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Developmental Biology

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60455

Summary

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Abstract

La segnalazione di notch regola il mantenimento delle cellule staminali/progenitrici neurali mediante interazioni cellula-cellula. I componenti della segnalazione Notch presentano un'espressione dinamica. L'efere di segnalazione della nota Hes1 e il Delta-simile a 1 (Dll1) del ligando di Notch sono espressi in modo oscillatorio nelle cellule staminali/progenitrici neurali. Poiché il periodo dell'espressione oscillatoria di questi geni è molto breve (2 h), è difficile monitorarne l'espressione ciclica. Per esaminare tali rapidi cambiamenti nell'espressione genica o nella dinamica delle proteine, sono necessari giornalisti a risposta rapida. A causa della sua cinetica a maturazione rapida e dell'elevata sensibilità, il reporter di bioluminescenza luciferasi è adatto per monitorare i rapidi cambiamenti dell'espressione genica nelle cellule viventi. Abbiamo usato un giornalista di luciferasi destabilizzato per monitorare l'attività promotore e un reporter con luciferasi fuso per la visualizzazione delle dinamiche proteiche a risoluzione cellulare singola. Questi reporter di bioluminescenza mostrano un rapido turnover e generano segnali molto deboli; pertanto, abbiamo sviluppato un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile per rilevare tali deboli segnali. Questi metodi ci permettono di monitorare varie dinamiche di espressione genica nelle cellule viventi e nei tessuti, che sono informazioni importanti per aiutare a comprendere gli stati cellulari effettivi.

Introduction

Il cervello dei mammiferi è composto da un gran numero di vari tipi di neuroni e cellule gliali. Tutte le cellule sono generate da cellule staminali neurali,progenitrici (NPC), che prima proliferano per espandere il loro numero, poi iniziano a differenziarsi in neuroni, e infine danno origine a cellule gliali1,2,3,4,5. Una volta che le cellule si sono differenziate in neuroni, non possono proliferare o aumentare il loro numero e, quindi, il mantenimento dei PNG fino a quando le fasi successive non sono importanti. La segnalazione della notch tramite interazioni cella-cellula svolge un ruolo importante nel mantenimento dei PNG6,7. I ligandi Notch interagiscono con la proteina della membrana, Notch, sulla superficie delle cellule vicine e attivano la proteina Notch. Dopo l'attivazione, si verifica la proteolisi della proteina Notch, rilasciando così il dominio intracellulare di Notch (NICD) dalla membrana cellulare nel nucleo8,9,10. Nel nucleo, NICD si lega alle regioni promotrice di Hes1 e Hes5 (Hes1/5) e attiva l'espressione di questi geni. Hes1/5 reprime reprime reprimere l'espressione dei geni proneurali Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Poiché i geni proneurali inducono la differenziazione neuronale, Hes1/5 svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dei PNG. Inoltre, poiché i geni proneurali possono attivare l'espressione del Delta-come1 (Dll1), Hes1/5 reprimere anche l'espressione di Dll1. Pertanto, l'espressione di Dll1 porta alle celle adiacenti essere negativo per Dll1 tramite segnalazione Notch. In questo modo, le cellule impediscono alle cellule adiacenti di seguire il loro stesso destino, un fenomeno noto come inibizione laterale8. Nel cervello in via di sviluppo, l'inibizione laterale svolge un ruolo nella generazione di vari tipi di cellule diverse.

L'imaging in tempo reale a livello di singola cellula rivela le espressioni dinamiche dei componenti della segnalazione di Notch nei PNG15,16,17. La segnalazione di notch attiva l'espressione di Hes1, ma la proteina Hes1 si lega al proprio promotore e reprime la propria espressione. Inoltre, Hes1 è una proteina estremamente instabile, che è degradata dal percorso onniquitina-proteasome; pertanto, la repressione del proprio promotore è solo di breve durata e poi la trascrizione ricomincia. In questo modo, l'espressione di Hes1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale in un ciclo di 2 h18. L'espressione oscillatoria di Hes1, a sua volta, induce l'espressione oscillatoria dei geni bersaglio a valle, come Ascl1, Neurog2 e Dll1, attraverso la repressione periodica15,16,17,19. Mentre i geni proneurali possono indurre la differenziazione neuronale, la loro espressione oscillatoria non è sufficiente per la differenziazione neuronale; piuttosto la loro espressione sostenuta è essenziale per la differenziazione neuronale. L'espressione oscillatoria dei geni proneurali è importante per mantenere i PNG piuttosto che per indurre la differenziazione neuronale14,15,16. L'espressione di Dll1 oscilla sia a livello di trascrizione che a livello traslazionale durante varie morfogenesi, come la neurogenesi e la somitogenesi. L'espressione dinamica di Dll1 è importante per la normale morfogenesi e l'espressione costante di Dll1 induce difetti nella neurogenesi e somitogenesi17. Questi risultati dimostrano l'importante funzione che la dinamica dell'espressione genica e della cinetica proteica ha sulla regolazione di vari eventi dello sviluppo (cioè, dinamiche di espressione diverse producono risultati diversi nei comportamenti cellulari).

Per analizzare la dinamica della segnalazione di Notch, l'analisi statica dei tessuti e delle cellule è insufficiente perché cambia in continua evoluzione. L'imaging in tempo reale di singole cellule è un potente strumento per rivelare le dinamiche nell'espressione genica. L'espressione dinamica delle molecole di segnalazione Notch subisce risposte cicliche rapide nel periodo di 2-3 h. Questa rapida espressione periodica presenta due problemi difficili per il monitoraggio in tempo reale: (1) l'espressione delle molecole viene soppressa a bassi livelli e (2) un rapido turnover richiede una risposta rapida ai giornalisti. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un metodo di imaging in tempo reale di bioluminescenza20. Poiché il reporter di bioluminescenza ha una sensibilità più elevata e tempi di maturazione più brevi rispetto ai reporter fluorescenti, questa strategia ci permette di monitorare le dinamiche rapide nelle cellule viventi. Utilizzando la visualizzazione in tempo reale, abbiamo scoperto che più geni mostravano un'espressione dinamica di quanto pensassimo in precedenza. Inoltre, è aumentato il numero di rapporti che mostrano l'espressione e la dinamica delle proteine nelle cellule viventi e il significato di queste dinamiche in vari eventi biologici, suggerendo un ruolo fondamentale delle dinamiche nelle espressioni geniche21,22.

In questo rapporto viene descritto un modo per visualizzare l'espressione della Dll1 del ligando di Notch nei PNG sia nelle colture dissociate che nelle colture di taglio corticali. Per monitorare la dinamica della trascrizione Dll1 a livello di singola cellula, abbiamo generato colture dissociate di PNG derivate dal telencefano embrionale di topi transgenici che trasportano pDll1-Ub-Fluc reporter, un giornalista di luciferasi destabilizzate destabilizzato guidato dal promotore di Dll1. Per monitorare le dinamiche delle proteine Dll1 in vivo, abbiamo introdotto il reporter di fusione Dll1-Fluc nei PNG nella corteccia e abbiamo visualizzato l'espressione del reporter nei PNG nelle colture di fette corticali. L'imaging in tempo reale ci ha permesso di catturare le varie caratteristiche dell'espressione genica e della dinamica delle proteine nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale.

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Protocol

Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali istituzionali presso l'Istituto per la vita di frontiera e le scienze mediche dell'Università di Kyoto.

1. Giornalisti di bioluminescenza

NOTA: Il reporter luciferate è adatto per misurare la rapida dinamica dell'attività promotrice fondendo il segnale di degradazione. Inoltre, il reporter di fusione luciferasi consente il monitoraggio delle dinamiche proteiche nella singola cellula. Entrambi i tipi di reporter sono disponibili per l'esperimento di coltura monostrato (cultura della dissociazione) e di coltura dei tessuti (cultura delle fette).

  1. Reporter per il monitoraggio dell'attività promotore Dll117
    NOTA: Per monitorare i rapidi cambiamenti nell'espressione genica, è essenziale la risposta rapida e il reporter instabile. Firefly luciferase (Fluc) mostra una rapida maturazione rispetto ai reporter fluorescein. Poiché l'ubiquitina fusa giornalista lucidferasi (Ub-Fluc) mostra una rapida degradazione e un rapido turnover, è molto utile monitorare l'espressione genica dinamica nelle cellule viventi20.
    1. Utilizzare Dll1 promoter-driver-driver destabilizzato lucidferasi reporter, luciferasi ubiquitanated (pDll1-Ub-Fluc, Figura 1Un pannello superiore), per monitorare le rapide modifiche nell'espressione Dll1 a livello di trascrizione17.
    2. Generare una linea di mouse transgenica che trasporta pDll1-Ub-Fluc per l'espressione stabile di questo reporter.
  2. Reporter per il monitoraggio delle dinamiche proteiche Dll117.
    1. Per la generazione di topi knock-in, inserire la luciferate cDNA nel 3 - termini della regione di codifica Dll1 in modo che si eslentrasse la proteina di fusione Dll1-luciferate (dll1-Fluc reporter, Figura 1A, pannello inferiore)17.
    2. Monitorare la dinamica di espressione di Dll1 a livello proteico misurando l'attività di luciferasi.
    3. Per monitorare la dinamica delle proteine Dll1 a livello tissutale, introdurre il reporter Dll1-Fluc nei PNG nel telencephalon embrionale per elettroporazione in utero.

2. Sistema di imaging a bioluminescenza

  1. Costruisci un sistema di imaging live a bioluminescenza utilizzando un microscopio invertito installato con una telecamera CCD altamente sensibilia e raffreddata ad acqua. Al fine di ridurre il rumore e ottenere un'elevata sensibilità, raffreddare la fotocamera con acqua refrigerata fornita dal circolatore d'acqua ad una temperatura ottimizzata di -90 gradi centigradi.
  2. Per l'imaging delle cellule vive/tessuto, installare il sistema di incubazione, controllando la temperatura e il gas misto, allo stadio del microscopio.
  3. Per immaginare l'espressione di una giornalista lucidferasi destabilizzata, utilizzare un angolo numerico elevato (NA: 1.30) 40x lente di immersione dell'olio. La distanza di lavoro di questa lente è di 0,2 mm, è disponibile non solo per la coltura cellulare a strato monostrato, ma anche per la coltura delle fette.
  4. Per il doppio monitoraggio dell'espressione della lucidferasi e della fluoresceina, installare il dispositivo di illuminazione a LED nel percorso luminoso del microscopio.
  5. Controllare l'imaging time-lapse con un software associato al microscopio (ad esempio, programma di acquisizione multidimensionale del software MetaMorph).
  6. Preparare l'intero sistema in una stanza buia, perché il segnale del reporter luciferasi destabilizzato è molto debole, e per evitare la luce estranea impedire l'acquisizione.

3. Colture di dissociazione NPC (Neural Stem/Progenitor Cell)

  1. Preparazione dei mezzi di coltura, piatti e reagenti per la cultura della dissociazione NPC
    1. Preparare i supporti N2/B27 per la coltura di cellule staminali/progenitrici neurali con una concentrazione finale di 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF e 50 U/mL Penicillina/Streptomicina nei media DMEM/F12.
    2. Preparare la soluzione papaina per la dissociazione contenente 7 papaina U/mL, 0.006% DNase e 1 mM N-acetylcysteine nei media EBSS.
    3. Preparare 100 mM di soluzione di sodio luciferina per l'imaging a luminescenza. Diluire la soluzione luciferina di 100 mM nei supporti N2/B27 ad una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Luciferin mostra auto-fluoresceina stessa. Nel caso della luciferasi-fluorescenza doppia imaging, in particolare EGFP, abbassare la concentrazione di luciferina a 0,5 mM è meglio.
    4. Rivestire una soluzione di fondo in vetro da 35 mm (diametro di vetro di 27 mm) con una soluzione poli-L-lysine (PLL) di 40 g/mL di poli-L-lysine (PLL) per 1 h a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le piastre 3x con PBS e lasciarlo asciugare.
  2. Dissezione degli embrioni e dissociazione dei PNG
    1. Dopo l'eutanasia di un topo transgenico incinta pDll1-Ub-luc (giorno embrionale 12.5 (E12.5)) da CO2 asfissia e dislocazione cervicale, tagliare l'addome ed estrarre l'utero.
      NOTA: I ricercatori devono seguire i regolamenti e le linee guida del comitato per la ricerca sugli animali della loro istituzione. Se vengono utilizzati farmaci per l'anestesia o il sollievo dal dolore, usali correttamente.
    2. Trasferire l'utero in una teglia Petri di 10 cm contenente 25 mL di PBS ghiacciato. Estrarre gli embrioni dall'utero in PBS ghiacciato, utilizzando micro forbici e pinze sottili.
    3. Tagliare la testa di ogni embrione con le forbici e trasferirla a 10 cm piatti Petri contenenti dMEM/F12 ghiacciati. Rimuovere l'epidermide e la cartilagine che circonda il cervello e trasferire il cervello a 35 mm piatto Petri contenente ghiacciato 3 mL di n2/B27 media.
    4. Tagliare il telecefalo destro e sinistro dal diencefalo(Figura 1Ba-f, C,D). Rimuovere le meningi che coprono la superficie del telencephalon con pinze sottili (Figura 1Bi). Utilizzando di nuovo le doci sottili, estrarre la parte dorso-laterale della corteccia dal telencephalon (Figura 1Bg,h,j-l E).
    5. Trasferire i tessuti su nuovi tubi da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000 e rimuovere qualsiasi mezzo supplementare con una pipetta P200. Aggiungere 0,1 mL di soluzione papaina per tessuto cerebrale (una coppia della corteccia). Dopo 15 minuti di incubazione a 24 gradi centigradi, pipette pipette i campioni 10 volte con P1000 pipetta. Incubare nuovamente i campioni per 15 min a 24 gradi centigradi.
    6. Pipette delicatamente i campioni 10 volte con pipetta P1000. Centrifugare i campioni per 3 min a 400 x g e temperatura ambiente (RT). Scartare il super-attardato.
    7. Aggiungere 1 mL di supporto DMEM/F12 al pellet. Delicatamente pipetta 10 volte con p1000 pipetta. Centrifugare i campioni per 3 min a 400 x g e RT. Scartare il supernatante. Ripetere questa operazione almeno altre due volte.
    8. Al pellet, aggiungere 0,5 mL di supporti N2/B27 contenenti 1 m di luciferina e mescolare bene. Semina le celle (1 x 106 celle) a un piatto inferiore in vetro rivestito di PLL. Coltura le cellule nell'incubatrice di CO2 per 1 h. Una volta che le cellule aderiscono al piatto, aggiungere 2 mL di supporti N2/B27, contenenti 1 mM luciferina.
  3. Visualizzazione dell'espressione di reporter luciferasi nella cultura della dissociazione NPC
    1. Avviare il sistema di imaging live della luminescenza prima di eseguire la dissezione. Per la coltura NPC, impostare la temperatura dell'incubatore palco a 37 gradi centigradi e impostare l'impostazione della miscela di gas 20% O2, 5% CO2.
    2. Mettere l'olio di immersione alla lente obiettivo. Posizionare il piatto campione sullo stadio del microscopio. Visualizzare il campo manualmente e scegliere la posizione migliore e il focus delle celle di interesse. Fare clic su Live per acquisire l'immagine di prova.
    3. Eseguire l'acquisizione time-lapse mediante acquisizioni bidimensionali (luminescenza e campo luminoso) per 24 h con il programma Multi-Dimensional Acquisition. Scegliere il programma di acquisizione multidimensionale e impostare l'impostazione di acquisizione come segue (passaggio 3.3.6).
    4. Per l'acquisizione dell'immagine della luminescenza, utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: bassa velocità di trasferimento (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min tempo di esposizione. Per l'acquisizione di immagini da campo luminoso, utilizzare le seguenti impostazioni: velocità di trasferimento intermedio (1 MHz), 1 x 1 binning e 100 ms tempo di esposizione.

4. Elettroporazione in utero

NOTA: Questa operazione viene eseguita per l'introduzione del reporter Dll1-Fluc nelle cellule progenitrici neurali.

  1. Preparazione di utensili e reagenti per l'elettroporazione
    1. Preparare i micro capillari per l'iniezione di DNA nel ventricolo del telencephalon embrionale. Allungare un'erba capillare con calore e tagliare e lucidare la punta di esso con la lucidatrice.
    2. Preparare una miscela di DNA con colorante (ad esempio, blu Trypan). La concentrazione di ogni DNA è di 1 g/L in PBS e aggiungere il tinrito ad una concentrazione finale del 10%.
      NOTA: Utilizzare la miscela di DNA per la visualizzazione delle dinamiche proteiche Dll1 come segue: Dll1-Fluc (Dll1 proteina reporter, Figura 2E superiore) e pEF-EGFP (EF promoter guidato vettore di espressione EGFP, Figura 2E inferiore), monitoraggio della posizione e morfologia delle cellule trafette.
    3. Preparare due tipi di anestetici: 3,88 mg/mL di pentobarbital e 0,12% di xilazina, in pbS 1x sterile.
    4. Utilizzare gli strumenti sterili e guanti chirurgici durante il funzionamento.
  2. Elettroporazione in utero
    1. Anestetizzare un volta topo ICR incinta (E12.5) dalla somministrazione intraperita di anestetici con 500 - L di 3,88 mg/mL pentobarbital e 5000L di 0.12% xylazine.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione degli esperimenti sugli animali. Se si ha bisogno di usare l'anestesia o farmaci antidolorifici, usarli correttamente.
    2. Tagliare i capelli e disinfettare la pelle con scrub chirurgici.
    3. Verificare la mancanza di risposta pizzicato dell'alto. Una volta che il riflesso del pedale non viene osservato, fare un 2-3 cm tagliare attraverso l'addome lungo la linea mediana. Mettere garze intorno alla parte sezionata e umido le garze con PBS caldo non asciugare l'incisione. Estrarre delicatamente il corno uterino destro con pinze a forma di anello e contare il numero di embrioni.
    4. Iniettare 1-2 l del DNA misto nel ventricolo del telecefalo degli embrioni delicatamente con micro capillare.
      NOTA: Quando l'iniezione ha esito positivo, si può vedere il colore blu del colorante sulla superficie dell'utero.
    5. Sorsrare l'utero e l'elettrodo prima di fornire gli impulsi di tensione, quindi tenere delicatamente la testa di un embrione. Impostare l'elettrodo caricato positivamente sul lato dell'emisfero, in cui è stato iniettato il DNA. Assicurarsi che la condizione dell'impulso di elettroporazione sia 30-50 V per 50 ms, l'intervallo degli impulsi è 1 s (50 ms di carica e 950 ms non carica). Fornire 5 impulsi a un embrione e verificare che le bolle vengano generate dall'elettrodo caricato negativamente.
      NOTA: Assicurarsi che la direzione dell'elettrodo: il DNA è incorporato nelle cellule sul lato dell'elettrodo positivo. Durante questa procedura, non spostare la posizione dell'elettrodo.
    6. Ripetere i passi 4.2.3-4.2.4 per altri embrioni e restituire il corno uterino alla cavità addominale. Eseguire la stessa procedura per gli embrioni nel corno uterino sinistro.
    7. Dopo aver rimesso il lato sinistro, suturare l'incisione da una sutura di seta (4-0) con un ago (17 mm). Prima di chiudere completamente l'incisione, mettere PBS caldo nella cavità addominale
      NOTA: l'intervallo tra le suture è di circa 2 mm.
    8. Dopo aver terminato l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento per il recupero post anestesia. Casa il mouse individualmente.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione istiutola locale degli esperimenti sugli animali. Se si ha bisogno di usare farmaci antidolorifici, usarli correttamente.

5. Preparazione delle colture di fette della corteccia in via di sviluppo e visualizzazione dell'espressione del reporter luciferate nelle fette corticali

  1. Preparazione dei mezzi di coltura e reagenti per le colture di fette della corteccia
    1. Preparare supporti arricchiti per la coltura di fette corticali contenenti il 5% di siero bovino fetale e il 5% di siero di cavallo nei supporti N2/B27.
    2. Bolla 100% O2 gas attraverso i supporti DMEM/F12 per la dissezione e fare fette corticali.
      NOTA: Per utilizzare il gas di ossigeno in modo sicuro, conservare il cilindro O2 nell'armadio del cilindro e monitorare la concentrazione di ossigeno nell'aria mediante un misuratore di concentrazione di ossigeno.
    3. Diluire 100 mM di soluzione di sodio luciferina nei media arricchiti ad una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Luciferin mostra auto-fluoresceina stessa. Nel caso della luciferasi-fluorescenza doppia imaging, in particolare EGFP, minore concentrazione di luciferina (0,5 mM) è meglio.
    4. Impostare l'incubatore multi-gas a 37 gradi centigradi del 40% O2 e 5% di CO2.
  2. Dissezione degli embrioni ed esame dell'espressione del reporter fluorescente
    1. Dopo l'eutanasia del topo incinta a cui i reporter (E13.5) vengono introdotti per elettroporazione in utero (passaggio 4.2), tagliare l'addome ed estrarre l'utero.
      NOTA: I ricercatori devono seguire la regolazione degli esperimenti sugli animali. Se si utilizzano anestesia o farmaci antidolorifici, usarli correttamente.
    2. Trasferire l'utero in una teglia Petri di 10 cm contenente PBS. Estrarre gli embrioni dall'utero in PBS, utilizzando micro forbici e pinze sottili. Tagliare la testa di ogni embrione e trasferirla in una teglia Petri di 10 cm contenente supporti DMEM/F12 bollita con 100% O2 gas. Rimuovere l'epidermide e la cartilagine che circonda il cervello in supporti DMEM/F12.
    3. Posizionare il cervello sul coperchio del piatto Petri con pinze a forma di anello e impostare il coperchio sullo stadio del microscopio stereoscopico a fluorescenza. Controllare la regione della corteccia esprimendo proteine fluorescenti sotto la luce di eccitazione (Figura 2A,B).
    4. Trasferire il cervello in un tagliere in gomma siliconica riempito con 30 mL di supporti DMEM/F12 bollato con 100% O2 gas. Rimuovere le meningi che coprono la superficie del telencephalon con pinze sottili.
    5. Tagliare il confine tra la parte mediale e laterale del telencephalon dorsale e separarlo in due emisferi utilizzando coltello micro chirurgico o pinze fini. Utilizzando un coltello micro chirurgico, tagliare la corteccia come strisce e fare fette corticali (Figura 2C,D). Affettacone pipette con mezzo utilizzando pipetta e trasferite su supporti arricchiti in un piatto da 35 mm.
    6. Mettere le fette sugli inserti di coltura nei piatti di fondo di vetro con supporti arricchiti. Correggere la direzione delle sezioni utilizzando pinze fini. Impostare la superficie di taglio delle sezioni sulla superficie dell'inserto di coltura. Rimuovere il supporto supplementare da una pipetta. Incubare le fette in incubatrici multigas impostate da 40% O2 e 5% di CO2 a 37 gradi centigradi per 30 min.
    7. Aggiungere 300 l di supporti arricchiti contenenti 1 mM luciferina all'esterno della coltura inserto nel piatto inferiore di vetro.
  3. Visualizzazione dell'espressione del reporter luciferate nelle colture di sezioni
    1. Avviare il sistema di imaging live della luminescenza prima di iniziare la dissezione. Utilizzare la seguente condizione di colture di fette corticali: 40% O2, 5% CO2 e 37 gradi centigradi.
    2. Mettere l'olio di immersione a lente obiettivo 40x. Mettere il piatto campione allo stadio del microscopio. Acquisire l'immagine di prova di fluorescente e impostare la posizione e il piano di messa a fuoco per la regione di interesse sotto l'illuminazione della luce di eccitazione.
    3. Eseguire l'acquisizione time-lapse mediante acquisizioni di 3-dimentional (luminescenza, fluorescenza e campo luminoso) per 24 h (Figura 2F-H). Per l'acquisizione dell'immagine della luminescenza, utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: bassa velocità di trasferimento (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 min/5 min tempo di esposizione. Per la fluorescenza e l'acquisizione di immagini da campo luminose, utilizzare le seguenti impostazioni: velocità di trasferimento intermedio (1 MHz), 1x1 binning e 100 ms di tempo di esposizione.

6. Elaborazione e analisi delle immagini

  1. Collegare ogni immagine e creare le immagini pila. Fate clic su Importa sequenza di immagini (File) Proprietà Import . Sequenza immagine) e scegliere la cartella in cui vengono salvate le immagini acquisite. Inserire alcune parole contenute nel nome del file nella colonna di File name contiene.
  2. Per rimuovere il rumore del raggio cosmico sulle immagini della bioluminescenza, applicate il plug-in Filtro SpikeNoise di ImageJ/Fiji. Aprire le immagini della pila e fare clic su Filtro SpikeNoise.
  3. Applicare savitzky Golay Temporale Filter plug-in per ottenere una chiara dinamica di espressione reporter. Aprire le immagini della pila e fare clic su Filtro temporale di Savitzky Golay.
  4. Per misurare l'intensità dell'espressione del reporter, applicare il plug-in Axis Profile Plus a ogni singola cella. Selezionare le celle e impostare i ROI, l'area di interesse e fare clic su Profilo asse Plus.

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Representative Results

Le espressioni dei geni Hes1/7 presentano un ciclo di oscillazione di 2 h in varie linee cellulari e durante la somitogenesi. Inoltre, il periodo di oscillazione è molto breve e sia i loro mRNA che le proteine sono estremamente instabili con le emivite di circa 20 min. Se si utilizza un reporter a risposta lenta, non possiamo tracciare una dinamica così rapida, e se si usa un reporter stabile, si accumula gradualmente mentre l'espressione genica oscilla. Pertanto, il giornalista deve essere rapidamente degradato per monitorare il rapido avvicendamento di tali geni ciclicamente espressi. Per superare questi problemi, abbiamo usato la reporter luciferate per monitorare l'espressione dinamica degli oscillatori. Poiché il reporter di bioluminescenza ha un breve tempo di maturazione e un'elevata sensibilità, ci permette di monitorare la rapida dinamica degli oscillatori ultradiani. Come un reporter fluorescente, il reporter luciferate può monitorare la dinamica di espressione di una proteina essendo fuso alla sequenza di codificagenica( Figura 1A, Figura 2E e Figura 3D). I prodotti genici fusi di Luciferasi mostrano la stessa espressione, il turnover e la cinetica di traslocazione nelle cellule, così come le proteine endogene. Inoltre, per monitorare l'attività promotore del gene oscillante Dll1, abbiamo usato luciferasi ubiquitarate, un giornalista destabilizzato luciferasi (Figura 1A e Figura 3A)23, il cui emivita è di circa 10 min20. Utilizzando vari tipi di reporter luciferasi, abbiamo generato topi transgenici o topi knocked-in per ottenere l'espressione stabile del reporter in PNG durante la neurogenesi17. Per visualizzare l'espressione del reporter a livello di singola cellula nella coltura dei tessuti, è preferibile l'introduzione diffusa del reporter. Così, abbiamo usato la trasfezione transitoria del gene reporter nei PNG tramite elettroporazione in utero (Figura 2F-H). Il sistema di denuncia lucidferasi è stato utilizzato nel campo dei ritmi circadiani per monitorare le espressioni dinamiche dei geni dell'orologio per un lungo periodo (ad esempio, 1 settimana), suggerendo che la luciferina (D-luciferin), il substrato dell'enzima luciferasi della lucciola, è molto stabile e non ha tossicità per le cellule viventi24,25. Di solito usiamo la luciferina nelle concentrazioni di 1 mM nei media, che è sufficiente per l'imaging notturno delle cellule vive. Inoltre, il sistema di imaging basato su microscopio ci permette di acquisire le immagini multidimensionali, le immagini di campo luminoso, le immagini a fluorescenza e le immagini di chemiluminescenza (Figura 2F-H e Figura 3E).

Utilizzando queste condizioni, abbiamo visualizzato le espressioni di vari geni dell'orologio ultradiano, tra cui Hes1, Ascl1, Neurog2 e Dll1 (Figura 2 e Figura 3). I risultati rappresentativi sono riportati nella Figura 3. Il reporter dell'attività promotrice Dll1 ha mostrato un'espressione oscillatoria nei PNG derivata dal telencephalon dei topi reporter Dll1-Ub-Fluc. Il giornalista di luciferasi destabilizzato (Figura 3A) indicava una regolazione netta verso l'alto e verso il basso dell'espressione dell'attività promotrice (Figura 3B,C). In questo caso, le celle a progenitore singolo neurale mostravano un ciclo di oscillazione di circa 2,5 h con varie ampiezza nel corso di 13 h (Figura 3C). La risposta rapida luciferate reporter ci permette di catturare la dinamica di trasmissione della segnalazione Notch tra due cellule viventi (Figura 3D-F e Supplemental Movie S1). Abbiamo preparato due tipi di miscele di DNA: (1) il promotore Hes1 (pHes1-Ub-luc) e il vettore di espressione EGFP, e (2) il giornalista proteico Dll1 (Dll1-Luc) e il vettore di espressione mCherry e li trasterzi separatamente in PNG. Poi abbiamo raccolto i due tipi di cellule e co-coltivate per misurare l'espressione dei reporter nelle cellule viventi. I risultati rappresentativi sono riportati nella figura 3E,F. Le cellule positive EGFP adiacenti che trasportano le cellule positive Hes1 reporter e mCherry che esprimono proteina Dll1 reporter contattato tra loro durante l'osservazione. Hes1 espressione reporter in una cella verde sembrava iniziare circa 60 min dopo due celle di contatto (Figura 3E,F). Ciò ha suggerito che il ritardo di tempo per la trasmissione della segnalazione di Notch tra le celle adiacenti era di circa 1 h. Inoltre, durante la trasmissione del segnale, l'espressione della proteina Dll1 ha mostrato una traslocazione dinamica in una cella rossa (Figura 3E).

Figure 1
Figura 1: Dissezione del cervello murino embrionale. (A) La struttura dei giornalisti luciferate, promotore Dll1 e reporter proteico Dll1. (B) Procedura di dissezione. (a) La vista laterale di un embrione di topo. (b) Tagliare la testa insieme alla linea tratteggiata. (c) Rimuovere l'epidermide e la cartilagine dal divario tra il telencephalon e il midbrain. (d) Tagliare il tessuto circostante lungo la linea mediana tra gli emisferi destro e sinistro. (e) Rimuovere il tessuto dalla rottura centrale su entrambi i lati. (f) Il telencephalon e il midbrain dopo la rimozione del tessuto circostante. (g) Separare il telencephalon (tel), il midbrain (medio) e il bulbo olfattivo (OB). (h) Sezione trasversale del telencephalon, mostrata in linea tratteggiata (g). (i) Rimuovere le meningi che circondano la superficie del telencephalon. (j) Separare il telencephalon in due parti: mediale e laterale. (k) Tagliare il bordo della corteccia e l'eminenza ganglionica (GE). (l) La parte dorso-laterale della corteccia viene utilizzata per la coltura della dissociazione. (C) Il cervello al giorno embrionale 14 (E14), costituito dagli emisferi sinistro(a)e destro(b)del telencephalon e del midbrain (c). (D) Gli emisferi teleencefalici separati dal midbrain. (E) Uno dissenato l'emisfero del telencephalon: la parte ventrolaterale del telencephalon compresa le eminenze ganglioche (d), la parte dorsolaterale del telencephalon utilizzata per colture dissociate e fette (e), la parte mediale del telencephalon (f) e le meningi che coprono la superficie del cervello (g). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fare le fette corticali del telecefalo embrionale e visualizzare la dinamica delle proteine Dll1 nelle colture di fette corticali. (A) Controllo dell'espressione di EGFP utilizzando il microscopio stereoscopico a fluorescenza. Freccia rossa indica l'area della corteccia che esprime EGFP. L'emisfero sinistro (a), l'emisfero destro (b) e il midbrain (c). (B) Le linee punteggiate indicano i contorni delle regioni cerebrali mostrate nella (A). (C) Corteccia dissecinata del telecefalo dorsolaterale. Le frecce bianche indicano i bordi tagliati. (D) Affettare corticali del telencephalon dorso-laterale. (E) Strutture geniali dei reporter per la visualizzazione delle dinamiche delle proteine Dll1 nei PNG. Il reporter della proteina Dll1, Dll1-Fluc (superiore) è stato introdotto nei PNG con un vettore di espressione EGFP (inferiore) per monitorare la morfologia e la migrazione delle cellule nelle fette corticali. (F-H) Immagini tridimensionali di campo luminoso (F), espressione GFP (G) e bioluminescenza (H) nella fetta corticale. Il sistema di imaging a bioluminescenza ha permesso di tracciare simultaneamente le espressioni di luciferasi e fluorescenza. Barre di scala: 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dati rappresentativi per la visualizzazione e l'analisi dell'espressione dinamica del gene Dll1 nella coltura NPC. (A) Il costrutto reporter per la visualizzazione dell'espressione Dll1 a livello trascrizionale, utilizzando un giornalista di luciferasi destabilizzato (Ub-luciferate, luciferasi ubiquitare. (B) Visualizzazione dell'espressione di Dll1 in un singolo PNG con un reporter di bioluminescenza. I numeri nel pannello mostrano i punti di picco dell'espressione oscillatoria di Dll1 corrispondente ai numeri nel pannello C. (C) Un grafico del percorso temporale della bioluminescenza del Png dissociato mostrato in (B), che mostra l'espressione dinamica di Dll1. (D-F) Visualizzazione dell'espressione del promotore Hes1 reporter e dll1 proteina reporter espresso nelle cellule vicine. (D) La struttura del promotore Hes1 activity reporter (pHes1-Ub-luc) e del giornalista proteico Dll1 (Dll1-Luc). (E e F) La cellula positiva EGFP che trasportava il reporter Hes1 (Cell1) e la cellula positiva mCherry che trasportava il reporter della proteina Dll1 (Cell2) sono state co-coltivate e la luminescenza di entrambi i tipi di reporter è stata misurata. L'espressione del giornalista Hes1 nella cella verde (cell1) sembrava iniziare circa 60 min dopo che le due cellule hanno contattato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film supplementare S1: Visualizzazione dell'espressione del promotore Hes1 e giornalista proteico Dll1 espresso nelle celle vicine, relativo alla Figura 3D-3F. Fare clic qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

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Discussion

I componenti della segnalazione di Notch mostrano espressioni oscillatorie in sincronia durante la somitogenesi ma fuori sincronia durante la neurogenesi, portando alle difficoltà nel catturare la dinamica dell'espressione mediante analisi statica in quest'ultimo caso. Pertanto, il monitoraggio in tempo reale è necessario per rivelare la dinamica di espressione dei componenti di segnalazione Notch, ad esempio Hes1 e Dll1. Poiché i periodi delle espressioni delle oscillazioni Hes1 e Dll1 sono estremamente brevi, sono necessari circa 2-3 h, per il monitoraggio delle dinamiche di espressione sono necessari circa 2-3 h, sono necessari una risposta rapida e giornalisti instabili. A questo scopo, abbiamo sviluppato il sistema di bioluminescenza reporter e imaging. Il reporter di bioluminescenza luciferasi mostra cinetica di maturazione rapida e un'elevata sensibilità per tracciare il rapido turnover di tali espressioni geniche cicliche. Il rapido turnover dei giornalisti porta a segnali molto deboli generati. Per rilevare tali deboli segnali prodotti dai reporter di bioluminescenza, utilizziamo un sistema ottimizzato di imaging a bioluminescenza, che include una telecamera CCD ad alta sensibilità raffreddata ad acqua con una velocità di lettura ultra-bassa (50 kHz), che riduce il rumore al minimo. Inoltre, una lente obiettivo ad alta apertura numerica (N.A.) ci permette di raccogliere al massimo la luce rilasciata dal reporter lucidferasi destabilizzato. Per ottenere una maggiore sensibilità di solito usiamo binning più elevato (ad esempio, 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) e manteniamo l'otturatore aperto per un lungo periodo (ad esempio, 5-20 min). Poiché il segnale dei giornalisti luciferasi è estremamente debole, l'interferenza della luce proveniente dall'ambiente presenta anche un problema nel rilevare il segnale debole: quindi, la stanza del microscopio deve essere completamente scura. Questo sistema ci permette di misurare le espressioni dinamiche dei geni Hes1 e Dll1 nei PNG sia nei livelli trascrizionali che proteici (Figura 3). Inoltre, possiamo visualizzare la dinamica proteica della traslocazione intracellulare con i reporter proteici fusi luciferasi. Inoltre, utilizzando il reporter luciferate risposta rapida, siamo in grado di catturare la dinamica di trasmissione della segnalazione Notch e misurare il ritardo di tempo per la trasmissione del segnale tra due celle viventi (Figura 3D-F e Supplemental Movie S1). Inoltre, la combinazione di promoter reporter (Ub-luciferase reporter) e reporter proteico (fusione luciferasi) di un singolo gene ci permette di misurare il ritardo tra la trascrizione e la traduzione del gene. In questo modo l'imaging multiplo di vari tipi di reporter di luminescenza e di reporter di fluorescenza è disponibile per misurare il ritardo/tasso di tempo per le reazioni biochimiche.

Il monitoraggio in tempo reale delle espressioni geniche a risoluzione cellulare singola ha rivelato che esistono variazioni nella dinamica di espressione dello stesso gene. Alcune cellule esprimono Dll1/Neurog2 in modo oscillatorio, ma altre mostrano modelli sostenuti. Inoltre, le diverse dinamiche di espressione (oscillatorie contro costante) inducono diverse uscite nello stato delle cellule. Ciò che sembra essere chiaro è che le diverse dinamiche delle espressioni influenzano i comportamenti cellulari in modi diversi, suggerendo che la dinamica dell'espressione codifica più informazioni21,22,26,27,28,29,30,31,32. Le analisi statiche non possono catturare la dinamica nell'espressione genica e sono necessarie analisi in tempo reale per comprendere i fenomeni biologici per rivelare la dinamica dell'espressione negli eventi cellulari. L'approccio che introduciamo qui può monitorare la dinamica degli oscillatori ultradiani durante lo sviluppo neurale ad alta risoluzione temporale. Utilizzando questo metodo, abbiamo scoperto che molti più geni sono espressi dinamicamente di quanto pensassimo in precedenza, e possiamo tracciare non solo la dinamica dell'espressione proteica, ma anche la dinamica nella localizzazione delle proteine nella cellula ad alta risoluzione temporale. Tali modelli di espressione dinamica potrebbero avere significati biologici che devono ancora essere chiariti.

I giornalisti di bioluminescenza hanno un grande vantaggio nella risoluzione temporale e nella bassa tossicità delle cellule viventi rispetto ai giornalisti di fluorescenza33 . Tuttavia, a differenza delle variazioni di colore nei reporter fluorescenti, ci sono solo pochi colori nei giornalisti di bioluminescenza, imponendo una limitazione al numero di geni che possono essere monitorati contemporaneamente. Tuttavia, un numero crescente di luciferasi variabili viene isolato e clonato da varie creature34,35, e utilizzando una tale varietà di luciferasi, saremo in grado di tracciare simultaneamente molteplici dinamiche di espressione genica in una singola cellula ad alta risoluzione temporale. La dimensione molecolare della lucciola luciferasi è più grande dei reporter fluorescenza, il che presenta alcune difficoltà nella costruzione di proteine reporter-fuse per monitorare la dinamica delle proteine, ma recentemente è stata clonata una nuova luciferasi più piccola e luminosadi 36, che ci permetterebbe di visualizzare la dinamica delle proteine più facile che mai. Un numero crescente di rapporti ha recentemente mostrato diversi tipi di dinamiche nell'espressione genica e nella traslocazione proteica in vari eventi biologici21,22,26,27,28,29,30,31,32. L'analisi di tali dinamiche nella regolazione spaziale utilizzando un sistema di monitoraggio in tempo reale sarebbe sempre più importante per catturare gli stati effettivi delle cellule e rivelare la regolazione dei sistemi cellulari.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari contrastanti.

Acknowledgments

Ringraziamo Yumiko Iwamoto per aver sostenuto la produzione del video. Siamo anche grati ad Akihiro Isomura per la discussione e il supporto dell'analisi delle immagini, Hitoshi Miyachi per il supporto tecnico per la generazione di animali transgenici, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) per il supporto tecnico e le discussioni del sistema di imaging di bioluminescenza. Questo lavoro è stato supportato da Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (CPS) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Piattaforma per gli approcci dinamici al sistema vivente del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia, Giappone.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 154 Imaging in tempo reale Bioluminescenza Luciferase Oscillazione Segnalazione notch Neurogenesi
Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine
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Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

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