluminescens billeder, anvende Spikenoise filter plug-in af ImageJ/Fiji. Åbn stakken billeder, og klik på Spikenoise filter.
- Anvend Savitzky Golay Temporal filter plug-in for at få en klar dynamik i reporter Expression. Åbn stak billederne, og klik på Savitzky Golay Temporal filter.
- Hvis du vil måle intensiteten af reporter-udtrykket, skal du anvende Z-akse profil plus -plug-in til hver enkelt celle. Marker cellerne, og Angiv ROIs, interesseområde, og klik på Z-akse profil plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udtryk af gener Hes1/7 udviser 2 h svingningscyklus i forskellige cellelinjer og under somitogenesen. Desuden er perioden med svingning meget kort, og både deres mRNAs og proteiner er ekstremt ustabile med halveringstiden på omkring 20 min. Hvis du bruger en langsom respons reporter, kan vi ikke spore sådan hurtig dynamik, og hvis du bruger en stabil reporter, det gradvist ophobes, mens genekspression svinger. Således skal journalisten hurtigt nedbrydes for at overvåge den hurtige omsætning af sådanne cyklisk udtrykte gener. For at overvinde disse problemer brugte vi der Reporter til at overvåge det dynamiske udtryk for oscillatorer. Fordi bioluminescens reporter har en kort modning tid og høj følsomhed, det giver os mulighed for at overvåge den hurtige dynamik af ultradian oscillatorer. Som en fluorescerende reporter, kan der reporter overvåge ekspressions dynamikken af et protein ved at blive smeltet til genkodnings sekvensen (figur 1a, figur 2E og figur 3D). Luciferase-smeltet genprodukter udviser samme udtryk, omsætning og translokation kinetik i celler, som gør de endogene proteiner. Desuden, for at overvåge arrangøren aktivitet af oscillende gen filen dll1, vi brugte allestedsnærværende der, en destabiliseret der reporter (figur 1a og figur 3a)23, hvis Half-Life er omkring 10 min20. Ved hjælp af forskellige typer af der reportere, vi genererede Transgene mus eller bankede mus for at opnå stabile udtryk for reporter i NPCs under neurogenese17. At visualisere reporter udtryk på enkelt celle niveauer i vævskultur, den spredte introduktion af reporter er at foretrække. Således brugte vi forbigående transfektering af reporter genet i NPCs via i utero elektroporation (figur 2F-H). Der reporter system har været anvendt inden for døgnrytme til at overvåge de dynamiske udtryk af urgener i en lang periode (f. eks 1 uge), tyder på, at luciferin (D-luciferin), substrat af Firefly der enzym, er meget stabil og har ingen toksicitet for levende celler24,25. Vi plejer at bruge luciferin i koncentrationer på 1 mM i medierne, hvilket er tilstrækkeligt til at overnatte Live-Cell Imaging. Desuden gør det mikroskop baserede billedsystem det muligt for os at erhverve de flerdimensionelle billeder, lyse feltbilleder, fluorescensbilleder og chemiluminescens billeder (figur 2F-H og figur 3E).
Ved hjælp af disse betingelser visualiserede vi udtrykkene for forskellige ultradian-urgener, herunder Hes1, Ascl1, Neurog2 og filen dll1 (figur2 og fig. 3). Repræsentative resultater er vist i figur 3. Reporter of filen dll1 Promoter aktivitet udstillet oscillerende udtryk i NPCs afledt af telencephalon af filen dll1-UB-fluc reporter mus. Den destabiliserede der reporter (figur 3A) indikerede skarp op og ned regulering af ekspression af promotor aktivitet (figur 3B, C). I dette tilfælde viste enkelt neurale stamceller en ca. 2,5 h Oscillations cyklus med forskellige amplitude i løbet af 13 h (figur 3C). Den hurtige respons der reporter gør det muligt for os at fange transmissions dynamikken i notch signalering mellem to levende celler (figur 3D-F og supplerende film S1). Vi forberedte to typer af DNA-blandinger: (1) Hes1 Promoter reporter (pHes1-UB-Luc) og egfp Expression vektor, og (2) filen dll1 protein reporter (filen dll1-Luc) og mcherry Expression vektor og transficeret dem i NPCs separat. Så indsamlede vi de to typer af celler og co-dyrkede til at måle ekspression af journalister i levende celler. Repræsentative resultater er vist i figur 3E, F. Tilstødende EGFP positive celler bærer Hes1 reporter og mCherry positive celler, der udtrykker filen dll1 protein reporter kontaktet med hinanden under observation. Hes1 reporter udtryk i en grøn celle syntes at starte omkring 60 min efter to celler kontakt (figur 3E, F). Dette foreslog, at tidsforsinkelsen for transmission af notch signalering mellem tilstødende celler var omkring 1 h. Desuden viste filen dll1 protein ekspression dynamisk translokation i en rød celle (figur 3E) under signaltransmission.
Figur 1: dissektion af embryonale musehjerne. (A) strukturen af der Reporters, filen dll1 Promoter reporter og filen dll1 protein reporter. B) procedure for dissektion. a) sidevisning af et muse embryon. (b) afskårne hovedet sammen med den stiplede linje. c) fjerne epidermis og brusk fra kløften mellem telencephalon og midbrain. d) skær det omgivende væv langs midterlinjen mellem højre og venstre halvkugle. (e) Fjern vævet fra midterskiftet til begge sider. f) telencepon og midthjernen efter fjernelse af det omgivende væv. g) adskille telencepon (Tel), hjernen (MID) og olfaktoriske Bulb (OB). h) tværsnit af telencephalon, vist i punkteret linje i (g). (i) fjerne meninges omkring overfladen af telencephalon. j) adskille telencephalon i to dele: mediale og lateral del. (k) skær grænsen af cortex og ganglione eminence (GE). (l) dorso-lateral del af cortex anvendes til dissociations kultur. C) hjernen på embryon dag 14 (E14), der består af venstre (a) og højre (b) halvdele af telencephalon og midthjernen (c). D) telencephalic-halvsfærerne adskilt fra midthjernen. E) en dissekeret halvkugle af telencephalon: den ventrolaterale del af telencephalon inklusive de ganglioniske to (d), den dorsolaterale del af telencephalon anvendes til dissocierede kulturer og skive kulturer (E), den mediale del af telencephalon (f) og meninges dækker overfladen af hjernen (g). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: gør de kortikale skiver af embryonale telencephalon og visualisere filen dll1 protein dynamik i de kortikale skive kulturer. A) kontrol af egfp-ekspression ved brug af fluorescens stereoskopisk mikroskop. Rød pil viser regionen i cortex udtrykker EGFP. Den venstre halvkugle (a), den højre halvkugle (b) og midthjernen (c). B) stiplede linjer angiver konturerne af de i litraa) viste hjerneområder. C) dissekeret cortex af den dorsolaterale telencephalon. Hvide pilespidser angiver de afskårne kanter. D) kortikale skiver af den dorso-laterale telencephalon. (E) genstrukturer af reportere til visualisering af filen dll1 protein dynamik i NPC'er. Filen dll1 protein reporter, filen dll1-Fluc (øvre) blev introduceret i NPC'er med en EGFP-udtryks vektor (lavere) for at overvåge morfologien og migrationen af celler i de kortikale skiver. (F-H) Tredimensionale billeder af lyse felt (F), gfp-udtryk (G) og bioluminescens (H) i den kortikale skive. Bioluminescens billedbehandlingssystem tillod at spore udtrykkene der og fluorescens reporter samtidigt. Skala stænger: 200 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative data for visualisering og analyse af det dynamiske udtryk for filen dll1-genet i NPC-kulturen. (A) reporter konstruere for at visualisere filen dll1 udtryk på transkriptional niveau, ved hjælp af en destabiliseret der reporter (UB-der, allestedsnærværende der). B) visualisering af ekspression af filen dll1 i en enkelt NPC med en bioluminescens reporter. Tallene i panelet viser spids punkterne i det oscillatoriske udtryk for filen dll1 , der svarer til tallene i panel c.c) et tids kursus plot af bioluminescensen den dissocierede NPC vist i (B), udviser dynamisk udtryk for filen dll1. (D-F) Visualisering af ekspression af Hes1 Promoter reporter og filen dll1 protein reporter udtrykt i de tilstødende celler. (D) strukturen af Hes1 Promoter Activity reporter (PHes1-UB-Luc) og filen dll1 protein reporter (filen dll1-Luc). (E og F) Den EGFP-positive celle, der bærer Hes1 reporter (Cell1) og mCherry positive Cell med filen dll1 protein reporter (Cell2), blev co-dyrket, og luminescens fra begge typer af journalister blev målt. Udtrykket af Hes1 reporter i den grønne celle (cell1) syntes at starte omkring 60 min efter de to celler kontaktet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film S1: visualisering af ekspression af Hes1 Promoter reporter og filen dll1 protein reporter udtrykt i de tilstødende celler, relateret til figur 3D-3F. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Komponenterne i notch signalering viser oscillatoriske udtryk i Synchrony under somitogenesen, men ud af Synchrony under neurogenese, hvilket fører til vanskelighederne med at opfange udtryks dynamikken ved statisk analyse i sidstnævnte tilfælde. Således, real-time overvågning er nødvendig for at afsløre udtrykket dynamik af notch signalering komponenter, såsom Hes1 og filen dll1. Fordi perioderne med udtrykkene Hes1 og filen dll1 svingninger er ekstremt korte, ca. 2-3 h, hurtig respons og ustabile journalister er nødvendige for at overvåge deres udtryks dynamik. Til dette formål har vi udviklet bioluminescens reporter og Imaging System. Bioluminescens reporter der viser hurtig modning kinetik og høj følsomhed til at spore den hurtige omsætning af sådanne cykliske gen udtryk. Den hurtige omsætning af reportere fører til meget svage signaler genereret. For at detektere sådanne svage signaler produceret af bioluminescens reportere, bruger vi et optimeret bioluminescens billedbehandlingssystem, herunder en høj følsomhed, vandkølet CCD-kamera med en ultra-lav udlæsningshastighed (50 kHz), hvilket reducerer støjen til et minimum. Desuden giver en høj numerisk blænde (N.A.) objektiv linse os mulighed for at indsamle lyset frigivet fra den destabiliserede der Reporter til fulde. For at opnå en højere følsomhed bruger vi normalt højere Binning (f. eks. 2 x 2,4 x 4, 8 x 8) og holder lukkeren åben i lang tid (f. eks. 5-20 min). Fordi signalet fra der reportere er ekstremt svagt, interferens af lys fra miljøet også præsenterer et problem i at opdage det svage signal: således, mikroskopet rummet skal være helt mørkt. Dette system giver os mulighed for at måle de dynamiske udtryk for Hes1 og filen dll1 gener i NPC'er i både transkriptional og protein niveauer (figur 3). Derudover kan vi visualisere protein dynamikken i intracellulære translokation med der smeltet protein reportere. Desuden kan vi ved hjælp af Rapid Response der reporter fange transmissions dynamikken i notch signalering og måle tidsforsinkelsen for signaltransmission mellem to levende celler (figur 3D-F og supplerende film S1). Desuden giver kombinationen af promotor reporter (UB-luciferase reporter) og protein reporter (luciferase fusion) af et enkelt gen os mulighed for at måle tidsforsinkelsen mellem transkriptionen og oversættelsen af genet. På denne måde er multiple Imaging af forskellige former for luminescens reportere og fluorescens Reporter til rådighed til at måle tidsforsinkelsen/raten for biokemiske reaktioner.
Realtidsovervågning af genudtryk ved enkelt celle opløsning har afsløret, at der er variationer i udtryks dynamikken i det samme gen. Nogle celler udtrykker filen dll1/Neurog2 i oscillerende måde, men andre viser vedvarende mønstre. Desuden inducerer de forskellige udtryks dynamikker (oscillatory versus steady) forskellige udgange i cellernes tilstand. Hvad synes at være klart, er, at forskellige udtryks dynamik påvirke celle adfærd på forskellige måder, hvilket tyder på, at udtrykket dynamik koder mere information21,22,26,27,28,29,30,31,32. De statiske analyser kan ikke opfange dynamikken i genekspression, og realtidsanalyser er nødvendige for at forstå biologiske fænomener for at afsløre udtryks dynamikken i cellulære begivenheder. Den tilgang, vi introducerer her, kan overvåge dynamikken i ultradian oscillatorer under neurale udvikling ved høj tidsmæssig opløsning. Ved hjælp af denne metode, vi fandt, at mange flere gener er dynamisk udtrykt, end vi tidligere havde troet, og vi kan spore ikke kun dynamikken i protein ekspression, men også dynamikken i protein lokalisering i cellen ved høj tidsmæssig opløsning. Sådanne dynamiske udtryks mønstre kan have biologiske betydinger, der endnu ikke er belyst.
Bioluminescens reportere har en stor fordel i tidsmæssig opløsning og lav toksicitet for levende celler sammenlignet med fluorescens journalister33. Men i modsætning til farvevariationer i fluorescerende journalister, der er kun et par farver i bioluminescens reportere, indførelse af en begrænsning på antallet af gener, der kan overvåges samtidigt. Ikke desto mindre bliver et stigende antal variable der isoleret og klonet fra forskellige væsner34,35, og ved hjælp af sådan en række luciferaser, vil vi være i stand til samtidig at spore flere genekspressions dynamik i en enkelt celle ved høj tidsmæssig opløsning. Den molekylære størrelse af Firefly der er større end fluorescens journalister, som præsenterer nogle vanskeligheder med at konstruere reporter-smeltet proteiner til at overvåge protein dynamikken, men for nylig, en ny, mindre og lysere der er blevet klonet36, hvilket ville give os mulighed for at visualisere protein dynamikken lettere end nogensinde. Et stigende antal rapporter har for nylig vist forskellige typer af dynamik i genekspression og protein translokation i forskellige biologiske begivenheder21,22,26,27,28,29,30,31,32. Analyser af en sådan dynamik i spatiotemporale regulering ved hjælp af et realtids overvågningssystem vil være stadig vigtigere at fange de faktiske tilstande af celler og afsløre reguleringen af cellulære systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Yumiko Iwamoto for at støtte produktionen af videoen. Vi er også taknemmelig for at Akihiro Isomura til diskussion og støtter af billedanalyse, Hitoshi Miyachi for teknisk støtte til generering af transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Af Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) til teknisk støtte og diskussioner i bioluminescens billedbehandlingssystem. Dette arbejde blev støttet af kerneforskning inden for evolutions videnskab og teknologi (JPMJCR12W2) (R.K.), tilskud til videnskabelig forskning i innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), støtte til videnskabelig forskning (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og platform for dynamiske tilgange til levende system fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
